CN103234993A

CN103234993A - 一种优秀冰雪运动员内皮祖细胞鉴定方法

Info

Publication number: CN103234993A
Application number: CN2013101231460A
Authority: CN
Inventors: 王世君; 张海龙; 胡萍; 白春雨; 李向臣; 关伟军
Original assignee: Harbin Institute of Physical Education
Current assignee: Harbin Institute of Physical Education
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明公开了一种优秀冰雪运动员内皮祖细胞的鉴定方法，本发明提供了通过透射电子显微镜观察细胞器Weibel-Palade小体来鉴定优秀冰雪运动员的内皮祖细胞，该方法的特异性、专一性强，成本低廉。

Description

一种优秀冰雪运动员内皮祖细胞鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种血管内皮祖细胞鉴定方法，本发明特别涉及优秀冰雪运动员的血管内皮祖细胞的鉴定，属于运动医学、细胞生物学与生物技术交叉领域。

背景技术

冰雪运动是耐力项目，对心血管系统和呼吸系统功能要求很高。不仅要求有很好的有氧代谢功能，而且还要有较强的负氧能力，所以在选材时要把运动员的心肺功能放在重要因素之内。一般冰雪运动员心肺功能发育良好、心容量大、脉搏有力、每博输出量大、搏动活动频率较低、脉压差较大、脉搏回降迅速、脉活量大等等。一氧化氮作为内皮细胞松驰因子，在心血管系统主要由血管内皮细胞以左旋精氨酸与活性氧分子为底物，在一氧化氮合酶的催化下产生并释放，具有舒张血管、改善冠状动脉功能、增大毛细血管通透性等作用，在运动员运动过程中对调节机体的心血管功能具有重要的生理意义。冰雪运动员由于长期在高氧、高寒地区活动，对心血管功能要求极高，血管壁的内皮细胞更新速度较正常入的高，所以冰雪运动员外周血中内皮祖细胞的含量也比普通人的高。

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞，又称血管母细胞(angioblast)或血管内皮干细胞(endothelial stem cells)，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞(angioblast)和人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞(endothelial cells，ECs)。1997年，Asahara等人首次分离并证实成年入外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究，目前，内皮祖细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来。但是，内皮祖细胞的表面标志与其他干细胞标志极其相似，造成内皮祖细胞的鉴定限制了其在临床医学上的应用。内皮祖细胞细胞表面标志物一般认为CD34+VEGFR-2+CD133+。然而，CD133是造血干细胞的表面标志物，其选择性地表达于早期造血细胞以及骨髓、胚胎肝和外周血的祖细胞，所以单纯用其鉴定不能区分EPCs和造血干细胞，同样CD34和VEGFR-2，它们为造血系和内皮系细胞所共有，也不是必要的EPCs标志。vWF(von Willebrand factor)主要由内皮细胞产生，与内皮素等共同存在于内皮细胞Weibel-Palade小体中，因此Weibel-Palade小体被作为内皮细胞的识别标志。

发明内容

本发明的目的为提供一种鉴定优秀冰雪运动员内皮祖细胞的方法。

一种通过透射电子显微镜观察细胞器Weibel-Palade小体从而鉴定内皮祖细胞的方法。

在电子染色过程中，本发明对染色温度进行了改进，采用37°染色30s，节约了染色时间，提高了染色效率。

具体实施方式

(一)优秀冰雪运动员外周血CD34+内皮祖细胞细胞分离培养

无菌采集优秀冰雪运动员外周血40ml，肝素抗凝，用Hakn’s液等倍稀释血液。

然后采用Fiocll密度梯度离心法分离。方法如下：

(1)在离心管中加入淋巴细胞分离液；

(2)取肝素抗凝血与等量Hanks液充分摇匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心，2000rpm，20min；

(3)离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核红饱包括淋巴细胞、内皮祖细胞和造血干细胞。

(4)用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，植入另一离心管中，加入5倍以上体积的Hanks液，离心，1500rpm，10min，洗涤细胞2次。

(5)末次离心后，弃上清，加入含有，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台酚兰染液混合，于血球计数板上，计算细胞活率。

(6)将收集的单个核细胞与CD34单克隆抗体孵育1h后，1200rpm离心洗涤2次，流式细胞仪分选CD34+细胞。

(二)优秀冰雪运动员外周血CD34+细胞体外富集

(1)培养板及培养瓶的的包被

取10ml 1％明胶加入培养板和培养瓶，放入37℃培养箱中孵育2h取出，吸出多余的液体备用。

(2)CD34+细胞传代培养

将流式细胞仪分选CD34+细胞重悬于含10％胎牛血清和细胞生长因子VEGF和bFGF、青霉素链霉素各1×10⁵IU/L的M199培养基中。以5×10⁸的密度接种于铺有明胶包被的培养瓶中，放入37℃，5％CO₂，湿度100％的细胞培养箱中培养，48h后弃去贴壁细胞，悬浮细胞离心收集，以2×10⁶个/mL的密度接种于六孔板中，加入上述完全培养基，4d后换液继续培养，以后每隔2d换液。当细胞生长汇合超过80％，即可传代。吸出培养液，用PBS缓冲液洗2～3次。用0.25％胰酶消化液消化，随时观察消化细胞的变化，当观察到大量细胞回缩变圆，即加入完全培养基轻轻吹打细胞，以1∶2进行传代。传代培养过程中，每2～3d换一次完全培养基，直至细胞生长汇合超过80％。重复以上操作，并按1∶2的比例传代、接种、培养。

(三)优秀冰雪运动员外周血CD34+细胞透射电子显微镜下观察

(1)细胞收集：取生长良好的细胞接种于培养瓶中培养。观察细胞成单层铺满瓶底后，倒掉培养基，PBS冲洗3遍，每遍5min，用胰酶消化细胞，收集于2ml EP管中，1500rpm，离心5min，弃去上清。

(2)标本固定：2.5％戊二醛4℃固定2h，将细胞团移入青霉素小瓶中，在4℃条件下用PBS漂洗3次，每次5min。再用四氯化饿4℃固定30min，接着用PBS漂洗3次。

(3)脱水：50％丙酮溶液，10min，1次；70％丙酮溶液，10min，1次；90％丙酮溶液，10min，2次；100％丙酮溶液，10min，3次。

(4)浸透：吸去瓶中脱水剂，加入3ml纯丙酮一EPON812包埋剂，室温下放置30min，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml，室温放置2h。

(5)包埋：把细胞团块移入胶囊膜块孔的底部中心，注满混合包埋剂，放置于60℃烤箱烘烤24h，使之固化成为硬块。

(6)修块：将包埋块安置在特制的夹具上，用单刃刀修整包埋并做标记。

(7)制备半薄切片：将修好的包埋块在超薄切片机上切取厚度为1μm的半薄切片。取洁净载玻片，浸入1％明胶和1％铬明矾的混合液中，取出放在烤片机上加热至60℃使之干燥。在玻片上加一滴蒸馏水，用镊子将半薄切片移入水滴中，放在烤片机上加热使之展平干燥。然后滴加美蓝溶液，在60℃染30s，水洗，烤干。在显微镜下观察半薄切片的细胞图像，确定行超薄切片的部位并做标记。

(8)制备超薄切片：用氯仿制备0.45％Formvar溶液，将洁净载玻片垂直浸入此溶液，即刻取出，玻片表面即形成一层薄膜。用刀片划开薄膜四周，浸入盛满水的水槽中使薄膜于玻片分开。将铜网小心仿在薄膜上并用封口膜覆盖其上，一并将铜网及支持膜取出。在超薄切片机上固定包埋块，调整刀距，切取50nm厚度的超薄切片，贴在铜网有支持膜的一侧，保存在干燥器皿中待染色。

(9)电子染色：将载有切片的铜网垂直夹于橡胶板上并放入平皿内，在切片的一侧滴加1滴醋酸双氧铀染色液，室温下染色37°染色30s。取出橡胶板，用双蒸水冲洗切片，滤纸吸干后，放入平皿中，加1滴铅染色，室温下染37°染色30s。水洗、吸干、晾干备用。

(10) 透射电镜(8000×)观察并照相。（见附图）

附图说明

附图是冰雪运动员内皮祖细胞Weibel-Palade小体透射电镜图。

Claims

1.通过透射电子显微镜观察优秀冰雪运动员内皮祖细胞细胞器Weibel-Palade小体，用于血管内皮祖细胞鉴定的方法。

2.依据权利要求1所述的方法，在电子染色过程中，本发明对染色温度进行了改进，采用37°染色30s，节约了染色时间，提高了染色效率。