CN1181195C - 一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法。本发明直接用MNC细胞进行体外培养以获得EPCs，在培养液中加入生长因子，以一定的种植密度植于用明胶包被的培养瓶中或小玻片上，进行常规培养获得ECPs。本发明简化了传统培养方法的步骤，有效的避免MNC CD34+的不必要损失，提高EPCs的得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明方法为人外周血EPCs的分离和培养建立了方法学，为今后临床应用做准备，能相应减少外周血的用量，为自体回输治疗缺血性疾病创造条件。

Description

一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及人外周血血管内皮祖细胞的培养方法。

背景技术

人为地刺激血管新生是治疗缺血性疾病的一种新方法。血管新生包括两个概念：胚胎期的血管发生(vasculogenesis，VG)和出生后的血管生成(angiogenesis，AG)。传统意义的VG指，在没有血管系统的情况下，由血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)或成血管细胞(angioblasts)分化成内皮细胞，以出芽方式形成血管网，进而形成血管。这一过程通常以造血干细胞(HSC)为中心、EPCs在周围的血岛开始。传统意义的AG指，在成体血管由已经存在的成熟内皮细胞冲破管壁基质迁移，增殖和重构，以发芽方式使血管树枝持续延长。近年来，Ashara等研究报道从外周血中分离培养出EPCs，并且证明EPCs也参与了出生后的血管生成，AG的概念有新的改变。

用磁式细胞分选法从人的外周血中分离出CD³⁴⁺的单个核细胞(MNC^CD34+)，体外培养显示它能分化为内皮细胞，给缺血动物模型回输显示它参与了出生后血管生成(Angiogenesis，AG)的过程。因而首次证明血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)来源于MNC^CD34+。此后陆续有从胚胎、骨髓、脐静脉血分离出同样的EPCs的报道。

目前，传统的EPCs分离培养法如下：

1.用已知的Ficoll密度梯度离心法将外周血分离出单个核细胞(MNC)层。

2.用人CD³⁴⁺抗体包被的免疫磁珠采取磁珠分选法在MNC中分离出MNC^CD34+。然后将MNC^CD34+单独种植于培养皿中进行培养。

3.MNC^CD34+的培养：

培养液：medium-199+20％胎牛血清+牛脑提取物+抗生素，或EBM-2+5％FBS+人VEGF-1+人FGF-2+人EGF+人IGF-1+抗坏血酸。(VEGF为血管内皮生长因子，FGF为成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，IGF为胰岛素样生长因子)培养皿采用人纤维结合蛋白(fibronectin)或胶原I型(collagen typeI)包被。

传统的培养方法较为繁琐，在用CD34+抗体包被的免疫磁珠分选MNC的过程中不可避免会有MNC CD34+的损失，造成细胞收率较低。另外，国外传统方法要求实验条件较高，因此其方法的可重复性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人外周血血管内皮祖细胞的培养方法。本发明方法采用分离人外周血MNC后，通过体外直接培养MNC得到EPCs。本方法可简化EPCs培养步骤，提高细胞的收率。

医学界公认EPCs有以下用途：a.促进血管新生的作用，改善脏器缺血导致的功能障碍，EPCs的体内回输可用来治疗人体缺血性疾病：如缺血性心脏病、脑缺血、肾缺血、肢端缺血坏死等一系列疾病，尤其将在心肌梗死、心绞痛等缺血性心脏病的治疗过程中起到巨大作用；b.帮助修复损伤的血管内膜，如经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和其他血管的介入手术不可避免的多少会损伤血管内膜，EPCs的回输将促进损伤内膜的修复，减少因内膜损伤而导致的介入术后的血管再狭窄；c.帮助恢复和重建动脉粥样硬化的血管内皮功能，防止动脉粥样硬化的进一步恶化，减少心肌梗死的发生；d.在肿瘤学方面，通过研究EPCs在肿瘤血管生成过程中的作用，采取相应的抑制措施，为抑制肿瘤血管生成以及抑制肿瘤生长开辟新途径。

本发明一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法通过下述步骤实现：

1、分离人外周血MNC：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出MNC。

2、体外培养MNC：在体外细胞培养液中加入生长因子；将MNC细胞种于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上，明胶密度为5-10μl/cm²；细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱中，每3-4天半量换液一次。

上述MNC的体外细胞培养液为M-199+20％FBS+肝素100U/ml+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；生长因子为牛垂体提取物(市购)，以3-15μg/ml的终浓度加入培养液中；细胞按10⁵-10⁶cell/cm²种植；培养瓶中或小玻片上包被有2％的明胶，明胶密度为5-10μl/cm²。

3、血管内皮祖细胞特性鉴定：

细胞形态学特征：每ml外周血经Ficoll密度梯度离心可得到MNC 1-2×10⁶，培养一天的贴壁率约为30％，多数细胞形态为圆形。培养的第2天出现梭形贴壁细胞(attaching cell，AT cell)，并出现成簇现象，第4天梭形细胞多见并形成条索状或管状分布。

细胞功能鉴定：在培养的第7天，将细胞和DiI标记的乙酰化的低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)10μg/ml在37℃孵浴24h，结果为85％的贴壁细胞都特异性地摄取了乙酰化的LDL，说明所述贴壁细胞具有内皮细胞家族的功能特性。

蛋白和细胞表面分子鉴定：在培养的第14天，将培养在小玻片上的细胞进行vWF和Flk-1的免疫组化染色以及CD31和CD34的免疫荧光染色，和CD31、CD34的流式细胞计数检测。结果显示AT cell胞浆内vWF、Flk-1(VEGFR-2)、CD31、CD34均呈阳性，流式细胞计数结果：CD31为70.24±10.12％(n＝5)，CD34为55.37±14.85％(n＝8)。所述的vWF、Flk-1、CD31、CD34均为内皮细胞家族特异性标志，其中Flk-1、CD34为EPCs的特异性标志。

基因鉴定：在培养的第14天，用Tris抽提细胞RNA，用RT-PCR方法检测细胞Flt-1(VEGFR-1)mRNA的表达。Flt-1为内皮细胞家族的特异性基因之一，在血管的发育过程中是必须的。本方法使用了不同引物如下：

引物1(317bp)——Choi K，Development.1998；125.

sense，5′CTCTGATGGTGATCGTGG3′；

antisense，5′CATGCGTCTGGCCACTTG3′.

引物2(1080bp)——Bellamy WT，Cancer Res.1999；59.

sense，5′GAGAATTCACTATGGAAGATCTGATTTCTTACAGT′；antisense，

′GAGCATGCGGTAAAATACACATGTGCTTCTAG 3′.

结果显示细胞表达Flt-1基因。

本发明所用试剂均为市购，本发明所用检测方法为常规已知方法。

本发明培养的来源于MNC的AT细胞在生长过程中呈现出特殊的形态特征，如细胞呈梭形贴壁生长、有成簇现象和条索状或管状的生长现象。同时AT细胞具有内皮细胞家族特性：a.功能方面：AT细胞能摄取Ac-LDL，具备了内皮细胞的功能；b.蛋白和细胞表面分子方面：AT细胞胞浆含有vWF、Flk-1，细胞表面分子CD31和CD34阳性，说明AT细胞具有内皮细胞家族的特异性标志；c.基因方面：用两种来自Flt-1基因不同片段的引物进行的RT-PCR检测结果均显示AT细胞表达内皮细胞特异性基因Flt-1。另外，由于Flk-1和CD34目前被认为是EPCs的特异性标志，进一步证明了本发明培养所得的AT细胞就是EPCs。本发明通过直接培养MNC得到EPCs，简化了传统培养方法的实验步骤，有效的避免MNC CD34+的不必要损失，提高EPCs的得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明方法为人外周血EPCs的分离和培养建立了方法学，为以后的研究奠定基础。本方法还充分为今后临床应用做准备，能相应减少外周血的用量，为日后自体回输治疗缺血性疾病创造条件。

附图说明

图1是所培养细胞的形态特征图

其中：a.贴壁细胞的成簇现象

      b.梭形细胞呈条索状分布

      c.梭形细胞呈管状分布

图2是细胞功能鉴定图

其中：a.红色荧光为摄取了LDL的AT cell

      b.同一视野中普通光显微镜下景象

图3是免疫荧光和免疫组化图

其中：a.免疫荧光检测显示绿色荧光为CD31阳性的细胞，绿色CD31阳性部分位于细胞浆内

       b.免疫荧光检测显示绿色荧光为CD34阳性的细胞，绿色CD34阳性部分同样也位于细胞浆内

       c.免疫组化检测显示vWF阳性染色，棕色vWF阳性部分分布于细胞浆内，苏木素反染后显示细胞核为蓝色

       d.免疫组化检测显示Flk-1阳性染色，棕色Flk-1阳性部分分布于细胞浆内，苏木素反染后显示细胞核为蓝色。

图4是流式细胞计数分析图

其中：黑色曲线为阴性对照，绿色曲线为CD31(a)和CD34(b)阳性曲线。

图5是Flt-1的RT-PCR电泳图

其中：内参照为长度510bp的βactin。

具体实施方式

实施例1

1、分离人外周血MNC：取人股动脉抗凝血10-15ml，用D-Hanks平衡盐溶液1∶1稀释后沿管壁铺在Ficoll分离液上，2000rpm×30min密度梯度离心后将白色云雾层吸出，再用D-Hanks平衡盐溶液1000rpm×10min洗两遍，最后将细胞重悬于培养液中并用台盼蓝记数。

2、体外培养MNC：培养液为M-199+20％FBS+肝素100U/ml+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；生长因子为牛垂体提取物，以9μg/ml的终浓度加入培养液中；将细胞按10⁵/cm²种于包被有2％明胶的培养瓶中或小玻片上，明胶密度为5μl/cm²；细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱中，每3-4天半量换液一次。

3、血管内皮祖细胞特性鉴定：按上述方法进行。

Claims (6)

1、一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于分离人外周血单个核细胞，通过体外直接培养后，得到血管内皮祖细胞，包括下述步骤：

1)分离人外周血单个核细胞：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞；

2)体外培养单个核细胞：培养液中加入生长因子，将单个核细胞种于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上，所述培养液含20％胎牛血清的M-199，肝素100U/ml，青霉素0.1mg/ml，和0.1mg/ml的链霉素，所述生长因子是牛垂体提取物，终浓度为3-15μg/ml；

3)血管内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、功能、蛋白和细胞表面分子及基因鉴定。

2、按权利要求1所述的人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于所述的单个核细胞种植密度为10⁵-10⁶个细胞/cm²。

3、按权利要求1所述的人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于所述的包被明胶浓度为2％，密度为5-10μl/cm²。

4、按权利要求1所述的方法，其中步骤2的生长因子牛垂体提取物的终浓度为9μg/ml。

5、按权利要求2所述的方法，其中单个核细胞种植密度是10⁵个细胞/cm²。

6、按权利要求3所述的方法，其中包被明胶密度为5μl/cm²。

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