CN105521484A - 胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及本发明的目的是提供胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)在促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生中的应用。本发明还涉及IGFBP2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生的药物中的应用，以及IGFBP2过表达的间充质干细胞在制备治疗脂肪组织再生的药物中的应用。本发明通过研究发现胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)具有促进间充质干细胞成脂分化的作用，进而利用IGFBP2增强间充质干细胞再生脂肪组织的能力，并可预计能够应用于治疗修复先天及后天性脂肪组织缺损。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用。
背景技术
脂肪组织可分为白色和棕色脂肪组织，棕色脂肪组织分布有限，主要功能是产生热量，白色脂肪组织广泛分布于全身皮下组织及腹腔内，除用于贮存能量外，尚具有广泛而复杂的内分泌功能。脂肪组织可分泌众多激素和脂肪细胞因子如瘦素、IGF1、IGFBP3和抵抗素等，这些细胞因子形成复杂的信号通路网络，作用于脑、肝脏、骨骼肌等全身器官组织，调节机体的脂肪形成及代谢平衡、免疫功能等。先天及后天脂肪组织缺失，如获得性部分脂肪营养不良、外伤等，临床表现为脂肪组织的丧失，严重影响患者的美观和身心健康。目前治疗方法有限主要包括赝复体、整形美容手术等方法，但这些传统治疗方法尚不能使丧失的脂肪组织获得理想的再生。随着干细胞、组织工程技术的发展及应用为脂肪组织的生物性再生提供了更为有效的手段。组织工程技术是利用可降解生物材料、各种类型的种子细胞及细胞因子相互复合，移植后可在宿主体内重建具有正常结构及功能的组织器官。
干细胞发展及应用为组织生物性再生提供了更为有效的手段。研究发现间充质干细胞具有自我更新、多向分化等能力，可以分化为组织修复所需的各种组织如脂肪组织、骨组织等，与生物材料复合应用具有良好的修复自身缺损和改建周围组织的功能。近年来越来越多的研究报道表明，间充质干细胞除免疫原性低、具备再生和修复功能外，还有较强的免疫抑制及调节作用，并已安全和成功地用于临床，或结合组织工程技术进行组织再生，或直接应用间充质干细胞对自身免疫疾病进行细胞治疗，是脂肪组织再生理想的治疗手段和良好的种子细胞。
研究表明，骨髓间充质干细胞(Bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,BMSCs)作为经典的用于组织再生的间充质干细胞，其应用最为广泛。然而研究发现成人BMSCs细胞数量及分离效率随供者年龄的增大而下降，同时自体间充质干细胞采集须行骨髓穿刺术，其细胞来源较有限。自体脂肪干细胞(Adipose-derivedmesenchymalstemcells,ADSCs)来源广泛，然而需二次手术增加了患者的额外痛苦。脐带间充质干细胞(Wharton’sjellyofumbilicalcordstemcells,WJCMSCs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有与骨髓间充质干细胞一致的自我更新、克隆形成、多向分化和免疫调节能力，具有来源广泛、取材方便、体外扩增能力强，不存在伦理学限制以及免疫原性低等优点，正逐渐成为间充质干细胞研究领域的热点。目前已广泛应用于自身免疫病治疗，其安全性使得在科学研究和临床应用的前景更为广阔。
胰岛素样生长因子系统由胰岛素、受体及胰岛素样生长因子结合蛋白组成，胰岛素样生长因子结合蛋白作为胰岛素样生长因子轴的重要组成，共有6条单链多肽，在组织和细胞中广泛表达，参与机体诸多病生理过程。IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2，Insulin-likegrowthfactorbindingprotein2)是胰岛素样生长因子系统的重要组成，大量存在于外周循环和骨髓腔中，与IGF有较高的亲和力。在新生儿快速生长期和骨堆积高峰期，IGFBP2表达水平升高。研究表明IGFBP2基因敲除的小鼠有明显的骨组织形成缺陷，然而IGFBP2在间充质干细胞成脂方面的作用少有研究。
胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)是由处于分化期的白色脂肪前体细胞分泌，这提示IGFBP2可能与脂肪组织形成及分化密切相关。有研究显示，过表达IGFBP2的转基因大鼠，其体脂肪百分比显著增多。L.Leng等研究表明IGFBP2基因是影响鸡脂肪形状的主要因素之一。但IGFBP2对间充质干细胞成脂肪分化的作用及机制不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)在促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生中的应用。本发明还涉及IGFBP2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生的药物中的应用，以及IGFBP2过表达的间充质干细胞在制备治疗脂肪组织再生的药物中的应用。
本发明实现目的的技术方案是：
一种胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用。
胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生中的应用。
胰岛素样生长因子结合蛋白2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生的药物中的应用。
胰岛素样生长因子结合蛋白2在制备治疗脂肪组织再生的药物中的应用。
本发明的优点和积极效果是：
本发明通过研究发现胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)具有促进间充质干细胞成脂分化的作用，进而利用IGFBP2增强间充质干细胞再生脂肪组织的能力，并可预计能够应用于治疗修复先天及后天性脂肪组织缺损。
附图说明
图1为建立IGFBP2过表达的稳定转染细胞。图1A为mRNA检测外源性IGFBP2的表达水平结果，图1B为蛋白水平检测外源性IGFBP2的表达结果；
图2为IGFBP5过表达促进脐带间充质干细胞体外成脂分化。图2A为油红O染色图，图2A-1至图2A-4为检测0周和诱导3周后油红O染色，图2B为脂滴定量检测检测图，测定OD值来检测其成脂分化能力，图2C为在0周、1周、2周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成脂分化的指标：PPARg，图2D为在0周、1周、2周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成脂分化的指标：LPL。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但是此说明不会构成对本发明的限制法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)干细胞的获取、培养
购买脐带间充质干细胞，将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1：2消化传代。
(2)构建质粒病毒。
通过NCBI数据库查询IGFBP2的基因序列，设计IGFBP2基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到IGFBP2的全长并加表面标记FlagTag，将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成Flag-IGFBP2的质粒。然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。
(3)稳定转染细胞系的建立
对照质粒及Flag-IGFBP2的病毒转染脐带干细胞，转染48小时后，用G418筛选10天得到IGFBP2过表达的稳定转染脐带干细胞，在mRNA(图1A)和蛋白水平(图1B)检测Flag的表达鉴定外源性IGFBP2的表达。结果表明IGFBP2过表达稳定转染细胞的建立。
实施例2
Real-timeRT-PCR：
1.引物设计，Primer3及oligo6等生物软件。
2.RT-PCR引物序列：
IGFBP2-F：CGTTCAAGTGCAAGATGTCTCTGAACG
IGFBP2-R：GGATCAGCTTCCCGGTGTTG
3.RNA提取
1)培养皿细胞弃上清，PBS冲洗2遍，加700ulQIAZOL，吹打混匀，收于EP管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃12000g离心15min,收上清于新EP管；
2)取700ul样本至RNeasyRNA提取柱，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
3)加700ulBufferRWT至RNA提取柱，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
4)加500ulBufferRPE至RNeasyMinicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
5)重复步骤4)；
6)转移RNeasyMinicolumn至一新2ml收集管，4℃1000g离心1min,弃下层液体；
7)转移RNeasyMinicolumn至一新2mlcollectiontube，加30-50ulNase-freewater,4℃8000g离心15s，收集下层液体于新EP管，测RNA浓度，-80℃保存。
4.反转录PCR
1)微小收集管管中配制下列模板RNA/引物混合液；
2)65℃保温5分钟后迅速置于冰上1分钟以上；
3)离心数秒，使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部；
4)在上述Microtube管中配制加入下列反转录反应液；
5)混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却；
6)加入1ulM-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀；
7)37℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。
5.Real-timePCR
配置Real-timePCR反应体系如下：
Real-timePCR反应体系如下：
实施例3
WesternBlot
1、细胞总蛋白的提取
1)弃培养基，用4℃预冷的5mlPBS漂洗细胞两次，加入5mlPBS后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1mlPBS重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min；
2)弃上清，以1：5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ulRIPA+1ulPMSF+1ulPIC)，冰上15min，每2-3min混悬一次；
3)4℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存。
2、Bradford法测定蛋白浓度
1)BSA蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；
2)根据样品和标准品数量，按每孔加200ul1X考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；
3)测定595nm波长的吸光度；根据标准曲线计算蛋白浓度；
4)根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳
1)准备预成胶；
2)变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ulloadingbuffer(溴酚蓝)，95℃加热10min；
3)上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。
4、转膜
1)准备预成膜；
2)将电泳胶转移至预成膜中，使用BioRad半干转进行转膜；
3)取出PVDF膜，TBST漂洗5min。
5、Westernblot滤膜杂交
1)将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时；
2)TBST漂洗10min×3次；
3)将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜；
4)TBST洗膜，10min×3次；
5)将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的HRP标记的二抗中，室温摇床孵育1小时；
6)TBST洗膜，10min×3次。
6、显色
将PVDF膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。
(4)IGFBP2对脐带间充质干细胞成脂分化功能影响的体外研究，发现IGFBP2促进脐带间充质干细胞成脂分化
取脐带间充质干细胞以2×103/cm2的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至90％融合后，用成脂诱导培养液将脐带间充质干细胞在体外向成脂方向分化诱导，每2天换1次液，在光镜下观察脂滴形成情况。检测0周和诱导3周后油红O染色(图2A)，并测定OD值(图2B)来检测其成脂分化能力。分别在0周、1周、2周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成脂分化的指标：PPARg(图2C)、LPL(图2D)。结果表明过表达IGFBP2促进脐带间充质干细胞体外成脂分化。
油红O染色：
油红O储存液：将150mg油红O溶于50ml异丙醇中，37℃，30min；
油红O工作液：用双蒸水稀释储存液，比例为水：储存液＝4：6，过滤使溶液呈清澈桔红色方可使用；
甲醛钙固定液：40％甲醛10ml，CaCl22.0g,双蒸水90ml；
染色步骤：
1)细胞诱导后，去培养基，用PBS洗2次；
2)甲醛-钙室温固定15min；
3)PBS洗2次；
4)60％异丙醇媒染1min；
5)去异丙醇，油红O工作液室温染色30min；
6)60％异丙醇浸洗一次；
7)PBS洗2次；
8)镜下观察，甘油三脂脂滴染成红色；
9)拍片；
10)用100％异丙醇冲洗油红O，作用10min。用枪吹打几次,使油红O充分溶解于异丙醇中。将其移到1.5mlEP管中，读500nm的吸光度值(用作定量分析)，用100％异丙醇作为空白对照。
实施例4
Real-timeRT-PCR：(步骤如上)
1.RT-PCR引物序列:
PPARg-F：CGAGACCAACAGCTTCTCCTTCTCG
PPARg-R：TTTCAGAAATGCCTTGCAGTGG
LPL-F：CGGATTAACATTGGAGAAGCTATCCG
LPL-R：AGCTGGTCCACATCTCCAAGTC
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用。
2.胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生中的应用。
3.胰岛素样生长因子结合蛋白2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生的药物中的应用。
4.胰岛素样生长因子结合蛋白2在制备治疗脂肪组织再生的药物中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215092A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102357263A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-02-22 | 董萍 | 一种可用于美容和美体的促自体外周前体脂肪细胞增殖和增大的复合诱导剂及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102357263A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-02-22 | 董萍 | 一种可用于美容和美体的促自体外周前体脂肪细胞增殖和增大的复合诱导剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHARLOTTE REHFELDT等: "Increased fat mass, decreased myofiber size, and a shift to glycolytic muscle metabolism in adolescent male transgenic mice overexpressing IGFBP-2", 《AM J PHYSIOL ENDOCRINOL METAB》 * |
| SHI YU等: "Analysis of Differentiation Potentials and Gene Expression Profiles of Mesenchymal Stem Cells Derived from Periodontal Ligament and Wharton’s Jelly of the Umbilical Cord", 《CELLS TISSUES ORGANS》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215092A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法 |
| CN113215092B (zh) * | 2021-05-26 | 2022-04-05 | 广州峰缘生物科技有限公司 | 一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法 |
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