JP2001524815A - 迅速なガン診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は迅速なガンの診断方法に関する。特に本発明は、無症候性期または初期段階の患者における発ガン過程の存在を検出するのに適当な迅速なガンの診断方法に関する。本発明はさらに、ガン患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該ガンの診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者のガンを検出することを特徴とするガンの処置方法；ならびに該ガンの診断方法を行うためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 迅速なガン診断方法発明の背景 発明の分野 本発明は、無症候性期または初期における患者の発ガン性過程の存在を検出す るのに適当な迅速なガン診断方法に関する。本発明はさらに、ガン患者の血清中 に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化物質、すなわち腫瘍マーカー；該診断方法 により無症候性期または初期の患者のガンを検出することを含むガンの治療方法 ；および該ガン診断のための方法を行うためのキットに関する。本発明のガン診 断方法は、精製された炭酸脱水酵素ＩＩの活性に対するガン患者血清の影響に基 づくものである。適量のガン患者の血清を加えることによって、精製された炭酸 脱水酵素ＩＩの活性は有意に増大することが認められた。一方、健康なボランテ ィアの血清またはガン以外の他の疾患の患者の血清はいずれも同様の効果を示さ なかった。 関連技術の記載 炭酸脱水酵素は、1932年にMeldrumらによって発見された亜鉛酵素である(Meld rum N.U.，Roughton J.W.:Carbonic Anhydrase:Its preparation and propertie s，J．Physiol．(London)，1933，80，113-142)。この酵素は、赤血球および酸 塩基平衡の維持に関与する生物の他の細胞に存在する(Maren T.H.:Carbonic Anh ydrase，Physiological Reviews 1967，47，585-782;Hewett Emmett D.，Hopkin s P.J.，Tashian R.E.，Czelusniak J.:Origins and molecular evolution of t he carbonic anhydrase isozymes，Ann．N.Y．Acad．Sci．1984，429，338-358) 。脊椎動物では、異なる生理的機能を有し、胃酸分泌、水性体液および脳脊髄液 形成、膵臓の重炭酸塩分泌、中間代謝、石灰化などに関与する炭酸脱水酵素の８ 個の区別されたイソ酵素が既知である(ＩからＶＩＩＩと称する)。 発明者らの以前の研究では、通常の治療的用量で経口投与された炭酸脱水酵素 特異的インヒビター（アセトゾールアミド、エトキシゾールアミド、ベンゾチア ゾール−２−スルホンアミド）は、非常に短い期間内に、胃酸分泌を減少させ、 潰瘍の痛みの消失および胃十二指腸潰瘍の内視鏡的な治癒を導くことが示された (I．Puscas et al.:Les inhibiteurs de I'anhydrase carbonique dans letrait ement de l'ulcere gastrique et duodenal，Archive Francaises des Maladies de l'Appareil Digestif，Paris，1976，65:577-583;I．Puscas:Treatment of gastroduodenal uclers with carbonic anhydrase inhibitors，Ann．New York Acad．of Sciences，1984，587-591;I．Puscas:Carbonic anhydrase inhibitors in the treatment of gastric and duodenal uclcers，in:New Pharmacology o f Ulcer Disease，S．Szabo，Gy．Mozsik（Editors）Elsevier Publ．House，Ne w York，USA，164-178，1987;I．Puscas:Farmacologia Clinica da Ulcera Pept ica，In:Aparelho Digestivo，Clinica e Cirurgia，Julio Coelho（Ed）MEDSI Publ．House，Rio de Janeiro，The 1st Edition in 1990，The 2ndEdition in 1996，1704-1734;I．Puscas:Avaliacao do paciente com doenca do estomago e duodeno，In:Aparelho Digestivo．Clinica e Cirurgia，Julio Coelho(Ed.)， MEDSI Publ．House，Rio de Janeiro，Brasil，The 1st Edition in 1990，The 2nd Edition in 1996，173-179)。 発明者らのさらなる研究では、胃酸分泌の主要な刺激物質であるヒスタミン、 ガストリンおよびアセチルコリンは、胃粘膜で炭酸脱水酵素ＩＩおよびＩＶを直 接活性化することが示された（I．Puscas:New concepts concerning the mechan ism of stimulation of gastric acid secretion by hist amine．VI^thWOrld Co ngress of Gastroenterology，Madrid，1978，213;I．Puscas:Direct activatio n by histamine of the carbonic anhydrase in the human gastric mucosa，Re v．Roum．Biochem.，1979，4:317-320)。出願人らの研究では、赤血球および血 管壁に存在する炭酸脱水酵素のイソ酵素Ｉは血管調節の過程に関与し(I．Puscas et al.:Inhibition of carbonic anhydrase by nitric oxide．Arzneimittel-F orschung/DrugResearch，1995，8:I．Puscas et al.:Prostaglandins having va sodilating effects inhibit carbonic anhydrase while leukotriens B₄ and C₄ increase carbonic anhydrase activity．Int．J ．Clin．Pharmacol Therapeutics，1995，32，3:176-181;I．Puscas et al.:Iso sorbide nitrates，nitroglycerine and sodium nitroprusside induce vasodil ation，concomitantly inhibiting down to abolishment carbonic anhydrase I in erythrocytes．American Journal of Hypertension，1997，10(1)，124-128 )、赤血球および分泌細胞に存在する炭酸脱水酵素のイソ酵素ＩＩは生物の分泌 過程を調節している（I．Puscas et al.:World Congress of Gastroenterology ，Los Angeles，Oct．1994:1329-32;1366-81;I．Puscas et al.:Nonsteroidal a ntiinflammatory drugs activate carbonic anhydrase by adirect mechanism o f action．J．Pharmacol．Exp．Therap.，USA，1996，277，3:1146-1148）こと が証明された。 発明者らの結果は、細胞内のシグナル伝達についての新規な理論の仮定：ｐＨ 理論を導く。この理論にしたがえば、血管および分泌調節を生じさせる刺激また は第一の伝達子（メッセンジャー）は、細胞膜の特異的レセプターに対して、な らびに直接、膜結合炭酸脱水酵素に対しての二重機構によって作用する。この酵 素はその活性化または阻害によって、細胞性エフェクターに情報を伝達するため の刺激物質−レセプター複合体形成に適当なｐＨを保証する。この炭酸脱水酵素 によって開始されるｐＨ調節を介する方法によって、この酵素は生物の生理的お よび病理的な過程ならびにガン形成に関与する(I．Puscas.et al.:Carbonic anh ydrase and modulation of physiologic and pathologic processes in the org anism，I.Puscas-(Editor)，Helicon Publishing House Timisoara，Romania，1 994，the Romanian version p.155-205 and 577-585，and the English version p．147-197 and 551-559;I.Puscas:Carbonic anhydrase-a modulator of physi ologic and pathologic process in the organism:The pH Theory．The 4th Int ernational Conference on the Carbonic Anhydrases，July 1995，Universitay of Oxford;I．Puscas:Carbonic Anhydrase modulating physiological and pro cesses in organism．The pH Theory．The Medical Novelty(Noutatea Medicala )，Bucharest，Romania(1997，3:5-15)）)。 ここ数年、ガンに関する生物学的基礎および生化学的基礎の理解が著しく進歩 した。ガンは、起源の解剖学的部位から他の組織にまで広がる異常な細胞の制御 できない成長によって特徴付けられる疾患である。この転移過程には、なんらか の腫瘍細胞が転移コロニーを生じさせる前に起こる種々の細胞性事象が関与する 。この広がりは、それが制御できないものであれば、ガン疾患の致命的な結果の 主要原因である。しかし、多くのガンは早期に検出され、すぐに処置されれば、 治すことができ；そうでないものも種々の処置アプローチを用い、長年にわたっ て制御できる。 発明者らのインビトロおよびインビボ研究では、発ガン性物質は炭酸脱水酵素 ＩＩ活性およびスーパーオキシドジスムターゼ活性を減少させ、抗発ガン性物質 はこれらの酵素活性を増大させることが証明された（I．Puscas et al.:Relatio n between carbonic anhydrase I，CA II，non-steroidal anti-inflammatory d rugs and some carcinogenic substances，Digestive Disease Week，San Diego ，California，May 1995，0643;I．Puscasetal.:The values of superoxid dism utase in patients with gastric cancer as compared to controls，Digestive Disease Week，San Francisco，California，May 1996，0798;I．Puscas et al. :Anticancer chemotherapy increases red cell and gastric mucosa carbonic anhydrase activity．In vivo studies．Digestive Disease Week，San Francis co，California，May 1996，0797)。種々の形態のガンを有する患者について行 われた発明者らの他の最近の研究では、健康なボランティアで構成されるコント ロール群と比べ、すべての患者において、赤血球の細胞炭酸脱水酵素ＩＩ活性お よびスーパーオキシドジスムターゼの活性が弱いことが示された(I．Puscas et al.:The effect of benzpyrene and cyclophosphamide on superoxid dismutase and carbonic anhydrase activity in gastric carcinoma patients as compar ed to controls．The First Forum of Gastroenterology，"Banat-Crisana"，Ti misoara，Romania，Oct．1996)。 現在まで、多くのケースで、新生物増殖の存在に関する生化学的指示薬であり 、血清、血漿または他の体液中で検出可能な腫瘍マーカーを用いることによって 、腫瘍を早期に検出し、疾患を注意深くモニターすることが考慮されている。ガ ン 胚抗原(ＣＥＡ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−αおよびβ)、シアル酸、前立腺特異的 抗原（ＰＳＡ）などの腫瘍マーカーの主な用途は、治療応答、残留する疾患また は再発の決定にあった。今日まで、腫瘍マーカーはいずれも特異性を示しておら ず；正常な生理的状態または非新生物疾患にも、実質的にほとんどの腫瘍マーカ ーが低レベルで存在している。したがって、これらのマーカーはガンに関する一 般的スクリーニングには適用することができない。 腫瘍マーカーの主要な不利益を除くため、本発明は、無症候性段階においてガ ンを迅速にスクリーニングする方法の確立、あるいはその症候期における確認に 関する。このガン疾患の早期検出は、腫瘍局在化に用いられる他の通常の方法と ともに効果的な外科手術または薬物治療を可能にする。 現時点までに、出願人は、精製された炭酸脱水酵素ＩＩはガン患者の血清によ って有意に活性化され、この活性化は健康な患者の血清またはガン以外の他の疾 患の患者の血清では観察されないことを見出した。これらの観察から出発して、 出願人らは、精製された炭酸脱水酵素ＩＩの活性に対する血液血清の効果を試験 することによって、任意のタイプのガンを、初期段階のガンでさえも診断するこ とができることを発見した。本発明の要旨 したがって、本発明は以下のことを提供する： （１）（ａ）試験される患者の希釈された血液血清サンプルを精製された炭酸脱 水酵素ＩＩの溶液と混合し、第一反応混合物を製造し； （ｂ）第一反応混合物中の炭酸脱水酵素ＩＩの活性を決定し； （ｃ）第一反応混合物中の血液血清以外のすべての成分を含む第二反応混 合物中の炭酸脱水酵素ＩＩの活性を決定し；ならびに、 （ｄ）工程（ｃ）と比較した工程（ｂ）における炭酸脱水酵素ＩＩの活性 の程度を評価することを含む； ガンの診断方法 （２）１μＭまたはそれ以下の濃度で炭酸脱水酵素を活性化するガン患者の血清 中に存在する腫瘍マーカー； （３）上記（１）に定義のガン診断方法によって、無症候性期または初期におけ る患者のガン過程を検出することを特徴とするガンの処置方法；ならびに、 （４）炭酸脱水酵素ＩＩを含む組成物を含有する上記（１）に定義のガンの診断 方法を行うためのキット。本発明の詳細な説明 本発明のガンの診断方法はインビトロ法であり、試験される好ましい患者はヒ トである。 ガンの診断方法の好ましい態様では、希釈された血液血清は０．１から５０容 量％、好ましくは１から１０容量％の血液血清を含む。希釈血液血清サンプル用 の希釈剤は水および水性有機溶媒、例えば、０．１から５０容量％、好ましくは １から１５容量％の１つまたはそれ以上の有機溶媒を含む水性混合物であり、こ の希釈剤は緩衝液および／または有機の塩または無機の塩を含んでいることもあ る。適当な有機溶媒には、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プ ロパノール、イソプロパノールおよびブタノール、ケトン、例えばアセトンおよ びブタノン、ジオールおよびトリオール化合物、例えばエチレングリコール１， ３−ペンタンジオールおよびグリセリン、およびエーテル、例えばジエチルエー テル、ジエチレングリコールおよび２−メトキシエタノールがある。適当な緩衝 液には、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＳＰＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳおよびＭＯＰＳがあり、 適当な有機の塩または無機の塩には、Ｎａ₂ＳＯ₄およびＫ₂ＳＯ₄がある。 精製された炭酸脱水酵素ＩＩの溶液中の炭酸脱水酵素ＩＩの濃度は０．０１ｎ Ｍから０．１ｍＭ、好ましくは１．０ｎｍから１．０μＭの範囲である。該溶液 の適当な溶媒は、水および水性有機溶媒から選択され、該溶媒はさらに緩衝液、 無機の塩または有機の塩および／または１つまたはそれ以上の指示薬（群）を含 んでいてもよい。有機溶媒、緩衝液および有機の塩および無機の塩に関しては、 上記定義の希釈された血液血清サンプルを参照。適当な指示薬には、ｐ−ニトロ フェノール、フェノールレッドおよびニトロブルーテトラゾリウムがある。 本出願の発明では、希釈された血液血清サンプルおよび精製された炭酸脱水酵 素を１００：１から１：１００の比、好ましくは１０：１から１：１０の比、よ り好ましくは１：１の比で混合するのが好ましい。 好ましい態様では、第一の反応混合物には０．０５から２５容量％、好ましく は０．５から５容量％の血液血清が含まれる。第二の反応混合物の炭酸脱水酵素 ＩＩ活性と比較して、第一の反応混合物中における１００％またはそれ以上の活 性化（すなわち、第一の反応混合物中の炭酸脱水酵素の活性は第二の反応混合物 中の活性と比べて少なくとも２倍高いこと）、それにより該第一の反応混合物は ２５容量％またはそれ以下、好ましくは５容量％またはそれ以下の血清を含む、 は患者に発ガン性過程が存在することを示すことが理解される。 本発明の方法のさらに好ましい態様では、希釈された血液血清サンプルは、１ ０容量％の血清を含む水溶液であり、精製された炭酸脱水酵素ＩＩの溶液は、１ ．０から１０μＭの炭酸脱水酵素ＩＩを含む水性緩衝溶液であり、第一の反応混 合物は希釈された血液血清サンプルおよび精製された炭酸脱水酵素ＩＩの溶液を １：１の比で含む。 例えば本明細書中、上記引用された専門書に記載されている既知の方法の１つ を用いて、炭酸脱水酵素ＩＩ活性を決定することができる。本発明の方法の好ま しい態様では、ストップフロー法（Khalifah R．G.:The carbon dioxide hydrat ion activity of carbonic anhydrase:stop-flow kinetic studies on the nati ve human isozymes B and C，J．Biol．Chem.，1971，246:2561-2573）によって 炭酸脱水酵素の活性を決定する。この方法は、ＣＯ₂水和作用に対する酵素活性 を測定することを特徴とする。ＣＯ₂水和作用の後、ｐＨ変化に基づく比色定量 法を用いる。試薬混合物のｐＨが初期値７．５から最終値６．５に減少する時間 を測定する。この反応は、混合ユニットおよび試薬を供給する２つのシリンジ系 を備えた高速動力学的（rapid kinetic）分光光度計ＨＩ−ＴＥＣＨ ＳＦ−５１ ＭＸ（England）を用い、波長４００ｎｍで分光光度測定的に行った。以下の２ つの別の経路によって反応キュベット中の試薬の供給を確実にする：シリンジ１ は酵素緩衝液から構成される反応混合物（すなわち、第一または第二の反応混合 物）を導入し、一方第二のシリンジは、ＣＯ₂含量が５から５０ｍＭ、好ましく は１５ｎＭのＣＯ₂水溶液である基質溶液を導入する。試薬を反応キュベットに 入れて混合し、反応とそのモニターを開始する。混合チャンバーからの光電子増 倍管の送信シグナルを受信し、数学的コプロセッサーと動力学的ソフトＲＫＢＩ Ｎ ＩＳ−１が装備されているコンピューターによって可視化する。 以下のような他の方法によって炭酸脱水酵素活性の検出を評価することもでき る：ｐＨ変化に基づく方法 (Philipot F.J．et al．A modified colorimetric estima tion of carbonic anhydrase，Biochem．J.，1936;30:2192-94;Kernohan J.K．e t al.:The activity of concentrated solutions of carbonic anhydrase，Bioc hem.Biophys Acta，1963;67:31-41;Maren T．H.:Carbonic anhydrase:chemistry ，physiology and inhibition．Physiol.Rev.1967，47:595-781;Wilbur K．M．& Anderson N．O．Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase．J.Biol.Chem.1948，176:147-153)。該方法はＨ⁺生産および消費の測 定に基づくものであり、ａ）ｐＨ指示薬（この場合には、指示薬の色の変化によ ってＨ⁺生産が可視化される）またはｂ）ｐＨ電極（この場合には、ｐＨ電極に よりＨ⁺の生産および消費が測定される）によって行うことができる。ＣＯ₂濃度またはｐＣＯ₂の変化に基づく方法 この方法は、ａ）気体検圧技術（Meldrum N．U.，Roughton F．J．W.，Physio l，London，1933，80:113-142;Roughton F．J．W．et al．Biochem J.，1946，4 0:319-390）またはｐＣＯ₂電極（Holland R．A．B．et al．J．Physiol.，Londo n，1975，228:1589-1596;Klocke R.A.，J．Appl．Physiol.，1976，40:707-714 ）によってＣＯ₂−ＨＣＯ^- ₃の可逆反応のＣＯ₂生産または消費を測定することに 基づく。反応温度の変化に基づく方法 この方法は、反応により生じる温度の急速な初期増加を測定することに基づき 、熱電対を装備した機器を用いて評価する(Kernohan J.C．et al.，J．Physiol. ，London，1968，197:345-361)。ラベルされた同位体（トレーサー）を用いる方法 例えば¹⁸Ｏを用いる(Silverman D．N.，Methods Enzymol.1982，87:732-752) 。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を適用する方法 ¹³Ｃを用いる(Simonsson I．et al.，Eur.J.Biochem．1979，93:409-417)。緩和法（Relaxation methods） この方法では、ＨＣＯ₃−ＣＯ₂溶液平衡は、その化学平衡状態の連続的変化と ともに突然その物理的性質、例えばその電場、圧力または温度を変える(Eigen M ．et al.，Z．Physik．Chem．NF，1961，30:130-136)。免疫組織化学法 この方法は、炭酸脱水酵素によって生産されるＣＯ₂のコバルト捕獲に基づく ものであり、炭酸脱水酵素を身体のいくつかの部位に局在化させるものである(H ansson H．P．J.:Histochemical demonstration of carbonic anhydrase activi ty Histochemie，1967，11:112-128;Lonnerholm G.:Histochemical demonstrati on of carbonic anhydrase activity in the human kidney，Acta physiol．Sca nd.，1973，88:455-468)。蛍光測定法 (Shingles R.，Moroney J．V.:Measurement of carbonic anhydrase activity u sing a sensitive fluorometric assay，Analytical Biochemistry，1997，252 ，1:190-198)。他の基質を用いる方法 この方法では、炭酸脱水酵素の評価にｐ−ニトロフェニルアセテートのような Carbonathydrolyase mit p-Nitrophenylacetat，Z．Physiol．Chem.，1963，334 :279-282)。 上記のように、第二の反応混合物の炭酸脱水酵素ＩＩ活性と比較した、第一の 反応混合物（これは２５容量％またはそれ以下、好ましくは５容量％またはそれ 以下の血清を有する）における１００％またはそれ以上の活性化値は、発ガン性 過程の存在を示す。さらに、初期段階のガン患者の血清を用いると（ガンの局在 性にかかわらず）炭酸脱水酵素ＩＩがより弱く活性化されることが発明者らによ って見出されている。したがって、本発明の方法はまた、より進んだ段階の患者 の血清による活性化と比べ、（炭酸脱水酵素ＩＩの活性化の程度を比較すること によって）患者のガン過程の段階を決定するのに適当である。初期段階にもかか わらずガン患者のすべてのケースで、（５容量％血清を含む第一の反応混合物で の）炭酸脱水酵素ＩＩ活性化は１００％を超え、進んだ段階の患者の血清によっ て生じた活性化は４００％またはさらにそれ以上に達した。 本発明の方法は以下の利点を有する： １．慣用の方法ではガンを検出できない無症候性期、初期段階それぞれにおける ガンのスクリーニングを可能にする。 ２．少量の血液血清しか用いないことを可能にする。 ３．非常に高感度であり、評価が再現可能である。 ４．必要とされる試薬が低価格であるため、経済的に行うことができる。 炭酸脱水酵素ＩＩに対するガン患者の血清の活性化効果に関する上記結果から 出発して、該ガン患者の血清中の炭酸脱水酵素ＩＩを活性化するいくつかの原因 因子（すなわち腫瘍マーカー）を同定することが試みられた。これにより、腫瘍 壊死因子αおよびβ、ガン胚抗原、シアル酸、およびα₁−抗キモトリプシンが 炭酸脱水酵素ＩＩの強力な活性化因子であることが示された。また発明者らの研 究は、健康なボランティアの血清と比較して、８０％のガン患者では血清ガスト リン量が高いことを証明した。したがって、これは血清内因性の炭酸脱水酵素Ｉ Ｉ活性化因子の１つであるかもしれない。 本発明の腫瘍マーカーは、１μＭ以下の濃度でさえ、特に１ｎＭまたはそれ以 下の濃度でさえ、さらに１ｐＭまたはそれ以下の濃度でさえ炭酸脱水酵素ＩＩを 活性化する。好ましい腫瘍マーカーには、腫瘍壊死因子αおよびβ、ガン胚抗原 (ＣＥＡ)、シアル酸、α₁−抗キモトリプシン（α₁−antichymothrypsine）およ びｓｐ１８５^Her2腫瘍タンパク質がある。 検出された活性化百分率を定量するため、特にガン過程の段階を決定するため の標準溶液として、本発明の腫瘍マーカーを用いることができる。 本発明に記載のガンの処置方法であって、上記定義のような無症候性期または 初期段階においてガン患者のガン過程を検出することを特徴とする方法は、患者 の任意の種類のガンを処置するのに適当である。したがって、本発明に記載のガ ンの診断方法は、任意の種類の治療処置（例えば、外科手術または化学療法）と 組み合わせることができる。ガン過程の初期段階における検出はガン過程の治癒 の機会を増大させる。 本発明に記載のガン用の方法を行うためのキットは、炭酸脱水酵素ＩＩを含有 する組成物を含む。該組成物は乾燥状態または溶液にすることができる。組成物 のさらなる成分および組成物中の炭酸脱水酵素ＩＩの量については、上記第一の 反応混合物の化合物についての考察を参照。 このキットはさらに、緩衝液、例えば緩衝溶液を含有する組成物、指示物質を 含有する組成物、ならびに１つまたはそれ以上の腫瘍マーカーを含有する組成物 （ここに緩衝液、指示薬および腫瘍マーカーは上記定義のとおりである）を含む ことができる。 以下の非限定的な実施例によって本発明をより詳細に記載する。実施例 試薬 −ｐ−ニトロフェノールは比色指示薬として、濃度０．２ｍＭ；ｐＨ＝７．５； 温度２０−２５℃＝室温で用いた。 −ＨＥＰＥＳ緩衝液を濃度２０ｍＭ；ｐＨ＝７．５；室温で用いた。 −精製された炭酸脱水酵素ＩＩ（SIGMAから入手，Diesenhofen，Germany）の保 存溶液を濃度３．４４×１０^-6Ｍ；ｐＨ＝７．５；室温で用いた。 −蒸留水（2回蒸留）中、ＣＯ₂を飽和するまでバブル（bubbling）して（基質と しての）濃度１５ｍＭのＣＯ₂溶液を得た。 −Ｎａ₂ＳＯ₄を濃度０．１Ｍで用いて、一定のイオン強度を維持した。 該酵素の存在下でＣＯ₂水和が生じる時間を測定することによって、精製され た炭酸脱水酵素ＩＩ活性を評価した。この測定は、反応が開始した時点（反応混 合物の吸光度が３ユニットとなった時点）から反応が終了した時点（反応混合物 の吸光度が０になった時点）まで行った。吸光度の値は反応曲線で記載した。 反応キュベットは以下の２つのシリンジから構成されていた： シリンジＩ：緩衝液０．８ｍＬ＋指示薬＋ＣＡＩＩ溶液（３．４４×１０^-6Ｍ） ０．１ｍＬ＋水０．１ｍＬ：の混合液１ｍＬ。 シリンジＩＩ：ＣＯ₂溶液（１５ｍＭ）１ｍＬ。 上記のように試薬の注入および炭酸脱水酵素活性の測定を行った。このように 測定された反応時間をＴと記載した。 以下の式によって炭酸脱水酵素の活性を評価した： ［式中、Ｔ₀は触媒されていない反応の時間であり； Ｔは、（ＣＡＩＩの存在下で）触媒された反応の時間である]。 本発明の方法にしたがう血清の存在下での炭酸脱水酵素ＩＩ活性の測定は以下 のように行った：実施例１ 胃ガンを診断された患者から静脈血５ｍＬを採取した。この血液を恒温器中で ３０分間維持した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後、血清２ｍＬを 取り出し、蒸留水（2回蒸留）中、１／１０、１／５０および１／１００の３つ の希釈物を以下のように作成した：血清０．５ｍＬ＋水４．５ｍＬから１／１０ 希釈物を得；１／１０希釈物から血清１ｍＬを取り、水４ｍＬを加えて、１／５ ０希釈物を得；最後に１／５０希釈物からの血清１ｍＬ＋水４ｍＬから１／１０ ０希釈物を得た。第一工程 では、触媒されていない反応時間、すなわち緩衝液０．８ｍＬ＋指示薬 および＋ＣＯ₂溶液間の反応時間を測定した。このように測定した時間はＴ₀で表 し、これは６．５ｓであった。第二工程 では、緩衝液０．８ｍＬ＋指示薬および＋水０．１ｍＬ中の精製された 炭酸脱水酵素ＩＩ（３．４４×１０^-6Ｍ）０．１ｍＬとＣＯ₂溶液との反応時間 を測定した。このように測定した時間をＴで表し、これは３．２５ｓであった。 水存在下での精製された炭酸脱水酵素ＩＩの活性を以下の式から得た： 第三工程：ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）０．８ｍＬ＋指示薬（ｐ−ニトロフェ ノール０．２ｍＭ）中の精製された炭酸脱水酵素ＩＩ溶液（３．４４×１０^-6Ｍ ）０．１ｍＬに対し１：１の容量比で、１／１００、１／５０および１／１０血 清希釈物をそれぞれ加えた。ＣＯ₂の存在下、Ｔ₁、Ｔ₂、Ｔ₃で記載の各混合物の 反応時間を測定した。これらの値（Ｔ₁、Ｔ₂、Ｔ₃）は各反応混合物の吸光 度が０になるまでの時間を表す。 以下の値が得られた： Ｔ₁＝１．６７９ｓ １／１００希釈物； Ｔ₂＝１．２６４ｓ １／５０希釈物； Ｔ₃＝０．８７４ｓ １／１０希釈物。 血清存在下での炭酸脱水酵素ＩＩ活性を以下のように計算した： 血清希釈物の活性化百分率を以下のように計算した： 実施例２ 肺ガン と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理した 。 第一工程：T₀＝６．４０ｓ 第二工程：Ｔ＝３．２０ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．１４３ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．９８６[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化９８％； Ｔ₂＝１．４４９ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝３．４１５[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２４１％； Ｔ₃＝１．１２５ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝４．６８６[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化３６８％。実施例３ 乳ガン と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理した 。 第一工程：Ｔ₀＝６．３５ｓ 第二工程：Ｔ＝３．１７５ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．２０１ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．８８５[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化８８％； Ｔ₂＝１．５４５ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝３．１０８[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２ＩＩ％； Ｔ₃＝１．１７０ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝４．４２５[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化３４２％。実施例４ 卵巣ガン と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理し た。 第一工程：Ｔ₀＝６．５２ｓ 第二工程：Ｔ＝３．２６ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．３３０ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．７９８[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化８０％； Ｔ₂＝１．６６４ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝２．９１７[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化１９２％； Ｔ₃＝１．３３８ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝３．８７０[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２８７％。実施例５ 精巣ガン と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理し た。 第一工程：Ｔ₀＝６．２４ｓ 第二工程：Ｔ＝３．１２ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．１５５ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．８９５[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化９０％； Ｔ₂＝１．５５３ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝３．０１８[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２０２％； Ｔ₃＝１．２１０ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝４．１５６[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化３１６％。実施例6 前立腺ガン と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理 した。 第一工程：Ｔ₀＝６．４２ｓ 第二工程：Ｔ＝３．２１ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．４０７ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．７０８[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化７１％； Ｔ₂＝１．７９８ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝２．６２６[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化１６３％； Ｔ₃＝１．４７５ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝３．４１８[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２４２％。実施例７ 白血病 と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のように処理した 。 第一工程：Ｔ₀＝６．３６ｓ 第二工程：Ｔ＝３．１８ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝２．１０８ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝２．０１６[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化１０２％； Ｔ₂＝１．２７９ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝３．６１０[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化２６１％； Ｔ₃＝１．０４６ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝５．０８０[ＥＵ／ｍＬ] ；活性化４０８％。実施例８ 健康なボランティア と診断された患者から静脈血５ｍＬを採取し、実施例１のよ うに処理した。 第一工程：Ｔ₀＝６．２８ｓ 第二工程：Ｔ＝３．１４ｓ；Ａ＝１．００［ＥＵ／ｍＬ］ 第三工程：Ｔ₁＝３．１４ｓ(１／１００希釈物)；Ａ₁＝１．００[ＥＵ／ｍ Ｌ]；活性化０％； Ｔ₂＝３．０９ｓ(１／５０希釈物)；Ａ₂＝１．０３２[ＥＵ／ｍＬ]； 活性化３％； Ｔ₃＝３．０６ｓ(１／１０希釈物)；Ａ₃＝１．０５１[ＥＵ／ｍＬ]； 活性化５％。実施例９ 以下の２つの患者群に対して、特許請求している本発明に記載の迅速なガン診 断方法を試験した： 群１(Ｎ＝２３２０)：組織学的に確認された種々のタイプのガン患者 群２(Ｎ＝２６３８)：健康なボランティアおよびガン以外の他の疾患の患者 両群において、静脈血を採取し、実施例１にしたがって、精製された炭酸脱水 酵素ＩＩに対する血清の１／１００、１／５０および１／１０希釈物の効果を決 定した。 この結果を以下に示す表に表す。値は、精製された炭酸脱水酵素ＩＩに対する 血清の活性化効果の平均値である。 この結果は、精製された炭酸脱水酵素ＩＩがガン患者の血清によって爆発的に 活性化され、ＣＡＩＩ活性が健康なボランティアの血清または非ガン患者の血清 によっては変化しないことを示す。 上記結果から、活性化効果は血清濃度に比例して増大する、すなわち、実施例 では１／１０希釈物（第一反応混合物中、約５容量％の血清）で最大活性化効果 が得られ、一方血清希釈物が希釈される（１／１０から１／１００まで、約５容 量％から０．５容量％まで）につれ、血清の活性化効果が減少することが明らか である。それにもかかわらず、１／１００希釈物（第一の反応混合物中、約０． ５容量％の血清）でさえも活性化効果が明らかに観察される。有用性 本発明の方法は種々のタイプのガンの診断用の迅速な試験を提供する。 発明者らの行った研究には、これまで、以下のものを含む腫瘍過程の種々の段 階および局在性を示す３０００人を超える患者が含まれる：咽頭ガン、胃ガン、 食道ガン、結腸直腸ガン、肝細胞ガン、膵臓ガン、肺ガン、乳ガン、卵巣ガン、 子宮ガン、精巣ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、甲状腺ガン、口唇ガン、白血病、 悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫など。 発明者らは、種々の疾患で治療物質として投与することができ、本出願に記載 の試験方法に影響し得る、多くの範疇の炭酸脱水酵素活性化因子および阻害剤を 記載した。この理由のため、本ガン診断方法の実施５日前に、Ｈ₂−レセプター アンタゴニストでのいかなる処置をも中断し、また試験実施の１０日前に、炭酸 脱水酵素阻害剤（アセタゾルアミド、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｉ₂、プロスタグランジン）で のいかなる処置またはいかなる非ステロイド性抗炎症薬処置をも中断することを 強く勧める。 発明者らの研究は、特許請求している方法がすべてのタイプのガンについての スクリーニング試験として用いることができることを証明するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ (71)出願人 コルタウ，マルチェラ ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・パルテ ィザニロル14番、ビルディング・メー― １、アーペー２ (71)出願人 ドムタ，ガブリエラ ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・グ・ラ ザール・レー―21／４番 (71)出願人 バイカン，ミヒャエル ドイツ連邦共和国デー―58540 マイナー ツァーゲン、クリニク・ヴィルケンベルク (72)発明者 プスカス，イワン ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・チェタ ティイ・ネーレー10番 (72)発明者 プスカス，ユヤナ・カルメン ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・チェタ ティイ・ネーレー10番 (72)発明者 コルタウ，マルチェラ ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・パルテ ィザニロル14番、ビルディング・メー− １、アーペー２ (72)発明者 ドムタ，ガブリエラ ルーマニア、レー―4775サラジュ、シムレ ウ・シルヴァニエイ、ストラダー・グ・ラ ザール・レー―21／４番 (72)発明者 バイカン，ミヒャエル ドイツ連邦共和国デー―58540 マイナー ツァーゲン、クリニク・ヴィルケンベルク

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）試験される患者の希釈された血清サンプルと精製された炭酸脱水酵 素ＩＩの溶液を混合することによって、第一の反応混合物を調製し； （ｂ）第一の反応混合物中の炭酸脱水酵素ＩＩの活性を測定し； （ｃ）血清を除く第一の反応混合物のすべての成分を含む第二の反応混合物中の 炭酸脱水酵素ＩＩの活性を測定し；ならびに （ｄ）工程（ｃ）と比較して、工程（ｂ）における炭酸脱水酵素ＩＩの活性化の 程度を評価することを特徴とするガンの診断方法。 ２．希釈された血清サンプルが０．１から５０容量％、好ましくは１から１０ 容量％の範囲の血清を含む請求項１に記載の方法。 ３．希釈された血清サンプルの希釈剤が水および水性有機溶媒から選択され、 該希釈剤が緩衝液を含んでいることもある請求項１または２に記載の方法。 ４．精製された炭酸脱水酵素ＩＩの溶液中の炭酸脱水酵素ＩＩの濃度が０．０ １ｎＭから１．０ｍＭ、好ましくは１．０ｎＭから１．０μＭの範囲であり、該 溶液の溶媒が水および水性有機溶媒から選択され、該溶媒がさらに緩衝液および ／または指示薬を含んでいてもよい請求項１に記載の方法。 ５．希釈された血清サンプルおよび精製された炭酸脱水酵素の溶液を１００： １から１：１００の比、好ましくは１０：１から１：１０の比、より好ましくは １：１の比で混合する請求項１に記載の方法。 ６．第一の反応混合物が０．０５から２５容量％、好ましくは０．１から１０ 容量％、より好ましくは０．５から５容量％の血清を含む請求項１に記載の方法 。 ７．第二の反応混合物の炭酸脱水酵素ＩＩ活性と比べて、２５容量％またはそ れ以下、好ましくは５容量％またはそれ以下の血清を含む第一の反応混合物中に おける１００％またはそれ以上の活性化により患者における発ガン過程の存在を 示す、請求項６に記載の方法。 ８．希釈された血液血清サンプルが１０容量％の血清を含む水溶液であり、精 製された脱水酵素ＩＩの溶液が１．０から１０ｎＭの炭酸脱水酵素ＩＩを含む水 性緩衝溶液であり、希釈された血液血清サンプルと精製された炭酸脱水酵素の溶 液を１：１の比で混合することによって第一の反応混合物を調製する請求項１に 記載の方法。 ９．炭酸脱水酵素ＩＩのＣＯ₂水和をストップフロー動力学的測定することに よって該酵素の測定を行う請求項１または８に記載の方法。 １０．第一および第二の反応混合物の初期ｐＨが７．５であり、酵素活性の測 定が、第一または第二の反応混合物を、５から５０ｍＭの範囲のＣＯ₂、好まし くは１０から２５ｍＭの範囲のＣＯ₂、より好ましくは１５ｍＭのＣＯ₂を含む水 溶液である基質溶液と混合し、最終ｐＨ６．５に達するまでの時間を測定するこ とを特徴とする請求項９に記載の方法。 ＩＩ．ガン進行の段階に関係なく、特に無症候性期または初期段階において患 者のガン進行を検出するのに適当な請求項１に記載の方法。 １２．咽頭ガン、胃ガン、食道ガン、結腸直腸ガン、肝細胞ガン、膵臓ガン、 肺ガン、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、精巣ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、甲状 腺ガン、口唇ガン、白血病、悪性黒色腫およびホジキンリンパ腫および他の任意 の形態のガンを含む種々の段階および局在性のガンの診断のスクリーニング試験 に適当な請求項１に記載の方法。 １３．１μＭまたはそれ以下の濃度で炭酸脱水酵素ＩＩを活性化する、ガン患 者の血清中に存在する腫瘍マーカー。 １４．腫瘍壊死因子αおよびβ、ガン胚抗原、シアル酸、α₁−抗キモトリプ シンおよびｓｐ１８５^Her2腫瘍タンパク質から選択される請求項１３に記載の腫 瘍マーカー。 １５．（ａ）試験される患者の希釈された血清サンプルと精製された炭酸脱水 酵素ＩＩの溶液を混合することによって、第一の反応混合物を調製し； （ｂ）第一の反応混合物中の炭酸脱水酵素ＩＩの活性を測定し； （ｃ）血清を除く第一の反応混合物のすべての成分を含む第二の反応混合物中の 炭酸脱水酵素ＩＩの活性を測定し；ならびに （ｄ）工程（ｃ）と比較して、工程（ｂ）における炭酸脱水酵素ＩＩの活性化の 程度を評価することを特徴とするガンを診断するための方法によって、無症候性 期または初期段階において患者のガン進行を検出することを特徴とするガンの処 置方法。 １６．炭酸脱水酵素ＩＩを含有する組成物を含む、請求項１または１５に記載 のガンの診断方法を行うためのキット。