CN116162620A - 一种小干扰核酸和制剂及其制药应用 - Google Patents

一种小干扰核酸和制剂及其制药应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小干扰核酸和制剂及其制药应用，属于生物医药领域。一种小干扰核酸，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或该核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列，所述反义链具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和/或对核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列。本发明的优点：本发明小干扰核酸以阳离子聚合物PEI作为递送材料，通过尾静脉注射的方式给小鼠注射药物，结果显示转染RNA药物组小鼠肝组织中PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低。实验结果表明，本发明有望成为治疗高胆固醇血症的药物。

Description

一种小干扰核酸和制剂及其制药应用
技术领域
本发明涉及一种小干扰核酸和制剂及其制药应用，属于生物医药领域，具体涉及一种针对人蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的siRNA，以及用于递送该siRNA的递送材料。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因表达沉默的现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。当向细胞内导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA被降解而导致相应的基因表达沉默。人工合成的siRNA(Small interfering RNA，小干扰核酸)序列长度一般为19-23nt，可通过化学合成，具备高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
高脂血症主要是指血胆固醇和/或甘油三酯升高。高脂血症是人体脂肪代谢异常的表现。主要分为三类：高胆固醇血症、高甘油三酯血症、和混合性高脂血症。高脂蛋白血症被认为是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，动脉粥样硬化的发展取决于高脂蛋白血症的类型。低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白，当低密度脂蛋白过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，容易引起动脉硬化。
PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a)蛋白属于枯草杆菌酶的蛋白酶K亚家族，它们主要通过肝脏表达，并在肝脏分泌进入循环。已有研究表明，PCSK9蛋白能够抑制低密度脂蛋白(LDL-C)受体的回收和再利用。因此，降低PCSK9蛋白的水平可以让更多LDL-C受体回到肝细胞表面，与更多LDL-C结合，将它们从血液中清除，进而减少高胆固醇血症发生的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种小干扰核酸和制剂及其制药应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种小干扰核酸。
一种小干扰核酸，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列和/或该核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列，所述反义链具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和/或对核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列。
所述修饰为2'-甲氧基(2'-OMe)修饰、2'-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰、氟原子修饰和锁核酸修饰(locked nucleic acid)、磷酸二酯键替换为硫代磷酸二酯键中的一种或几种。
本发明提供的小干扰核酸，是针对人蛋白转化酶枯草溶菌素9的siRNA，具有以下序列：
正义链(Sense):5’-CCUCAUAGGCCUGGAGUU-3’(SEQ ID NO.1)
反义链(Antisense):5’-AACUCCAGGCCUAUGAGG-3’(SEQ ID NO.2)
优选地，为了增强siRNA的稳定性，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至4个额外的核苷酸，从而在所述正义链和反义链互补配对后形成至少一个由1至4个核苷酸构成的3’突出端。
进一步优选地，所述3’突出端最后两个核苷酸为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT或尿嘧啶核苷酸UU。这种dT或dU悬垂有助于提高稳定性。
进一步优选地，所述正义链和所述反义链都形成3’突出端。
所述修饰的核苷酸序列为以下2种修饰序列中的任意一种：
第一种修饰序列
正义链:5’-C-s-C-s-UCAUAGGCCTmGmGmAmGmUmUmUmA-s-T-s-T-3’；
反义链:5’-mA-s-mA-s-mCmUmCmCAGGCCUAUGAGGGU-s-T-s-T-3’；
第二种修饰序列
正义链:
5’-mCmCmUmCmAmUmAmGmGmCmCTmGmGmAmGmUmUmUmA-s-T-s-T-3’；
反义链:
5’-mAmAmCmUmCmCmAmGmGmCmCmUmAmUmGmAmGmGmGmU-s-T-s-T-3’
其中，小写字母m表示该字母右侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母s表示字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
本发明通过PubMed网站获取人(NM_174936.4、NR_110451.2)、小鼠(NM_153565.2)、大鼠(NM_199253.2)及猴(XM_005543257.2、XM_005543258.2、XM_005543259.2、XM_005543260.2)的PCSK9 mRNA序列，通过多序列比对网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，获得8条序列的共有的保守序列，参考siRNA的设计原则，初步筛选出候选的siRNA序列。利用PubMed的BLAST软件，对siRNA序列进行同源分析，选取10对基因特异性高的序列，合成进行实验验证。
细胞实验验证结果显示本发明中提供的小干扰核酸序列(SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)抑制PCSK9基因表达水平效果更好，对于脂质异常的代谢调节更有优势。这两条序列的组合可以有效的降低肝脏中PCSK9 mRNA的表达水平，从而起到治疗高脂血症的作用。
本发明的第二方面，提供一种治疗高胆固醇血症的药物制剂。
含有本发明上述任意核苷酸序列的小干扰核酸的制剂。
所述的制剂，由小干扰核酸和递送材料组成。
所述递送材料包括但不限于阳离子聚合物PEI和/或阳离子脂质。所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.26～1.95。
优选的，所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.39～1.69。该质量比的递送效率更高，制剂稳定性更好。
进一步优选的，所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.52～1.3。该优选质量比范围具有最佳的制剂稳定性。
所述制剂中，还含有其他辅料，其他辅料选自10％葡萄糖、10％蔗糖、9.5％海藻糖、0.9％氯化钠溶液中的一种。
所述阳离子聚合物PEI为聚乙烯亚胺聚合物，分子量范围在40000-52000之间，分子式如下
Figure BDA0003371382760000031
本发明的发明人发现利用阳离子聚合物in vivo jet PEI(法国Polyplus公司)包载靶向PCSK9的siRNA，可以有效抑制肝脏中PCSK9基因的表达。在实验过程中，尚未发现明显的毒性。
此处以制备体积600μl含30μg siRNA的药物溶液、siRNA储液浓度为1μg/μl为例：
1)siRNA溶液：取30μl的1μg/μl siRNA溶液加入到120μl无酶无菌水中，轻轻涡旋瞬离。
2)PEI溶液：取7.2μl的100mM in vivo-jet PEI溶液加入到142.8μl无酶无菌水中，轻轻涡旋瞬离。
3)将上述2)PEI溶液滴加入到1)siRNA溶液中，再加入到300μl的10％葡萄糖中，轻轻涡旋瞬离。
4)室温孵育15min。
5)标记样品名称、配制日期等信息，用封口膜封住容器盖，置于4℃冰箱中备用。
本发明的第三方面，提供小干扰核酸和制剂的用途。
本发明任何一项所述的小干扰核酸、小干扰核酸制剂在制备治疗高胆固醇血症的药物中的用途。
即，本发明提供一种针对人蛋白转化酶枯草溶菌素9的小干扰核酸(siRNA)用于制备治疗高胆固醇血症的药物的用途，所述针对人蛋白转化酶枯草溶菌素9的siRNA具有序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、或对所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列。
所述高胆固醇血症是指与低密度脂蛋白(LDL-C)升高相关的高脂血症。
所述高脂血症包括糖尿病相关的高脂血症和心脑血管疾病相关的高脂血症。
本发明的优点如下：本发明利用阳离子聚合物PEI作为递送材料，和PCSK9 siRNA按特定的比例混合后，以等渗溶液作为载体，通过尾静脉注射的方式给小鼠注射药物，观察小鼠状态，并于给药48小时后处死实验动物并取肝组织，随即提取组织总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染本发明siRNA药物组小鼠肝组织中PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低。实验结果表明将PCSK9 siRNA与阳离子聚合物PEI为主要原料制成的制剂有望成为治疗高胆固醇血症的药物。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1 PCSK9 siRNA能够显著抑制HepG2细胞中PCSK9基因mRNA的表达水平。向HepG2细胞转染PCSK9 siRNA 48小时后，收集细胞并提取细胞总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染PCSK9 siRNA后PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(**P<0.01)。横坐标代表不同的小干扰核酸(siRNA)序列，其中数字1对应SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；数字3对应SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；数字5对应SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6,；数字7对应SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，数字9对应SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，数字11对应SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，数字13对应SEQ ID NO.13和SEQID NO.14，数字15对应SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，数字17对应SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18，数字19对应SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
图2示出PCSK9 siRNA能够显著抑制小鼠肝组织中PCSK9基因mRNA的表达水平。小鼠尾静脉注射给药或药物溶剂48小时后，取小鼠肝组织并提取组织总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染RNA药物组小鼠肝组织中PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(*P<0.05)。
图3示出PCSK9 siRNA能够显著降低小鼠血清LDL-C的表达水平。小鼠尾静脉注射给药或药物溶剂48小时后，取小鼠血清，利用生化分析仪检测血中LDL-C的水平，结果显示干扰正常小鼠的PCSK9基因表达不影响血清中LDL-C的水平。
图4示出PCSK9 siRNA能够显著降低小鼠肝组织中LDL-C受体的mRNA表达水平。小鼠尾静脉注射给药或药物溶剂48小时后，取小鼠肝组织并提取组织总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染RNA药物组小鼠肝组织中LDL-C R基因的相对表达量与对照组相比显著升高(**P<0.01)。
图5示出经过修饰的PCSK9 siRNA能够显著抑制HepG2细胞中PCSK9基因mRNA的表达水平。向HepG2细胞转染经修饰的PCSK9 siRNA 48小时后，收集细胞并提取细胞总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染经修饰的PCSK9 siRNA后PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(**P<0.01)。横坐标代表不同的siRNA序列，其中数字1对应SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；数字33对应第一种修饰序列；数字35对应第二种修饰序列。
具体实施方式
实施例1：PCSK9 siRNA能够显著抑制HepG2细胞中PCSK9基因mRNA的表达水平
一、试剂与仪器
MEM培养基(品牌：GIBCO，货号：11095080)，胎牛血清(品牌：Corning，货号：35-081-CV)，双抗Penicillin-Streptomycin(品牌：GIBCO，货号：15140122)，胰酶(品牌：GIBCO，货号：25200072)，Opti-MEM(品牌：GIBCO，货号：31985062)，Lipo3000(品牌：invitrogen，货号：L30000-15)，RNA提取试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction(品牌：Takara，货号：9767)，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，货号：RR036A)，qPCR试剂盒TB
Figure BDA0003371382760000061
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，货号：RR420A)，荧光定量PCR仪(品牌：Bio-Rad，货号：CFX connect)，超微量浓度测定仪(品牌：奥盛，货号：Nano300)
HepG2细胞：赛百慷(上海)生物技术股份有限公司
siRNA：针对PCSK9的siRNA设计合成如下序列，均由苏州贝信生物技术有限公司合成。
Sense:5’-CCUCAUAGGCCUGGAGUU-UATT-3’；(SEQ ID NO.1)
Antisense:5’-AACUCCAGGCCUAUGAGG-GUTT-3’；(SEQ ID NO.2)
Sense:5’-CCUCAUAGGCCUGGAGUUUATT(3'Cholesterol)-3’(SEQ ID NO.3)
Antisense:5’-AACUCCAGGCCUAUGAGGGUTT-3’(SEQ ID NO.4)
Sense:5’-UGGGGGUGAGGGUGUCUATT-3’(SEQ ID NO.5)
Antisense:5’-GACACCCUCACCCCCAAATT-3’(SEQ ID NO.6)
Sense:5’-GGUGGAGGUGUAUCUCCUAGATT-3’(SEQ ID NO.7)
Antisense:5’-UAGGAGAUACACCUCCACCAGTT-3’(SEQ ID NO.8)
Sense:5’-CCUACGUGGUGGUGCUGAAGGTT-3’(SEQ ID NO.9)
Antisense:5’-UUCAGCACCACCACGUAGGUGTT-3’(SEQ ID NO.10)
Sense:5’-UCAUUGAUGACAUCUUUGGCATT-3’(SEQ ID NO.11)
Antisense:5’-CCAAAGAUGUCAUCAAUGAGGTT-3’(SEQ ID NO.12)
Sense:5’-UGUUUGAAUGGUGAAAUGCCCTT-3’(SEQ ID NO.13)
Antisense:5’-GCAUUUCACCAUUCAAACAGGTT-3’(SEQ ID NO.14)
Sense:5’-CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU-3’(SEQ ID NO.15)
Antisense:5’-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3’(SEQ ID NO.16)
Sense:5’-UGGAGGUGUAUCUCCUAGATT-3’(SEQ ID NO.17)
Antisense:5’-UAGGAGAUACACCUCCACCTT(SEQ ID NO.18)
Sense:5’-CCAAAGAUGUCAUCAAUGATT-3’(SEQ ID NO.19)
Antisense:5’-AUUGAUGACAUCUUUGGCATT-3’(SEQ ID NO.20)
用于作为对照的siRNA序列
Sense:5’-UUC UUC GAA CGU GUC ACG UTT-3’(SEQ ID NO.21)
Antisense:5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’(SEQ ID NO.22)
二、实验方法
1.细胞铺板及siRNA转染
(1)细胞铺板：
12孔板接种密度约10万个细胞/孔，保证细胞在孔内均匀分布。
(2)制备转染试剂Lipo3000和siRNA的复合物：
①在无菌无酶的离心管内加入一定体积的Opti-MEM，将实验所需的siRNA按需求量加入其中，用移液器轻吹混匀；
②在无菌无酶的离心管内加入一定体积的Opti-MEM，将Lipo3000加入其中，轻轻混匀，室温条件下静置5分钟；
③将含有siRNA的Opti-MEM轻轻滴加入含Lipo3000的Opti-MEM中，混匀后室温静置15分钟。
(3)细胞转染：
从细胞培养箱中取出待转染的12孔板，在显微镜下观察细胞转态，确认能够转染后，将制备好的siRNA和Lipo3000混合液缓慢加入孔内，待轻晃液体混匀后，将细胞培养板放入CO2恒温培养箱中。
2、提取细胞RNA、反转录及荧光定量PCR
待细胞转染48小时后，将细胞培养板取出，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，提取后检测RNA浓度，再进行反转录及荧光定量PCR。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
3、荧光定量PCR用到的引物序列为：
PCSK9-human Forward：5’-CCTGGAGCGGATTACCCCT-3’，(SEQ ID NO.23)
PCSK9-human Reverse：5’-CTGTATGCTGGTGTCTAGGAGA-3’，(SEQ ID NO.24)
GAPDH-human Forward：5’-GCAAATTCCATGGCACCGT-3’，(SEQ ID NO.25)
GAPDH-human Reverse：5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’(SEQ ID NO.26)
4、数据处理
应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图(图1)，样本用t检验，*P＜0.05表示与空白对照组相比差异显著，**P＜0.01示与空白对照组相比差异极显著，具有统计学意义。
三、实验结果
向HepG2细胞转染PCSK9 siRNA 48小时后，收集细胞并提取细胞总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果见图1，结果显示转染PCSK9 siRNA后PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(**P<0.01)，其中转染SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的HepG2细胞，抑制PCSK9基因mRNA的表达水平的效果最好，对于脂质异常的代谢调节更有优势。
实施例2：PCSK9 siRNA能够显著抑制小鼠肝组织中PCSK9基因mRNA的表达水平一、试剂与仪器
RNA提取试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction(品牌：Takara，货号：9767)，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，货号：RR036A)，qPCR试剂盒TB
Figure BDA0003371382760000081
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，货号：RR420A)，荧光定量PCR仪(品牌：Bio-Rad，货号：CFX connect)，超微量浓度测定仪(品牌：奥盛，货号：Nano300)，组织破碎仪(品牌：净信，货号：JXFSTPRP24L)
C57BL/6小鼠：雄性，7周龄，SPF级，采购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号SYXK(浙)2019-0021。
二、实验方法
(一)RNA药物配制方法
1)siRNA溶液：配制0.2μg/μl的siRNA(SEQ ID NO.1和NO.2)溶液150μl。
2)PEI溶液：将7.2μl的100mM invivo-jetPEI溶液加入到142.8μl无酶无菌水中，轻轻涡旋并瞬离。
3)将上述2)PEI溶液滴加入到1)siRNA溶液中，再加入到300μl 10％葡萄糖溶液中，轻轻涡旋瞬离。
4)室温孵育15min。
5)标记样品名称、配制日期等信息，用封口膜封住容器盖，置于4℃冰箱中备用。
(二)实验操作
雄性C57BL/6小鼠，实验开始时小鼠体重24+2g，共20只小鼠，分为PCSK9siRNA药物组和对照组，每组10只。在温度24～26℃，湿度60％，明暗各12h的培养条件下适应性饲养一周。
适应性饲养一周后，PCSK9 siRNA药物组和对照组分别尾静脉注射1次siRNA药物或空白溶剂(PCSK9 siRNA药物组小鼠按0.05ml/10g体重注射，对照组给予葡萄糖水溶液)。空白溶剂为葡萄糖水溶液。
给药48小时后处死小鼠取肝脏组织，之后用RNA提取试剂盒提取肝脏组织RNA，通过反转录PCR将其反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR的方法检测肝脏组织中PCSK9的mRNA相对表达情况。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
荧光定量PCR用到的引物序列为：
PCSK9-mouse Forward：5’-GCCCATCGGGAGATTGAGG-3’，(SEQ ID NO.27)
PCSK9-mouse Reverse：5’-TTCCCTTGACAGTTGAGCACA-3’，(SEQ ID NO.28)
β-actin-mouse Forward：5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，(SEQ ID NO.29)
β-actin-mouse Reverse：5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’(SEQ ID NO.30)
表1.实验动物分组和药物处理说明表
Figure BDA0003371382760000091
应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图，独立样本用t检验，*P＜0.05表示与空白对照组相比差异显著，具有统计学意义。
三、实验结果
小鼠尾静脉注射给药或药物制剂48小时后，取小鼠肝组织并提取组织总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染RNA药物组小鼠肝组织中PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(*P<0.05)。结果见图图2。
实施例3：PCSK9 siRNA能够降低由高脂高胆固醇饮食的小鼠的血清LDL-C水平一、试剂与仪器
TG、TC、LDL-C、HDL-C检测试剂盒购自美康生物。C57BL/6小鼠：雄性，7周龄，SPF级，采购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号SYXK(浙)2019-0021。
正常饲料参照实验室啮齿动物标准饲料配方(Research diets D10001)；高脂高胆固醇饲料参考标准为(Research diets D12451+1％胆固醇)。
此处以制备体积600μl含30μg siRNA的药物溶液、siRNA溶液浓度为1μg/μl为例：
1)siRNA溶液：取30μl的1μg/μl siRNA(SEQ ID NO.1和NO.2)储液加入到120μl无酶无菌水中，轻轻涡旋瞬离。
2)PEI溶液：取7.2μl的100mM invivo-jetPEI储液加入到142.8μl无酶无菌水中，轻轻涡旋瞬离。
3)将上述2)PEI溶液滴加入到1)siRNA溶液中，再加入到300μl 10％葡萄糖中，轻轻涡旋瞬离。
4)室温孵育15min。
5)标记样品名称、配制日期等信息，用封口膜封住容器盖，置于4℃冰箱中备用。
二、实验方法
雄性C57BL/6小鼠，实验开始时小鼠体重24+2g。总共30只小鼠，分为正常对照组，高脂高胆固醇饮食模型组及PCSK9 siRNA组，每组10只。在温度24～26℃，湿度60％，明暗各12h的培养条件下适应性饲养一周。
适应性饲养一周后按正常对照组喂饲基础饲料、其余两组喂饲高脂高胆固醇饲料，连续喂养10周，实验期间小鼠自由摄食饮水。第10周时，眼眶采血一次。采血后，正常对照组和模型组尾静脉注射1次空白溶剂(葡萄糖水溶液)，PCSK9 siRNA组尾静脉注射1次药物溶剂(剂量为0.05ml/10g体重注射)。第20周时，摘眼球采血，处死小鼠。
采血后，血液静置30min后，置于4℃离心机3500r，离心15min，取上清，进全自动生化仪(日立型号：3100)检测。
应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图(图3)，采用双因素方差分析检验，##P＜0.01表示与模型组相比差异极显著，具有统计学意义。
三、实验结果
在第十周的时候小鼠尾静脉注射含有PCSK9 siRNA复合物，对正常小鼠血清中的LDL-C水平没有显著影响。结果见图3。
实施例4：PCSK9 siRNA能够显著提高小鼠肝组织中LDL-C受体的mRNA表达水平
一、试剂与仪器
RNA提取试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction(品牌：Takara，货号：9767)，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，货号：RR036A)，qPCR试剂盒TB
Figure BDA0003371382760000111
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，货号：RR420A)，荧光定量PCR仪(品牌：Bio-Rad，货号：CFX connect)，超微量浓度测定仪(品牌：奥盛，货号：Nano300)，组织破碎仪(品牌：净信，货号：JXFSTPRP24L)
C57BL/6小鼠：雄性，7周龄，SPF级，采购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号SYXK(浙)2019-0021
二、实验方法
雄性C57BL/6小鼠，实验开始时小鼠体重24+2g。总共20只小鼠，每组10只。在温度24～26℃，湿度60％，明暗各12h的培养条件下适应性饲养一周。
适应性饲养一周后，按组别尾静脉注射1次RNA药物或药物溶剂(按小鼠0.05ml/10g体重注射，对照给予葡糖糖水溶液)。药物配制参考实施例2。
给药48小时后处死小鼠取肝脏组织，之后用RNA提取试剂盒提取肝脏提取肝脏组织RNA，通过反转录PCR将其反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR的方法检测肝脏组织中PCSK9的mRNA相对表达情况。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
荧光定量PCR用到的引物序列为：
LDLR-mouse Forward：5’-CTCCTGCATTCACGGTAGCC-3’，(SEQ ID NO.31)
LDLR-mouse Reverse：5’-CCCACTGTGACACTTGAACTTG-3’，(SEQ ID NO.32)
β-actin-mouse Forward：5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，(SEQ ID NO.29)
β-actin-mouse Reverse：5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’(SEQ ID NO.30)
表2.实验动物分组和药物处理说明表
Figure BDA0003371382760000121
应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图(图4)，独立样本用t检验，**P＜0.01示与空白对照组相比差异极显著。
三、实验结果
实验结果显示，与对照组相比，转染PCSK9 siRNA能够显著提高小鼠肝组织中LDL-C受体的mRNA表达水平，从而降低血液中LDL-C含量。
实施例5：经过修饰的PCSK9 siRNA能够显著抑制HepG2细胞中PCSK9基因mRNA的表达水平
一、试剂与仪器
MEM培养基(品牌：GIBCO，货号：11095080)，胎牛血清(品牌：Corning，货号：35-081-CV)，双抗Penicillin-Streptomycin(品牌：GIBCO，货号：15140122)，胰酶(品牌：GIBCO，货号：25200072)，Opti-MEM(品牌：GIBCO，货号：31985062)，Lipo3000(品牌：invitrogen，货号：L30000-15)，RNA提取试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction(品牌：Takara，货号：9767)，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，货号：RR036A)，qPCR试剂盒TB
Figure BDA0003371382760000122
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，货号：RR420A)，荧光定量PCR仪(品牌：Bio-Rad，货号：CFX connect)，超微量浓度测定仪(品牌：奥盛，货号：Nano300)
HepG2细胞：赛百慷(上海)生物技术股份有限公司
siRNA：针对PCSK9的siRNA设计合成如下序列，均由苏州贝信生物技术有限公司合成。
Sense:CCUCAUAGGCCUGGAGUUUATT；(SEQ ID NO.1)
Antisense:AACUCCAGGCCUAUGAGGGUTT；(SEQ ID NO.2)
第一种修饰序列：
正义链(Sense):C-s-C-s-UCAUAGGCCTmGmGmAmGmUmUmUmA-s-T-s-T
反义链(Antisense):mA-s-mA-s-mCmUmCmCAGGCCUAUGAGGGU-s-T-s-T
第二种修饰序列：
正义链(Sense):
mCmCmUmCmAmUmAmGmGmCmCTmGmGmAmGmUmUmUmA-s-T-s-T；
反义链(Antisense):
mAmAmCmUmCmCmAmGmGmCmCmUmAmUmGmAmGmGmGmU-s-T-s-T
其中，小写字母m表示该字母右侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母s表示字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
用于作为对照的siRNA序列
Sense:UUC UUC GAA CGU GUC ACG UTT(SEQ ID NO.21)
Antisense:ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT(SEQ ID NO.22)
二、实验方法
1、细胞铺板及siRNA转染
(1)细胞铺板：
12孔板接种密度约10万个细胞/孔，保证细胞在孔内均匀分布。
(2)制备转染试剂Lipo3000和siRNA的复合物：
①在无菌无酶的离心管内加入一定体积的Opti-MEM，将实验所需的siRNA按需求量加入其中，用移液器轻吹混匀；
②在无菌无酶的离心管内加入一定体积的Opti-MEM，将Lipo3000加入其中，轻轻混匀，室温条件下静置5分钟；
③将含有siRNA的Opti-MEM轻轻滴加入含Lipo3000的Opti-MEM中，混匀后室温静置15分钟。
(3)细胞转染：
从细胞培养箱中取出待转染的12孔板，在显微镜下观察细胞转态，确认能够转染后，将制备好的siRNA和Lipo3000混合液缓慢加入孔内，待轻晃液体混匀后，将细胞培养板放入CO2恒温培养箱中。
2、提取细胞RNA、反转录及荧光定量PCR
待细胞转染48小时后，将细胞培养板取出，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，提取后检测RNA浓度，再进行反转录及荧光定量PCR。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
3、荧光定量PCR用到的引物序列为：
PCSK9-human Forward：5’-CCTGGAGCGGATTACCCCT-3’，(SEQ ID NO.23)
PCSK9-human Reverse：5’-CTGTATGCTGGTGTCTAGGAGA-3’，(SEQ ID
NO.24)
GAPDH-human Forward：5’-GCAAATTCCATGGCACCGT-3’，(SEQ ID
NO.25)
GAPDH-human Reverse：5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’(SEQ ID NO.26)
4、数据处理
应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图(图1)，样本用t检验，*P＜0.05表示与空白对照组相比差异显著，**P＜0.01示与空白对照组相比差异极显著，具有统计学意义。
三、实验结果
向HepG2细胞转染PCSK9 siRNA 48小时后，收集细胞并提取细胞总RNA、反转录、荧光定量PCR检测PCSK9基因mRNA的表达水平，结果显示转染SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，第一种修饰序列，第二种修饰序列后PCSK9基因的相对表达量与对照组相比显著降低(**P<0.01)。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
序列表
<110> 佑嘉（杭州）生物医药科技有限公司
<120> 一种小干扰核酸和制剂及其制药应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccucauaggc cuggaguu 18
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacuccaggc cuaugagg 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccucauaggc cuggaguuua tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacuccaggc cuaugagggu tt 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugggggugag ggugucuatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacacccuca cccccaaatt 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gguggaggug uaucuccuag att 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uaggagauac accuccacca gtt 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccuacguggu ggugcugaag gtt 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uucagcacca ccacguaggu gtt 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ucauugauga caucuuuggc att 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaaagaugu caucaaugag gtt 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uguuugaaug gugaaaugcc ctt 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcauuucacc auucaaacag gtt 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cuagaccugu tuugcuuuug u 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acaaaagcaa aacaggucua gaa 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
uggaggugua ucuccuagat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uaggagauac accuccacct t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaaagaugu caucaaugat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
auugaugaca ucuuuggcat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
uucuucgaac gugucacgut t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctggagcgg attacccct 19
<210> 24
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgtatgctg gtgtctagga ga 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcaaattcca tggcaccgt 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgccccact tgattttgg 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcccatcggg agattgagg 19
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttcccttgac agttgagcac a 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtaacagtcc gcctagaagc ac 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctcctgcatt cacggtagcc 20
<210> 32
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cccactgtga cacttgaact tg 22

Claims (17)

1.一种小干扰核酸，其特征在于：包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或该核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列，所述反义链具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和/或对核苷酸序列的任意核苷酸进行了修饰的序列。
2.根据权利要求1所述的一种小干扰核酸，其特征在于：所述修饰为2'-甲氧基(2'-OMe)修饰、2'-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰、氟原子修饰和锁核酸修饰(locked nucleicacid)、磷酸二酯键替换为硫代磷酸二酯键中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的一种小干扰核酸，其特征在于：所述正义链和/或反义链的3’末端连接有1至4个额外的核苷酸，在所述正义链和反义链互补配对后形成至少一个由1至4个核苷酸构成的3’突出端。
4.根据权利要求3所述的一种小干扰核酸，其特征在于：所述3’突出端末尾为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT或尿嘧啶核苷酸UU。
5.根据权利要求3所述的一种小干扰核酸，其特征在于：所述正义链和反义链都形成3’突出端。
6.根据权利要求1或2所述的一种小干扰核酸，其特征在于；所述修饰的核苷酸序列为以下2种修饰序列中的任意一种：
第一种修饰序列
正义链:5’-C-s-C-s-U-C-A-U-A-G-G-C-C-T-mG-mG-mA-mG-mU-mU-mU-mA-s-T-s-T-3’；
反义链:5’-mA-s-mA-s-mC-mU-mC-mC-A-G-G-C-C-U-A-U-G-A-G-G-G-U-s-T-s-T-3’；
第二种修饰序列
正义链:
5’-mC-mC-mU-mC-mA-mU-mA-mG-mG-mC-mC-T-mG-mG-mA-mG-mU-mU-mU-mA-s-T-s-T-3’；
反义链:
5’-mA-mA-mC-mU-mC-mC-mA-mG-mG-mC-mC-mU-mA-mU-mG-mA-mG-mG-mG-mU-s-T-s-T-3’
其中，小写字母m表示该字母右侧的核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母s表示字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
7.含有权利要求1至6中任一项所述的小干扰核酸的制剂。
8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：由小干扰核酸和递送材料组成。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于：所述递送材料为阳离子聚合物PEI和/或阳离子脂质。
10.根据权利要求8或9所述制剂，其特征在于：所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.26～1.95。
11.根据权利要求10所述的制剂，其特征在于：所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.39～1.69。
12.根据权利要求11所述的制剂，其特征在于：所述小干扰核酸与递送材料的质量比为0.52～1.3。
13.根据权利要求9所述的小干扰核酸制剂，其特征在于：所述阳离子聚合物PEI为聚乙烯亚胺聚合物，分子量范围在40000-52000之间，分子式如下
Figure FDA0003371382750000021
14.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于：还含有其他辅料，其他辅料选自10％葡萄糖、10％蔗糖、9.5％海藻糖、0.9％氯化钠溶液中的一种。
15.权利要求1至6中任何一项所述的小干扰核酸、权利要求7至14任一项所述的小干扰核酸制剂在制备治疗高胆固醇血症的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述高胆固醇血症是指与低密度脂蛋白(LDL-C)升高相关的高脂血症。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于：所述高脂血症包括糖尿病相关的高脂血症和心脑血管疾病相关的高脂血症。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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