CN115089715B - Alpk1基因作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供α‑激酶1基因(ALPK1)作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用，即将ALPK1基因作为从而为抗衰老研究提供新的研究靶点。所述的中枢神经系统疾病，包括有由于衰老所导致的认知障碍或脑缺血导致的相关疾病。本发明再一个方面还提供ALPK1基因的抑制剂或拮抗剂在制备用于预防或治疗认知障碍的制品中的应用。

Description

ALPK1基因作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用
技术领域
本发明属于医用动物模型构建技术领域，具体涉及α-激酶1(alpha-kinase 1，ALPK1)作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用。
背景技术
现代生活方式和医学技术使人均寿命得以延长，报告显示，2050年左右，世界六十岁以上老年人数将翻两倍，其中中国老年人数约会占世界总老年人数的四分之一。随着人类寿命的延长，很多老年性疾病发病率也逐渐上升，其中阿尔茨海默症(Alzheimer′sDisease,AD)这一年龄依赖性神经退行性疾病的患者数量逐年增加，是当今社会促进人类健康生活目标的强大阻力，很多老年人饱受其苦。因此，探索衰老进程中发生认知障碍的机制并寻找干预治疗策略，从而减缓甚至预防增龄性过程中认知障碍的发生，是一个亟待突破的课题。
AD发生的最大危险因素是衰老，衰老发生的过程中，个体逐渐呈现一系列机能老化的现象，其中就包括大脑的老化，表现为学习能力不佳、记忆障碍等，且这种神经性退行是不可逆的过程。在衰老过程中，神经元不断丢失，给AD患者日常生活带来极大困扰。研究表明AD呈现年龄的高依赖性，由德国科学家Alois Alzheime在1906年首次提出。随着对AD研究的不断深入，其特征性病理变化也逐渐被探索发现，在其发病过程中，老年斑随着β-淀粉样蛋白聚集而生成，神经纤维在Tau蛋白过度磷酸化中不断缠结，进一步导致神经元损伤丢失等。
认知障碍的发生与年龄呈高度正相关，全世界痴呆患者中60～70％均为老年人。研究发现，老年AD患者肠道微生物群中细菌水平较低，同样的结论在Quigley EMM等的研究中被同样发现，肠道微生物群结构及多样性与年龄相关，不同年龄个体中有较大差异。许多啮齿类动物研究表明，肠道菌群改变可能与个体行为变化有关。
Jeffery IB等在一项对老年群体肠道菌群的研究中发现，衰老的过程中伴随着肠道菌群结构的改变。研究发现肠道菌群中常见的革兰氏阴性菌外膜主要成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)可诱导认知功能障碍的发生。Jaeger等研究发现给小鼠腹腔注射LPS后，其更易透过血脑屏障向脑内迁移，而更少的往肠道等转移。并且在研究中，还发现了脑内有Aβ斑块沉积。已有报道将LPS注射到小鼠第四脑室后，其大脑发现了AD特征性病理产物，通过神经行为学实验发现其认知能力下降。综上可发现AD的发生发展与肠道微生物的生长代谢密不可分，肠道微生物的失调而导致AD特征性产物的生成。而且伴随着胃肠道屏障完整性的降低，细菌及其代谢物迁移入血等，最终导致微生物-肠-脑轴(Microbiota-gut-brain，MGB)全面失衡。
对衰老机制研究和抗衰老药物筛选中第一步就是建立最近似人类衰老状态的衰老动物模型，只有这样其模型所表现出的研究结果才更能提供参考意义。在很多研究中，使用自然生长且无外部其他刺激因素饲养到18～24月龄的自然衰老小鼠模型，此时小鼠年纪大致对应56～70岁人类，此模型在构建过程中并不复杂，但其却与衰老人群特点最为相近，如出现神经细胞丢失变性、行为迟缓、认知障碍及感觉降低甚至丧失等。但该模型构建时间长，饲养成本高且死亡率高，因而急需构建一种周期相对短，死亡率低且成功率高的与衰老致认知障碍相关的动物模型。
发明内容
本发明的目的是提供α-激酶1基因(ALPK1)作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用，即将ALPK1基因作为从而为抗衰老研究提供新的研究靶点。
本发明首先提供α-激酶1(alpha-kinase 1，ALPK1)基因的一种用途，即作为中枢神经系统疾病预防或治疗靶点的应用；
所述的中枢神经系统疾病，为认知障碍疾病；
更进一步的，所述的认知障碍疾病，是由于衰老所导致的认知障碍；
作为本发明一个实施例的具体记载，所述衰老是由于肠道菌群失调导致的。
另一个方面，所述的中枢神经系统疾病为脑缺血导致的相关疾病。
本发明还提供一种抗认知障碍的小鼠模型的构建方法，是通过降低小鼠α-激酶1蛋白表达量或α-激酶1的活性来构建动物模型；
所述的降低动物体内α-激酶1蛋白表达量，其一种方式是通过基因编辑来完成的；
其中通过基因编辑，一种方式是敲除了ALPK1基因的至少一个外显子的全部或部分片段；
作为实施例的具体记载，所述的外显子为ALPK1基因的3号外显子；
所述的降低动物体内α-激酶1蛋白表达量，还可以通过RNA干涉方式来降低蛋白的表达量；
更进一步的，所述的动物模型的构建方法，是通过将降低α-激酶1蛋白表达量或α-激酶1的活性的小鼠按照伪无菌小鼠模型方法处理肠道后，再灌注衰老小鼠的菌粪来导致认知障碍。
本发明另一个方面还提供一种动物模型，是使用上述的构建方法建立的小鼠动物模型。
本发明还提供一种筛选具有预防或治疗认知障碍药物的方法，所述的方法是使用上述的动物模型进行筛选。
本发明再一个方面还提供ALPK1基因的抑制剂或拮抗剂在制备用于预防或治疗认知障碍的制品中的应用。
更进一步的，本发明还提供一种用于预防或治疗中枢神经系统疾病的制剂，所述的制剂中包含有药理有效浓度的供ALPK1基因的抑制剂或拮抗剂；
更进一步的，所述的制剂中还包含有肠道益生菌；
所述的肠道益生菌，优选为年轻个体肠道中的优势菌。
本发明通过基因敲除等方式制备抗认知障碍动物模型，为衰老导致的认知障碍的研究和药物筛选提供新的分子靶点、分子机制和动物模型。
附图说明
图1：4月龄和20月龄小鼠衰老程度比较图(老化度评分)，每组n＝12，实验数据表示为mean±SD。与4月龄组比较，**P<0.01。
图2：4月龄和20月龄小鼠体内ALPK1激活情况比较。其中A，B和C分别为大脑、回肠和结肠ALPK1及p-Tifa WB代表图，D，E，F分别为大脑、回肠和结肠ALPK1蛋白表达统计图，G，H，I分别为大脑、回肠和结肠Tifa蛋白磷酸化表达统计图。ALPK1表达水平用β-actin标准化，p-Tifa表达水平用Tifa标准化，每组n＝6，实验数据表示为mean±SD。与4月龄组比较，**P<0.01。
图3：C57BL/6小鼠粪菌移植后体内ALPK1激活情况比较。其中A，B和C分别为大脑、回肠和结肠ALPK1及p-Tifa WB代表图，D，E，F分别为大脑、回肠和结肠ALPK1蛋白表达统计图，G，H，I分别为大脑、回肠和结肠Tifa蛋白磷酸化表达统计图。ALPK1表达水平用β-actin标准化，p-Tifa表达水平用Tifa标准化，每组n＝6，实验数据表示为mean±SD。与old-KO组比较，*P<0.05，**P<0.01；与young-WT组比较，#P<0.05，##P<0.01。
图4：粪菌移植后C57BL/6小鼠Y迷宫及旷场实验行为学评价图，其中A为Y迷宫交替率，B为旷场实验跨格次数，C为移动距离，D为中心区域停留时间和E为旷场实验经典路径图。每组n＝12，实验数据表示为mean±SD。与old-KO组比较，*P<0.05，**P<0.01；与young-WT组比较，#P<0.05，##P<0.01。
图5：粪菌移植后C57BL/6小鼠新物体识别行为学评价图。A为新物体识别实验新物体识别指数，B为新物体识别实验(短期测试)经典路径图，C为新物体识别实验(长期测试)经典路径图。
图6：粪菌移植后C57BL/6小鼠Morris水迷宫行为学评价图。A为Morris水迷宫穿越次数，B为Morris水迷宫有限象限率，C为Morris水迷宫潜伏期时间和D为Morris水迷宫空间探索经典路径图。
图7：粪菌移植后C57BL/6小鼠神经元损伤情况图。(A)NeuN染色检测小鼠大脑皮层和海马CA1区神经元细胞状态(×400)。(B)NeuN染色神经元数量统计图。每组n＝6，实验数据表示为mean±SD。与old-KO组比较，*P<0.05，**P<0.01；与young-WT组比较，#P<0.05，##P<0.01。
图8：ALPK1敲减对脑缺血小鼠神经功能的影响。(A)小鼠神经行为学评分。(B)小鼠海马CA1区NeuN免疫荧光染色代表图(×400)及阳性表达定量分析。实验数据表示为mean±SD。采用双因素方差分析进行统计，与对应的Sham组进行比较，**P<0.01，*P<0.05；与sgNC/2VO组比较，##P<0.01。
图9：小鼠脑缺血后ALPK1蛋白及mRNA水平变化情况图，其中左侧的图为小鼠脑缺血后ALPK1蛋白变化代表图，右侧两幅图分别为小鼠脑缺血后ALPK1蛋白及mRNA水平变化统计图。每组n＝6，实验数据表示为mean±SD。与Sham组比较，**P<0.01。
图10：ALPK1敲除对脑缺血小鼠神经行为功能及脑水肿的影响，左侧图为各组小鼠改良神经行为功能缺损评分，右侧图为各组小鼠脑水肿统计图。每组n＝6，实验数据表示为mean±SD。与WT/Sham组比较，**P<0.01；与WT/tMCAO组比较,##P<0.01。
具体实施方式
本发明提供了ALPK1基因的一个新的用途，确定其表达水平与中枢神经系统疾病，包含衰老导致的认知功能障碍以及神经退行性疾病相关联，可作为防治衰老相关认知障碍的新靶点。
所述的小鼠ALPK1基因，其一种具体的NCBI编号为NC_000069.7，但还可以选择其它ALPK1的同源基因进行操作。
本发明的一个实施例中了建立了ALPK1基因敲除C57BL/6小鼠，用于构建衰老动物模型。
本发明所提供的小鼠模型的构建方法，还可以通过降低小鼠α-激酶1蛋白表达量或α-激酶1的活性来构建，例如通过基因编辑或RNAi方式来完成构建。
其中通过基因编辑，一种方式是敲除了ALPK1基因的至少一个外显子的全部或部分片段；作为实施例的具体记载，所述的外显子为ALPK1基因的3号外显子，但还可以选择在ALPK1基因的其它位置进行编辑，来敲除了ALPK1基因。
在构建了降低α-激酶1蛋白表达量或α-激酶1活性的小鼠模型的基础上，通过将小鼠按照伪无菌小鼠模型方法处理肠道后，再灌注衰老小鼠的菌粪来导致认知障碍，从而构建获得本发明的具有抗认知障碍效果的小鼠模型。
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：构建ALPK1基因敲除小鼠
本实施例中所用的小鼠是从北京生命科学研究所邵峰课题组(北京，中国)获得的SPF级C57BL/6小鼠。实验期间12/12h昼夜节律饲养，温度24±1℃，湿度60％±10％。遵守四川大学的实验动物管理要求。小鼠的饲养和繁育均按照南京大学模式动物研究所发布的指示进行。
以Alpkl外显子3为靶点的gRNA(GGCCCTTCGTGCCTGA AAAG)生成Alpkl-/-小鼠。将体外转录的引导RNA和Cas9 mRNA共微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。
用正向引物5'-CCTGTAGGGCAGAGTAGGCT-3'和反向引物5'-TTCAAGGTGACAGGTTTCGT-3'扩增每个子代的尾端基因组DNA。对PCR产物进行Sanger测序分析，识别出框外indel创建者。
将具有相同框外索引(3号外显子缺失GTGCCTGAAAA)的第一代小鼠交叉杂交获得纯合子Alpkl-/-小鼠。纯合敲除Alpkl基因的小鼠可存活，可育，大小正常，不显示任何明显的身体或行为异常。
1、对ALPK1基因敲除小鼠的鉴定
1)小鼠基因型检测
对实验小鼠时进行编号，每只小鼠剪取1.0～1.2cm鼠尾组织置于管中，进行基因型鉴定操作。使用组织核酸提取试剂盒(QIAGEN,REF：69504)提取DNA。在盛放鼠尾的管中加入20μl蛋白酶K，涡旋充分混合，于56℃烘箱中孵育组织待其完全溶解(过夜)。取出管后涡旋15s，向管中加入200μl Buffer AL涡旋充分混合，然后加入200μl无水乙醇，再次彻底涡旋混合后将混合物(包括沉淀)吸移到置于2ml DNeasy Mini spin column收集管中，8000rpm离心1min后丢弃流通液和收集管。将DNeasy Mini spin column放入新收集管中，添加500μl Buffer AW1，8000rpm离心1min后丢弃流通液和收集管。将DNeasy Mini spincolumn放在新的2ml收集管中，添加500μl Buffer AW2，并以14,000rpm离心3min后丢弃流通液和收集管。将DNeasy Mini spin column放在干净的1.5ml EP管中，然后将200μlBuffer AE直接吸到DNeasy膜上。在室温下孵育1min，8000rpm离心1min后得到的即为提取的DNA样本，于Thermo NanoDrop 2000测定浓度(ng/μl)及纯度(260/280)，看是否合格，合格DNA样本立即放入-80℃存用。
以提取的基因组为模板，对目的基因进行扩增，PCR反应体系如下(10μl)：Supermix 5μl，引物正义链和反义链各0.5μl，DNA 1μl，ddH2O 3μl。
1)PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，36个循环后72℃延伸7min。
2)电泳：1×TAE Buffer缓冲液，1.7％琼脂糖凝胶，恒压75V电泳约50min。
(每孔上样量为10μl)
3)将凝胶放入Bio-Rad凝胶成像仪中进行成像，得到基因分型结果。
以从鼠尾中提取的基因组DNA为模板，进行ALPK1基因检测。使用ALPK1.mut(Reverse)和ALPK1(Forward)引物跑出条带为ALPK1基因敲除小鼠KO的条带，使用ALPK1.wt(Reverse)和ALPK1(Forward)引物跑出条带为野生型小鼠WT条带，每只小鼠基因组DNA均需要同时做2个PCR后根据琼脂糖凝胶电泳结果来对基因型进行判断。
表1：基因型检测所用引物序列表
Figure GDA0003798661770000081
Figure GDA0003798661770000091
为进一步确保小鼠体内ALPK1基因被敲除，使用Sanger测序对小鼠DNA基因组进行了测定，结果提示WT鼠和KO鼠DNA序列间存在差异，KO小鼠ALPK1基因被敲除。
实施例2：衰老导致小鼠结肠和脑ALPK1表达变化和肠菌紊乱
本实施例中所用的小鼠是从成都达硕生物科技有限公司购买，SPF级C57BL/6小鼠，雄性，20月龄(20m)和4月龄(4m)小鼠各12只，许可证号：SCXK(川)2013-113。SPF级12/12h昼夜节律饲养，温度24±1℃，湿度60％±10％。遵守四川大学实验动物管理要求。
1、4月龄小鼠和20月龄小鼠衰老程度比较。
为了评估小鼠的衰老老化程度，客观依据小鼠外在形体及行为学老化变化评分。依据小鼠行为学(反应性、被动逃避)、皮肤及毛发枯糙度、溃疡情况等11项指标，每个指标下不同小鼠的老化情况表现对应5个等级，可依据表格中的分值来进行评分，最终将分数汇总后比较小鼠的衰老老化程度，分数与衰老程度呈正相关。
当小鼠衰老后其会出现大脑、皮肤以及内脏等一系列多系统全身性衰老表征，对4m C57BL/6小鼠和20m C57BL/6小鼠进行了老化度评分。4m C57BL/6小鼠和20m C57BL/6小鼠老化度评分结果如图1所示，与4m C57BL/6小鼠老化度评分0.75±0.26相比，20m C57BL/6小鼠老化度评分5.63±1.45明显升高(P＜0.01)。结果显示20m C57BL/6小鼠的衰老程度高，其皮毛、反应性及眼周等均出现老化受损表征。
2、4月龄和20月龄小鼠体内ALPK1激活情况比较。
使用免疫印迹法(Western blot，WB)检测了ALPK1及p-Tifa磷酸化水平在2组不同年龄小鼠大脑组织和肠道组织中的激活情况。WB结果显示(如图2所示)，与4m C57BL/6小鼠相比，20m C57BL/6小鼠的大脑、回肠及结肠组织中ALPK1蛋白的表达水平和Tifa蛋白的磷酸化水平显著升高(P＜0.01)。
3、4月龄和20月龄小鼠肠道菌群结构变化(门、属、种水平)。
分别收集了4月龄C57BL/6小鼠和20月龄C57BL/6小鼠粪便，进行了16S rRNA测序。结果发现4m C57BL/6小鼠和20m C57BL/6小鼠的肠道菌群结构在门属种水平上具有明显差异。
从门水平分析了4m C57BL/6小鼠和20m C57BL/6小鼠的肠菌构成及相对丰度，结果显示Firmicutes门、Bacteroidetes门、Proteobacteria门、Actinobacteria门和Deferribacteres门为主要菌门，占总菌门的97.49％和91.66％。其中Firmicutes/Bacteroidetes值(F/B)常用来评估菌群变化，结果显示20m组C57BL/6小鼠F/B值显著高于4m组(P<0.05)。4m C57BL/6小鼠的Firmicut-es门为43.88％，显著低于20m C57BL/6小鼠48.65％(P＜0.01)。4m C57BL/6小鼠Bacteroidetes门、Tenericutes门为44.96％和0.78％，显著高于20m C57BL/6小鼠36.13％和0.10％(P＜0.05)。
实施例3：ALPK1基因敲除小鼠构建拮抗衰老导致的认知障碍模型
1)伪无菌小鼠模型建立
实施例1制备的KO鼠和WT鼠满6w后，将其饮用水换成抗生素混合溶液，让其自由饮用(为保证抗生素溶液效价，每2天更换1次溶液)，饮用2周后收集各组小鼠粪便进行16SrRNA检测。
2)粪菌移植操作
各组小鼠自由饮用2周抗生素溶液建立伪无菌模型后，将四组小鼠的饮用水替换为洁净水，开始进行粪菌移植(Fecal microniota transplantation，FMT)，200μl/只，old-KO组和old-WT组小鼠灌胃20月龄(老龄20m)小鼠FMT溶液，young-KO组和young-WT组小鼠灌胃4月龄(年轻4m)小鼠FMT溶液，一周3次，持续8周。
3)粪菌移植后小鼠体内ALPK1蛋白激活情况
与4月龄C57BL/6小鼠相比，20月龄C57BL/6衰老小鼠认知功能障碍，肠道菌群多样性及结构改变，肠、脑屏障损伤且炎症反应加重，且伴发ALPK1/TRAF6/NF-κB信号通路的激活，提示ALPK1信号通路可能在衰老小鼠菌肠脑轴失衡中发挥重要调节作用。使用WB检测了四组粪菌移植小鼠肠道和大脑组织ALPK1蛋白及p-Tifa磷酸化水平的激活情况。
WB结果显示(如图3所示)，与young-WT组小鼠相比，old-WT组小鼠的大脑、回肠及结肠组织中ALPK1蛋白的表达水平和Tifa蛋白的磷酸化水平显著升高(P＜0.01；P＜0.05)；old-KO组小鼠敲除掉ALPK1后，其ALPK1蛋白不表达，同时Tifa蛋白的磷酸化水平升高不显著(P＜0.01；P＜0.05)。据以上结果显示C57BL/6小鼠移植衰老小鼠肠菌后体内ALPK1蛋白表达和Tifa蛋白的磷酸化水平显著增加，而敲除ALPK1后，ALPK1被抑制，Tifa蛋白的磷酸化水平也被抑制。
4)粪菌移植后对小鼠肠道菌群结构的影响
8周FMT操作后，通过16S rRNA测序结果发现移植old-FMT组小鼠和移植young-FMT组小鼠肠道菌群结构在门属种水平上存在较明显差异。
3)神经行为学评价
FMT操作结束后，为了探究小鼠移植衰老小鼠肠菌后是否会引起认知功能障碍，以及进一步确定ALPK1的作用，对四组小鼠进行了神经行为学评价。
Y迷宫的结果显示(如图4A所示)，old-KO组、old-WT组、young-KO组和young-WT组小鼠交替率分别为70.99±6.79％、39.65±16.22％、69.69±9.86％和61.59±7.17％。与young-WT组小鼠相比，old-WT组小鼠交替率显著降低(P＜0.01)，提示4m小鼠移植衰老小鼠肠菌后其短时程工作记忆能力明显下降；而old-KO组小鼠交替率显著高于old-WT组小鼠(P＜0.01)。
旷场实验的结果显示(如图4B-D所示)，old-KO组小鼠的跨格次数、移动距离和中心区域停留时间分别为167.1±25.2次、935.2±124.2cm和25.4±6.6s；old-WT组小鼠的跨格次数、移动距离和中心区域停留时间分别为99.3±55.4次、597.4±254.9cm和8.4±5.8s；young-KO组小鼠跨格次数、移动距离和中心区域停留时间分别为213.5±38.4次、1219.1±208.8cm和35.2±16.7s；young-WT组小鼠跨格次数、移动距离和中心区域停留时间分别为184.1±57.3次、1014.3±299.1cm和36.8±29.3s。与young-WT组小鼠相比，old-WT组小鼠跨格次数、移动距离和中心区域停留时间显著降低(P＜0.01)；而old-KO组小鼠跨格次数、移动距离和中心区域停留时间显著高于old-WT组小鼠(P＜0.01)。此外，小鼠旷场实验经典路径图(如图4E所示)，young-FMT组小鼠在陌生环境中的自主行为与探究行为明显优于old-FMT组小鼠，但old-KO组小鼠在陌生环境中的自主行为与探究行为优于old-WT组小鼠。
新物体识别实验的结果显示(如图5A所示)，old-KO组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)分别为69.1％±9.1％和75.7％±11.4％；old-WT组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)分别为36.6％±8.1％和27.9％±7.7％；young-KO组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)分别为68.6％±7.6％和77.6％±15.11％；young-WT组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)分别为73.43％±10.5％和83.9％±14.3％。与young-WT组小鼠相比，old-WT组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)显著降低(P＜0.01)，移植衰老小鼠肠菌后4m小鼠探索新物体时间明显短于探索熟悉物体时间，表明小鼠对物体的记忆能力减弱；而old-KO组小鼠的新物体识别指数(短期)和新物体识别指数(长期)在移植衰老小鼠肠菌后，显著高于old-WT组小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。此外，小鼠在新物体识别实验(短期测试)经典路径图(如图5B所示)、新物体识别实验(长期测试)经典路径图(如图5C所示)，young-KO组和young-WT组小鼠在对新旧物体的识别记忆能力明显优于old-KO组和old-WT组小鼠，但old-KO组小鼠对新旧物体的识别记忆能力优于old-WT组小鼠。
隐匿平台实验结果显示(如图6A所示)，随着小鼠水迷宫训练实验时间的增加，old-KO组、old-WT组、young-KO组和young-WT组四组小鼠找到平台的潜伏期时间也随之同步减少，并且在水迷宫训练实验第5天时找到平台的潜伏期时间最短，据此结果可以发现通过水迷宫训练实验，四组小鼠学习记忆了平台位置。但在第1天时old-WT组小鼠找到平台的潜伏期时间明显长于young-WT组小鼠(P＜0.05)；在第2天时old-WT组小鼠找到平台的潜伏期时间明显长于old-KO组小鼠(P＜0.01)。
空间探索实验结果显示(如图6B，C所示)，old-KO组小鼠穿越次数以及有效象限率分别为3.6±1.5次和37.2±10.9％；old-WT组小鼠穿越次数以及有效象限率分别为2.1±1.5次和25.5±8.2％；young-KO组小鼠穿越次数以及有效象限率分别为5.1±1.8次和39.8±8.4％；young-WT组小鼠穿越次数以及有效象限率分别为4.2±1.3次和37.4±8.1％。与young-WT组小鼠相比，old-WT组小鼠穿越平台次数以及有效象限率显著降低(P＜0.01)；而old-KO组小鼠穿越平台次数以及有效象限率显著高于old-WT组小鼠(P＜0.05和P＜0.01)。此外，四组小鼠的空间探索典型路径图显示(如图6D所示)，young-KO组和young-WT组小鼠寻找安全平台的策略明显优于old-KO组和old-WT组小鼠，但old-KO组小鼠寻找安全平台的策略优于old-WT组小鼠。
通过上述神经行为学实验，可看出4月龄C57BL/6小鼠在移植衰老小鼠肠菌后发生认知功能障碍，而小鼠敲除ALPK1后抵抗了衰老肠菌所带来的降低小鼠短、长时程工作记忆能力以及学习记忆能力的影响。
4)粪菌移植后小鼠神经病理学情况
通过神经行为学实验结果可看出，移植衰老小鼠肠菌后会引起4m小鼠认知功能障碍，而敲除ALPK1则可以在一定程度上抵抗衰老小鼠肠菌降低小鼠学习记忆能力的影响。因此我们采用了Neun染色对old-KO组、old-WT组、young-KO组和young-WT组四组小鼠大脑中神经元细胞进行了检测。
Neun染色结果显示(如图7A，B所示)，与young-KO组和young-WT组相比，old-WT组C57BL/6小鼠的大脑皮层及海马CA1区神经元细胞出现空泡样变性，细胞核发生固缩，且大脑皮层及海马CA1区神经元数量显著减少(P＜0.01)；而old-KO组小鼠的大脑皮层及海马CA1区神经元细胞空泡样变性、细胞核发生固缩和大脑皮层及海马CA1区神经元细胞数量减少程度较old-WT组相比显著改善(P＜0.01)。据此结果提示，移植衰老小鼠肠菌后，4m小鼠大脑皮层及海马CA1区神经元细胞出现明显损伤且发生丢失，而敲除ALPK1后可一定程度抵抗移植衰老肠菌后对小鼠大脑皮层及海马CA1区神经元细胞损伤的影响。
实施例4：敲减ALPK1对短暂全脑缺血小鼠(2VO)的神经保护作用
采用Crispr/Cas9基因技术敲除小鼠ALPK1慢病毒购自于上海吉凯基因医学科技股份有限公司。慢病毒的滴度分为sgNC(4×108TU/ml)，sg-ALPK1-2(6×108TU/ml)。
实验采用SPF级2月龄雄性C57BL/6小鼠36只，购自成都达硕实验动物有限公司。小鼠饲养于SPF级屏障系统，环境温度控制在24℃～26℃，相对湿度控制在50％～70％，12h交替昼夜照明，自由饮水摄食。
1)慢病毒注射
小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉，麻醉后将小鼠固定在脑立体定位仪上，剪开头部皮肤组织，暴露前囟，调节位置并进行定位(前囟后0.2mm，旁开1.0mm，深度2.5mm)。用微量注射器将1.5μl生理盐水、1.5μl sg-NC或1μl sgALPK1-2慢病毒注射到侧脑室，注射速度为0.5μl/min，留针5min后，缓慢取出进样针，缝合伤口。14天后对小鼠进行2VO造模。
2)建立2VO模型
按照文献方法建立小鼠2VO模型。使用气体麻醉系统对C57BL/6小鼠进行麻醉，小鼠仰卧于体温维持垫上，小鼠肛温维持在36.5℃～37.5℃。暴露小鼠的双侧颈总动脉，剥离迷走神经，颈动脉夹闭20min后松开，并确保再灌注成功，假手术组仅暴露双侧颈总动脉，不进行夹闭。
3)神经行为学评分
于再灌72h后对小鼠进行神经行为学功能进行评分，评分方法见表2。
Figure GDA0003798661770000161
表2：神经行为学评分表
4)ALPK1敲减对脑缺血小鼠神经功能的影响
小鼠再灌注72h后，采用神经行为学评分对小鼠神经行为功能进行评分。如图所示(图8-A)，2VO术后72h，2VO组小鼠神经行为学评分显著高于Sham组(P<0.01)，Sham组的神经行为学评分都为0，而Saline/2VO、sgNC/2VO和sgALPK1-2/2VO的神经行为学评分分别为6.7±0.5、6.5±0.5和4.1±0.4，表明2VO给小鼠造成了严重的神经行为学障碍。而ALPK1敲减小鼠可以显著改善2VO术后的神经行为学障碍：与sgNC/2VO组相比，sgALPK1-2/2VO组小鼠神经行为学评分明显降低(P<0.01)。
神经元是神经系统的基本结构和功能单位，通过突触形成复杂的反射弧以对机体功能做出调控。脑缺血发生后，释放的炎性因子对神经元造成损害，使得神经元的数目和形态都发生改变。
采用免疫荧光法考察了小鼠海马CA1区神经元丢失情况，如图所示(图8-B)。与Sham组相比，2VO组小鼠海马CA1区神经元数目显著减少(P<0.01)，表明2VO造成了严重的神经元损伤。而ALPK1敲减小鼠可以显著改善神经元丢失情况：与sgNC/2VO组相比，sgALPK1-2/2VO组小鼠海马CA1区神经元存活得到明显改善(P<0.01)
实施例5：ALPK1基因敲除对短暂局灶性脑缺血小鼠(tMCAO)的神经保护作用
1)小鼠脑缺血后ALPK1蛋白及mRNA水平变化情况
将雄性C57BL/6J小鼠分为Sham组和tMCAO组，采用线栓法制备短暂性脑缺血小鼠模型，具体步骤如下：雄性C57BL/6J小鼠(23-27g)吸入混有氮气与氧气的异氟烷(浓度为2％)。气体麻醉后，将其仰卧位固定在手术台上。剪开小鼠颈部正中间的皮肤，轻柔分离出左侧CCA、ECA和ICA，尽量避开迷走神经，以免引发小鼠深呼吸甚至死亡。用活结结扎CCA和ECA的远心端。用显微手术剪在ECA剪一斜形切口，插入尼龙线栓，翻转ECA直至与ICA位于同一直线位置，线栓插入ICA约10mm，感觉到微小阻力时停止继续插入。将线栓另一端用手术缝线固定于ECA，打开CCA的活结，缝合手术切口。1小时后再次麻醉小鼠，解除原来的缝线，打开颈部切口，将线栓拔出以实现阻塞的大脑中动脉血液再灌注。整个手术过程中用实验动物体温维持仪将小鼠体温维持在37±0.5℃。手术过程中用激光散斑血流成像仪检测脑血流改变，小鼠局部流血流下降不低于75％，再灌后血流量恢复者视为模型成功，用于后续实验。正常对照组除了不插入线栓外，其他操作均与上述相同。缺血24h后麻醉小鼠，用预冷的生理盐水从小鼠心脏灌流至肝脏变白，在冰上取下脑组织立即冻存到-20℃，用于ALPK1mRNA和蛋白水平的检测。
图9显示，与Sham组相比，tMCAO组小鼠脑缺血24h后，缺血脑组织中的ALPK1 mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.01)，提示ALPK1可能在小鼠脑缺血后发挥了重要的调节作用。
2)ALPK1敲除对脑缺血小鼠神经行为功能及脑水肿的影响
针对上述实验结果，采用ALPK1基因敲除小鼠进行验证实验。将小鼠分为WT/Sham组、WT/tMCAO组和KO/tMCAO组。采用上述线栓法制备短暂性脑缺血小鼠模型。缺血24h后，采用mNSS评分对小鼠整体神经功能障碍程度进行评价。具体评分标准如表3所示。mNSS总分为18分,0分正常,1-6分为轻度损伤，7-12分为中度损伤，13-18分为重度损伤。
表3：改良神经功能缺损评分(mNSS)量表
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Figure GDA0003798661770000191
图10显示，与WT/tMCAO组相比，KO/tMCAO组小鼠神经功能障碍有显著改善(P<0.01)，提示ALPK1敲除可改善小鼠脑缺血后神经功能障碍。
3)干湿重法测量脑水肿
实验小鼠缺血24h后，大脑被收集起来，分为缺血半脑、非缺血半脑和小脑。每个部分称量以得到湿重(WW)，然后在摄氏110度的环境下烘干24h达到恒重，测定其干燥时的干重，脑组织含水量为-用以下公式计算:(WW-DW)/WW×100％。图10显示，与WT/tMCAO组相比，KO/tMCAO组小鼠缺血半脑的脑水肿程度明显减轻(P<0.01)，提示ALPK1敲除可改善小鼠脑缺血后脑水肿。综上所述，ALPK1在小鼠脑缺血后神经功能损伤中发挥了关键的调节作用。

Claims (3)

1.一种抗认知障碍的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的方法是通过敲除小鼠的α-激酶1基因的至少一个外显子的全部或部分片段来完成的，所述的认知障碍是由于肠道菌群失调导致的衰老引起的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外显子为α-激酶1基因的3号外显子。
3.α-激酶1的抑制剂或拮抗剂在制备用于预防衰老相关的认知功能障碍的制品中的应用，所述的认知功能障碍是由于α-激酶1基因的蛋白表达量增加而相关联的认知功能障碍。
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