CN202994798U - 一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开的一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括盒体，其在盒体内放置有至少两条试纸条，每条试纸条均包括依次搭接在支撑底板上的样品垫、结合垫、检测膜和吸水垫；每一试纸条的结合垫上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白；检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹；检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹；检测膜的检测区上的所述检测蛋白印迹与所述质控区上的质控蛋白印迹彼此分离；其中至少有一条试纸条上的检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹与其它条试纸条上的检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹不相同。本实用新型在临床中能够快速准确地检测RA,以满足临床诊断的需要，实现即时检测、床边检测。

Description

一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种诊断试剂盒。更具体地，本实用新型涉及包括至少两项检测试纸条的诊断试剂盒，所述至少两项试纸条分别包被有抗原，用于体外检测人血液中的RF-(IgM,IgA,IgG)，瓜氨酸化多肽CCP抗体瓜氨酸化蛋白CP抗体，辅助诊断类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）。 

背景技术

类风湿关节炎是一个累及周围关节为主的系统性炎症性自身免疫性疾病,其特征性病理改变是关节滑膜的慢性炎症，滑膜增生形成绒毛状突起，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。在我国，RA患病率为0.32%～0.36%，患者率女性约3倍于男性,RA可发生于任何年龄，80%发病于35-55岁,其次60岁以上者发病率明显高于30岁以下者。 

目前的研究表明，在RA发病的2年内就有可能出现骨质破坏和关节间隙变窄，未经及时而正确治疗的患者大多数发展为关节畸形和关节功能障碍。所以早期诊断，早期给予有效的改善病情抗风湿药物治疗，控制病情进展，预防和减少骨关节破坏，对于改善类RA患者的预后显得尤为重要。 

迄今为止，自身免疫性疾病的诊断手段主要是在结合临床的基础上，依赖实验室检测到一种或多种高效价的自身抗体。在国际权威机构制定的某些自身免疫性疾病诊断标准中就包括了自身抗体，如类风湿关节炎。美国风湿病学学会(ACR)和欧洲风湿病防治联合会(EULAR)2009年发表的类风湿关节炎分类标准中，血清学标准包括类风湿因子RF和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体ACPA。瓜氨酸化蛋白CP包括多种抗原，主要包括聚丝蛋白类抗原，纤维蛋白原蛋白，波形蛋白类抗原等。病理性RF的滴度/浓度高、亲和力高、特异性强,并具有3种RF(IgM-RF、IgG-RF和IgA-RF)。传统的血清学指标为IgM型类风湿因子（RF），但其敏感性仅50%～70%，且该指标特异性差，不仅可以在RA以外的其它结缔组织病患者中出现，在一些非结缔组织病如感染、肿瘤等患者，甚至部分正常老年人中也可呈阳性。 

有文献报道，联合检测RF的不同类型，有助于提高检测的特异性。RF-IgM阳性多伴有骨质破坏以及多关节受累，RF-IgA显示RA伴有多关节受累，RF-IgG与关节外症状相关。近年来陆续有报道，除类风湿因子以外，类风湿关节炎患者血清中还存在多种类风湿关节炎自身抗体的检测及临床评价种自身抗体，如:抗核周因子抗体（APF）、抗聚角蛋白微丝蛋白抗体（AFA）,抗突变的波形蛋白（MVC）抗体，抗CCP抗体，抗纤维蛋白原抗体等，可在类风湿关节炎的早期出现，对RA的诊断有一定意义。抗APF,AFA敏感性差，但是特异性高。抗MCV的特异性达到90%以上，敏感性也能达到70%，抗瓜氨酸纤维蛋白原抗体的敏感性稍低，只达到60%，抗CCP抗体的敏感性和特异性均较高,这些相关抗体联合检测RF因子有助于提高 RA的诊断率。 

在临床诊断上，目前实验室常用的检测自身抗体的方法主要有酯联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay.ELISA)、间接免疫荧光法(indirect immunoflurescence.IFF)、免疫印迹法(immunoblottin g test.IBT)、线性免疫分析法(Line immuno assay.LIA)等。免疫印迹法虽综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，但操作相对复杂，且试剂具有较强的毒性和污染性，对自身抗体的检测局限于线性表位。间接免疫荧光法可作半定量测定，但需有荧光显微镜观察结果，结果判定的客观性不足，标准化困难，技术程序比较复杂，也不适合高通量标本的检测。线性免疫分析法主要用于疾病大类的筛查，针对性相对较差，同时也不适合高通量样本的检测。ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高,目前被广泛认可，但操作比较繁琐,需多次加样和洗涤，且易受温度和孵育条件的影响,在专业实验室里进行操作，给实验带来诸多不便。 

目前还没有一种诊断装置，同时对RF以及CP,CCP进行方便、快捷和准确的筛查。而这几种指标的联合检测有助于提高RA诊断的敏感性和特异性以及早期诊断，对于后期的治疗有重大的意义。因此，本领域迫切需要提供一种在临床中能够快速准确地检测RA的诊断装置,以满足临床诊断的需要，实现即时检测、床边检测。 

实用新型内容

本实用新型所要解决的技术问题在于针对现有用于诊断类风湿关节炎的诊断方法所存在的问题而提供了一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包含有至少两项检测试纸条，分别包被有抗原，用于体外检测人血液中的RF-(IgM,IgA,IgG)，CCP抗体,CP抗体，辅助诊断类风湿关节炎。 

本实用新型所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现： 

一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括盒体，其特征在于，在所述盒体内放置有至少两条试纸条，每条试纸条均包括依次搭接在支撑底板上的样品垫、结合垫、检测膜和吸水垫； 

每一试纸条的所述结合垫上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白； 

每一试纸条的所述检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹； 

每一试纸条的所述检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹； 

每一试纸条的所述检测膜的检测区上的所述检测蛋白印迹与所述质控区上的质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫； 

其中至少有一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹与其它条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹不相同。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述样品垫是由玻璃纤维、酯聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述结合垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述检测膜是由硝酸纤维素膜制成；所述支撑底板由硬质地而不吸水的材料制成。 

所述支撑底板由PVC板制成。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述检测蛋白印迹为斑点状或条带状。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述质控蛋白印迹的形状为斑点状或条带状。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为斑点状。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为条带状。 

在本实用新型的某些优选实施例中，每条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹或结合RF的变性IgG蛋白印迹。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条为两条，两条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性IgG蛋白印迹，但两条试纸条上的的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹的物质不相同。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条为三条，三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性IgG蛋白印迹，但三条试纸条上的的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹的物质均不相同。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条为四条，其中一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，其余三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为RF-(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条为五条，其中一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为CP蛋白印迹，一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为CCP蛋白印迹，其余三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为RF-(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述质控蛋白印迹中的质控蛋白为与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者为与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条的结合垫上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹中的质控蛋白为能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述诊断试剂盒进一步包括放置在所述盒体内的至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述至少两条试纸条。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述至少一个固定底座上固定有两个到五个所述试纸条，且所述试纸条相互独立。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单条试纸条的容纳部内。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述容纳部为至少两个。在本实用新型的 某些优选实施例中，所述固定底座为两个或两个以上，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述诊断试剂盒还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述至少两条试纸条相互平行放置。在本实用新型的某些优选实施例中，所述试纸条的检测膜上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。 

在本实用新型的某些优选实施例中，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自下组的组成部分：固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、样品稀释液。 

本实用新型在临床中能够快速准确地检测RA,以满足临床诊断的需要，实现即时检测、床边检测。 

附图说明

图1为单条试纸条的剖面示例图，其中l指示样品垫，2指示结合垫，3指示检测膜，4指示吸水垫，5指示检测区，6指示质控区，7指示支撑底板。 

图2为单条试纸条的分解示例图，其中1-7所表示的结构同图1。 

图3为可以设置单条试纸条的设有突起的固定底座的示例图，其中(a)为俯视图，(b)为(a)的A-A剖视图。其中8指示固定底座，9指示突起，20指示容纳部。 

图4为可与固定底座配合的上盖的示例俯视图，其中10指示上盖.11指示加样口，12指示观察窗口。 

图5为设有试纸条的固定底座和上盖配合时的结构示意图，其中(a)为俯视图，(b)为(a)的B-B剖视图，其中1-12所表示的结构同图l、图2和图4。 

图6为可以设置两条试纸条的设有突起的固定底座及可与之配合的上盖的示例图，其中(a)为固定底座的示例俯视图，(b)为图（a）的C-C剖视图。(c)为上盖的示例俯视图。其中8'指示固定底座，9'指示突起，10'指示上盖，11'指示加样口，12'指示观察窗口，20指示容纳部。 

图7为可以设置三条试纸条的设有突起的固定底座及可与之配合的上盖的示例图，其中(a)为固定底座的示例俯视图，(b)为固定底座的示例剖视图，(c)为上盖的示例俯视图。其中8"指示固定底座，9"指示突起，10"指示上盖，11"指示加样口，12"指示观察窗口，20指示容纳部。 

具体实施方式

本实用新型提供了用于诊断类风湿关节炎的含有试纸条的诊断试剂盒，所述试纸条能够用于进行样品的层析，并且能够检测样品中存在的被检物质。 

在某些实施方式中，所述样品可以是人体液样品，例如全血或血清，血浆样 本，体液如关节液等。在某些实施方式中，所述样品中存在的被检物质是一种或多种人抗体，例如，抗CCP抗体抗瓜氨酸化蛋白抗体,RF-IgG,RF-IgM,RF-IgA,上述这些人抗体被证明与类风湿关节炎有关，通过检测样本中是否存在一种或多种这些抗体，可以辅助诊断类风湿关节炎。这些被检抗体能够特异性结合其对应的抗原，因此，将这些抗体的抗原包被在所述试纸条的检测区，可以检测与之对应的被检抗体。表l中列出了能够与抗CCP抗体，AFA,ACF,MCV,RF-IgG,RF-IgM,RF-IgA等特异性结合的抗原的示例。 

表1 

本申请提供的诊断试剂盒包括盒体，盒体内放置有至少两条试纸条100，其中每一条试纸条100都包括依次搭接在支撑底板7上的样品垫l、结合垫2、检测膜3和吸水垫4。其中，试纸条100的结合垫2上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白。试纸条100的检测膜3的检测区5上包被有一种检测蛋白印迹，检测膜3的质控区6上包被有一种质控蛋白印迹。试纸条的检测膜3上的检测蛋白印迹与质控蛋白印迹彼此分离，检测蛋白印迹相比于质控蛋白印迹更靠近于结合 垫。 

本申请提供的诊断试剂盒中的各条试纸条100相互独立，彼此互不干扰检测时样品的层析流动和结果显示。样品垫l是样品添加的区域。结合垫2上包被有金属胶体标记物，是样品与金属胶体标记物结合或混合的区域。检测膜3上设置有彼此分离的检测区5和质控区6，且检测区5比质控区6更靠近结合垫2，其中检测区5包被有检测蛋白印迹，用于结合待测抗体，质控区6包被有质控蛋白印迹用于结合质控对照物。吸水垫4用于吸收水份以使样品朝吸水垫4方向移动。支撑底板7用于支撑依次搭接的样品垫1、结合垫2、检测膜3和吸水垫4，单条试纸条100的具体结构示意图见图1和图2。 

如图l所示，单条试纸条100中，样品垫l、结合垫2、检测膜3和吸水垫4按照该顺序从左到右依次首尾搭接在支撑底板7上。 

"搭接"是指，相邻的两个组件的首尾部分重叠，并且在重叠处形成可以允许液体样品移动的连接结构。例如，可以在相邻的两个组件的首尾部分通过按压操作形成较为紧密的重叠结构，使得样品能够从上游组件的尾部通过该重叠结构移动至下游组件上。上游组件可以重叠在下游组件的上方，也可以重叠在下方。在检测时，可以将液体状态的样品(如血液，血浆，关节液等)加样到样品垫1上，该液态状态的样品可以通过吸水作用，沿着样品垫1向与之搭接的结合垫2移动，接触到结合垫2后再沿着结合垫2向与之搭接的检测膜3移动，接触到检测膜3之后再沿着检测膜3向与之搭接的吸水垫4移动。这样的移动通常称为层析作用。样品加到样品垫l上后，其中的物质通过层析作用，依次移动到结合垫2和检测膜3上。当样品移到结合垫2时，其中的待检测抗体，如人抗体，可与结合垫2上包被的金属胶体标记的蛋白相结合，然后含有从结合垫2上结合或混合的物质的样品继续移动到检测膜3上，并与检测膜3上包被的检测蛋白印迹相结合并且被截留，从而使得样品中的被检物质得以被检测。 

试纸条100的结合垫2上包被有可与人抗体结合的金属胶体物标记的第一种蛋白。第一种蛋白可以是抗人IgG抗体，例如，羊抗人IgG抗体，兔抗人IgG抗体，猪抗人IgG抗体，或鼠抗人IgG抗体等。另外第一种蛋白可以是葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。还有第一种蛋白可以是抗人IgM抗体，例如羊抗人IgM抗体，兔抗人IgM抗体，猪抗人IgM抗体，或鼠抗入IgM抗体等。第一种蛋白也可以是抗人IgA抗体，例如羊抗人IgA抗体，兔抗人IgA抗体，猪抗人IgA抗体，或鼠抗人IgA抗体等。 

金属胶体标记的第一种蛋白可以通过在适当条件下混合金属胶体物和蛋白而制得。具体方式是可以用适当的缓冲液加入金属胶体物中，调节至适当的pH，再按一定比例加入蛋白，混匀制得金属胶体物标记的蛋白。其适当的缓冲液包括，例如，碳酸钾缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等，适当的缓冲浓浓度可以是O.01～O.5M。适当的pH可以是4～10，金属胶体物可以通过本领域公知的方法制得，例如，将含有金属离子的溶液在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成一定大小的金属颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶体溶液。金属胶体物的例子有胶体金、胶体银等。 

试纸条的结合垫2上包被有可与人抗体结合的胶体金标记的蛋白。例如包被有胶体金标记的抗人IgG抗体，抗人IgM抗体，抗人IgA抗体,胶体金标记的葡萄球菌A蛋白，或胶体金标记的链球菌G蛋白。 

在结合垫2上还包被有金属胶体物标记的第二种蛋白。第二种蛋白不同于所述金属胶体物标记的第一种蛋白。第二种蛋白可以特异性结合质控蛋白，但不结合样品中的人抗体。如下所述，该第二种蛋白为质控对照物，用于显示试纸功能是否正常。第二种蛋白也可以根据实际情况选择，例如，可以是不结合人抗体的兔抗体、鼠抗体、羊抗体、猪抗体、或者其他适合的蛋白。第二种蛋白还可以通过上述的方法形成金属胶体标记的第二种蛋白。第二种蛋白与第一种蛋白以混合物的形式包被在结合垫2上。 

试纸条100的检测膜3上设置有彼此分离的检测区5和质控区6，且检测区5相比于质控区6更靠近结合垫2，其中检测区5包被有检测蛋白印迹，质控区6包被有质控蛋白印迹。检测区5与质控区6之间间隔足够的距离，使得层析的样品能够分别与检测区5的检测蛋白印迹和质控区6的质控蛋白印迹相接触，并且互相不会干扰。检测区5更靠近于结合垫2，使得层析的样品在层析过程中，先与检测蛋白印迹接触，然后再与质控蛋白印迹接触。 

每个试纸条100上的检测蛋白印迹为‐种选自下列组的物质:CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹或RF‐(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性的IgG蛋白印迹，且不同试纸条上包被的蛋白印迹不同。这些检测蛋白印迹能够特异性结合其对应的抗体，如CCP蛋白印迹能够特异性结合抗CCP抗体，其中CCP为人工合成的多肽，改良形成了环化的瓜氨酸肽；RF‐IgM结合抗原蛋白印迹能够特异性结合RF‐IgM，RF‐IgG结合抗原蛋白印迹能够特异性的结合RF‐IgG,RF‐IgA结合抗原蛋白印迹能够特异性的结合RF‐IgA,RF是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体,包被的抗原一般为热变性的IgG.CP蛋白印迹能特异的结合抗CP抗体，CP主要包括聚丝蛋白，波形蛋白以及纤维蛋白原。可以通过常规的技术进行蛋白的生物表达和分离纯化,或者通过天然纯化，人工合成，从而获得这些蛋白以及多肽。 

聚丝蛋白的提取：参照FemIro—Peyret”的方法提取抗原。抗原提取自整形外科手术切除的正常人皮肤。上皮组织经EDTA处理后分离表皮与真皮，表皮组织放人组织匀浆液后离心，加乙醇后离心沉淀，干燥后蒸馏水再溶蛋白，离心后取上清即得部分纯化的聚丝蛋白抗原。见张丽君，艾脉兴，曾小峰等人表皮聚角蛋白微丝蛋白的提取及其在类风湿关节炎诊断中的应用,中华风湿病学杂志，2001，（6），350‐353。 

Sa抗原是一种波形蛋白，目前主要有重组表达的和天然纯化的两种。MCV为突变的瓜氨酸化波形蛋白，能特异性的结合抗MCV的抗体。见陈华等，Sa抗原相关蛋白质的研究，中华医学杂志，2006（27），1896-1900。 

瓜氨酸化的纤维蛋白原，是将人纤维蛋白原在体外催化形成瓜氨酸化的形式。赵义等抗瓜氨酸化的纤维蛋白原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义，北京大学学报（医学版），2006，（38），350-354。 

在某些实施方式中，在诊断试剂盒的盒体内放置有两条试纸条100，每条试纸条100上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹或 RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹，且不同试纸条100上包被的检测蛋白印迹不同。例如，两条试纸条上的检测蛋白印迹可以分别是CP蛋白印迹或RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹，或者两条试纸条上的检测蛋白印迹也可以分别是CCP蛋白印迹、RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹。 

在某些实施方式中，在诊断试剂盒的盒体内放置有三条试纸条100，每条试纸条100上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹或RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹且不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不同。例如，三条试纸条上的检测蛋白印迹可以分别是CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹和RF结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

在某些实施方式中，在诊断试剂盒的盒体内放置有四条试纸条100，每条试纸条100上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，其余三条为RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹。例如，一条试纸条100上的检测蛋白印迹是CP蛋白印迹，三条试纸条100上的检测蛋白印迹是RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹。 

在某些实施方式中，在诊断试剂盒的盒体内放置有五条试纸条100，一条试纸条100上的检测蛋白印迹为CP蛋白印迹，另一条试纸条100上的检测蛋白印迹为CCP蛋白印迹，其余三条试纸条100上的检测蛋白印迹为RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性的IgG蛋白印迹。 

上述检测蛋白印迹可以用适当的方法包被在检测膜3的检测区5上。具体方式是可以将检测蛋白溶于适当的缓冲液中，再通过固定、包被、吸附、喷涂、打印等方式包被在检测区。适当的缓冲液包括，硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Tris磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液等，其pH值可以为6.5～7.5或7.0～7.4。另外可以将含有检测蛋白的缓冲液与检测区接触一段时间，然后除去接触后的缓冲液。再例如，可以将含有检测蛋白的缓冲液喷洒在或涂布在检测区，再通过干燥等方式除去溶剂成分。再例如，可以将检测蛋白印在或压制在检测区。 

上述质控蛋白印迹为可与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者可与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。 

在某些实施方式中，试纸条100的结合垫2上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且质控蛋白印迹能够结合第二种胶体金标记的蛋白。质控蛋白可以是抗体。当第二种蛋白为抗体时，质控蛋白印迹还可以是葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白。 

使用与检测蛋白印迹相似的包被方法，可以将质控蛋白印迹包被在检测膜3的质控区6上。质控蛋白印迹可用于监测层析作用是否正常发生。如果质控蛋白印迹能够检测到金属标记物标记的蛋白，则表明样品已经从样品垫l经过结合垫2上，并带走了结合垫2上包被的金属胶体物标记的蛋白，然后继续移动到检测膜3。这说明该检测结果有效。如果质控蛋白印迹没有检测到任何信号，则提示试纸条可能没有正常工作，检测结果无效。 

检测区5上包被的检测蛋白印迹和质控区6上包被的质控蛋白印迹可以是任 何适当的形状。在某些实施方式中，检测蛋白印迹和/或质控蛋白印迹的形状为斑点状或条带状。在某些实施方式中，检测蛋白印迹和质控蛋白印迹都为斑点状或都为条带状。这里所说的斑点状可以是圆形、椭圆等规则形状或不规则形状。 

在某些实施方式中，样品垫1是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，结合垫2是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，检测膜3是由硝酸纤维素膜制成，支撑底板7由PVC板或其它硬质地而不吸水的材料制成。 

在某些实施方式中，试纸条100的吸水垫4可以是由吸收纸制成的片状物。玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布、吸收纸和硝酸纤维素膜都是己知的材料，本领域人员可以通过商业途径很容易地获得。这些材料的型号和规格可以根据实际需要进行选择。例如，适用的玻璃纤维的型号有Ahlstrom8964，Ahlstrom8975，GF-06和GF-08。适用的硝酸纤维素膜的型号可以包括Millipore135，Sartorius CN140和Vivid 170等。 

在某些实施方式中，每条试纸条还包括一个支撑底板7。在某些实施方式中，支撑底板7可以是平板，如图2所示。试纸条100的其他部分可以通过粘贴的方式固定在平板状的支撑底板7上，例如使用胶条粘贴在支撑底板7上。胶条可以是本领域公知的透明胶带或半透明胶带。再例如，也可以在支撑底板上涂覆有粘性的材料，再将试纸条100的其他部分粘贴在支撑底板7上。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒进一步在盒体内还放置有至少一个固定底座8，且至少一个固定底座8上固定有至少一条试纸条100。固定底座可以由塑料等合适的材料制成。在某些实施方式中，如图3(a)和3(b)所示，固定底座8的板面边缘司以设置有连续突起9，突起9在固定底座8上界定可容纳单条试纸条的容纳部20。尽管图示的由连续突起9界定的容纳部20为例如矩形的闭合图形，但本领域技术人员可以理解，还可以在固定底座8上形成不连续的点状、条状等合适形状的突起，并且由突起所界定的容纳部也可以是诸如"="、"C"形的非闭合图形。例如，可以在固定底座8的两个相对边缘分别设置两列点状突起，这两列点状突起在底座上界定可容纳单条试纸条的槽状容纳部。进一步，容纳部20的形状和/或尺寸可以与试纸条100相当。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒还可包括可与固定底座8配合的、与固定底座8数目相同的上盖10。如图4所示，每个上盖10均设有彼此分离的加样口11和观察窗口12。上盖10可以通过粘贴或扣合方式与设置有试纸条100的固定底座8相配合。在上盖10与固定底座8配合时，上盖10的加样口11位于试纸条100的样品垫I1上方，观察窗口12位于试纸条100上的检测膜3上方，优选露出检测膜3的检测区5和质控区6。因图5(a)和图5(b)示意性地显示了彼此配合的上盖10和设置有单条试纸条的固定底座8的结构。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒进一步在盒体内还放置有至少一个固定底座8'，至少一个固定底座8'上固定有至少两条试纸条100。例如，在盒体内还放置有一个固定底座8'，固定底座8'上设置有至少两条试纸条100。在某些实施方式中，至少一个固定底座8'或8"上固定有两条或五条试纸条100，且所有的试纸条100相互独立。在某些实施方式中，试纸条100可以是相互分离的。 

在某些实施方式中，固定底座8'或8"的板面上设有突起，其中试纸条100放置在由突起界定的、可容纳单条试纸条的容纳部20内。例如，固定底座8'的板面上可设置连续突起9'，突起9'界定至少两个可分别容纳单条试纸条100的容纳部20，使得两条试纸条100彼此分隔开。再例如，固定底座8"空旷的板面上可设置连续突起9"，突起9"界定两个到五个可分别容纳单条试纸条100的容纳部20，使得两条到五条试纸条100彼此分隔开。具体方式可以用粘贴的方式将试纸条100固定在各自的容纳部20内。图6(a)和图6(b)分别示出了带有两个容纳部20的设有连续突起9'的固定底座8'的俯视图和剖视图，图7(a)和图7(b)分别示出了带有三个容纳部20的设有连续突起9"的固定底座8"的俯视图和剖视图。同样地，本领域技术人员根据两个和三个容纳部的示例图可以很容易地知道带有四个、五个或更多容纳部的固定底座的结构。当然，固定底座8'或8"上的突起9'或9"也可以如上面介绍的那样，构造成多个点状、条状的突起，并且突起9'或9"所界定的各个容纳部的形状也可以是非封闭图形(例如槽状)。优选各个容纳部的形状和/或尺寸与试纸条100相当。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒还包括至少一个可与固定底座配套使用的上盖，每个上盖带有加样口和观察窗口，加样口位于试纸条100的样品垫上方，观察窗口位于试纸条100上的检测膜上方。例如，诊断试剂盒还可包括一个可与固定底座8'配合的上盖10'，上盖10'设有彼此分离的至少两个加样口11'，上盖10'可以粘贴或扣合的方式与固定底座8'配合。在上盖10'与设有至少两条试纸条100的固定底座8'盖合时，各个加样口11'分别位于对应试纸条100的样品垫l上方。在某些实施方式中，上盖10'还可包括至少两个彼此分离的观察窗口12'。在上盖10'与设有至少两条试纸条100的固定底座8'盖合时，各个观察窗口12'分别位于对应试纸条100的检测膜3上方，优选露出该检测膜3的检测区5和质控区6。图6(c)示出了带有两个加样口和两个观察窗口的上盖的俯视图，图7(c)示出了带有三个加样口和三个观察窗口的上盖的俯视图，同样地，本领域技术人员根据图6(c)和图7(c)可以很容易地知道带有四个、五个或更多加样口和观察窗口的上盖结构。本领域技术人员可以理解，至少两个彼此分离的观察窗口12'和12"也可以用一个连贯的观察窗口来替代，在上盖10'与设有至少两或三条试纸条100的固定底座8'和8"盖合时，该观察窗口12'和12"位于试纸条100的检测膜3上方，优选露出所有检测膜3的检测区5和质控区6。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒包括两个或两个以上的固定底座，其中每个固定底座上分别固定有至少一条试纸条100。在某些实施方式中，两个或两个以上的固定底座相互独立。例如，诊断试剂盒可以包括两个相互独立的固定底座，其中每一个都固定有至少一条试纸条100。再例如，诊断试剂盒可以包括两个相互独立的固定底座，其中一个固定有至少两条试纸条100，另一个固定有至少一条试纸条100。再例如，诊断试剂盒可以包括三个相互独立的固定底座，其中两个固定底座分别固定有两条试纸条100，另一个固定有一条试纸条100。例如，诊断试剂盒可以包括五个相互独立的固定底座，其中每个固定底座分别国定有一条试纸条100。在某些实施方式中，诊断试剂盒还包括有可与固定底座配套使用的上盖，上盖带有加样口和观察窗口，加样口位于试纸条100的样品垫上方，观察窗口位于 试纸条100上的检测膜上方。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒中的至少两条试纸条100相互平行。在某些实施方式中，设置在固定底座8'上的至少两条试纸条100的检测区5和/或质控区6基本上排列在同一直线上，即至少两条试纸条100的检测区5基本上排列在一条直线上，和/或质控区6基本上排列在同一条直线上。在某些实施方式中，至少两条试纸条100在固定底座8'上平行排列。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒进一步包括一种或多种选自下组的组成部分：固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管和样品稀释液。滴管可用于吸取液体样品，并可用于将液体样品滴加到样品垫1。干燥剂可以保持试剂盒的湿度在适当的范围。说明书上写有使用方法、保存方法、生产批号等信息。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒还可以包括至少一个避光、密封的塑料袋，其中装有诊断试剂盒。 

在某些实施方式中，诊断试剂盒能够用于检测抗瓜氨酸化蛋白抗体、抗CCP抗体、RF-（IgM,IgA,IgG）。例如，诊断试剂盒可用于检测样品中是否存在一种或多种上述抗体。如果样品中存在一种或多种上述抗体，其可以在样品层析过程中被检测膜上的对应的检测蛋白捕获，从而在检测区被检测到。 

在某些实施方式中，本申请提供的诊断试剂盒可用于帮助诊断疾病。 

在某些实施方式中，本申请提供的诊断试剂盒可用于帮助诊断类风湿关节炎。 

RF因子和抗瓜氨酸蛋白/肽抗体是类风湿关节炎的特异性抗体，其检测特异性高。具有确诊意义。通过检测样品中是否存在RF因子以及抗瓜氨酸蛋白/肽抗体，可以辅助诊断样品来源者是否患有类风湿关节炎。 

本申请提供的试剂盒可以对类风湿关节炎的多项血清学指标同时进行联检，有助于类风湿关节炎的早期的确诊，以避免误诊和漏诊。 

在某些实施方式中，如果检测到样品中存在RF因子和抗瓜氨酸蛋白/肽抗体中的一种或两种，则提示样品来源者可能患有类风湿关节炎。 

在某些实施方式中，如果检测到样品中不存在抗CCP抗体，抗瓜氨酸蛋白抗体(包括抗MCV抗体，APF等)以及RF-（IgM,IgA,IgG）中的任一种，则提示样品来源者可能不患有类风湿关节炎。 

本申请中请提供的诊断试剂盒使用胶体金免疫层析法。该方法是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为回相，通过毛细效应使样品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的(Sikowicz G et a l.On e-step chromatographic imm uno assay for qual ita tive determin ation of choricogonadotropin in u rine.Clin Chem.1990(36)1579-1586.)。使用时只需将样品加样到样品垫上，数分钟就根据检测线上条带出现情况来判断阴阳性结果。与其他检测方法相比，检测时间短，只需要5～10分钟，操作人员无需培训，不受场地人员之限，操作简便、快速，无需低温保存，储运 方便等优势。 

此外该试纸具有高特异性、高灵敏度、高准确度，能满足临床快速检测类风湿关节炎，为病人及早诊断治疗提供条件，同时，也能满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。因此，本申请提供的诊断试剂盒与现有产品相比具有明显的优势。 

示范例1 

试剂盒的结构 

本示范例中提供了一个诊断试剂盒，其包括五个如图l所示的试纸条100，其中每一条试纸条100都包括依次搭接在支撑底板7上的样品垫1、结合垫2、检测膜3和吸水垫4。每条试纸条100的结合垫2上都包被有胶体金标记的抗人抗体（IgG，IgM和IgA），以及胶体金标记的兔IgG。每条试纸条100的检测膜3上都设有彼此分离的检测区5和质控区6，且检测区5比所述质控区6更靠近于结合垫2。检测区5包被有检测蛋白印迹，质控区6包被有质控蛋白印迹。五条试纸条100上的检测蛋白印迹，分别为CP,CCP,RF-IgM,RF-IgG,RF-IgA结合抗原。每条试纸条100的质控蛋白印迹相同，都为羊抗兔IgG。 

诊断试剂盒还包括一个如图6所示的固定底座8'和上盖10'。固定底座8'上的突起9'界定两个可容纳并分隔试纸条100的容纳部20，两条试纸条100平行排列地分别放置在容纳部20内，且两条试纸条100检测膜3上的检测区5基本上在同一直线上，两条试纸条100质控区6也基本上在同一直线上。 

上盖10'扣合在固定底座8'上后，上盖10'上的加样口11'分别正对每条试纸条100的样品垫1。检测窗口12'分别正对每条试纸条100的检测膜3。诊断试剂盒还可含有未图示的滴管、干燥剂、说明书、颜色标签、样品收集管和样品稀释液。 

用试剂盒进行检测的方法 

用上述示范例中的试剂盒进行人体样品的检测。收集来源于临床的200份确诊为类风湿关节炎患者的样本。对于每一个患者的样品，用滴管吸取适量样品，分别滴加到五个加样口。室温条件下静置5分钟后，观察并记录结果。 

用上述示范例中的诊断试剂盒进行人体样品的检测。收集来源于临床的200份健康献血者和对照疾病患者（非类风湿关节炎病人，其它风湿病患者包括系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和混合性结缔组织病等）。对于每一个患者的样品，用滴管吸取适量样品，分别滴加到五个加样口。室温条件下静置5分钟后，观察并记录结果。 

对200份类风湿关节炎确诊患者的血清的检测结果进行统计和分析，以验证本试剂盒对类风湿关节炎诊断的敏感性。统计类风湿关节炎的检测结果，见表2。 

对于每个联检指标的诊断灵敏性:诊断灵敏性(%)=阳性结果样品数/测试样品总数x100%。结果见表2。 

在被检的200份样品中，只要联检指标中任一检测为阳性，则该样品被判断为类风湿关节炎患者样品。结果显示，本试剂盒对RA患者的诊断率可达95%。 

统计用本试剂盒检测得到的阴性和阳性结果，并根据公式计算对于被检抗体 的诊断特异性.诊断特异性(%)=阴性结果样品数/测试样品总数x100%。结果显示，示范例l的试剂盒，抗瓜氨酸化蛋白抗体的特异性达到90%以上，抗CCP抗体的特异性达到98%以上，特异性较高，而RF因子的特异性较低，只有80%，但是通过对RF因子两种分型同时为阳性认定为阳性，特异性提高到90%以上。 

表2 

结果显示，示范例1中的试剂盒对联合检测指标的诊断特异性有所提高，且敏感性也明显提高。 

Claims (24)

1.一种用于诊断类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括盒体，其特征在于，在所述盒体内放置有至少两条试纸条，每条试纸条均包括依次搭接在支撑底板上的样品垫、结合垫、检测膜和吸水垫； 

每一试纸条的所述结合垫上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白； 

每一试纸条的所述检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹； 

每一试纸条的所述检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹； 

每一试纸条的所述检测膜的检测区上的所述检测蛋白印迹与所述质控区上的质控蛋白印迹彼此分离； 

其中至少有一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹与其它条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹不相同。 

2.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述样品垫是由玻璃纤维、酯聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述结合垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述检测膜是由硝酸纤维素膜制成；所述支撑底板由硬质地而不吸水的材料制成。 

3.如权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述支撑底板由PVC板制成。 

4.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测蛋白印迹为斑点状或条带状。 

5.如权利要求1或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述质控蛋白印迹的形状为斑点状或条带状。 

6.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为斑点状。 

7.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为条带状。 

8.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，每条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹、CCP蛋白印迹或RF-(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

9.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条为两条，两条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性IgG蛋白印迹，但两条试纸条上的的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹的物质不相同。 

10.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条为三条，三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，RF-（IgM,IgA,IgG）结合抗原变性IgG蛋白印迹，但三条试纸条上的的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹的物质均不相同。 

11.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条为四条，其中一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质:CP蛋白印迹或CCP蛋白印迹，其余三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为RF-(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

12.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条为五条，其中一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为CP蛋白印迹，一条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为CCP蛋白印迹，其余三条试纸条上的所述检测膜的检测区上包被的检测蛋白印迹为RF-(IgM,IgA,IgG)结合抗原变性IgG蛋白印迹。 

13.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述质控蛋白印迹中的质控蛋白为与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者为与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。 

14.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条的结合垫上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹中的质控蛋白为能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。 

15.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒进一步包括放置在所述盒体内的至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述至少两条试纸条。 

16.如权利要求15所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述至少一个固定底座上固定有两个到五个所述试纸条，且所述试纸条相互独立。 

17.如权利要求15所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单条试纸条的容纳部内。 

18.如权利要求17所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述容纳部为至少两个。 

19.如权利要求17所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述固定底座为两个或两个以上，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。 

20.如权利要求15所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。 

21.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述至少两条试纸条相互平行放置。 

22.如权利要求21所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条的检测膜上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。 

23.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自下组的组成部分：固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、样品稀释液。 

24.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫。 

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