CN107356746A - 一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。该试剂盒包括：吖啶酯标记物、偶联有抗原或抗体的磁微粒、特布他林校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明建立的直接化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速，检测时间短，检测结果具有更高的准确性与重复性，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

Description

一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体是一种特布他林的免疫磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。
背景技术
特布他林（Terbutaline），中文别名为5-(1-羟基-2-叔丁基氨基乙基)苯-1,3-二酚，分子式为C12H19NO3，其结构为：
又称叔丁喘安、特普他林，临床上常用于治疗支气管哮喘，喘息性支气管炎，肺气肿等，其支气管扩张作用比沙丁胺醇弱，同样为选择性β2受体激动剂，对动物具有促进骨骼肌（瘦肉）生长，减少脂肪蓄积，提高胴体瘦肉率，常被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产。特布他林不易破坏，如若动物在屠宰前没有经过一定时间的用药停留期，残留会聚集在动物可食用组织中，由于这类化合物具有口服活性，如果违法超量使用人体会将出现不同程度的中毒反应，其症状与动物中毒症状相似，表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心眩晕、呼吸困难等症状，重者可引发高血压、心脏病甚至死亡，严重影响人体健康。因此我国禁止使用促进动物生长的特布他林作为饲料添加剂。
早在1997年3月，农业部发文严令禁止β-激动剂在动物生产中的应用。2001年，随着广东、广西等地连续发生人食用含β-激动剂的动物性食品中毒事件，农业部启动了“无公害食品行动计划”，将“瘦肉精”监测作为动物产品监控的重点。2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物使用β激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）。因此，食品中特布他林残留检测，对保证食品安全起着非常重要的作用。
到目前为止，用于检测动物源性食品中特布他林残留的方法主要有：微生物法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、放射免疫法、酶促化学发光等。微生物法缺乏特异性且所需时间较长。高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用法中仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时费力又不易普及，检测成本高。放射免疫法除了上述缺陷外还需配备放射源，有一定危险性。CN 101393210 A（2009年3月）公开了一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒采用酶标板包被特布他林与卵清蛋白偶合制成的人工抗原，辣根过氧化物酶标记特布他林多克隆抗体，虽达到了省时省力、节约成本的效果，但采用辣根过氧化物酶具有以下缺点：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。综上，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测特布他林的方法具有十分重要的意义。
本发明采用方法为直接化学发光法，采用吖啶酯作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。本发明建立的磁微粒化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、检测结果具有更高的准确性与重复性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测特布他林的试剂盒，可以采取特布他林单克隆抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记特布他林抗原，也可以采取特布他林抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记特布他林单克隆抗体。试剂盒还包括特布他林校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
所述的磁微粒可直接与抗体或抗原偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记抗体或抗原。
所述磁微粒的表面修饰基团为羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
所述的吖啶酯标记的是特布他林抗原，或特布他林单克隆抗体。
所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA 和0.1-0.5% PC300 的Tris-HCl缓冲液为基质，加入特布他林纯品配置而成，校准品形态为液态。
所述的特布他林校准品溶液浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L。
所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.05-5%，HNO3的浓度为0.05-2.5 mol/L。
所述的化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的浓度为0.05-2.0 mol/L，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
所述的清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.05-0.50 mol/L的NaCl及0.01-0.25% Tween-20。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明的优点在于采用竞争法联合磁微粒化学发光技术，测定食品中的特布他林含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
具体实施方式
本发明提供一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，其中，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测特布他林的试剂盒，可以采取特布他林单克隆抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记特布他林抗原，也可以采取特布他林抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记特布他林单克隆抗体。试剂盒还包括特布他林校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
具体地，本发明所述磁珠的内核为四氧化三铁，所述的磁微粒可直接与抗体或抗原偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记抗体或抗原。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，长时间放置磁珠抱团个数少，沉降速度慢的磁珠。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述偶联抗原缓冲液为pH 5.0、浓度为0.1 mol/L 的MES缓冲液；偶联抗体缓冲液为pH 6.0、浓度为0.1 mol/L 的MES缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
具体地，本发明所述校准品是用含有1-3% BSA 和0.1-0.3% PC300 的Tris-HCl缓冲液为基质，加入特布他林纯品配置而成，校准品形态为液态。
具体地，本发明所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L。
具体地，本发明所述化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L。
具体地，本发明所述清洗液为：pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：所述的一种检测特布他林的磁微粒化学发光试剂盒1的组建及制备方法，包括以下步骤：
1. 试剂盒1的组建：
组建一种检测特布他林的磁微粒化学发光试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁微粒偶联的特布他林单克隆抗体；
吖啶酯标记的特布他林抗原；
特布他林系列标准品溶液，浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5μg/L、12.5 μg/L，其缓冲液是含有1-3% BSA和0.1-0.3% PC300的Tris-HCl溶液；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液，具体为浓度25 mmol/L的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.2），其中含浓度0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2. 偶联有特布他林单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入一定量 MES（pH为6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μL（15 μg）的特布他林单克隆抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育17min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。
（4）去上清，加入一定量的清洗缓冲液（TBS+0.05%Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1%BSA的缓冲液进行封闭，反复封闭4次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的特布他林抗原液相试剂制备
（1）纯化特布他林：将一定量的特布他林抗原置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺DMF中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将经透析过后的特布他林溶液置于500 μL离心管内（避光反应），加入200 μL标记缓冲液，然后加入一定量的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与特布他林的摩尔比值为9.7:1，室温下反应1 h，加入10 g/L赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装。
4. 特布他林校准品配制
用含有1-3% BSA 和0.1-0.3% PC300 的Tris-HCl 缓冲液将特布他林纯品配制成标示浓度为0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L共6个浓度的校准品梯度值。
5. 化学发光激发液A、B制备
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例2：所述的一种检测特布他林的磁微粒化学发光试剂盒2的组建及制备方法，包括以下步骤：
1. 试剂盒2的组建：
组建一种检测特布他林的磁微粒化学发光试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁微粒偶联的特布他林抗原；
吖啶酯标记的特布他林单克隆抗体；
特布他林系列标准品溶液，浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5μg/L、12.5 μg/L，其缓冲液是含有1-3% BSA和0.1-0.3% PC300的Tris-HCl溶液；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液，具体为浓度25 mmol/L的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.2），其中含浓度0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2. 偶联有特布他林抗原的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入一定量MES（pH为5.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μL（15 μg）的特布他林抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育17 min。
（3）加入10 μL 浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。
（4）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1%BSA的缓冲液进行封闭，反复封闭4 次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的特布他林单克隆抗体液相试剂制备
（1）纯化特布他林单克隆抗体：将一定量的特布他林单克隆抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺DMF中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将经透析过后的特布他林单克隆抗体溶液置于500 μL离心管内（避光反应），加入200 μL标记缓冲液，然后加入一定量的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与特布他林单克隆抗体的摩尔比值为7.4:1，室温下反应1h，加入10 g/L赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1 mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装。
4、特布他林校准品配制
用含有1-3% BSA 和0.1-0.3% PC300 的Tris-HCl 缓冲液将特布他林纯品配制成标示浓度为0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L共6个浓度的校准品梯度值。
5. 化学发光激发液A、B制备
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例3：样品的前处理
A. 肌肉、内脏的处理
肌肉的处理：称取2.0 g均质后的组织样本至50 mL离心管中；加入4 mL、2% NaCl以及0.2 mol/L HCl-甲醇混合液，振荡30 s；3000 r/min，室温离心5min后取0.5 mL上清液(避开上层悬浮物)加入35 mL、0.5 mol/L NaOH溶液，再加入0.5 mL、浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，混匀。
内脏的处理：称取2.0 g均质后的组织样本至50 mL离心管中；加入4 mL、2%NaCl以及0.2 mol/L HCl-甲醇混合液，振荡30 s；3000 r/min，室温离心5 min后取0.5 mL上清液(避开上层悬浮物)加入20 mL、0.5 mol/L NaOH溶液，再加入0.5 mL、浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，混匀。
B. 牛奶检测样本溶液的处理
取150 μL新鲜牛奶于500 μL离心管中，4℃离心10 min（3000 r/min），弃去上层脂肪。移取离心后的牛奶样本25 μL置于干净的玻璃试管中，加入950 μL、浓度为0.02 mol/L磷酸盐缓冲液进行稀释。
实施例4：利用所述的特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒进行检测的步骤为：
（1）将待测样本100 μL、偶联磁微粒混悬液150 μL、吖啶酯标记物150 μL，依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育15 min。
（2）分离清洗5次。
（3）将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（4）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中特布他林的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例5：试剂盒的性能指标
（1）试剂盒的灵敏度
对零标准溶液进行20次重复测试，取零标准溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的灵敏度。本试剂盒对特布他林的灵敏度为0.03 μg/L。
（2）试剂盒的特异性
与特布他林结构或功能相似的竞争药物：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。按试剂盒步骤操作，分别加入特布他林、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇，制作抑制曲线，根据线性方程计算各药物的50%抑制浓度。交叉反应率即为抗体对特布他林的IC50与抗体对特布他林竞争物的IC50之比的百分数。结果显示：本试剂盒对特布他林具有较高的特异性，对与特布他林结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：包括偶联有特布他林单克隆抗体的磁微粒混悬液、校准品、吖啶酯标记的特布他林抗原、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁微粒可直接与特布他林单克隆抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记特布他林单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
4.根据权利要求1所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是特布他林抗原。
5.根据权利要求1所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的校准品是以含有0.5-5.0% BSA 和0.1-0.5% PC300 的Tris-HCl 缓冲液为基质，加入特布他林纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由TritonX-100和NaOH的混合液组成。
7.一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：包括偶联有特布他林抗原的磁微粒混悬液、校准品、吖啶酯标记的特布他林单克隆抗体、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
8.根据权利要求7所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁微粒可直接与特布他林抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记特布他林抗原。
9.根据权利要求7所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
10.根据权利要求7所述的一种特布他林的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是特布他林单克隆抗体。
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