CN117110603A - 联合检测抗mcv抗体、抗ccp抗体和rf的荧光免疫层析试纸条 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于类风湿性关节炎检测的荧光免疫层析试纸条,所述试纸条包括上样区、检测区和吸水区;所述检测区包括固定有突变型瓜氨酸波形蛋白的第一子检测区、固定有环瓜氨酸肽的第二子检测区和固定有变性人IgG的第三子检测区。
Description
技术领域
本申请涉及医学检验技术领域,具体是同时检测抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(Anti-MCV)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)和类风湿因子(RF)的荧光免疫层析试纸条及其应用。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、系统性自身免疫病。除关节炎及周围组织受累外,亦可出现皮下结节、贫血、肺间质病变和血管炎等关节外表现。未经治疗的RA可出现明显的关节损失,并进展为肢体残疾和功能丧失,给患者家庭和社会带来巨大的经济负担。随着对RA发病机制认识的不断深入及大量高质量临床试验的开展,RA的治疗策略不断更新,诊治水平亦得到快速提高。自身抗体可在RA患者表现出临床典型症状前产生,并且具有一定的预测价值,因而在RA早期诊断、治疗监测以及预后评估中有重要应用价值。其中,类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸化肽/蛋白抗体(ACPA)因具有较好的诊断性能被纳入2010年美国风湿病学会(ACR)、欧洲抗风湿病联盟(EULAR)及我国RA分类标准,目前在临床上广泛应用,亦成为临床实验室最常见的自身抗体检测项目之一。其他抗体对RA具有一定的补充诊断价值,可作为联合诊断指标用于临床。
RF是最早用于诊断RA的血清学指标,也是目前临床上最常用指标,其敏感性高但特异性较差,在一些其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染患者甚至正常人中也有一定的阳性率。ACPA是一类以瓜氨酸类蛋白为靶抗原的自身抗体,包括抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)和抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(Anti-MCV)等。APF和AKA虽然特异性较高,但据需采用免疫荧光方法检测,其结果判断易受个人主观影响,且敏感性较差。Anti-CCP和Anti-MCV具有较高的特异性和敏感性,有报道Anti-CCP阴性RA患者血清可检测到Anti-MCV,显示Anti-MCV特异性稍高于Anti-CCP,但其敏感性不如Anti-CCP。RF、Anti-CCP、Anti-MCV三项指标诊断RA的敏感性依次为Anti-CCP>RF>Anti-MCV;特异性为Anti-MCV>Anti-CCP>RF。
RF常用的检测方法为化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法或免疫比浊法,Anti-CCP目前主要用化学发光免疫分析法、酶联免疫法进行检测,Anti-MCV目前主要用酶联免疫法进行检测。这些方法学具有快速、自动化、定量检测及变异系数小等特点,但是操作比较复杂、耗时较长,不利于快速便捷检测。
免疫层析(immunochromatography)是一种快速诊断技术,具有精确、快速和操作简单等优点。常用的标记材料主要有胶体金、荧光材料等。胶体金主要通过自身颜色进行肉眼观察检测结果,但是对于某些抗原或抗体含量极低的样品,胶体金的颜色很浅且很难用肉眼来判断结果,灵敏度低,且很难实现高灵敏定量检测。而荧光材料则具体荧光强度高,可实现高灵敏定量检测。
发明内容
本申请的目的之一在于提供同时检测抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(Anti-MCV)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)和类风湿因子(RF)的荧光免疫层析试纸条,为临床诊断分析提供一种灵敏度高、特异性好、稳定性强且方便快捷的试剂盒,可以大大提高检测及诊断效率,以解决现有技术中的问题。
本申请中,MCV的瓜氨酸突变位点的选择与CCP不同,因此能很好地区分抗CCP抗体和抗MCV抗体,而不会出现交叉反应,解决了CCP和MCV之间的干扰问题。
本申请的第一方面提供了一种用于类风湿性关节炎检测的荧光免疫层析试纸条,所述试纸条包括上样区、检测区和吸水区;所述检测区包括固定有突变型瓜氨酸波形蛋白的第一子检测区、固定有环瓜氨酸肽的第二子检测区和固定有变性人IgG的第三子检测区;其中所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被量独立地为0.15-0.75μg;所述突变型瓜氨酸波形蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1;所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2;所述上样区含有质量比为20:10:1的荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括底板。
在一些实施方案中,上样区分为样品区和标记区,所述样品区用于接收样品,并且所述标记区用于包被荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
在一些实施方案中,所述荧光材料选自异硫氰酸荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、藻红蛋白、荧光聚苯乙烯微球、时间分辨微球、上转换发光微粒和量子点微球。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括质控区,所述质控区按照样品在试纸条上的流动方向位于第一检测区、第二检测区或第三检测区的下游。
在一些实施方案中,所述质控区包被有兔IgG,所述兔IgG的包被量为0.15-0.75μg。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,上样区、检测区和吸水区由上游至下游排列。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL。
本申请的第二方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括第一方面所述的荧光免疫层析试纸条和说明书。
本申请的第三方面提供了第一方面所述的荧光免疫层析试纸条在制备用于类风湿性关节炎检测的试剂盒中的用途。
附图说明
图1示出了一种荧光免疫层析试纸条的示意图。其中1为上样区,2为检测区,3至5为子检测区,6为质控区,7为吸水区,8为底板。
图2示出了另一种荧光免疫层析试纸条的示意图。其中1为底板,2为样品区,3为标记区,4为检测区,5至7为子检测区,8为质控区,9为吸水区。
图3为荧光免疫层析法与胶体金法的灵敏度比较。
序列说明
SEQ ID NO:1为突变型瓜氨酸波形蛋白的氨基酸序列,其中X为瓜氨酸(Citrulline,Cit)。
SEQ ID NO:2为环瓜氨酸肽的氨基酸序列,其中C3与C16之间存在二硫键,X为瓜氨酸(Citrulline,Cit)。
SEQ ID NO:1
MSTXSVSSSSYRGMFGXPGTASGPSSSXSYVTTSTRTYSLXSALGPSTS
XSLYASSPGRVYATGSSYVXLRSSVPXVGLLQDSVDFSLADAINTEFKN
TRTNEKVELQELNDRFANYIDKVRFLEQQNKILLAELEQLKGQGKSXL
GDLYEEEMRELRXQVDQLTNDKARVEVERDNLAEDIMXLREKLQEE
MLQREEAENTLQSFRQDVDNASLAXLDLERKVESLQEEIAFLKKLHE
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KGTNESLERQMREMEENFAVEAANYQDTIGGLQDEIQNMKEEMAGH
LREYQDLLNVKMALDIEIATYGKLLEGEESRISLPLPNFSSLNLGETNL
DSLPLVDTHSKXTLLIKTVETRDRQVINETSQHXDDLEGHHHHHH
SEQ ID NO:2
HQCHQSSTGXHRHGRCGRTGS
具体实施方式
本申请的目的之一为同时检测抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(Anti-MCV)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)和类风湿因子(RF),通过荧光免疫层析法原理进行检测。
Anti-MCV采取间接法检测原理,待测样品中所含的Anti-MCV,首先与上样区上的偶联了羊抗人IgG的荧光材料结合,通过层析作用被固定在检测区(例如,硝酸纤维膜)上的重组MCV(T线,其可以是T1线、T2线或T3线)捕获,T线荧光信号可被配套仪器定量检测,荧光强度与样品中的Anti-MCV浓度呈正相关,经仪器计算可定量显示样品中Anti-MCV的浓度。
Anti-CCP采取间接法检测原理,待测样品中所含的Anti-CCP,首先与上样区上的偶联了羊抗人IgG的荧光材料结合,通过层析作用被固定在检测区(例如,硝酸纤维膜)上的重组CCP(T线,其可以是T1线、T2线或T3线)捕获,T线荧光信号可被配套仪器定量检测,荧光强度与样品中的Anti-CCP浓度呈正相关,经仪器计算可定量显示样品中Anti-CCP的浓度。
RF采取双抗原夹心法检测原理,待测样品中所含的RF,首先与上样区上的偶联了变性人IgG的荧光材料结合,通过层析作用被固定在检测区(例如,硝酸纤维膜)上的变性人IgG(T线,其可以是T1线、T2线或T3线)捕获,T线荧光信号可被配套仪器定量检测,荧光强度与样品中的RF浓度呈正相关,经仪器计算可定量显示样品中RF的浓度。
本申请的第一方面提供了一种用于类风湿性关节炎检测的荧光免疫层析试纸条,所述试纸条包括上样区、检测区和吸水区;所述检测区包括固定有突变型瓜氨酸波形蛋白的第一子检测区、固定有环瓜氨酸肽的第二子检测区和固定有变性人IgG的第三子检测区;其中所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被量独立地为0.15-0.75μg;所述突变型瓜氨酸波形蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1;所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2;所述上样区含有质量比为20:10:1的荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
在一些实施方案中,荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG混合后以4μL/cm喷垫。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,上样区、检测区和吸水区由上游至下游排列。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL,以1.0μL/cm划线。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第一子检测区、第二子检测区、第三子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第一子检测区、第三子检测区、第二子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第二子检测区、第一子检测区、第三子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第二子检测区、第三子检测区、第一子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第三子检测区、第一子检测区、第二子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,第三子检测区、第二子检测区、第一子检测区由上游至下游顺序排列。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白的包被量为0.15μg、0.155μg、0.16μg、0.165μg、0.17μg、0.175μg、0.18μg、0.185μg、0.19μg、0.195μg、0.2μg、0.205μg、0.21μg、0.215μg、0.22μg、0.225μg、0.23μg、0.235μg、0.24μg、0.245μg、0.25μg、0.255μg、0.26μg、0.265μg、0.27μg、0.275μg、0.28μg、0.285μg、0.29μg、0.295μg、0.3μg、0.305μg、0.31μg、0.315μg、0.32μg、0.325μg、0.33μg、0.335μg、0.34μg、0.345μg、0.35μg、0.355μg、0.36μg、0.365μg、0.37μg、0.375μg、0.38μg、0.385μg、0.39μg、0.395μg、0.4μg、0.405μg、0.41μg、0.415μg、0.42μg、0.425μg、0.43μg、0.435μg、0.44μg、0.445μg、0.45μg、0.455μg、0.46μg、0.465μg、0.47μg、0.475μg、0.48μg、0.485μg、0.49μg、0.495μg、0.5μg、0.505μg、0.51μg、0.515μg、0.52μg、0.525μg、0.53μg、0.535μg、0.54μg、0.545μg、0.55μg、0.555μg、0.56μg、0.565μg、0.57μg、0.575μg、0.58μg、0.585μg、0.59μg、0.595μg、0.6μg、0.605μg、0.61μg、0.615μg、0.62μg、0.625μg、0.63μg、0.635μg、0.64μg、0.645μg、0.65μg、0.655μg、0.66μg、0.665μg、0.67μg、0.675μg、0.68μg、0.685μg、0.69μg、0.695μg、0.7μg、0.705μg、0.71μg、0.715μg、0.72μg、0.725μg、0.73μg、0.735μg、0.74μg、0.745μg、0.75μg或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白的包被浓度为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述环瓜氨酸肽的包被量为0.15μg、0.155μg、0.16μg、0.165μg、0.17μg、0.175μg、0.18μg、0.185μg、0.19μg、0.195μg、0.2μg、0.205μg、0.21μg、0.215μg、0.22μg、0.225μg、0.23μg、0.235μg、0.24μg、0.245μg、0.25μg、0.255μg、0.26μg、0.265μg、0.27μg、0.275μg、0.28μg、0.285μg、0.29μg、0.295μg、0.3μg、0.305μg、0.31μg、0.315μg、0.32μg、0.325μg、0.33μg、0.335μg、0.34μg、0.345μg、0.35μg、0.355μg、0.36μg、0.365μg、0.37μg、0.375μg、0.38μg、0.385μg、0.39μg、0.395μg、0.4μg、0.405μg、0.41μg、0.415μg、0.42μg、0.425μg、0.43μg、0.435μg、0.44μg、0.445μg、0.45μg、0.455μg、0.46μg、0.465μg、0.47μg、0.475μg、0.48μg、0.485μg、0.49μg、0.495μg、0.5μg、0.505μg、0.51μg、0.515μg、0.52μg、0.525μg、0.53μg、0.535μg、0.54μg、0.545μg、0.55μg、0.555μg、0.56μg、0.565μg、0.57μg、0.575μg、0.58μg、0.585μg、0.59μg、0.595μg、0.6μg、0.605μg、0.61μg、0.615μg、0.62μg、0.625μg、0.63μg、0.635μg、0.64μg、0.645μg、0.65μg、0.655μg、0.66μg、0.665μg、0.67μg、0.675μg、0.68μg、0.685μg、0.69μg、0.695μg、0.7μg、0.705μg、0.71μg、0.715μg、0.72μg、0.725μg、0.73μg、0.735μg、0.74μg、0.745μg、0.75μg或上述任意数值之间的范围。在一些实施方案中,所述环瓜氨酸肽的包被浓度为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述变性人IgG的包被量为0.15μg、0.155μg、0.16μg、0.165μg、0.17μg、0.175μg、0.18μg、0.185μg、0.19μg、0.195μg、0.2μg、0.205μg、0.21μg、0.215μg、0.22μg、0.225μg、0.23μg、0.235μg、0.24μg、0.245μg、0.25μg、0.255μg、0.26μg、0.265μg、0.27μg、0.275μg、0.28μg、0.285μg、0.29μg、0.295μg、0.3μg、0.305μg、0.31μg、0.315μg、0.32μg、0.325μg、0.33μg、0.335μg、0.34μg、0.345μg、0.35μg、0.355μg、0.36μg、0.365μg、0.37μg、0.375μg、0.38μg、0.385μg、0.39μg、0.395μg、0.4μg、0.405μg、0.41μg、0.415μg、0.42μg、0.425μg、0.43μg、0.435μg、0.44μg、0.445μg、0.45μg、0.455μg、0.46μg、0.465μg、0.47μg、0.475μg、0.48μg、0.485μg、0.49μg、0.495μg、0.5μg、0.505μg、0.51μg、0.515μg、0.52μg、0.525μg、0.53μg、0.535μg、0.54μg、0.545μg、0.55μg、0.555μg、0.56μg、0.565μg、0.57μg、0.575μg、0.58μg、0.585μg、0.59μg、0.595μg、0.6μg、0.605μg、0.61μg、0.615μg、0.62μg、0.625μg、0.63μg、0.635μg、0.64μg、0.645μg、0.65μg、0.655μg、0.66μg、0.665μg、0.67μg、0.675μg、0.68μg、0.685μg、0.69μg、0.695μg、0.7μg、0.705μg、0.71μg、0.715μg、0.72μg、0.725μg、0.73μg、0.735μg、0.74μg、0.745μg、0.75μg或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述变性人IgG的包被浓度为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述变性人IgG的变性条件为60℃水浴30分钟。
在一些实施方案中,荧光材料包括但不限于异硫氰酸荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、藻红蛋白、荧光聚苯乙烯微球、时间分辨微球、上转换发光微粒和量子点微球。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括底板。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括质控区,所述质控区按照样品在试纸条上的流动方向位于第一子检测区、第二子检测区或第三子检测区的下游。
在一些实施方案中,所述质控区包被有兔IgG。
在一些实施方案中,所述兔IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL。
在一些实施方案中,所述兔IgG的包被量为0.15μg、0.155μg、0.16μg、0.165μg、0.17μg、0.175μg、0.18μg、0.185μg、0.19μg、0.195μg、0.2μg、0.205μg、0.21μg、0.215μg、0.22μg、0.225μg、0.23μg、0.235μg、0.24μg、0.245μg、0.25μg、0.255μg、0.26μg、0.265μg、0.27μg、0.275μg、0.28μg、0.285μg、0.29μg、0.295μg、0.3μg、0.305μg、0.31μg、0.315μg、0.32μg、0.325μg、0.33μg、0.335μg、0.34μg、0.345μg、0.35μg、0.355μg、0.36μg、0.365μg、0.37μg、0.375μg、0.38μg、0.385μg、0.39μg、0.395μg、0.4μg、0.405μg、0.41μg、0.415μg、0.42μg、0.425μg、0.43μg、0.435μg、0.44μg、0.445μg、0.45μg、0.455μg、0.46μg、0.465μg、0.47μg、0.475μg、0.48μg、0.485μg、0.49μg、0.495μg、0.5μg、0.505μg、0.51μg、0.515μg、0.52μg、0.525μg、0.53μg、0.535μg、0.54μg、0.545μg、0.55μg、0.555μg、0.56μg、0.565μg、0.57μg、0.575μg、0.58μg、0.585μg、0.59μg、0.595μg、0.6μg、0.605μg、0.61μg、0.615μg、0.62μg、0.625μg、0.63μg、0.635μg、0.64μg、0.645μg、0.65μg、0.655μg、0.66μg、0.665μg、0.67μg、0.675μg、0.68μg、0.685μg、0.69μg、0.695μg、0.7μg、0.705μg、0.71μg、0.715μg、0.72μg、0.725μg、0.73μg、0.735μg、0.74μg、0.745μg、0.75μg或上述任意数值之间的范围。
在一些实施方案中,所述兔IgG的包被浓度为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL或上述任意数值之间的范围。
上样区上包被的羊抗兔IgG的荧光材料能够通过层析作用被固定在检测区(例如,硝酸纤维膜)上的兔IgG(C线,质控线)捕获,C线荧光信号可被配套仪器定量检测,实现了质控作用。
本申请的第二方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括第一方面所述的荧光免疫层析试纸条和说明书。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括底板。
在一些实施方案中,上样区分为样品区和标记区,所述样品区用于接收样品,并且所述标记区用于包被荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
在一些实施方案中,所述荧光材料选自异硫氰酸荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、藻红蛋白、荧光聚苯乙烯微球、时间分辨微球、上转换发光微粒和量子点微球。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括质控区,所述质控区按照样品在试纸条上的流动方向位于第一检测区、第二检测区或第三检测区的下游。
在一些实施方案中,所述质控区包被有兔IgG,所述兔IgG的包被量为0.15-0.75μg。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,上样区、检测区和吸水区由上游至下游排列。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL。
本申请的第三方面提供了第一方面所述的荧光免疫层析试纸条在制备用于类风湿性关节炎检测的试剂盒中的用途。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括底板。
在一些实施方案中,上样区分为样品区和标记区,所述样品区用于接收样品,并且所述标记区用于包被荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
在一些实施方案中,所述荧光材料选自异硫氰酸荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、藻红蛋白、荧光聚苯乙烯微球、时间分辨微球、上转换发光微粒和量子点微球。
在一些实施方案中,所述荧光免疫层析试纸条还包括质控区,所述质控区按照样品在试纸条上的流动方向位于第一检测区、第二检测区或第三检测区的下游。
在一些实施方案中,所述质控区包被有兔IgG,所述兔IgG的包被量为0.15-0.75μg。
在一些实施方案中,按照样品在试纸条上的流动方向,上样区、检测区和吸水区由上游至下游排列。
在一些实施方案中,所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL。
T/C值的含义为仪器读取检测线(T线)的信号值与质控线(C线)的信号值的比值。这种计算方式能有效提高检测结果的精密度。例如,单独统计检测线T的信号值时其变异系数为10.81%,而用T/C计算变异系数下降至4.11%。变异系数越低代表检测结果的精密度越好,试剂越可靠。
表1:使用T/C值计算变异系数
本申请的定量检测突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(Anti-MCV)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)和类风湿因子(RF)的荧光免疫层析试纸条设有Anti-MCV、Anti-CCP和RF的检测线,能够通过一次加样同步检测人全血、血浆、血清中Anti-MCV、Anti-CCP和RF三个指标,操作简单,能减少试剂及耗材的成本。同时可弥补单项指标诊断RA的不足,有助于提高诊断RA的准确性,减少误诊和漏诊。
实施例
将通过具体实例的方式更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的,且并不旨在以任何方式限制本申请。本领域技术人员将容易认识到各种非关键参数,这些参数可以被改变或修改以产生基本上相同的结果。
实施例1:定量联合检测抗MCV抗体、抗CCP抗体和RF的荧光免疫层析试纸条的制备
(a)荧光材料的处理:
将荧光材料溶解在pH为8.0的磷酸(PB)缓冲溶液中,待荧光材料充分重悬后,往其中加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC),混合均匀,再加入与EDC等量的稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),混合均匀,室温条件下孵育2h,然后14000rpm高速离心30min,弃去上清液,沉淀用pH为7.0的磷酸(PB)缓冲溶液清洗沉淀并复溶,EDC和NHS的浓度均为10mg/mL;
(b)抗体标记:
往步骤(a)所得的荧光材料中加入羊抗人IgG,混合均匀,不断搅拌,4℃下过夜反应,反应结束后14000rpm高速离心30min,弃去上清液,沉淀用pH为7.0的磷酸(PB)缓冲溶液清洗沉淀并复溶,即得荧光材料标记的羊抗人IgG;
往步骤(a)所得的荧光材料溶液中加入变性人IgG,混合均匀,不断搅拌,4℃下过夜反应,反应结束后14000rpm高速离心30min,弃去上清液,沉淀用pH为7.0的磷酸(PB)缓冲溶液清洗沉淀并复溶,即得荧光材料标记的变性人IgG;
往步骤(a)所得的荧光材料溶液中加入羊抗兔IgG,混合均匀,不断搅拌,4℃下过夜反应,反应结束后14000rpm高速离心30min,弃去上清液,沉淀用pH为7.0的磷酸(PB)缓冲溶液清洗沉淀并复溶,即得荧光材料标记的羊抗兔IgG;
(c)上样区的制备:将步骤(b)所得到的荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG以20:10:1的比例包被在上样区上,然后37℃干燥24h;其中荧光材料标记的羊抗人IgG的包被浓度为2%(体积百分比,即荧光材料标记的的羊抗人IgG的体积与配液总体积之比),与其它两种标记物混匀后4μL/cm喷垫;荧光材料标记的变性人IgG的包被浓度为1%,与其它两种标记物混匀后4μL/cm喷垫;荧光材料标记的羊抗兔IgG的包被浓度为0.1%与其它两种标记物混匀后4μL/cm喷垫
(d)检测区(2)的制备(以图1所示为例):
检测线的制备:将重组MCV(如SEQ ID NO:1所示)、重组CCP(如SEQ ID NO:2所示)和变性人IgG均稀释至浓度为1mg/ml,以1.0μL/cm分别在检测区上的第一子检测线(3)、第二子检测线(4)和第三子检测线(5)处划线;
划线用量为1.0μL/cm,溶液浓度为1mg/ml,切条宽度为0.4cm,检测线包被的蛋白量为约0.4μg。
质控线(6)的制备:将浓度为1mg/mL的兔IgG以1μL/cm在检测区上的质控线(6)处划线;
将上述包被好的检测区(硝酸纤维素膜)37℃干燥24h,干燥结束后,取出硝酸纤维素膜进行密封干燥保存;
(e)组装:
在底板(8)上先粘贴步骤(d)所得的层析膜(2),然后在层析膜(2)靠第一检测线(3)的一端粘贴上样区(1),在层析膜(2)靠质控线(6)的一端粘贴吸水纸(7),将粘贴好的底板(8)裁切成长为3.5mm的试纸条,然后装入塑料卡壳中,压紧后即为试剂盒,试剂盒在湿度低于30%的环境下进行组装。
实施例2:定量联合检测抗MCV抗体、抗CCP抗体和RF的荧光免疫层析试纸条的另一种制备
(a)试剂准备
1)时间分辨微球
2)羊抗人IgG、变性人IgG、羊抗兔IgG(使用前30分钟,从冰箱拿出,回温到室温)。
3)活化剂EDC、Sulfo-NHS(EDC干燥环境小管分装,开盖时间短,称量后封口膜封口,-20℃保存;Sulfo-NHS 4℃保存;使用前30分钟,从冰箱拿出,回温到室温)。
4)活化液Buffer A(0.05M/L的MES pH6.0)
5)反应液Buffer B(0.05M/L的MES pH6.5)
6)封闭液Buffer C(0.05M/L的TRIS-HCl+1%W/V BSA pH8.0)
7)保存液Buffer D(0.05M/L的TRIS-HCl+1%W/V BSA+10%W/V海藻糖pH8.0)
(b)标记过程
1%微球可稀释10倍、5倍或原始倍等不同浓度标记,即反应过程微球浓度可为1mg/mL、2mg/mL或10mg/mL;三种浓度下的灵敏度差异不大,但原始倍标记容易团聚;大于2mg/mL,则微球浓度高,反应过程分散情况不易观察,因此,优先选择稀释10倍,微球使用溶度为1mg/mL。
1)清洗微球
取50μL的1%微球加入到1.5mL离心管中,再加入活化液Buffer A450μL,1000rpm震荡1min,然后14800rpm离心30min,取掉上清,加入400μL活化液Buffer A,复融(必要时可采用超声分散),清洗1次。
2)活化微球
使用活化液Buffer A配制10mg/mL的EDC及Sulfo-NHS溶液,如称取1mg EDC,用100μL Buffer A溶解(现配现用)。在清洗后的微球中先后加入50μL Sulfo-NHS溶液和50μLEDC溶液,即EDC、NHS使用溶度为1mg/mL,置于漩涡振荡器上1000rpm震荡活化30min。
3)活化后清洗
活化后清洗、溶液更换为反应液Buffer B:
(1)活化后,14800rpm离心20min,取掉上清,加入500μL反应液Buffer B,复融(必要时可采用超声分散),清洗1次。
(2)清洗后,14800rpm离心20min,取掉上清,加入500μL反应液Buffer B,复融(必要时可采用超声分散)。
4)偶联抗体
加入抗体至复溶后的微球中,旋转混合反应2h。不同抗体标记浓度范围为0.02-0.1mg/mg,即每1mg微球加入抗体0.02-0.1mg。
抗体体积量=抗体标记浓度X微球质量/抗体浓度。
5)封闭
偶联反应2.0h后,14800rpm离心20min,取掉上清,加入500μL封闭液Buffer C,复融(必要时可采用超声分散),置于旋转培养器上旋转混合封闭60min。
6)清洗保存
封闭后,14800rpm离心20min,取掉上清,加入250μL保存液Buffer D(微球终浓度2mg/mL),复融(必要时可采用超声分散)。重悬后,于2-8℃保存备用。
(c)上样区制备:
上述步骤所得到的荧光材料标记羊抗人IgG、荧光材料标记变性人IgG和荧光材料标记羊抗兔IgG以20:10:1的比例包被在上样区上,然后37℃干燥24h。
实施例3:定量联合检测抗MCV抗体、抗CCP抗体和RF的荧光免疫层析试纸条的另一种制备(以图2所示为例)
1)PVC板(1):表面涂有不干胶,起支撑与固定作用。
2)样品区(2):成分为玻纤,经过含缓冲剂、抗红细胞抗体、表面活性剂、糖等成分的溶液喷涂处理,起到缓冲与红细胞等干扰物质分离作用。
3)标记区(3):成分为玻纤聚酯等,含羊抗体IgG荧光微球标记物、变性人IgG荧光微球标记物、羊抗兔IgG荧光微球标记物的溶液喷涂处理。
4)检测区(4):硝酸纤维素膜,层析反应的载体,上面依次包被有第一检测线、第二检测线、第三检测线、质控线。
5)第一检测线(5、6或7):包被于NC膜上,含有重组MCV蛋白(如SEQ ID NO:1所示),用于检测抗MCV抗体。
6)第二检测线(5、6或7):包被于NC膜上,含有重组CCP蛋白(如SEQ ID NO:2所示),用于检测抗CCP抗体。
7)第三检测线(5、6或7):包被于NC膜上,含有变性人IgG,用于检测RF。
8)质控线(8):包被于NC膜上,含有兔IgG,用于指示产品的有效性。
9)吸收垫(9):成分为植物纤维或者棉绒等,用于吸收多余的液体,为层析反应提供动力。
实施例4:荧光免疫层析法与胶体金法的比较
由于胶体金法进行的是灰度分析,而荧光免疫层析法进行的是荧光强度分析;因此在定量分析中胶体金的灵敏度和准确度都差于荧光免疫层析。
使用荧光免疫层析试纸条与胶体金试纸条进行比较,实验数据如表2和图3所示。
T/C值的含义为仪器读取检测线(T线)的信号值与质控线(C线)的信号值的比值。这种计算方式能有效提高检测结果的精密度。
表2:荧光免疫层析法与胶体金法的比较
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Claims (10)
1.用于类风湿性关节炎检测的荧光免疫层析试纸条,所述试纸条包括上样区、检测区和吸水区;
所述检测区包括固定有突变型瓜氨酸波形蛋白的第一子检测区、固定有环瓜氨酸肽的第二子检测区和固定有变性人IgG的第三子检测区;
其中所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被量独立地为0.15-0.75μg;
所述突变型瓜氨酸波形蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1;
所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2;
所述上样区含有质量比为20:10:1的荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
2.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其还包括底板。
3.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其中上样区分为样品区和标记区,所述样品区用于接收样品,并且所述标记区用于包被荧光材料标记的羊抗人IgG、荧光材料标记的变性人IgG和荧光材料标记的羊抗兔IgG。
4.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其中所述荧光材料选自异硫氰酸荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、藻红蛋白、荧光聚苯乙烯微球、时间分辨微球、上转换发光微粒和量子点微球。
5.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其还包括质控区,所述质控区按照样品在试纸条上的流动方向位于第一子检测区、第二子检测区或第三子检测区的下游。
6.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其中所述质控区包被有兔IgG,所述兔IgG的包被量为0.15-0.75μg。
7.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其中,
按照样品在试纸条上的流动方向,上样区、检测区和吸水区由上游至下游排列。
8.如权利要求1所述的荧光免疫层析试纸条,其中所述突变型瓜氨酸波形蛋白、所述环瓜氨酸肽和所述变性人IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL。
9.试剂盒,其包括权利要求1-8中任一项所述的荧光免疫层析试纸条和说明书。
10.权利要求1-8中任一项所述的荧光免疫层析试纸条在制备用于类风湿性关节炎检测的试剂盒中的用途。
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