WO2017221744A1 - 肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット - Google Patents

肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット Download PDF

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WO2017221744A1
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hsa
mir
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lung cancer
mirna
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隆 高橋
聖 柳澤
昌弘 中杤
香平 横井
健志 若井
真理子 内藤
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国立大学法人名古屋大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing information for lung cancer examination, a lung cancer examination method, a lung cancer examination apparatus, a program and a recording medium for a lung cancer examination apparatus, and a miRNA measurement kit for lung cancer examination.
  • lung cancer In most developed countries, including Japan, death from lung cancer is the first among deaths by region due to cancer. For lung cancer, various treatments have been improved and testing methods for early detection have been improved. In Japan, about 70,000 lung cancer patients (hereinafter simply referred to as “patients”) May have died).
  • X-ray examinations X-rays
  • sputum cytology sputum cytology
  • blood tests tumor markers
  • CT test is known as a test for examining in detail whether there is a suspicion of cancer or whether it is another disease when an abnormality is found in a medical examination or the like.
  • bronchoscopy, thoracoscopy, percutaneous lung biopsy, and the like are known as tests for directly observing and confirming lesions when there is a suspicion of cancer.
  • CEA which is the most common marker, shows a high value in glandular cancer
  • SCC which is a tumor marker for estimating the presence or absence of squamous cell carcinoma
  • NSE which is a marker used in the examination of small cell lung cancer
  • CYFRA21-1 which is a marker showing high levels of cancer
  • a marker for small cell lung cancer which is a useful marker that reacts well at the time of recurrence / progression
  • ProGRP ProGRP
  • SLX that is an effective marker for determining the progression of adenocarcinoma, etc.
  • lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma the abundance of hsa-miR-126, has-miR-205, and has-miR-21 is increased or decreased, and the expression of hsa-miR-155 is increased.
  • Lung adenocarcinoma patients with high or low expression of hsa-let-7a-2 have a worse prognosis than patients with low expression of hsa-miR-155 or high expression of hsa-let-7a-2 (See Patent Document 2).
  • Patent Documents 1 and 2 are inventions related to miRNA markers for predicting the prognosis of lung cancer. Therefore, the methods described in Patent Documents 1 and 2 are intended for patients who already have lung cancer. Development of a test method using miRNA markers that can test whether a subject suffers from lung cancer even at an early stage using blood collected at the time of medical examination is desired. However, miRNA markers for lung cancer testing are not known.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned conventional problems, and as a result of intensive studies, at least hsa-miR-451a (Accession: MIMAT0001631), hsa-miR- in the blood of a subject. It was newly found that information for examining lung cancer can be provided by measuring the abundance of 1290 (Accession: MIMAT0005880) and hsa-miR-636 (Accession: MIMAT0003306), thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing information for lung cancer testing, a lung cancer testing method, a lung cancer testing device, a program and a recording medium for a lung cancer testing device, and a miRNA measurement kit for lung cancer testing. That is.
  • the present invention relates to a method for providing information for lung cancer testing, a lung cancer testing method, a lung cancer testing device, a program and a recording medium for a lung cancer testing device, and a miRNA measurement kit for lung cancer testing, as described below.
  • a method for providing information for lung cancer testing by measuring the abundance of miRNA, Measuring the abundance of at least hsa-miR-451a (Accession: MIMAT0001631), hsa-miR-1290 (Accession: MIMAT0005880) and hsa-miR-636 (Accession: MIMAT0003306) in the blood of the subject;
  • To provide information for lung cancer testing including (2) In the step of measuring the abundance, in addition to the miRNA according to claim 1, hsa-miR-30c-5p (Accession: MIMAT0000244), hsa-miR-19b-3p (Accession: MIMAT00000074), hsa- miR-22-5p (Accession: MIMAT0004495), hsa-miR-486-5p (Accession: MIMAT0002177), hsa-miR-20b-5p (Accession: MIMAT0001413), hsa-miR-93-5p (Accession
  • the step of measuring the abundance measures the abundance of all miRNAs according to claim 1 and claim 2.
  • Storage means for storing at least a test model constructed in advance based on the abundance of the miRNA according to any one of (1) to (3) expressed in the blood of a lung cancer patient; By applying the abundance of the miRNA described in any one of (1) to (3) above in the subject's blood to a test model stored in the storage means, and calculating the score Testing means to test for lung cancer, Lung cancer inspection device.
  • (11) including a probe for measuring the abundance of all miRNAs according to (9) and (10) above, The kit for measuring miRNA for lung cancer examination according to (10) above.
  • (12) hsa-miR-223-3p (Accession: MIMAT0000280), hsa-miR-342-3p (Accession: MIMAT000053), hsa-miR-21-5p (Accession: MIMAT00000076), hsa-miR-320a (Accession: A probe that measures the abundance of at least one miRNA selected from MIMAT000010), hsa-miR-106b-5p (Accession: MIMAT0000680) and hsa-miR-126-3p (Accession: MIMAT000045).
  • the above-mentioned miRNA access numbers are all miRBBase (http://www.mirbase.org) numbers. Hereinafter, Access may be omitted.
  • the present invention can provide information for examination of lung cancer by measuring the abundance of at least hsa-miR-451a, hsa-miR-1290, and hsa-miR-636 in the blood of a subject. Therefore, it is possible to examine lung cancer based on blood collected at the time of medical examination or the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a procedure for creating an inspection model and a verification procedure for the created inspection model.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a lung cancer inspection apparatus.
  • FIG. 3 is a diagram showing a process for inspecting a subject using the inspection apparatus of the present invention.
  • FIG. 4A is a diagram showing a procedure for searching for and determining candidates for an internal standard.
  • FIG. 4B is a graph showing a stability value of each candidate miRNA of the internal standard.
  • FIG. 4C (a) shows the Raw Ct values of hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, and hsa-miR-21-5p of lung adenocarcinoma patients (AD) and healthy subjects (HS).
  • (B) is a graph showing an average of Raw Ct values of hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, and hsa-miR-21-5p.
  • FIG. 5A shows the procedure for searching and determining miRNA for lung cancer testing.
  • FIG. 5B is a graph showing an error rate when 1 to 178 miRNAs are selected.
  • FIG. 5C (a) is a graph showing the result of the examination of the teacher group using the created examination model
  • FIG. 5C (b) is a graph showing the ROC curve of an AD patient vs. a healthy person (HS).
  • FIG. 6A is a graph showing the result of inspecting the verification group using the created inspection model.
  • FIG. 6B (a) is a graph showing ROC analysis of AD patient vs healthy subject (HS) in the verification group
  • FIG. 6B (b) shows ROC analysis of AD patient vs non-AD patient (HS + BPD) in the verification group. It is a graph.
  • FIG. 6C is a graph showing the results of testing applied to the test model in which the AD patients in the verification group shown in Table 1 were created.
  • FIG. 6D is a graph showing a result of an examination applied to an examination model in which cancer patients other than AD patients are created.
  • test apparatus Lung cancer testing apparatus
  • program lung cancer testing apparatus program
  • recording medium Lung cancer testing apparatus
  • kit test miRNA measurement kit
  • the type of “lung cancer” in the present invention includes adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, non-small cell lung cancer such as large cell cancer, and small cell lung cancer such as small cell cancer. It is done.
  • the sample used in the method of the present invention is blood.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a procedure for creating an inspection model and a verification procedure for the created inspection model.
  • blood samples of various cancer patients and healthy persons are collected.
  • serum serum (sample) is isolated from collected blood of lung adenocarcinoma (AD) patients and healthy volunteers (HS) classified into a training group, and TaqMan Human MicroRNA Using Arrays (cards A and B; 768 types of miRNA can be detected), the abundance of various miRNAs expressed in the sample is measured.
  • a kit for measuring the abundance of the miRNA specified for the lung cancer test by “Classifier construction” is prepared.
  • various cancer patients classified into a test group lung adenocarcinoma: AD 110); lung squamous cell carcinoma (squamous cell lung carcinoma: SQ) 27; lung large cells Cancer (Large cell lung: LC) 10 people; Gastric cancer (GC) 18 people; Colorectal cancer (CRC) 20 people; Pancreatic cancer (Pan) 18 people; Ovarian cancer (Ovarian cancer: Ova) 20 people; Breast cancer (Br) 20 people>, Benign pulmonary disease (BPD) 47 people, and Separating serum (sample) from normal persons (HS) 110 people collected blood to measure the abundance of miRNA in a sample by using a kit produced. Then, the abundance of the measured miRNA is applied to the test model created from the miRNA specified for the lung cancer test, and the superiority of the created test model is verified.
  • Combination (1) As shown in the Examples described later, as a miRNA specific to lung cancer patients compared to healthy individuals, at least a combination of hsa-miR-451a, hsa-miR-1290 and hsa-miR-636 (hereinafter this combination is referred to as “ Combination (1) ”).
  • At least the abundance of the combination (1) may be measured, but in order to improve the accuracy of the inspection method, in addition to the abundance of the combination (1), hsa-miR -30c-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-34b -3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-1274a, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-628-5p, hsa -MiR-486-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-645 and hsa
  • the abundance of all miRNAs described in the combination (1) and the combination (2) may be measured.
  • the abundance of miRNA in the sample may be corrected based on the abundance of miRNA for normalizer.
  • the normalizer miRNA is not particularly limited as long as it is a miRNA that is expressed in the blood of any healthy subject and lung cancer patient and has a small difference in abundance.
  • hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-106b-5p and hsa-miR-126-3p (hereinafter, This combination may be referred to as “combination (3)”).
  • hsa-miR-223-3p having the smallest difference in the abundance in the blood of healthy subjects and lung cancer patients may be used alone or in combination.
  • the miRNA shown in the combination (1) is different in the abundance of healthy subjects and lung cancer patients. Therefore, information for lung cancer testing can be provided by measuring at least the abundance of the miRNA in combination (1). Further, if necessary, the abundance of one or more miRNAs selected from the combination (2) or the abundances of all miRNAs in the combination (2) are also measured, so that a more accurate lung cancer test can be performed. Information can be provided.
  • the test method of the present invention tests whether or not a subject suffers from lung cancer based on the abundance of miRNA expressed in at least the combination (1) expressed in blood collected from the subject. It is characterized by.
  • the test is not particularly limited as long as it can be tested based on the abundance of miRNA shown in the measured combination (1).
  • a test model discriminant
  • create a threshold The measured miRNA abundance is applied to a test model, a score is calculated, and if necessary, a test can be performed to determine whether or not the patient has lung cancer.
  • the computer can be used as an inspection device.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the inspection apparatus.
  • the inspection apparatus 1 includes at least an input unit 2, an inspection model, a storage unit 3 that stores a threshold as necessary, an inspection unit 4, a control unit 5, and a program memory 6.
  • the input means 2 is not particularly limited as long as it can input information on the abundance of miRNA measured from the blood of the subject to the test apparatus 1, and examples thereof include a keyboard and a USB.
  • the input means 2 may use an internet line. For example, information on the abundance of miRNA measured from the blood of a subject measured at a remote hospital using an internet line is transmitted to and input to the testing apparatus 1, and the test result is sent remotely via the internet line. Appropriate tests can also be performed on subjects in local hospitals.
  • the storage means 3 stores an inspection model and a threshold value as necessary.
  • the inspection unit 4 calculates the score by applying the information on the abundance of the miRNA of the subject input by the input unit 2 to the inspection model stored in the storage unit 3, and further compares it with a threshold as necessary. Whether or not the subject suffers from lung cancer can be examined.
  • the program memory 6 stores a program for causing the computer shown in FIG. 2 to function as the inspection apparatus 1. When this program is read and executed by the control unit 5, operation control of the input unit 2, the storage unit 3, and the inspection unit 4 is performed.
  • the program may be stored in advance in a computer, or may be recorded on a recording medium together with an inspection model or a threshold value, and stored in the program memory 6 using an installation unit.
  • FIG. 3 is a diagram showing a process for inspecting a subject using the inspection apparatus 1 of the present invention.
  • the program stored in the program memory 6 is read out and executed by the control unit 5, and first, the abundance of miRNA shown in at least the combination (1) in the blood of the subject is input by the input means 2 (S100). ).
  • the abundance of miRNA in the blood may be input directly from the measurement result of the measurement apparatus for the abundance of miRNA connected to the test apparatus 1 or may be input from a separately measured measurement value.
  • the information of the abundance input by the input unit 2 is applied to the examination model stored in the storage unit 3 to calculate a score, and compared with a threshold as necessary (S110).
  • the obtained inspection result is displayed (S120).
  • the display method may be displayed on a display means of a computer, or may be printed out on paper or the like.
  • miRNA expressed in blood can be comprehensively measured using a commercially available miRNA microarray or the like, since it is not for lung cancer testing, the number of samples that can be measured with one microarray or the like is limited.
  • a miRNA unique to lung cancer patients was newly found. Therefore, a new kit can be prepared using only probes that can measure newly found miRNA combinations.
  • the form of the kit is not particularly limited as long as the abundance of miRNA corresponding to the probe can be finally measured.
  • a commercially available miRNA microarray there are an array form in which probes are attached to a plate, a liquid form in which probes are dispersed in a liquid for quantitative PCR, and a bead form in which probes are attached.
  • Examples of the probe used in the kit include probes that can measure the miRNA shown in the combination (1).
  • the probe that can measure one or more miRNAs selected from the combination (2), or the probe that can measure the abundance of all miRNAs in the combination (2) May be added. Since the miRNA shown in the combinations (1) and (2) can be measured with a commercially available miRNA microarray, a known probe may be used. Alternatively, a newly designed one may be used.
  • a probe that can measure miRNA for normalizer may be arranged in the kit.
  • the normalizer probe include probes that can measure one or more miRNAs selected from the combination (3).
  • the normalizer probe a known probe or a newly designed probe may be used.
  • RNA total RNA from blood sample
  • serum serum (sample) was separated from the blood of the subject by a conventional method. 400 ⁇ l was collected from the separated serum, and total RNA in the serum was separated using a miRVana PARIS kit (Ambion) according to the protocol. The separated total RNA includes miRNA in exosomes.
  • synthesized RNA synthesized RNA, ath-miR159a (MI0000189) was added to each sample as a spike control for evaluating RNA extraction. The total RNA concentration was quantified using a Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).
  • [Create miRNA profile] The human miRNA in each sample was profiled according to the protocol using ath-miR159a, TaqMan Human MicroRNA array Card (A, v2.0, 11 and B, v3.0, Life Technologies). Specifically, using TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (manufactured by Life Technologies), 6 ⁇ g of total RNA was reverse transcribed together with stem-loop Megaplex primers pool set A or B.
  • Reverse transcripts were pre-amplified using TaqMan PreAmp Master Mix and Megaplex PreAmp primers (manufactured by Life Technologies), and TaqMan Human MicroSriMetRimSemiTemSmTmSmTmSriTmSlMlSlTmSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlSlMlMlMlSlMlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlSlS
  • Table 1 shows the subjects who were analyzed in Example 1. There were 253 lung adenocarcinoma patients (AD), 143 for the teacher group and 110 for the verification group. In addition, there were 101 healthy persons (HS), 49 for the teacher group and 52 for the verification group. Table 1 shows the average age, the number of men, the number of women, and the number of patients with lung adenocarcinoma (AD) according to stage I-IV of the distinguished subjects.
  • AD lung adenocarcinoma patients
  • HS healthy persons
  • Table 1 shows the average age, the number of men, the number of women, and the number of patients with lung adenocarcinoma (AD) according to stage I-IV of the distinguished subjects.
  • FIG. 4A are diagrams showing a procedure for searching for and determining candidates for an internal standard.
  • FIG. 4A first, among AD patients (143 people) and healthy subjects (HS: 49 people) divided into teacher groups, 35 miRNAs were selected from miRNAs having a Ct value of less than 32. Selected as a candidate.
  • estimation by bootstrap resampling was performed.
  • the specific procedure is as follows. (1) From the original data (HS: 49 people, AD patient: 143 people), the operation of randomly selecting 192 cases of data was performed 10,000 times. At this time, the same case may be duplicated. As a result, 10,000 sets of different data having the same distribution as the original data were prepared.
  • Each data set was named Set 1 to Set 10,000.
  • the stability value of miRNA was calculated for each 10,000 sets.
  • the stability value is an index that indicates the stability of the gene expression level defined by NormFinder, and was developed as an index that shows a certain level of the miRNA expression level between different samples. .
  • the specific procedure of the calculation is (Andersen, CL, Jensen, JL & Orntoft, TF Normalization of real-quantitative reverse transcription-PCR data: a modd rations, as shown in FIG. for normalization, applied to blade and colon cancer data sets. Cancer Res. 64, 5245-5250 (2004)).
  • the median value was calculated from the values of 10,000 stability values obtained for each miRNA.
  • the candidate miRNAs were arranged in order with an intermediate value of the stability value.
  • hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320a, hsa- miR-106b-5p, hsa-miR-126-3p... were selected.
  • FIG. 4B shows the stability value of each candidate miRNA, and the horizontal line of each graph shows the median value.
  • FIG. 4C shows Raw Ct values of hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, and hsa-miR-21-5p of lung adenocarcinoma patients (AD) and healthy subjects (HS).
  • AD lung adenocarcinoma patients
  • HS healthy subjects
  • miRNAs with low stability values have low differences in the abundance of HS and AD in the blood, so they can be used alone as normalizers, respectively, but miRNAs with low stability values are combined. It has been clarified that the accuracy can be increased by using them.
  • three types of hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342-3p, and hsa-miR-21-5p were combined and used as a normalizer.
  • FIG. 5A shows a procedure for searching and determining miRNA for lung cancer testing.
  • the search for miRNA for lung cancer testing was performed by statistical processing of the abundance of each obtained miRNA.
  • the specific procedure is as follows. (1) The sample was divided into a training group and a verification group, and the teacher group was further randomly divided into training data and test data. Using training data, a classification model by weighted vote classification (Weighted Voting) that can construct a classification model using a plurality of variables was created. The created classification model evaluated the prediction performance based on Error rate using test data. (2) By repeating the construction of the classification model while increasing the number of candidate miRNAs one by one, sets with different numbers (m) of candidate miRNAs were created. (3) Furthermore, by repeating these steps n times, n sets in which the number of candidate miRNAs is m were created.
  • Weighted Voting weighted vote classification
  • the accuracy of discriminant models with different numbers of candidate miRNAs was evaluated using the error rate as an index, and the number M of candidate miRNAs appropriate for final classification was created.
  • M the number of candidate miRNAs
  • M ⁇ n miRNAs including duplicates
  • Mth the Mth from the miRNAs selected most frequently among the n models.
  • M miRNAs Up to M miRNAs were selected, and a final classification model based on the weighted vote classification was constructed using the selected miRNAs.
  • the constructed final classification model (inspection model) is verified by using data in a verification group different from the teacher group used in the creation, so that the reliability of the final classification model (inspection model) created can be verified. Can be evaluated.
  • miRNAs that have been selected many times when miRNA is narrowed down to 1 to 20 are shown in order.
  • “hsa-miR-451a” when miRNA was narrowed down to one was also selected in Tables 3 to 21.
  • “Hsa-miR-451a” and “hsa-miR-1290” when miRNA is narrowed down to two are also selected from Tables 4 to 21 and “hsa-miR-” when narrowed down to three.
  • the combination shown in Table 5 was 12.7%, about 12.0%, the combination shown in Table 6 was about 10.4%, and the combination shown in Table 7 was about 8.0%. Therefore, for example, the abundance is measured by combining at least three miRNAs shown in Table 4 with an error rate of about 12.7% (correct answer rate of about 87.3%), and the number of miRNA combinations is increased as necessary. May be.
  • the error rate showed the smallest value (about 4.98%) in the case of the 20 miRNAs shown in Table 21, so in the following examples, a test model was created using the miRNAs of the combinations shown in Table 21. did.
  • the created inspection model (discriminant) is shown below.
  • “coefficent1” and “mean1” in the test model are “coefficent” and “mean” of hsa-miR-1290, which is the miRNA with the number of selections shown in Table 22 below. These values are “ ⁇ 0.800973407150772” and “ ⁇ 0.258402900946032”. “Coefficent2” and “mean2”... Indicate the “coefficent” and “mean” values of the miRNAs ranked second. "MiRNA1”, “miRNA2” ... means “abundance of miRNA of the first rank" expressed in individual samples in 192 samples, "abundance of miRNA of the second rank" -Represents.
  • the risk score of each sample was calculated.
  • the risk score can be calculated by performing the same calculation.
  • the threshold may be set as appropriate based on the calculated risk score. For example, in the examples shown in FIGS. 5C, 6A, and 6C described later, the threshold value is set to 0, but other values may be used.
  • the inspection model is an inspection model created based on the Ct value.
  • a test model may be created based on the same statistical processing as described above based on the fluorescence intensity value.
  • the values of “coeffectent” and “mean” shown in Table 22 are “coefficient” and “mean” in the inspection model created based on the Ct value. Therefore, “coefficent” and “mean” when the examination model is created based on the fluorescence intensity values are different from those in Table 22. “Coefficent” is a weighting factor for calculating the risk score, and can be changed as appropriate.
  • FIG. 5C shows the results of an examination of 143 AD patients and 49 healthy persons (HS) in the teacher group using the created examination model.
  • (a) as a result of the test, since the test with Positive was 2.0% for HS and 94.4% for AD, the sensitivity was 94.4% and specificity ( (specificity) was 98%, and the overall classification accuracy was 95.3%.
  • (b) has shown the ROC curve of AD patient vs healthy subject (HS), and AUC (area under the curve: area under a concentration curve) was 0.991, which is a very high value.
  • Example 2 As described above, since the sensitivity and specificity of the test model prepared with the 20 miRNAs shown in Table 21 were high, the miRNAs and normalizers (hsa-miR-223-3p, hsa-miR-342 shown in Table 21). -3p and hsa-miR-21-5p), a kit that formed a probe capable of measuring the abundance of ThermoFisher Scientific was requested. In Example 2, the following verification was performed using a custom-made TaqMan low density array.
  • FIG. 6A shows the test results. 89.1% of AD patients tested positive for lung cancer, and 0% of healthy subjects (HS) tested positive for lung cancer. The rate of correct answers was high. In addition, 10.6% of lung benign neoplasm patients (BPD) were tested positive for lung cancer.
  • FIG. 6B (a) shows the ROC analysis of the AD patient vs. healthy person (HS) in the verification group, and the AUC value was 0.975, which is a very high value.
  • FIG. 6B (b) shows the ROC analysis of the AD patient vs. non-AD patient (HS + BPD) in the verification group, and the AUC value was 0.958, which was a very high value. From the above results, it is possible to test with high accuracy whether or not the subject suffers from lung cancer by using the test model created in the present invention.
  • FIG. 6C shows the results of testing by applying the miRNA abundance of AD patients (Stage I: 65, Stage II: 15; Stage III: 30) in the verification group shown in Table 1 to the created test model. .
  • the correct answer rate was 90.8% for Stage I, 100% for Stage II, and 80% for Stage III.
  • FIG. 6D shows the result of examining the abundance of miRNA in cancer patients other than AD patients by applying it to the created examination model.
  • the correct answer rate judged positive in lung squamous cell carcinoma (SQ) was 70.4%
  • the correct answer rate judged positive in lung large cell carcinoma (LC) was 70.0%.
  • the correct answer rate judged positive for cancers other than lung cancer was 22.2% for gastric cancer (GC), 25.0% for colorectal cancer (CRC), 38.9% for pancreatic cancer (Pan), It was 35.0% for ovarian cancer (Ova) and 0.0% for breast cancer (Br).
  • the created examination model is the examination of lung squamous cell carcinoma (SQ) and large cell lung cancer (LC) which are non-small cell lung cancer (NSCLC) other than lung adenocarcinoma (AD), that is, This proved useful for specific examination of non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • SQL lung squamous cell carcinoma
  • LC large cell lung cancer
  • AD lung adenocarcinoma
  • a lung cancer examination method By using a method for providing information for examining lung cancer according to the present invention, a lung cancer examination method, a lung cancer examination device, a program and a recording medium for a lung cancer examination device, and a miRNA abundance measurement kit, Whether or not the subject suffers from lung cancer can be accurately examined at an early stage. Therefore, it is useful for examination and research of lung cancer patients in research institutions such as medical institutions and university medical departments.

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Abstract

早期ステージであっても被検者が肺がんに罹患しているのか検査ができる肺がん検査用の情報を提供することを課題とする。　ｍｉＲＮＡの存在量を測定することによる肺がん検査用の情報を提供する方法であって、被検者の血液中の、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定する工程、を含む肺がん検査用の情報を提供する方法により、課題を解決できる。

Description

肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット
　本発明は、肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キットに関する。
　日本を含む殆どの先進諸国において、がんによる部位別死亡者数の中で、肺がんによる死亡は第１位を占めている。肺がんに対しては、様々な治療法の改良及び早期発見用の検査方法の改良が行われているが、日本においては毎年約７０，０００人の肺がん患者（以下、単に「患者」と記載することがある。）が死亡している。
　肺がんの検査についてはいくつかの方法があり、目的に応じて検査内容が異なる。例えば、健康診断などで行われるＸ線検査（レントゲン）、喀痰細胞診、血液検査（腫瘍マーカー）が知られている。また、健康診断などで異常が認められた場合に、がんの疑いがあるかどうか、又は他の病気ではないかどうかについてより詳しく調べるための検査として、ＣＴ検査が知られている。そして、がんの疑いがある場合に病変を直接観察して確かめるための検査として、気管支鏡検査、胸腔鏡検査、経皮肺生検等が知られている。
　上記検査方法の中で、血液検査（腫瘍マーカー）とは、がんが作り出す特殊な物質のうち、主として血液中で測定できるもので、がんの性質や広がりの目安を示すものとして使われている。具体的には、最も一般的なマーカーで、腺がんで高値を示すＣＥＡ；扁平上皮がんの有無を推測する腫瘍マーカーであるＳＣＣ；小細胞肺がんの検査で用いられるマーカーであるＮＳＥ；扁平上皮がんで高値を示すマーカーであるＣＹＦＲＡ２１－１；小細胞肺がんのマーカーであって、再発・進行時に良く反応する有用なマーカーであるＰｒｏＧＲＰ；腺がんの進行判定に有効なマーカーであるＳＬＸ等が知られている。
　また、上記に挙げたマーカー以外に、近年、ｍｉＲＮＡとがんとの関係が注目され、ｍｉＲＮＡの発現パターンをがんの検査に利用する研究が進められている。例えば、小細胞肺がん患者における予後を判定するための検査方法として、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１９６ａ、ｍｉＲ－２０３、ｍｉＲ－２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の存在量を測定する、小細胞肺がん患者における予後を判定するための検査方法が知られている（特許文献１参照）。
　また、肺腺がんや肺扁平上皮がんでは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈａｓ－ｍｉＲ－２０５及びｈａｓ－ｍｉＲ－２１の存在量が増加又は減少しており、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５の発現が高い又はｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２の発現が低い肺腺がん患者は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５の発現が低い又はｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２の発現が高い患者よりも予後が悪いことが知られている（特許文献２参照）。
国際公開第２０１１／１２５２４５号 国際公開第２００７／０８１７２０号
　しかしながら、特許文献１及び２に記載されている発明は、肺がんの予後を予測するためのｍｉＲＮＡマーカーに関する発明である。したがって、特許文献１及び２に記載されている方法は、既に肺がんに罹患した患者が対象となる。健康診断等の際に採取した血液を用いて、早期ステージであっても被検者が肺がんに罹患しているのか検査ができるｍｉＲＮＡマーカーを用いた検査方法の開発が望まれているが、現在のところ、肺がん検査用のｍｉＲＮＡマーカーは知られていない。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、被検者の血液中の、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定することで、肺がんの検査をするための情報を提供できることを新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キットを提供することである。
　本発明は、以下に示す、肺がん検査用の情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キットに関する。
（１）ｍｉＲＮＡの存在量を測定することによる肺がん検査用の情報を提供する方法であって、
　被検者の血液中の、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定する工程、
を含む、肺がん検査用の情報を提供する方法。
（２）前記存在量を測定する工程が、請求項１に記載のｍｉＲＮＡに加え、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４４９５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００２１７７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１４１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４６７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４５０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩ０００６４１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４８０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４７６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３１５）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００８０）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定する、
上記（１）に記載の方法。
（３）前記存在量を測定する工程が、請求項１及び請求項２に記載の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定する、
上記（２）に記載の方法。
（４）上記（１）～（３）の何れか一に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づいて、被検者の肺がんの検査を行う検査工程、
を含む、肺がんの検査方法。
（５）前記被検者の肺がんの検査を行う検査工程が、
　肺がん患者の血液中で発現している上記（１）～（３）の何れか一に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づき予め構築した検査モデルに、上記（１）～（３）の何れか一に記載のｍｉＲＮＡの存在量を当てはめる工程、
　前記検査モデルに当てはめたｍｉＲＮＡの存在量からスコアを算出する工程、
を含む上記（４）に記載の検査方法。
（６）肺がん患者の血液中で発現している上記（１）～（３）の何れか一に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づき予め構築した検査モデルを少なくとも格納した記憶手段、
　被検者の血液に含まれる、上記（１）～（３）の何れか一に記載のｍｉＲＮＡの存在量を、前記記憶手段に記憶された検査モデルに当てはめスコアを算出することで被検者の肺がんの検査を行う検査手段、
を含む肺がんの検査装置。
（７）コンピュータを、上記（６）に記載の肺がんの検査装置として機能させるためのプログラム。
（８）上記（７）に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
（９）被検者の血液中で発現している少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定するプローブを含む、
肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
（１０）ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４４９５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００２１７７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１４１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４６７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４５０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩ０００６４１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４８０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４７６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３１５）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００８０）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを更に含む、
上記（９）に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
（１１）上記（９）及び（１０）に記載の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを含む、
上記（１０）に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
（１２）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００７５３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００５１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００６８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４５）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを更に含む、
上記（９）～（１１）の何れか一に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
　なお、上記のｍｉＲＮＡのＡｃｃｅｓｓｉｏｎは、全てｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）の番号である。以下、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎは省略することがある。
　本発明は、被検者の血液中の、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６の存在量を測定することで、肺がんの検査用の情報を提供できる。したがって、健康診断等の際に採取した血液に基づき、肺がんの検査をすることができる。
図１は、検査モデルの作成手順、及び作成した検査モデルの検証手順の概略を示す図である。 図２は、肺がんの検査装置の概略を示す図である。 図３は、本発明の検査装置を用いて、被検者を検査するための工程を示す図である。 図４Ａは、内部標準の候補の探索及び決定手順を示す図である。 図４Ｂは、内部標準の各候補ｍｉＲＮＡの安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）を示すグラフである。 図４Ｃ（ａ）は、肺腺がん患者（ＡＤ）及び健常者（ＨＳ）のｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐのＲａｗ　Ｃｔ値を示しグラフで、（ｂ）は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐのＲａｗ　Ｃｔ値の平均を示すグラフである。 図５Ａは、肺がん検査用のｍｉＲＮＡの探索・決定の手順を示す。 図５Ｂは、ｍｉＲＮＡを１個～１７８個まで選択した時のＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅを示すグラフである。 図５Ｃ（ａ）は、作成した検査モデルを用いて教師群の検査を行った結果を示すグラフ、図５Ｃ（ｂ）は、ＡＤ患者ｖｓ健常者（ＨＳ）のＲＯＣ曲線を示すグラフである。 図６Ａは、作成した検査モデルを用いて検証群を検査した結果を示すグラフである。 図６Ｂ（ａ）は、検証群のＡＤ患者ｖｓ健常者（ＨＳ）のＲＯＣ解析を示すグラフで、図６Ｂ（ｂ）は、検証群のＡＤ患者ｖｓ非ＡＤ患者（ＨＳ＋ＢＰＤ）のＲＯＣ解析を示すグラフである。 図６Ｃは、表１に示す検証群のＡＤ患者を作成した検査モデルに当てはめて検査した結果を示すグラフである。 図６Ｄは、ＡＤ患者以外のがん患者を作成した検査モデルに当てはめて検査した結果を示すグラフである。
　以下に、本発明の肺がん検査用の情報を提供する方法（以下、単に「方法」と記載することがある。）、肺がんの検査方法（以下、単に「検査方法」と記載することがある。）、肺がんの検査装置（以下、単に「検査装置」と記載することがある。）、肺がんの検査装置のプログラム（以下、単に「プログラム」と記載することがある。）及び記録媒体、並びに肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット（以下、単に「キット」と記載することがある。）について詳しく説明する。
　先ず、本発明における「肺がん」の種類は、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、大細胞がん等の非小細胞肺がん、小細胞がん等の小細胞肺がん、が挙げられる。本発明の方法に用いられるサンプルは、血液である。
　図１は、検査モデルの作成手順、及び作成した検査モデルの検証手順の概略を示す図である。先ず、各種がん患者及び健常者（ＨＳ）の血液サンプルを集める。左側の“Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”に示すように、教師群（ｔｒａｉｎｉｇ　ｃｏｈｏｒｔ）に分類された肺腺がん（ＡＤ）患者及び健常者（ＨＳ）の採取血液から血清（サンプル）を分離し、ＴａｑＭａｎ　Ｈｕｍａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｒｒａｙｓ（ｃａｒｄｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ；７６８種のｍｉＲＮＡの検出が可能）を用いて、サンプル中で発現している各種ｍｉＲＮＡの存在量を測定する。次に、各サンプル間のｍｉＲＮＡの存在量を標準化するための内部標準（ノーマライザー）となるｍｉＲＮＡを探索・決定し、決定したノーマライザーで各サンプルのｍｉＲＮＡの存在量を補正することで、各サンプル間の存在量の誤差を補正する。そして、肺がん検査用のｍｉＲＮＡの候補を選択し、その中から、肺がん患者を検査するのに好ましいｍｉＲＮＡを特定する。
　次いで、右側の“Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”において、“Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”で肺がん検査用として特定したｍｉＲＮＡの存在量を測定するキットを作製する。次に、検証群（ｔｅｓｔ　ｃｏｈｏｒｔ）に分類された各種がん患者《肺腺がん（ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＤ）１１０人；肺扁平上皮がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＱ）２７人；肺大細胞がん（ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣ）１０人；胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ：ＧＣ）１８人；大腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ：ＣＲＣ）２０人；膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ：Ｐａｎ）１８人；卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ：Ｏｖａ）２０人；乳がん（ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ：Ｂｒ）２０人》、肺の良性新生物（ｂｅｎｉｇｎ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ：ＢＰＤ）４７人、及び健常者（ＨＳ）１１０人の採取血液から血清（サンプル）を分離し、作製したキットを用いてサンプル中のｍｉＲＮＡの存在量を測定する。そして、肺がん検査用として特定したｍｉＲＮＡから作成した検査モデルに測定したｍｉＲＮＡの存在量を当てはめ、作成した検査モデルの優位性の検証を行う。
　後述する実施例で示すように、健常者と比較して肺がん患者に特有なｍｉＲＮＡとして、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６の組み合わせ（以下、この組み合わせを「組み合わせ（１）」と記載することがある。）が挙げられる。
　本発明の方法を実施する際には、少なくとも組み合わせ（１）の存在量を測定すればよいが、検査方法の精度を向上するためには、組み合わせ（１）の存在量に加え、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５及びｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（以下、この組み合わせを「組み合わせ（２）」と記載することがある。）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量も併せて測定してもよい。
　また、組み合わせ（１）及び組み合わせ（２）に記載の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定してもよい。
　図１に示すように、サンプル中のｍｉＲＮＡの存在量を測定する際には、ノーマライザー用のｍｉＲＮＡの存在量に基づき、サンプル中のｍｉＲＮＡの存在量を補正してもよい。ノーマライザーを用いて存在量を補正することで、サンプルの量や濃度が変わっても、サンプル中のｍｉＲＮＡの存在量を補正することができる。ノーマライザー用のｍｉＲＮＡは、健常者と肺がん患者の何れの血液中でも発現し、且つ存在量の差が小さいｍｉＲＮＡであれば特に制限はない。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（以下、この組み合わせを「組み合わせ（３）」と記載することがある。）等が挙げられる。前記ノーマライザー用のｍｉＲＮＡは、健常者と肺がん患者の血液中で最も存在量の差が小さいｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐを単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
　後述する実施例に示すとおり、組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡは、健常者と肺がん患者の存在量が異なっている。したがって、少なくとも組み合わせ（１）のｍｉＲＮＡの存在量を測定することで、肺がん検査用の情報を提供することができる。更に必要に応じて組み合わせ（２）から選択される１種以上のｍｉＲＮＡの存在量、または組み合わせ（２）の全てのｍｉＲＮＡの存在量も併せて測定することで、より精度の高い肺がん検査用の情報を提供することができる。
　本発明の検査方法は、被検者から採取した血液中で発現している少なくとも組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡの存在量に基づいて、被検者が肺がんに罹患しているか否か検査することを特徴としている。検査は、測定した組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡの存在量に基づいて、検査できるものであれば特に制限はない。後述する実施例に示すとおり、肺がん患者及び健常者の血液中のｍｉＲＮＡの存在量の比較定量結果から、統計的手段を用いて検査モデル（判別式）、更に必要に応じて閾値を作成し、測定したｍｉＲＮＡの存在量を検査モデルに当てはめスコアを算出、必要に応じて閾値と比較することで肺がんに罹患しているか否か検査をすればよい。
　また、作成した検査モデルや閾値をコンピュータの記憶手段に記憶しておくことで、コンピュータを検査装置として用いることもできる。
　図２は、検査装置の概略を示す図である。検査装置１は、入力手段２、検査モデル、更に必要に応じて閾値を記憶する記憶手段３、検査手段４、制御部５及びプログラムメモリ６を少なくとも含んでいる。
　入力手段２は、被検者の血液から測定したｍｉＲＮＡの存在量の情報を検査装置１に入力できれば特に制限はなく、キーボード、ＵＳＢ等が挙げられる。また、入力手段２はインターネット回線を使用しても良い。例えば、インターネット回線を用いて遠隔地の病院で測定した被検者の血液から測定したｍｉＲＮＡの存在量の情報を検査装置１に送信・入力し、インターネット回線を通じて検査結果を送付することで、遠隔地の病院の被検者に対しても適切な検査をすることもできる。
　記憶手段３には、検査モデル、必要に応じて閾値が記憶されている。検査手段４は、入力手段２により入力された被検者のｍｉＲＮＡの存在量の情報を記憶手段３に記憶されている検査モデルに当てはめスコアを算出、更に必要に応じて閾値と比較することで、被検者が肺がんに罹患しているか否か検査することができる。プログラムメモリ６には、例えば、図２に示すコンピュータを検査装置１として機能させるためのプログラムが格納されている。このプログラムが制御部５により読み出され実行されることで、入力手段２、記憶手段３及び検査手段４の動作制御が行われる。プログラムは、予めコンピュータに記憶しておいても良いし、記録媒体に検査モデル又は閾値と共に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ６に格納されるようにしてもよい。
　図３は、本発明の検査装置１を用いて、被検者を検査するための工程を示す図である。プログラムメモリ６に格納されたプログラムが制御部５に読み出されて実行し、先ず、入力手段２により、被検者の血液中の少なくとも組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡの存在量を入力する（Ｓ１００）。なお、血液中のｍｉＲＮＡの存在量は、検査装置１と接続しているｍｉＲＮＡの存在量の測定装置の測定結果を直接入力してもよいし、別途測定した測定値を入力してもよい。次に、入力手段２により入力された存在量の情報を、記憶手段３に記憶されている検査モデルに当てはめスコアを算出、必要に応じて閾値と比較する（Ｓ１１０）。そして、得られた検査結果を表示する（Ｓ１２０）。表示方法は、コンピュータの表示手段に表示してもよいし、紙等にプリントアウトしてもよい。
　血液中で発現しているｍｉＲＮＡは、市販されているｍｉＲＮＡマイクロアレイなどを用いて網羅的に測定できるが、肺がん検査用ではないことから、１つのマイクロアレイなどで測定できるサンプル数に限りがある。本発明では、肺がん患者に特有なｍｉＲＮＡを新たに見出した。そのため、新たに見出したｍｉＲＮＡの組み合わせを測定できるプローブのみを用いて、新たなキットを作製することができる。キットの形態は最終的にプローブに対応するｍｉＲＮＡの存在量が測定できれば特に制限はない。例えば、市販のｍｉＲＮＡマイクロアレイと同様にプローブをプレートに貼り付けたアレイ状、定量ＰＣＲ用にプローブを液体に分散した液体状、プローブを貼り付けたビーズ状等が挙げられる。キットを作製することで、多数の被検者の血液サンプルを効率よく測定することができる。
　キットに用いるプローブは、組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡを測定できるプローブが挙げられる。また、組み合わせ（１）に示すｍｉＲＮＡを測定できるプローブに加え、組み合わせ（２）から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定できるプローブ、または組み合わせ（２）の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定できるプローブを加えてもよい。組み合わせ（１）及び（２）に示すｍｉＲＮＡは、市販のｍｉＲＮＡマイクロアレイで測定できるものであることから、プローブは公知のプローブを用いればよい。または、新たに設計したものでもよい。
　また、キットには、ノーマライザー用のｍｉＲＮＡを測定できるプローブを配置してもよい。ノーマライザー用のプローブとしては、組み合わせ（３）から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定できるプローブが挙げられる。ノーマライザー用のプローブも、公知のプローブまたは新たに設計したプローブを用いればよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
　以下の手順により、肺がんの検査に必要なｍｉＲＮＡの同定、測定したｍｉＲＮＡの存在量の補正に必要な内部標準（ノーマライザー）となるｍｉＲＮＡの同定、及び検査モデルの構築を行った。
＜実施例１＞
〔血液サンプルからの全ＲＮＡの分離〕
　先ず、対象者の血液から、定法により血清（サンプル）を分離した。分離した血清から４００μｌを採取し、ｍｉＲＶａｎａ　ＰＡＲＩＳキット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、プロトコルにしたがって血清中の全ＲＮＡを分離した。なお、分離した全ＲＮＡには、エクソソーム中のｍｉＲＮＡも含まれる。また、全ＲＮＡの分離の際には、ＲＮＡ抽出を評価するためのスパイクコントロールとして、合成されたＲＮＡであるａｔｈ－ｍｉＲ１５９ａ（ＭＩ００００１８９）を各々のサンプルに添加した。全ＲＮＡ濃度は、ナノドロップ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量化した。
〔ｍｉＲＮＡプロファイルの作成〕
　各々のサンプル中のヒトｍｉＲＮＡは、ａｔｈ－ｍｉＲ１５９ａ、ＴａｑＭａｎ　Ｈｕｍａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ａｒｒａｙ　Ｃａｒｄ（Ａ，ｖ２．０，１１　ａｎｄ　Ｂ，ｖ３．０，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、プロトコルにしたがってプロファイルされた。具体的には、ＴａｑＭａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、６μｇの全ＲＮＡが、ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ　Ｍｅｇａｐｌｅｘ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｐｏｏｌ　ｓｅｔ　Ａ又はＢと一緒に逆転写された。逆転写産物は、ＴａｑＭａｎ　ＰｒｅＡｍｐ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ａｎｄ　Ｍｅｇａｐｌｅｘ　ＰｒｅＡｍｐ　ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、予備増幅され、ＴａｑＭａｎ　Ｈｕｍａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ａｒｒａｙｓ　ａｎｄ　ａｎ　ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、リアルタイムＰＣＲ解析を行った。Ｃｔ値（Ｒａｗ　Ｃｔ　Ｖａｌｕｅ）は、ＲＱ　ｍａｎａｇｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ１．２．１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて計算した。
〔解析対象者〕
　ａｔｈ－ｍｉＲ１５９ａの発現が検出されない等、不適切なサンプルを解析対象者から排除し、残りのサンプルを解析した。実施例１で解析対象とした対象者を表１に示す。肺腺がん患者（ＡＤ）は２５３人で、教師群用に１４３人、検証群用に１１０人を区分した。また、健常者（ＨＳ）は１０１人で、教師群用に４９人、検証群用に５２人を区別した。区別した対象者の平均年齢、男性人数、女性人数、肺腺がん患者（ＡＤ）のがんのステージＩ～ＩＶ別人数は、表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔内部標準の探索・決定〕
　図４Ａ～図４Ｃは、内部標準の候補の探索及び決定手順を示す図である。図４Ａに示すように、先ず、教師群に区分されたＡＤ患者（１４３人）及び健常者（ＨＳ：４９人）の中で、Ｃｔ値が３２未満のｍｉＲＮＡの中から、３５個のｍｉＲＮＡを候補として選択した。次に真のｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅを推定する手段として、ブートストラップリサンプリングによる推定を行った。具体的手順は以下のとおりである。
（１）元々のデータ（ＨＳ：４９人、ＡＤ患者：１４３人）から、１９２例のデータをランダムに選択するという作業を１万回実施した。この時、同じ症例を重複しても良いものとした。その結果、元々のデータと同じ分布を持つが異なったデータを１万セット用意した。それぞれのデータセットにＳｅｔ　１～Ｓｅｔ　１０，０００と名前を付けた。
（２）１万セットそれぞれに対して、ｍｉＲＮＡの安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）を計算した。なお、安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）とは、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒにより定義された遺伝子発現量の安定度を示す指標で、異なる検体間でｍｉＲＮＡの発現量が一定である程度を示した指標として開発されたものである。計算の具体的手順は、（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．＆Ｏｒｎｔｏｆｔ，Ｔ．Ｆ．Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ　ｄａｔａ：ａ　ｍｏｄｅｌ－ｂａｓｅｄ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｇｅｎｅｓ　ｓｕｉｔｅｄ　ｆｏｒ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｂｌａｄｄｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｄａｔａ　ｓｅｔｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．６４，５２４５－５２５０（２００４））に記載されている。
（３）ｍｉＲＮＡ毎に得られた１万個のｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅの値から中央値を計算した。
　次に、候補のｍｉＲＮＡを、安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）の中間値で順に並べた。上から順に、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－
ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ・・・、が選択された。
　図４Ｂは、各候補ｍｉＲＮＡの安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）を示しており、各グラフの横線が中央値を示している。
　図４Ｃの（ａ）は、肺腺がん患者（ＡＤ）及び健常者（ＨＳ）のｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐのＲａｗ　Ｃｔ値はＡＤとＨＳでほぼ同じであったことから、ＡＤとＨＳの血液中の各ｍｉＲＮＡの存在量がほぼ同じであったことを示している。また、（ｂ）は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐのＲａｗ　Ｃｔ値の平均を示している。以上の結果より、安定値の低いｍｉＲＮＡはＨＳ及びＡＤの血液中の存在量の差が低いことから、それぞれ単独でノーマライザーとして用いることもできるが、安定値（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）の低いｍｉＲＮＡを組み合わせて用いることで、精度をより高くできることが明らかとなった。以下の実施例では、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐの３種を組み合わせてノーマライザーとして用いた。
〔肺がん検査用のｍｉＲＮＡの決定〕
　図５Ａは肺がん検査用のｍｉＲＮＡの探索・決定の手順を示す。なお、上記〔ｍｉＲＮＡプロファイルの作成〕で作成したプロファイルは、ＴａｑＭａｎ　Ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡアレイで測定したＣｔ値である。そのため、肺がん検査用のｍｉＲＮＡを決定するため、まず、ノーマライザーを用いて、Ｃｔ値より各ｍｉＲＮＡの存在量に変換した。変換手順は以下のとおりである。
（１）各ｍｉＲＮＡのＣｔ値から、ノーマライザーの平均Ｃｔ値を引いた（この値を「△Ｃｔ値」と記載する。）。
（２）△Ｃｔ値を、Ｚスコアに変換（平均値＝０，ＳＤ＝１となるように変換）した。
　肺がん検査用のｍｉＲＮＡの探索は、得られた各ｍｉＲＮＡの存在量を統計処理により行った。具体的手順は次のとおりである。
（１）サンプルを教師群(ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｃｏｈｏｒｔ)と検証群(ｔｅｓｔ　ｃｏｈｏｒｔ)に分け、教師群を更にランダムにｔｒａｉｎｉｎｇ　ｄａｔａとｔｅｓｔ　ｄａｔａに分けた。ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｄａｔａを用いて、複数の変数を用いて分類モデルを構築できる重み付け得票分類（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ　Ｖｏｔｉｎｇ）による分類モデルの作成を行った。作成した分類モデルは、ｔｅｓｔ　ｄａｔａを利用してＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅに基づいた予測性能の評価を行った。
（２）候補ｍｉＲＮＡを一つずつ増やしながら、上記分類モデルの構築を繰り返すことで、候補ｍｉＲＮＡの数（ｍ）が異なるセットを作成した。
（３）更に、これらの工程をｎ回繰り返すことで、候補ｍｉＲＮＡの数がｍであるセットをｎ個作成した。作成した候補ｍｉＲＮＡの数が異なる判別モデルの精度をＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅを指標に評価を行い、最終分類デル作成に適切な候補ｍｉＲＮＡ数Ｍを決定した。候補ｍｉＲＮＡの数がＭであるセットをｎ個作成することで、Ｍ×ｎ個のｍｉＲＮＡ(重複を含む)が得られ、ｎ個のモデルの中で最も高い頻度で選択されたｍｉＲＮＡからＭ番目までのｍｉＲＮＡをＭ個選択し、当該選択したｍｉＲＮＡを用いて重み付け得票分類に基づく最終分類モデルを構築した。
（４）なお、最終分類モデルとは、Ｍ×ｎ個の候補ｍｉＲＮＡ（重複を含む）の中から選択したｍｉＲＮＡ　Ｍ個に基づいて、教師群の全症例を予測できるように重み付け得票分類を用いて作成したモデルを意味する。本解析ではｎ＝１０，０００で実施した。
（５）構築した最終分類モデル（検査モデル）は、作成に用いた教師群とは別の検証群のデータを用いて検証を行うことで、作成した最終分類モデル（検査モデル）の信頼性の評価をすることができる。
（６）そして、ＡＤとＨＳを分類するためには、サンプル中のｍｉＲＮＡの存在量を測定し、測定した存在量を最終分類モデル（検査モデル）にあてはめ、リスクスコアを算出することで分類すればよい。
　以下に、ｍｉＲＮＡを１個～２０個に絞り込んだ際に、選択された回数の多いｍｉＲＮＡを順に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　上記表２～表２１に示すように、ｍｉＲＮＡを１個まで絞り込んだ時の「ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ」は、表３～２１においても全て選択されていた。また、ｍｉＲＮＡを２個まで絞り込んだ時の「ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ」及び「ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０」も表４～表２１の全てで選択され、３個まで絞り込んだ時の「ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ」、「ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０」及び「ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６」も表５～表２１の全てで選択され、４個まで絞り込んだ時の「ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ」、「ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０」、「ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６」及び「ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ」も表６～表２１の全てで選択された。以下同様に、５、６、７・・・２０まで絞り込んだ時のｍｉＲＮＡの組合せは、当該組合せより多くのｍｉＲＮＡを組み合わせた時に選択されていた。以上の結果より、選択回数の順位は異なるものの、ｍｉＲＮＡの組合せを絞り込んだ際に、選択回数が上位のｍｉＲＮＡには共通性が見られた。
　図５Ｂは、ｍｉＲＮＡを１個～１７８個まで選択した時のＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅを示すグラフである。なお、Ｅｒｒｏｒ　ｒａｔｅとは、（不正解だった評価サンプル数の例数）／（評価サンプルの全例数）を意味し、Ｅｒｒｏｒ　ｒａｔｅが低いほど好ましい。また、図５Ｂに示すＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅは、Ｍ（例えば、Ｍ＝１、Ｍ＝２、Ｍ＝３、・・・Ｍ＝２０）毎に作成したｎ＝１０，０００個のモデルの平均値である。
〔検査モデルの作成〕
　上記表２～２１に示すように、本発明の方法では、選択回数が上位のｍｉＲＮＡに共通性が見られた。したがって、少なくとも「ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ」、更に必要に応じて他のｍｉＲＮＡを組み合わせて（例えば、表３～表２１に示す組み合わせ。）存在量を測定すればよい。なお、検査の精度を挙げるとの観点からは、例えば、Ｅｒｒｏｒ　ｒａｔｅ（不正解だった評価サンプル数の例数／評価サンプルの全例数）が小さい方が好ましい。図５Ｂに示すグラフでは、表２に示すｍｉＲＮＡ１種の場合のＥｒｒｏｒ　ｒａｔｅは約１９．４％、以下、表３に示す組み合わせの場合は約１４．７％、表４に示す組み合わせの場合は約１２．７％、表５に示す組み合わせの場合は約１２．０％、表６に示す組み合わせの場合は約１０．４％、表７に示す組み合わせの場合は約８．０％であった。したがって、例えば、Ｅｒｒｏｒ　ｒａｔｅが約１２．７％（正答率が約８７．３％）となる表４に示すｍｉＲＮＡ３種を少なくとも組み合わせて存在量を測定し、必要に応じてｍｉＲＮＡの組み合わせ数を多くしてもよい。Ｅｒｒｏｒ　ｒａｔｅは、表２１に示す２０個のｍｉＲＮＡの場合に最も小さな値（約４．９８％）を示したので、以下の実施例では、表２１に示す組み合わせのｍｉＲＮＡを用いて検査モデルを作成した。作成した検査モデル（判別式）を以下に示す。
ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１×（ｍｉＲＮＡ１のｚスコア－ｍｅａｎ１）＋ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ２×（ｍｉＲＮＡ２のｚスコア－ｍｅａｎ２）＋・・・ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１９×（ｍｉＲＮＡ１１９のｚスコア－ｍｅａｎ１９）＋ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ２０×（ｍｉＲＮＡ２０のｚスコア－ｍｅａｎ２０）
　なお、上記検査モデル（判別式）の、“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１”及び“ｍｅａｎ１”とは、下記表２２に示す選択回数の順位が１位のｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０の“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”の値である“－０．８００９７３４０７１５０７７２”、“－０．２５８４０２９００９４６０３２”である。“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ２”及び“ｍｅａｎ２”・・・は、順位が２位・・・のｍｉＲＮＡの“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”の値を示す。また、“ｍｉＲＮＡ１”、“ｍｉＲＮＡ２”・・・とは、１９２サンプル中の個々のサンプル中で発現している“順位１位のｍｉＲＮＡの存在量”、“順位２位のｍｉＲＮＡの存在量”・・・を表している。
　上記の検査モデル（判別式）に１９２サンプルを当てはめることで、各々のサンプルのリスクスコアを算出した。ｍｉＲＮＡが２０個以外の検査モデル（判別式）の場合も、同様に計算をすることでリスクスコアを算出できる。閾値は計算したリスクスコに基づき、適宜設定すればよい。例えば、後述する図５Ｃ、図６Ａ及び図６Ｃに示す例では閾値を０としているが、他の値であってもよい。
　なお、上記検査モデルは、Ｃｔ値に基づき作成した検査モデルである。例えば、ｍｉＲＮＡの存在量を蛍光強度により求めた場合は、蛍光強度値に基づき、上記と同様の統計学処理に基づき検査モデルを作成すればよい。また、表２２に示す“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”の値は、Ｃｔ値に基づき作成した検査モデルにおける“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”である。したがって、蛍光強度値により検査モデルを作成した場合の“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”は表２２とは異なる値となる。また、“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”はリスクスコアを算出する際の重み係数であって、適宜変更が可能な値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　図５Ｃは、作成した検査モデルを用いて教師群のＡＤ患者１４３人及び健常者（ＨＳ）４９人の検査を行った結果を示している。（ａ）に示すとおり、検査の結果、Ｐｏｓｉｔｉｖｅとの検査は、ＨＳが２．０％で、ＡＤが９４．４％であったことから、感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は９４．４％、特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は９８％で、全体の分類精度（ｏｖｅｒａｌｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｃｃｕｒａｃｙ）は９５．３％であった。また、（ｂ）は、ＡＤ患者ｖｓ健常者（ＨＳ）のＲＯＣ曲線を示しており、ＡＵＣ（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ:濃度曲線下面積）は０．９９１と非常に高い値であった。
＜実施例２＞
　上記のとおり、表２１に示す２０個のｍｉＲＮＡで作成した検査モデルの感度及び特異性が高かったことから、表２１に示すｍｉＲＮＡ及びノーマライザー（ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ）の存在量を測定できるプローブを形成したキットを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社に作製依頼した。実施例２では、カスタムメイドのＴａｑＭａｎ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ａｒｒａｙを用いて以下の検証を行った。
　次に、検証群（ｔｅｓｔ　ｃｏｈｏｒｔ）に分類された各種がん患者《ＡＤ１１０人；ＳＱ２７人；ＬＣ１０人；ＧＣ１８人；ＣＲＣ２０人；Ｐａｎ１８人；Ｏｖａ２０人；Ｂｒ２０人》、肺の良性新生物（ＢＰＤ）４７人、及び健常者（ＨＳ）１１０人の血清から、カスタムメイドのアレイを用いた以外は、実施例１の〔ｍｉＲＮＡプロファイルの作成〕と同様の手順でＣｔ値を求め、次いで、実施例１の〔肺がん検査用のｍｉＲＮＡの決定〕と同様の手順でｍｉＲＮＡの存在量を求めた。
　次に、測定した各種対象者の内、健常者（ＨＳ）、肺の良性新生物患者（ＢＰＤ）、肺腺がん患者（ＡＤ）のｍｉＲＮＡの存在量を実施例１で作成した検査モデルに当てはめ、検査を行った。図６Ａは検査結果を示しており、ＡＤ患者で肺がん陽性と検査された者は８９．１％、また、健常者（ＨＳ）で肺がん陽性と検査された者は０％で、何れも非常に高い正答率であった。なお、肺の良性新生物患者（ＢＰＤ）で肺がん陽性と検査された者は１０．６％であった。
　図６Ｂ（ａ）は、検証群のＡＤ患者ｖｓ健常者（ＨＳ）のＲＯＣ解析を示しており、ＡＵＣ値は０．９７５と非常に高い値であった。また、図６Ｂ（ｂ）は、検証群のＡＤ患者ｖｓ非ＡＤ患者（ＨＳ＋ＢＰＤ）のＲＯＣ解析を示しておりＡＵＣ値は０．９５８と非常に高い値であった。以上の結果より、本発明で作成した検査モデルを用いることで、被検者が肺がんに罹患しているか否かを高い精度で検査できる。
　図６Ｃは、表１に示す検証群のＡＤ患者（ＳｔａｇｅＩ：６５人、ＳｔａｇｅＩＩ：１５人、ＳｔａｇｅＩＩＩ：３０人）のｍｉＲＮＡの存在量を、作成した検査モデルに当てはめて検査した結果を示している。図６Ｃに示すように、ＳｔａｇｅＩでは９０．８％、ＳｔａｇｅＩＩでは１００％、ＳｔａｇｅＩＩＩでは８０％の正答率であった。以上の結果より、本発明の検査モデルを用いて被検者の検査を行うと、早期ステージの肺がんを非常に高精度に検査できることが明らかとなった。ヘリカルＣＴで肺がんの検査を行う際には、偽陽性が問題となっている。そのため、Ｃｔ値と本発明の検査を併用することで、検査精度の向上が期待される。
　図６Ｄは、ＡＤ患者以外のがん患者のｍｉＲＮＡの存在量を、作成した検査モデルに当てはめて検査した結果を示している。肺扁平上皮がん（ＳＱ）では陽性と判断された正答率は７０．４％、肺大細胞がん（ＬＣ）では陽性と判断された正答率は７０．０％であった。一方、肺がん以外のがんで陽性と判断された正答率は、胃がん（ＧＣ）では２２．２％、大腸がん（ＣＲＣ）では２５．０％、膵がん（Ｐａｎ）では３８．９％、卵巣がん（Ｏｖａ）では３５．０％、乳がん（Ｂｒ）では０．０％であった。以上の結果より、作成した検査モデルは、肺腺がん（ＡＤ）以外の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である肺扁平上皮がん（ＳＱ）及び肺大細胞がん（ＬＣ）の検査、つまり、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の特異的な検査に有用であることが明らかとなった。
　本発明に係る肺がんの検査をするための情報を提供する方法、肺がんの検査方法、肺がんの検査装置、肺がんの検査装置のプログラム及び記録媒体、並びにｍｉＲＮＡの存在量測定用キットを用いることで、被検者が肺がんに罹患しているか否かを、早期ステージの段階で正確に検査することができる。そのため、医療機関や大学医学部などの研究機関等における肺がん患者の検査及び研究に有用である。

Claims (12)

  1. 　ｍｉＲＮＡの存在量を測定することによる肺がん検査用の情報を提供する方法であって、
    　被検者の血液中の、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定する工程、
    を含む、肺がん検査用の情報を提供する方法。
  2. 　前記存在量を測定する工程が、請求項１に記載のｍｉＲＮＡに加え、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４４９５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００２１７７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１４１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４６７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４５０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩ０００６４１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４８０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４７６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３１５）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００８０）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定する、
    請求項１に記載の方法。
  3. 　前記存在量を測定する工程が、請求項１及び請求項２に記載の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定する、
    請求項２に記載の方法。
  4. 　請求項１～３の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づいて、被検者の肺がんの検査を行う検査工程、
    を含む、肺がんの検査方法。
  5. 　前記被検者の肺がんの検査を行う検査工程が、
    　肺がん患者の血液中で発現している請求項１～３の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づき予め構築した検査モデルに、請求項１～３の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの存在量を当てはめる工程、
    　前記検査モデルに当てはめたｍｉＲＮＡの存在量からスコアを算出する工程、
    を含む請求項４に記載の検査方法。
  6. 　肺がん患者の血液中で発現している請求項１～３の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの存在量に基づき予め構築した検査モデルを少なくとも格納した記憶手段、
    　被検者の血液に含まれる、請求項１～３の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの存在量を、前記記憶手段に記憶された検査モデルに当てはめスコアを算出することで被検者の肺がんの検査を行う検査手段、
    を含む肺がんの検査装置。
  7. 　コンピュータを、請求項６に記載の肺がんの検査装置として機能させるためのプログラム。
  8. 　請求項７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
  9. 　被検者の血液中で発現している少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１６３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００５８８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３０６）の存在量を測定するプローブを含む、
    肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
  10. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４４９５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００２１７７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００１４１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４６７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４５０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩ０００６４１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４８０９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００４７６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００３３１５）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００８０）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを更に含む、
    請求項９に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
  11. 　請求項９及び請求項１０に記載の全てのｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを含む、
    請求項１０に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
  12. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００２８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００７５３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００５１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００６８０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＭＩＭＡＴ００００４４５）から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲＮＡの存在量を測定するプローブを更に含む、
    請求項９～１１の何れか一項に記載の肺がん検査用のｍｉＲＮＡ測定用キット。
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