ES2587994T3 - Método de diagnóstico de la enfermedad de Sjögren - Google Patents

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Abstract

Método para determinar si un individuo humano tiene la enfermedad de Sjögren (SD) que comprende i) determinar por una muestra biológica del individuo la presencia de anticuerpos que actúan en contra de cualquiera de las siguientes, proteína de las glándulas salivales 1 (SP-1), proteína secretora parótida (PSP) o anhidrasa carbónica 6 (CA6), o determinar la presencia de una combinación de dichos anticuerpos, y determinar que el individuo tiene SD en base a la presencia de los anticuerpos; o determinar por una muestra biológica obtenida del individuo la ausencia de detección de anticuerpos contra PSP y SP-1 y determinar en base a la ausencia de detección de los anticuerpos que el individuo no tiene SD.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de diagnostico de la enfermedad de Sjogren Antecedentes de la invencion
La enfermedad de Sjogren es un trastorno autoimmune comun con una morbilidad y una mortalidad significativas que derivan en la destruccion de las glandulas salivares y lacrimales. Implica tanto autoinmunidad sistemica como local y en general se reconoce solo despues de que glandulas salivares y lacrimales se hayan destruido lo que da como resultado la boca seca y los ojos secos (Borchers, A. T., S. M. Naguwa, C. L. Keen, and M. E. Gershwin. 2003. Immunopathogenesis of Sjogren's syndrome. Clin Rev Allergy Immunol 25:89-104 ; Delaleu, N., R. Jonsson, and M. M. Koller. 2005. Sjogren's syndrome. Eur J Oral Sci 113:101-113). El smdrome de Sjogren es un smdrome comun que afecta al 0,5 % de la poblacion con un fuerte predominio del sexo femenino (Delaleu, N., R. Jonsson, and M. M. Koller. 2005. Sjogren's syndrome. Eur J Oral Sci 113:101-113, Fox, R. I. 2005. Sjogren's syndrome. Lancet 366:321331). Se compone de xerostomia y xeroftalirna y puede ser debido a varias causas entre las que se incluyen envejecimiento, infecciones, medicamentos, toxinas ambientales y respuestas autoinmunes (Daniels, T. E. 2000. Evaluation, differential diagnosis, and treatment of xerostomia. J Rheumato/Suppl 61:6-10). La enfermedad de Sjogren es un trastorno primario que consiste en el smdrome de Sjogren con manifestaciones sistemicas que incluyen linfadenopatfa, neumonitis intersticial y enfermedad renal leve (Borchers, A. T., S. M. Naguwa, C. L. Keen, and M. E. Gershwin. 2003. Immunopathogenesis of Sjogren's syndrome. Clin Rev Allergy Immunol 25:89-104; Delaleu, N., R. Jonsson, and M. M. Koller. 2005. Sjogren's syndrome. Eur J Oral Sci 113:101-113). El smdrome de Sjogren es visto a menudo en asociacion con otras enfermedades autoinmunes, especialmente lupus eritematoso sistemico (SLE) (Manoussakis, M. N., et al. Moutsopoulos. 2004. Sjogren's syndrome associated with systemic lupus erythematosus: clinical and laboratory profiles and comparison with primary Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum 50:882-891). Los pacientes con enfermedad de Sjogren suelen tener hipergammaglobulinemia, y varios autoanticuerpos, especialmente Ro y La (Fox, R. I. 2005. Sjogren's syndrome. Lancet 366:321-331, Lazarus, M. N., and D. A. Isenberg. 2005. Development of additional autoimmune diseases in a population of patients with primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis 64:1062-1064, ansen, A., P. E. Lipsky, and T. Dorner. 2005. Immunopathogenesis of primary Sjogren's syndrome: implications for disease management and therapy. Curr Opin Rheumatol 17:558-565). Casi el 4 % de los pacientes con la enfermedad de Sjogren desarrollaran linfoma, predominantemente linfomas de no Hodgkin de celulas B.
El diagnostico de la enfermedad de Sjogren se hace generalmente cuando los ojos secos causan irritacion y abrasiones en la cornea, y la sequedad en la boca provoca dificultad para tragar y caries dental.
El diagnostico bioqmmico se basa en la deteccion de linfocitos infiltrandose en las glandulas salivales y de autoanticuerpos sericos que actuan en contra de Ro y La. Las terapias actuales implican el uso de lagrimas y saliva artificiales, asf como farmacos colinergicos para mejorar las secreciones de las pocas celulas glandulares restantes (la descripcion de las tres siguientes citas se incorpora en el presente documento a modo de referencia: Kassan, SS, y H. M. Moutsopoulos 2004. Clinical manifestations and early diagnosis of Sjogren syndrome. Arch Intern Med 164:1275-1284, Latkany, R. 2008. Dry eyes: etiology and management. Current Opinion in Ophthalmology 19:287291, Thanou-Stavraki, A., and J. A. James. 2008. Primary Sjogren's syndrome: Current and prospective therapies. Seminars in Arthritis and Rheumatism 37:273-292). Sin embargo, ninguna terapia actual restaura la funcion de las glandulas salivales y las glandulas lacrimales, porque las glandulas estan destruidas en gran parte en el momento en el que se identifica la enfermedad. Por tanto, sena muy beneficioso poder diagnosticar la enfermedad de Sjogren de manera precoz ya que es cuando es susceptible de tratamiento, pero no existen tales metodos de diagnostico. Por tanto, existe una necesidad permanente y no satisfecha de metodos mejorados para el diagnostico de la enfermedad de Sjogren, y en particular para su uso en el diagnostico antes de que las enfermedades avancen hasta un punto en el que los enfoques terapeuticos actuales sean inadecuados.
El documento US 2007/0184502 se refiere a un metodo para diagnosticar el smdrome de Sjogren, en el que la presencia y/o la cantidad de autoanticuerpos IgA contra a-fodrina se determina en una muestra.
Ruan et. al. "The Autoimmune Regulator Directly Controls the Expression of Genes Critical for Thymic Epithelial Function" (J. Immunol., vol. 178, 2007, paginas 7173-7180) ensena que SP-1 y al menos otras ocho protemas se expresan en menor grado en ratones que tienen una delecion homocigotica de un gen regulador autoinmune (Aire) con respecto a ratones que son homocigotos normales para Aire.
El documento US 2007/184511 se refiere a un metodo para el diagnostico de una persona con smdrome de Sjogren, comprendiendo el metodo el analizar muestras de fluido o tejido corporal con espectrometna de masas y comparar si la muestra del paciente contiene valores m/z que son caractensticos de la base de datos de referencia del smdrome de Sjogren.
Hu et. al. "Salivary Proteomic and Genomic Biomarkers for Primary Sjogren's Syndrome" (Arthritis & Rheumatism, vol. 56, n° 11, Noviembre 2007, paginas 3588-3600) se refiere a la identificacion de biomarcadores de protemas y de ARN mensajero en la saliva total humana.
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El documento US 5895812 se refiere a nuevos polipeptidos que proporcionan secrecion que mejora la actividad en el lagrimal y las celulas de la glandula parotida, anticuerpos monoclonales de los mismos, y metodos de diagnostico del smdrome de Sjogren que utilizan los anticuerpos.
K. Bayetto y R.M. Logan "Sjogren's syndrome: a review of aetiology, pathogenesis, diagnosis and management" (Australian dental journal, vol. 55, 1 Junio 2010, paginas 39-47) ofrecen una revision de las manifestaciones asociadas al smdrome de Sjogren y a los factores que tienen un papel en su etiologfa y patogenesis.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para determinar si un individuo humano tiene la enfermedad de Sjogren (SD). El metodo comprende determinar por una muestra biologica del individuo la presencia de anticuerpos que actuan en contra de la protema de las glandulas salivales 1 (SP-1), la protema secretora parotida (PSP) o la anhidrasa carbonica 6 (CA6), o determinar una combinacion de los anticuerpos. Determinar que el individuo tiene SD en base a la presencia de los anticuerpos. Tambien se proporciona un metodo para determinar que un individuo no tiene SD, que comprende determinar por una muestra biologica obtenida del individuo la ausencia de deteccion de anticuerpos contra PSP y SP-1 y determinar en base a la ausencia de deteccion de los anticuerpos que el individuo no tiene SD. El individuo tambien puede tener menos anticuerpos contra CA6 con respecto a un paciente que tiene SD. Puede utilizarse cualquier protema PSP o CA6. Sin embargo, no hay homologo humano conocido contra SP-1, y la invencion proporciona en consecuencia un nuevo e inesperado descubrimiento de que los seres humanos con SD producen autoanticuerpos que reconocen SP-1 no humano, y en particular SP-1 murina. Se espera que la SP-1 producida en otros mairnferos no humanos tambien pueda ser utilizada para la deteccion de anticuerpos anti-SP-1.
El metodo de la invencion se puede utilizar para diagnosticar SD en cualquier individuo de cualquier edad o sexo, y en cualquier etapa de la enfermedad. En una realizacion, la invencion se utiliza para detectar SD precoz.
Los anticuerpos que estan asociados positivamente a la SD y que se describen adicionalmente en este documento pueden detectarse usando cualquier metodo y/o reactivos adecuados para la deteccion de anticuerpos. En una realizacion, los anticuerpos se detectan utilizando un ensayo ELISA.
La invencion tambien proporciona el uso de kits en el metodo de la invencion que comprenden los antfgenos a los que se dirigen los anticuerpos de pacientes con SD y pueden comprender ademas componentes para la recogida de muestras biologicas, reactivos para la deteccion de anticuerpos, reaccion de control y otros materiales utiles para la deteccion de anticuerpos. En una realizacion, la invencion proporciona el uso de un kit que comprende protemas SP- 1, PSP y CA6 purificadas o fragmentos de las mismas que son reconocidos por anticuerpos producidos por pacientes con SD. Las protemas se pueden proporcionar de forma aislada y purificada, y pueden asociarse de manera covalente o no covalentemente a una matriz solida.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 proporciona una representacion fotografica de Western blot para autoanticuerpos en los sueros de ratones IL-14aTG durante las primeras etapas de la enfermedad de Sjogren. Para obtener los datos resumidos en la figura 1, se recogieron sueros de ratones IL-14aTG y ratones NOD y C57BL/6 a los 7 meses de edad. Se utilizaron la protema de las glandulas salivales 1 (SP-1), la protema secretora parotida (PSP) y la anhidrasa carbonica 6 (CA6) purificadas y expresadas de manera personalizada para ejecutar Western blots con estos sueros. Los datos mostrados son representativos de 6 ratones estudiados en cada grupo. El panel izquierdo muestra el suero de un raton IL-14aTG que reconoce CA6 y PSP de manera clara y SP-1 de manera debil. El panel central muestra el mismo estudio con el suero de un raton C57BL/6. Los sueros C57BL/6 no se adhirieron a ninguno de estos autoantfgenos. El panel derecho muestra el mismo estudio con el suero de un raton NOD. Tanto CA6 como PSP son reconocidas de manera clara por este suero.
La figura 2 proporciona una representacion fotografica de resultados de Western blots que demuestran que se encuentra linfotoxina en las secreciones de las glandulas salivales de ratones IL-14a Tg, aunque no de controles de companeros de camada.
La figura 3 proporciona una representacion grafica de datos que muestran que se encuentra linfotoxina en los sueros de pacientes seleccionados con la enfermedad de Sjogren.
La figura 4 proporciona una representacion fotografica de Western blots que muestra autoanticuerpos en los sueros en las glandulas salivales de ratones IL-14aTG.LTA -/-. Los datos muestran que el suero de un raton IL-14aTG.LTA - /- a los 11 meses de edad reacciona con CA6 y PSP.
La figura 5 proporciona una representacion fotografica de resultados de Western blots que muestra que los sueros de pacientes con la enfermedad de Sjogren contienen autoanticuerpos contra CA6, PSP y SP-1. Los Western blots se realizaron como en la figura 1 exceptuando que los sueros fueron utilizados a partir de pacientes con la
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enfermedad de Sjogren o de controles normales por grupo de edad. Se evaluaron cinco pacientes y dos controles normales. Los datos mostrados son representativos de un paciente (los cinco pacientes mostraron resultados similares) y de un control normal (ambos controles normales mostraron resultados similares). Los pacientes con SD, aunque no los controles normales, tienen anticuerpos contra PSP y SP-1.
Descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para determinar si un individuo humano tiene la enfermedad de Sjogren (SD). El metodo comprende determinar por una muestra biologica obtenida del individuo la presencia de anticuerpos contra la protema de las glandulas salivales 1 (SP-1), la protema secretora parotida (PSP) o la anhidrasa carbonica 6 (CA6), o determinar la presencia de una combinacion de anticuerpos SP-1, PSP y CA6. Se determina que el individuo tiene SD si estan presentes tales anticuerpos o combinaciones de los mismos.
La invencion proporciona la primera identificacion de una correlacion positiva entre la SD y anticuerpos contra cualquiera de SP-1, PSP y CA6. Nuestro descubrimiento de que los pacientes humanos con SD producen anticuerpos que reconocen SP-1 murina era particularmente inesperado porque no hay ningun homologo humano conocido de esta protema. Por tanto, la invencion proporciona un metodo sorprendente y novedoso para la identificacion de individuos que tienen SD. La invencion proporciona ademas la identificacion de un individuo sin SD si los anticuerpos contra SP-1 y PSP no son detectados en una muestra biologica obtenida del individuo.
Ademas de los anticuerpos contra SP-1, PSP y CA6, se pueden determinar anticuerpos contra otros marcadores en el metodo de la invencion para evaluar si una persona tiene o no tiene SD. Ejemplos no limitativos de tales anticuerpos incluyen los que actuan en contra de linfotoxina (LTA), mucina 10 (mucina de las glandulas salivales submandibulares), amilasa salival 1, Ro, La, receptor muscannico 3, fodrina y las citoquinas IL-14 e interferon-a.
Nuestra demostracion de que la produccion de anticuerpos contra SP-1, PSP y CA6 son indicativos de SD se complementa con la investigacion que realizamos en modelos de animales clmicamente relevantes de SD. En este sentido, hemos desarrollado un modelo de animal que reproduce todas las caractensticas inmunologicas y clmicas observadas en pacientes con SD en el mismo margen de tiempo relativo. El modelo de animal que hemos desarrollado se conoce como el raton transgenico IL-14alpha (IL14aTG). Utilizando este modelo, hemos demostrado que la infiltracion linfodtica de las glandulas salivales se produce despues de que las glandulas ya han sido destruidas y de que solo un pequeno porcentaje de los ratones desarrollan anticuerpos contra Ro y La. Nuestros datos tambien demuestran que LTA es importante para una lesion temprana de las glandulas salivales en modelos de raton IL14aTG y NOD de SD, y que los ratones IL-14aTG que carecen de LTA (IL-14aTG.LTA -/-) conservan la funcion normal de las glandulas salivales y no sufren ninguna infiltracion linfocftica de sus glandulas salivales. Tambien demostramos que LTA se encuentra en el suero de pacientes humanos con SD.
Los ratones IL-14aTG, al igual que los pacientes con SD, producen interferon-a (IFN-a) sistemicamente y linfotoxina (LTA) localmente en las glandulas salivales. Los autoanticuerpos se depositan en las glandulas salivales en el momento en el que se pierde la funcion de las glandulas salivales. Los autoantfgenos reconocidos en esta etapa son diferentes de los autoantfgenos observados mas tarde en la enfermedad, Ro y La, que tradicionalmente han sido observados como caractensticos de SD. Tambien hemos demostrado en este modelo que la funcion de las glandulas salivales se pierde antes de la infiltracion de las glandulas salivales con linfocitos. En resumen, y sin la intencion de estar limitados por ninguna teona particular, se considera que los ratones IL-14aTG reproducen todas las caractensticas de SD observadas en pacientes en el mismo margen de tiempo relativo. Ademas, la SD se produce en todos los ratones IL-14aTG analizados. La evolucion temporal de SD en ratones IL-14aTG es 1) produccion de hipergammaglobulinemia y anticuerpos tempranos a los 6 meses de edad, 2) disminucion de la funcion de las glandulas salivales con la infiltracion linfodtica de solo las glandulas submandibulares, aunque con deposicion de anticuerpos en las glandulas submandibulares y parotidas a los 10 meses, 3) infiltracion linfodtica de las glandulas submandibulares, parotidas y lacrimales con celulas B y T y celulas plasmaticas, junto con enfermedad renal y pulmonar leve a los 14 meses, y 4) linfoma de celulas grandes B a los 18 meses. Hay que tener en cuenta que la perdida de funcion de las glandulas salivales se produce varios meses antes de la infiltracion linfodtica de las glandulas salivales, lo que indica que hay lesion mediada por anticuerpos y/o citoquinas que se produce antes de la infiltracion linfocftica de las glandulas. Ademas, como se senalo anteriormente, los ratones IL-14aTG generalmente no producen anticuerpos anti-Ro y anti-La durante las primeras etapas de la enfermedad. El patron de inmunofluorescencia para la deposicion de inmunoglobulina en las glandulas salivales vana con el tiempo, lo que sugiere que es probable que diferentes autoantfgenos sean importantes en varias etapas de la enfermedad. Ademas, los ratones IL-14aTG no desarrollan diabetes, como los ratones NOD, o glomerulonefritis proliferativa, como los ratones (NZB x NZW) Fl y MRL/lpr. El raton IL-14aTG es, pues, el unico modelo de animal de SD que desarrolla todas las caractensticas de la enfermedad de Sjogren, en ausencia de otras enfermedades autoinmunes. De acuerdo con ello, los ratones IL-14aTG e IL-14aTG.LTA son valiosos para la identificacion de episodios tempranos en el desarrollo de SD.
Identificamos los antfgenos SD descritos en este documento, en parte, mediante el examen de la expresion de mRNA en el bazo de ratones IL14aTG. Hemos producido antfgenos purificados codificados por estos mRNA y hemos demostrado que los modelos de raton IL14aTG y NOD de SD desarrollan anticuerpos contra estos antfgenos
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durante el ciclo inicial de la enfermedad (Figura 1). Tambien hemos demostrado que la linfotoxina esta presente en las secreciones de las glandulas salivales de ratones IL14aTG durante el ciclo inicial de su enfermedad, y que la eliminacion de la linfotoxina previene el desarrollo de lesiones de las glandulas salivales (Figura 2). Hemos demostrado que la linfotoxina esta presente en los sueros de pacientes humanos con SD (Figura 3). Ademas, hemos demostrado la presencia de anticuerpos contra los antigenos de SD en ratones IL-14aTG.LTA -/- (Figura 4.) Mas aun, tambien demostramos que los sueros de pacientes humanos con SD contienen autoanticuerpos contra CA6, PSP y SP-1 (la ultima de las cuales, como se describe mas arriba, no tiene homologo humano conocido), mientras que los controles normales no tienen anticuerpos contra PSP-1 o SP-1, y tienen unicamente una respuesta de anticuerpos debil contra CA6 (Figura 5). La respuesta de anticuerpos contra CA6 era mas clara en pacientes con SD que en controles normales.
Cada uno de los marcadores de SD para el que estan establecidos los anticuerpos de acuerdo con el metodo de la invencion, esta bien definido y se conoce de sobra en la tecnica y sus secuencias de codificacion y de aminoacidos estan disponibles en el GenBank. Cada referencia de GenBank presentada en esta descripcion se incorpora aqu como referencia en la fecha de esta invencion. Se espera que cualquier antfgeno CA6, pSp y SP-1 de mairnfero (con la salvedad de que no se conoce ningun homologo humano de SP-1) pueda ser utilizado con cualquiera de una amplia variedad de inmunoensayos establecidos en el metodo de la invencion para determinar si un individuo produce o no anticuerpos que actuan en contra de los antigenos. En una realizacion, PSP murina se describe mediante las secuencias presentadas en la entrada de GenBank NM_008.953.2. En una realizacion, SP-1 murina se describe mediante las secuencias presentadas en la entrada de GenBank NM_009267.2. En una realizacion, CA6 se describe mediante las secuencias presentadas en la entrada de GenBank NM_009802.2.
Los antfgenos de protemas que se utilizan para la deteccion de autoanticuerpos de acuerdo con el metodo de la invencion se pueden preparar usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, cualquier secuencia de ADN que codifica los antfgenos se puede hacer usando tecnicas estandar e insertar en cualquier numero de vectores de expresion. En la literatura, se han descrito vectores de expresion adecuados y muchos estan disponibles comercialmente. Asimismo, una amplia variedad de sistemas de expresion son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente, incluidos los sistemas de procariotas y eucariotas. Las protemas se pueden aislar de los sistemas de expresion o de cualquier otra fuente adecuada y purificar para usar en la invencion en cualquier grado deseado de pureza.
La muestra biologica obtenida del individuo puede ser cualquier muestra biologica que comprenda anticuerpos, y puede comprender tejido biologico y/o lfquido biologico. En varias realizaciones, el lfquido biologico es sangre, suero o saliva.
Los autoanticuerpos que se correlacionan positivamente con la SD, como se describe en el presente documento, se pueden detectar usando cualquier tecnica, dispositivo, sistema y/o reactivos adecuados, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente y/o son de otro modo bien conocidos por los expertos en la tecnica. En varias realizaciones, tecnicas de deteccion adecuadas incluyen, aunque no se limitan necesariamente a, tecnicas inmunohistologicas, Western blot, placas de ensayo de pocillos multiples adaptadas para la deteccion de los anticuerpos, microesferas adaptadas para la deteccion de los anticuerpos, un dispositivo o tira de flujo lateral que esta adaptada para la deteccion de los anticuerpos, ensayos ELISA o cualquier modificacion de un ensayo ELISA que sea adecuado para la deteccion de los anticuerpos. Ademas, cualquiera y todos los isotipos de los anticuerpos pueden ser detectados. Se considera que los primeros anticuerpos son todos o predominantemente IgM y los anticuerpos posteriores se componen de IgM e IgG. Por tanto, si se desea, la invencion se puede adaptar para discriminar entre isotipos para ayudar a determinar, por ejemplo, la etapa de la enfermedad
El metodo de la invencion es adecuado para realizarlo en una muestra biologica obtenida de un individuo de cualquier edad o sexo. El metodo puede realizarse una vez, o se puede realizar una serie de pruebas, por ejemplo, para monitorizar la respuesta de un individuo a un tratamiento.
En una realizacion, la invencion es adecuada para la determinacion precoz de la SD. La SD precoz se considera que es una etapa de la SD antes de que disminuya la funcion de las glandulas salivales y/o lagrimales hasta un punto en el que los smtomas clmicos de la SD se ponen de manifiesto. Los expertos en la tecnica seran capaces de reconocer la SD precoz, particularmente cuando se proporciona el beneficio de la presente descripcion. Ademas, la invencion proporciona en algunos individuos, tales como aquellos con otras enfermedades autoinmunes o un historial familiar de SD, pruebas para SD antes de que aparezca cualquier smtoma.
En una realizacion, la invencion comprende fijar el resultado de realizar el metodo de la invencion en un medio tangible de expresion, tal como un registro informatico digitalizado. La invencion comprende, ademas, comunicar el resultado de la realizacion del metodo de la invencion a un profesional de la salud.
La invencion tambien proporciona el uso de kits en el metodo de la invencion que comprenden los antfgenos a los que se dirigen los anticuerpos de pacientes con SD y pueden comprender ademas componentes para la recogida de muestras biologicas y reactivos para la deteccion de anticuerpos, controles positivos y similares. En una realizacion, la invencion proporciona el uso de un kit que comprende protemas SP-1, PSP y CA6 purificadas o fragmentos de las
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mismas que son reconocidos por anticuerpos producidos por pacientes con SD. Los fragmentos de estas protemas que pueden ser reconocidos por anticuerpos producidos por individuos que tienen SD se pueden determinar utilizando tareas rutinarias si se ofrece el beneficio de la presente descripcion. En general, los fragmented tendran una longitud de 9 aminoacidos, hasta un aminoacido menor que la longitud total de las protemas, e incluiran todos los numeros enteros de 9 aminoacidos hasta un aminoacido menor que la longitud total de las protemas, inclusive. Por tanto, todos y cada uno de los fragmentos de estas protemas se consideran parte de la presente descripcion para su uso en la presente invencion. Cada uno de estos fragmentos puede hacerse y probarse para determinar si los anticuerpos de los individuos que tienen SD reconocen los fragmentos. Las protemas o fragmentos de las mismas se pueden proporcionar de forma aislada y purificada y pueden asociarse a una matriz solida. La matriz solida puede estar presente como un componente de cualquier sistema que pueda utilizarse para la deteccion de anticuerpos, tales como placas de ensayo de multiples pocillos, microesferas, dispositivos o tiras de flujo lateral o cualquier otra forma o formato que sea adecuado para mantener las protemas en una posicion en la que los anticuerpos puedan adherirse a ellos y ser detectados en el metodo de la invencion. Las protemas pueden estar asociadas de manera covalente o no covalentemente a la matriz solida.
Los siguientes ejemplos estan destinados a ilustrar ciertas realizaciones de la invencion, aunque no pretenden limitar la invencion.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra la produccion de autoanticuerpos en el suero de modelos de raton SD en las primeras etapas de SD.
Con el fin de obtener los resultados presentados en la figura 1, se recogieron sueros de ratones IL-14aTG, NOD y ratones C57BL/6 a los 7 meses de edad. Expresamos y purificamos SP-1, PSP y CA6 y utilizamos las protemas purificadas para el analisis Western blot. Los datos mostrados son representativos de 6 ratones estudiados en cada grupo. El panel izquierdo muestra el suero de un raton IL-14aTG que reconoce CA6 y PSP de manera clara y SP-1 de manera debil. El panel central muestra el mismo estudio con el suero de un raton C57BL/6. Ninguno de estos autoantfgenos se adhirio mediante sueros C57BL/6. El panel derecho muestra el mismo estudio con el suero de un raton NOD. Tanto CA6 como PSP son reconocidas de manera clara por este suero.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra que LTA se encuentra en las secreciones de las glandulas salivales de ratones IL-14aTG pero no en controles de companeros de camada. Con el fin de obtener los resultados de los datos presentados en la figura 2, se recogieron secreciones de las glandulas salivales de ratones IL-14a TG y de varios ratones de control a los 12 meses de edad. Se realizaron ensayos Western blot en espedmenes no diluidos. Las pistas 1 y 2 son de ratones IL-14a TG, las pistas 3 y 4 son de ratones IL-14aTG. LTA -/-, las pistas 5 y 6 de ratones LTA -/- y las pistas 7 y 8 de ratones C57BL/6. Tambien analizamos la histologfa de las glandulas parotidas y submandibulares en ratones IL-14aTG.LTA -/-. Estas son normales.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que LTA se encuentra en los sueros de pacientes humanos con SD. Con el fin de obtener los resultados que se presentan en la figura 3, se obtuvieron sueros de 6 donantes normales (la edad y el sexo coincidfan con los de los 6 pacientes con enfermedad de Sjogren) y 12 pacientes con enfermedad de Sjogren. Se determinarion los niveles de linfotoxina mediante un ELISA disponible comercialmente (R & D Systems, Inc). La diferencia entre los niveles sericos de linfotoxina entre controles normales y pacientes con la enfermedad de Sjogren fue estadfsticamente significativa (p = 0,0011).
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra la identificacion de autoanticuerpos en los sueros y las glandulas salivales de ratones IL- 14aTG.LTA -/-. Los datos presentados en la figura 4 muestran que el suero de un raton IL-14aTG.LTA -/- a los 11 meses de edad reacciona con SP-1, CA6 y PSP. El Western blot se realizo como se indica en la figura 1.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra que el suero obtenido de pacientes humanos con SD contiene anticuerpos contra CA6 murina, pSp murina y SP-1 murina. Se realizaron Western blots basicamente como se describe para la figura 1, excepto que se utilizaron sueros de pacientes con SD o de controles normales con la misma edad. Se evaluaron cinco pacientes y dos controles normales. Los datos mostrados son representativos de un paciente (los cinco pacientes mostraron resultados similares) y de un control normal (ambos controles normales mostraron resultados similares). Los pacientes con SD aunque no controles normales tienen anticuerpos contra PSP y SP-1. La respuesta de anticuerpos contra CA6 era mas clara en pacientes con SD que en controles normales. Por tanto, hemos
demostrado que la presencia de anticuerpos contra CA6, PSP y CA6 se puede utilizar para diagnosticar SD en seres humanos.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para determinar si un individuo humano tiene la enfermedad de Sjogren (SD) que comprende
    i) determinar por una muestra biologica del individuo la presencia de anticuerpos que actuan en contra de cualquiera de las siguientes, protema de las glandulas salivales 1 (SP-1), protema secretora parotida (PSP) o anhidrasa carbonica 6 (CA6), o determinar la presencia de una combinacion de dichos anticuerpos, y determinar que el individuo tiene SD en base a la presencia de los anticuerpos; o
    determinar por una muestra biologica obtenida del individuo la ausencia de deteccion de anticuerpos contra PSP y SP-1 y determinar en base a la ausencia de deteccion de los anticuerpos que el individuo no tiene Sd.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la combinacion de los anticuerpos incluye anticuerpos contra SP-1.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el individuo tiene SD precoz.
  4. 4. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la determinacion de los anticuerpos se lleva a cabo mediante ensayo ELISA.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, en el que los anticuerpos en la muestra biologica que actuan en contra de SP-1 se adhieren/bind a SP-1 murina en el ensayo ELISA.
  6. 6. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el individuo que no tiene SD tiene una menor cantidad de anticuerpos contra CA6 que un individuo que tiene SD.
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas determinar la presencia o ausencia de autoanticuerpos contra cualquiera de los siguientes, linfotoxina (LTA), mucina 10 (mucina de las glandulas salivales submandibulares), amilasa salival 1, Ro, La, receptor muscarmico 3, fodrina, IL-14, interferon-a, o combinaciones de los anteriores.
  8. 8. Uso en el metodo segun la reivindicacion 1 de un kit que comprende protema de las glandulas salivales 1 (SP-1) o un fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con la enfermedad de Sjogren (SD), protema secretora parotida (PSP) o un fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con SD, anhidrasa carbonica 6 (CA6) o un fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con SD, o combinaciones de los anteriores.
  9. 9. Uso segun la reivindicacion 8, en el que dicha SP-1 o un fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con SD, dicha PSP o fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con SD, y dicha CA6 o un fragmento de la misma que es reconocido por anticuerpos de un individuo con SD estan asociados a una matriz solida.
  10. 10. Uso segun la reivindicacion 9, en el que la matriz solida se selecciona a partir de placas de ensayo de multiples pocillos, microesferas y dispositivos o tiras de flujo lateral.
  11. 11. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dichos fragmentos que son reconocidos por anticuerpos de un individuo con SD tienen una longitud que tiene 9 aminoacidos hasta un aminoacido menor que la longitud total de las protemas.
  12. 12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o uso segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que los anticuerpos contra la protema de las glandulas salivales 1 (SP-1) reconocen SP-1 murina.
  13. 13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biologica es un lfquido biologico seleccionado de sangre, suero y saliva.
  14. 14. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la determinacion de los anticuerpos se lleva a cabo mediante una tecnica seleccionada de tecnicas inmunohistologicas, de Western Blot, de placas de ensayo de multiples pocillos adaptadas para la deteccion de los anticuerpos, de microesferas adaptadas para la deteccion de los anticuerpos, de un dispositivo o tira de flujo lateral que esta adaptada para la deteccion de los anticuerpos y de ensayos ELISA.
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