CN1688710A - 对ac133进行定量rt－pcr以在细胞样品中诊断癌症和监控血管生成活性 - Google Patents

Abstract

本发明包含应用定量RT－PCR来鉴定作为标记的AC133。AC133普遍存在于内皮祖细胞(EPCs)上，其在血管生成中是重要的细胞。因此，本发明被应用于确定在个体中EPCs的量以及诊断和监控例如在损伤的组织以及在癌症发生和进展中的血管生成。

Description

对AC133进行定量RT-PCR以在细胞样品中诊断癌症和监控血管生成活性

本发明要求于2002年8月28日提交的未授权美国临时专利申请号60/406,535，以及于2003年7月11日提交的美国临时专利申请号10/618,102的优先权。上述提到的内容的全文特别引入本文作为参考，不放弃任何权利。

技术领域

本发明涉及癌生物学以及核酸生物化学领域。特别地，本发明提供了一种新的方法，通过对可指示血管生成活性的特殊基因产物的扩增和定量，来诊断癌症和监控血管生成的活性。

背景技术

在癌症和其它非-癌症疾病中，已经有超过四十种的靶抗-血管生成剂被引入I、II和III期临床试验。细胞杀伤(toxic)剂也具有抗血管生成活性。尽管它们在动物模型中获得了显著的成功(Mundhenke等，2001)，但是许多前导抗血管生成剂的临床结果却令人失望。直到最近，一个随机的III期研究第一次显示，在转移的直肠癌患者中，与单独使用IFL相比()，加入抗VEGF抗体贝伐单抗到5-FU、亚叶酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan，IFL)中，可改进肿瘤反应率、肿瘤进展时间和总存活率(overall survival)(Hurvitz等，2003)。因此，用确定的替代物监控和验证抗-血管生成靶反应具有极为重要的临床价值(Mundhenke等，2001；Folkman等，2001)。目前正在使用的许多技术是不切实际的、具侵害性的，并且是不经济的。

微血管密度试验(MVD)是最多用到的血管生成替代物，通过计算分布在肿瘤中的CD34+内皮细胞的密度来定量(Byrne和Bundred，2000)。然而，MVD对于临床应用具有许多实践的和理论的局限，因为其要求在肿瘤组织中直接评估(assessment)微血管。因而，MVD是侵袭性的，并且不适于连续测量。此外，肿瘤血管生成是非常不均匀的，因为在已形成的肿瘤的外围的微血管浓度比中心高很多。并且，MVD忽略了血管生成细胞因子的系统性影响，更重要地是内皮祖细胞的影响。

血管生成不仅通过肿瘤血管积聚发生(cooption)，还通过动员和活化骨髓衍生出的内皮祖细胞(EPCs)至活跃血管生成位点，是日益被认识到其重要性的postnatal血管生成的关键特征以及MVD试验无法评估的特征(Asahara等，1999)。因此，EPCs是可用的血管生成替代物，可以用使用单克隆抗体的荧光-活化的细胞分选技术(FACS)来定量。

然而，FACS法具有许多局限性。比如，因为发现EPCs浓度低，并且在分离过程中产量也低，FACS试验要求每次高达50-100mL的血。如果需要连续测量，该过程是非常艰巨的。FACS可以是高度可变的，并受EPC的低产量和生存能力的制约，因为EPCs被确信在分离过程中经常发生凋亡，更降低了它们的回收。并且，FACS过程是麻烦的，需要昂贵的FACS分选设备以及熟练的技术人员来运行机器。

因此，需要符合以下规范的抗血管生成的替代标记用于临床用途：(1)它们应该是非侵袭性的、易感的和可重复的；(2)它们应该是可连续测量和经济可行的；以及(3)最重要地，它们应该反映潜在的肿瘤血管生成活性(Byrne和Bundred，2000)。

发明内容

本发明提供了用于检测由激活血管生成的癌症或炎症状态引起的潜在的血管生成活性的方法。在具体实施例中，本发明提供了在个体中诊断癌症的方法：(a)获得包含个体细胞的样品；(b)获得来自样品细胞的RNA转录物；(c)应用可扩增AC133核酸片断的引物，对RNA进行定量PCR；以及(d)将来自癌症个体的细胞中AC133扩增产物的量与来自非癌症个体的细胞中扩增产物的量作对比，当来自癌症个体的细胞中的AC133扩增产物的量与来自非癌症个体细胞中的AC133扩增产物相比有提高，指示该个体患有癌症。定量PCR可以是半定量的或全定量的。该方法可被用于指示潜在的来自癌症的血管生成活性。

在具体实施例中，本方法可被用于诊断癌症，包括但不限于直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、脑癌、白血病、肝癌、子宫内膜癌、前列腺癌、以及头部和颈部癌。在其它具体实施例中，所述的癌症是非上皮癌。在更多的具体实施例中，所述的非上皮癌是骨肉瘤、软组织肉瘤、或胃肠道间质瘤。

在本发明的一种实施例中，所述的细胞是单核的。在其它具体实施例中，所述的细胞分离自事先诊断为癌症的人类个体。在其它的实施例中，所述样品是从外周循环系统提取的血。

在本发明的其它具体方面，正向引物由以下DNA序列组成：5′-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3’(SEQ ID NO：1)。在本发明的另一个具体方面，反向引物由以下DNA序列组成：5’-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3′(SEQ ID NO：2)。

在本发明的其它实施例中，AC133扩增产物的增加还预测了肿瘤负荷。在本发明的另一个实施例中，AC133扩增产物的增加还预测了肿瘤复发。在本发明的另一个实施例中，本发明还包含制作一个基于个体细胞中AC133扩增产物量提高的治疗计划。

在本发明的某些特定的实施例中，所述方法还涉及为个体治疗癌症。更特别地，本发明的另一个具体实施例是用放射治疗、免疫治疗、化学治疗、激素治疗或基因治疗。所述方法也包括监控涉及放射治疗、免疫治疗、化学治疗、激素治疗或基因治疗的癌症治疗的血管生成影响。

在另一个实施例中，本发明提供了在样品中定量内皮祖细胞的方法，包括：(a)获得包含个体细胞的样品；(b)获得来自样品细胞的RNA转录物；以及(c)用可扩增AC133核酸区段的引物进行定量PCR，其中样品细胞中的AC133扩增产物的量与标准曲线比较，评估样品中内皮祖细胞的总量。在一个具体实施例中，标准曲线获自已知量的所述骨髓来源的内皮祖细胞的系列稀释。在本发明的一个具体方面，测定的精密度是99％。在本发明的另一个方面，检测极限是每100万细胞1个内皮祖细胞。

这里也提供了一种用于监控个体细胞中血管生成活性的方法，包含：(a)获得包含个体细胞的样品；(b)获得来自样品细胞的RNA转录物；(c)用可扩增AC133核酸区段的引物，进行定量PCR^TM；以及(d)评估AC133扩增产物的量，其中个体细胞中AC133扩增产物的量是个体细胞中血管生成活性的指标。在本发明的一个具体实施例中，样品是从外周循环系统提取的血。在另一个体现方式中，本发明还包含评估循环的内皮细胞的量。在一个具体实施例中，本发明还包含评估样品中的VEGF水平。在另一个实施例中，本发明包含建立个体的血管生成概貌(profile)。

在本发明的一个特殊的实施例中，本发明被应用于检测血管损伤、自体免疫疾病、心肌梗塞或脓血症的存在。在本发明的另一个方面，已经事先给予个体抗血管生成治疗，并且所述评估包含评估抗血管生成治疗的功效。

在本文的上下文，包括权利要求中，单词“一种”当与“包含”连用时，表示“一种或多种”。

通过以下的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得更明显。然而，应理解，用于表示本发明的优选体现方式的详细的描述和具体实施例仅仅作为例证，因为属于本发明的意愿和范畴内的不同的变化和修改对于本领域熟练人员是显而易见的。

附图说明

接下来的附图形成本说明书的一部分，包括进一步证明本发明的某些方面。结合具体实施例的详细描述，通过参考一个或多个附图，本发明将更好地被理解。

图1.AC133的PCR^TM。通过Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech)法从外周血中分离单核细胞。应用Trizol试剂(Gibco Life Technologies)抽提RNA，并测量其浓度。应用RT-PCR试剂盒(Invitrogene，圣地亚哥，CA)，根据厂家的用法说明进行AC133基因转录物的扩增。通过筛选，在本实验中应用的PCR^TM引物序列是：正向引物5′-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3′(SEQ ID NO：1)，反向引物5′-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3′(SEQ ID NO：2)。预期的PCR^TM产物是670bp，其是序列验证的。引物的设计基于AC133的基因序列，其GeneBank号为AF027208。作为附加对照，进行针对β-肌动蛋白的定量PCR^TM。患者1和患者2患有转移疾病；患者3三周前已经切除了Duke C癌。

图2.与正常对照相比，VEGF和bFGF的水平在癌症患者中显著升高。

图3.表达AC133(CD133)标记的CD34+细胞的生存能力。

图4.RT-PCR显示在患者样品中AC133水平升高。用ΔΔCt方法确定相对于标定器，对内部参考(GAPDPH)定标的目标量。

图5.定量PCR(Q-RT-PCR)的敏感性和特异性。在CRC患者样品中，区分活性或非活性疾病状态的估计的CD133阈值显示为0.017，曲线下面积(AUC)为81％。样品大小(n＝50)。

具体实施方式

由于癌症已经升高到被最多研究的人类疾病的最前沿，迫切需要开发可实践的、非侵袭性的和经济的方法来检测和/或诊断癌症，以及监控抗血管生成治疗的有效性。抗血管生成治疗的用途已经在患有转移性直肠癌的患者中被证实。由于任何具体方法是复合的，必须进行多重和频繁的测量，这进一步提升了抗血管生成治疗的连续测量的必要性。可用的监控血管生成活性的方法，如微血管密度试验(MVD)，对于临床应用具有许多实践的和理论的局限，因为它需要直接在肿瘤组织中评估微血管。

血管生成不仅通过肿瘤血管的积聚发生，还通过动员和活化骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)至活性血管生成位点，该特性MVD不能评估。因此，EPCs是可行的血管生成替代物，可用荧光活化的细胞分选技术(FACS)，应用针对AC133的单克隆抗体定量。然而，FACS方法具有很多的局限。例如，由于EPCs在低浓度中被发现，在分离过程中获得低的产量，FACS要求每次试验高达50-100mL的血。如果要求连续测量，该过程可能非常繁重。FACS可能是高度可变的并受到EPCs低产量的制约，因为可以确定EPCs在分离过程中经常发生凋亡，降低了它们的回收。并且，FACS分选是及其复杂和昂贵的。

因此，尽管存在监控血管生成活性的方法，但每种方法都有明显的局限。

A.本发明

本发明提供了一种高度敏感且特异的一步定量方法，在人外周血中检测和定量EPCs。AC133是一种功能未明确的糖蛋白，对EPCs是高度特异的，在个体外周血样品中以0.1-0.5％存在。因为AC133对EPCs是高度特异的，可用在细胞样品中，特异性扩增AC133基因产物的RT-PCR来评估样品中的EPCs数量。EPCs数量的评估可以应用标准曲线获得，所述标准曲线通过测量已知数量的EPCs的信号强度来制作。

如前面所陈述的，动员EPCs到血管生成位点是血管生成活动的特点。因此，该定量EPCs的方法也监控血管生成活性。此外，由于包括动员EPCs到癌血管生成位点，本发明还便利了检测血管生成活性和诊断发生该动员作用的癌症，包括但不限于直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、脑癌、白血病、肝癌、子宫内膜癌、前列腺癌、以及头颈癌。

本方法是高度可重复的、实际的、非侵袭性的，并且适合于连续测量，因为每次试验仅需要5-10ml的血。试验的敏感性通过在U-937细胞系中或在人单核外周血中富集的外周动员的干/祖细胞中连续稀释AC133+EPCs来评估。该方法的检测极限是每100万PMNC 1个EPC。

B.AC133、EPCs和血管生成

AC133是结构新颖的5-跨膜糖蛋白，具有未知的功能(Yin等，1997)。它选择性表达在骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)表面(Reyes等，2002；Schmeisser等，2000；Hariharan等，1999)。AC133的DNA序列可在GeneBank号AF027208(SEQ ID NO：3)中找到。

EPCs被认为在出生后的血管生成中发挥作用(Gill等，2001)。已显现的证据提示，在血管生成中一个重要事件是动员作用以及在血管生成位点活化EPC(Reyes等，2001；Gill等，2001)。例如，由烧伤或机械断裂(如在外科手术过程中)所引起的血管损伤，导致一系列的事件，包括在损伤的血管组织位点募集EPC，促进血管愈合(Gill等，2001)。EPCs在癌症血管生成中也发挥作用。因此，评估EPC的募集和增殖为诊断不同的损伤和疾病提供了重要的信息。除了鉴定癌症的血管生成活性，本发明也可应用于癌症的预后，鉴定早期或转移癌症的血管生成的潜在或背景可能性，评估肿瘤负荷、预期肿瘤复发、评估化学疗法和检测症状的减轻。

C.获得细胞样品

本发明公开了一种方法，部分包括：从人个体获得细胞样品。本发明的一个具体实施例包括从人个体收集外周血样品。这可以通过静脉内抽血来实现，或通过其它可用的方式，从任何外部四肢或包含部分外周循环系统的其它静脉提取。

一旦收集好了细胞样品，必须加工样品分离细胞。本发明的一个方面公开了单核细胞的分离。一种从血中分离单核细胞的方法是Ficoll-Paque(PharmaciaBiotech)方法。Ficoll-Paque是一种无菌的介质，用于从外周血中高产量分离细胞。其他从外周血中分离细胞的方法包括超速离心法和过滤。也可应用血沉棕黄层(buffy coat)单层细胞的收集。

D.来自细胞样品的RNA转录物的分离和定量

一旦获得包含细胞的样品，从细胞中抽提RNA。许多分离总细胞RNA的方法是本领域已知的。比如可参见Chomczynski和Sacchi(1987)。实现该任务的一个特殊的方法是应用Trizol试剂(Gibco Life Technologies)，抽提总细胞RNA。所述Trizol步骤包括在搅拌机中均质化细胞，接着用基于苯酚的Trizol试剂抽提。然后用异丙醇将RNA沉淀，在重溶解在不含RNA酶的水或0.5％SDS之前用乙醇洗涤。

E.反转录

反转录是将mRNA转变为DNA的过程。简要的说，多聚dT引物被退火到信使RNA的多聚A尾巴上。这提供了一个自由的3’末端，用于通过反转录(RT)延伸。酶进行5′→3′合成，应用mRNA作为模板。形成了中间产物杂合RNA-DNA分子。在反应的最后，通过利用反转录物的最后几个碱基作为模板，酶自身发生“回环”，用于合成完全的，即互补的DNA，取代mRNA。这形成了“发夹”结构。然后，可通过碱处理将初始的mRNA降解，生成单链的DNA。所述发夹提供了一种天然的引物，用于下一步骤——用DNA聚合酶I将单链DNA转变为双链DNA，一种cDNA。所述发夹通过S1核酸酶去除。

反转录RNA到cDNA的方法是已知的，如Sambrook等(1989)描述。可选择的反转录方法利用热稳定的、RNA依赖性DNA聚合酶，对于本领域技术人员来说是熟知的。

F.扩增方法学

1.引物

通常，核酸扩增方法依赖于引物的应用，引物促进了扩增过程。这里定义的词语“引物”指包括任何能够引起新生核酸以模板依赖的方式合成的核酸。典型地，引物是寡核苷酸，长度是10至25个碱基对，但也可使用更长的序列。尽管优选的是单链形式，引物可以以双链或单链形式提供。本发明的具体实施例公开了在扩增反应中应用的引物。

基于与AC133基因产物的互补性创建多种引物，所述AC133基因产物具有GeneBank ID：AF027208。本发明中公开的特异引物通过筛选多种引物，找到最优结果来选择的。然而，本发明可应用许多合适的引物进行。寡核苷酸的合成可根据标准的方法来进行。参见如Itakura和Riggs(1980)。并且，美国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244(每一项都在此引入以供参考)，描述制备寡核苷酸的方法。此外，引物是可以接受的价格购得的。

在13和100个核苷酸之间、优选在17和100个核苷酸之间长度的探针或引物的应用，或在本发明的一些方面，长度达1-2千碱基或更长，可形成既稳定又具有选择性的双链体分子。通常优选具有连续延伸长达20碱基的互补序列的分子，以提高所获得的杂交分子的稳定性和/或选择性。技术人员通常优选设计用于杂交的核酸分子，使其具有一条或多条20到30个核苷酸的互补序列，如需要还可以设计更长的序列。这种片断很容易制备，比如通过化学手段直接合成，或将选择的序列导入到重组质粒中，获得重组产物。

2.杂交

因此，可利用本发明的核苷酸序列(如引物)选择性形成具有DNA和/或RNA互补延伸段的双链分子，或提供用于从样品中扩增DNA和RNA的引物的能力。根据预想的应用，技术人员可使用不同的杂交条件，来获得对于靶序列不同程度的探针或引物的选择性。

对于需要高的选择性的应用，技术人员通常期望使用相对高的严格条件来形成杂交体。比如，相对低的盐和/或高的温度条件，如在温度约50℃至约70℃下约0.02M至0.10M NaCl。这种高的严格条件几乎不(如果可以)容许(如果可以的话)探针或引物与模板或靶链的错配，特别适合于分离特定基因或检测特定mRNA转录物。通常可以意识到，通过加入渐增量的甲酰胺可使可使条件更加严格。

一种中等严格条件可如下提供：约0.1至0.25M NaCl，温度约37℃至约55℃，而一种低的严格条件为：约0.15至约0.9M盐，温度范围约20℃至约55℃。依据所需的结果可方便的操纵杂交条件。在其它实施例中，杂交可通过如下的条件获得：50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，1.0mM二硫代苏糖醇，温度为约20℃至约37℃之间。其它可利用的杂交条件包括约10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，温度为约40℃至约72℃之间。

3.标记

在某些实施例中，将本发明的限定序列的核酸与适当的物质，如标记，相结合使用以确定杂交是有利的。本领域中已知大量的合适的指示剂，包括荧光、放射、酶或其它配体，如亲和素/生物素，其能够被检测到。在优选例中，技术人员可使用荧光标记或酶标签，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，代替放射性的或其它对环境有害的试剂。在使用酶标签的情况下，已知比色指示剂底物可提供一种显而易见或分光光度可察觉的检测方法，以在包含互补核酸的样品中鉴定特异的杂交。

4.PCR^TM

通常，可以预期，这里描述的探针或引物在液相杂交中，如在PCR^TM中，以及在使用固相的实施例中作为试剂是有用的。在涉及固相的实施例中，测试DNA(或RNA)被吸附或被附着到一种选择的基质或表面上。然后，将这种固定的、单链的核酸在所需的条件下与选择的探针进行杂交。选择的条件将依赖于特定的环境(比如依赖于G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。针对特定应用的杂交条件的优化是本领域技术人员熟知的。洗涤杂交分子、去除非特异性结合的探针分子后，通过测定结合标记的量，进行杂交检测和/或定量。典型的固相杂交方法公开在美国专利5,843,663、5,900,481和5,919,626中。其它可在本发明中使用的其它杂交方法公开在美国专利5,849,481、5,849,486和5,851,772中。这些和其它参考文献的相关部分在此引入以供参考。

可用许多模板依赖的过程在给定的细胞样品中扩增AC133基因产物。最常见的扩增方法之一是多聚酶链反应(称为PCR^TM)，其详细地描述在美国专利4,683,202和4,800,159，以及Innis等，1990中。简要地说，在PCR中，制备两种与标记序列的对应互补链区域相互补的引物序列。在反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸，同时加入DNA聚合酶，如Taq聚合酶。如果标记序列存在于样品中，引物将结合到标记上，聚合酶将通过添加核苷酸，使引物根据标记序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将从标记上分离，形成反应产物，过量的引物将与标记和反应产物结合，重复该过程。

反转录酶(RT)PCR扩增步骤是一种PCR的变体，使mRNA模板扩增。因而，优选的扩增AC133基因产物的方法是利用RT-PCR试剂盒(Invitrogene)，根据厂家的说明书进行操作。该技术应用荧光杂交探针或dsDNA特异的荧光染料，检测扩增过程中的PCR产物(实时检测)，不需要纯化或凝胶电泳分离。该方法的探针的敏感性可在扩增指数期过程中测量PCR产物，在关键反应物变为限制性之前进行。该方法不需要PCR产物的分离。

5.定量PCR

(i)定量PCR的类型

本发明依赖定量PCR，更特别地，依赖定量RT-PCR，来计算样品中的ACC133+细胞数量。该方法可以是半定量的或全定量的。

两种途径，竞争性定量PCR^TM和实时定量PCR^TM，都可通过与标准曲线比较评估样品中的靶基因浓度，所述标准曲线通过扩增标准DNA的连续稀释物构建的。然而，这些标准曲线如何建立在实质上是不同的。在竞争性QPCR中，在连续稀释的标准样品和未知(环境的)样品中加入一种已知浓度的内部竞争DNA。在共同扩增后，计算标准稀释物以及未知样品的内部竞争物和靶PCR^TM产物的比率，建立标准曲线，用竞争物-靶PCR^TM产物比率相对于标准稀释物的初始靶DNA浓度作图。假设竞争物和靶DNA具有相等的扩增效率，在环境样品中后者的浓度可从标准曲线中推断出。

在实时QPCR中，扩增产物的积聚在靶DNA的标准稀释物中和包含未知量靶DNA的样品中被连续测量。通过将标准样品中的初始模板浓度与产生特异阈值浓度的产物所必需的PCR^TM循环(Ct)数相关联来建立标准曲线。在测试样品中，靶PCR^TM产物积聚在相同的Ct后测量，这允许靶DNA浓度从标准曲线中插入。尽管实时QPCR允许在常规分析过程中更快速和更容易的测量靶DNA，竞争QPCR仍然是在环境样品中进行靶量化的重要的另选方法。已知量的竞争DNA与靶DNA的共同扩增是一种直观的途径，校正样品-样品间由抑制底物和大量背景DNA的存在所引起的扩增效率的变化，所述抑制底物和背景DNA在标准稀释物中显然是不存在的。

QPCR的另一种类型是实用的定量PCR^TM。经常称为“相对定量PCR”，该方法可确定特异核酸的相对浓度。在本发明的上下文中，RT-PCR针对分离自患者的mRNA进行。通过确定特定mRNA种类的浓度，显示出编码该特定mRNA种类的基因是差别表达的。

(ii)理论因素

在PCR^TM中，每轮反应靶DNA分子的数量增加达接近两倍，直到某些试剂变为限制性。此后扩增的速度愈加减慢，直到在两个循环间扩增的靶分子数不再提高。如果绘制一张图表，其中循环数表示在X轴，扩增的靶DNA的浓度记录表示在Y轴，通过连接各点，形成一条具有特定形状的曲线。从第一轮开始，线的斜率是正的并且是不变的。这被称为曲线的线性部分。在试剂变为限制性后，线的斜率开始下降，最后变为0。在该点上，扩增的靶DNA浓度变得渐近至某一固定值。这是所谓的到达曲线的平坦区。

在PCR^TM扩增的线性部分中的靶DNA的浓度是与反应起始前靶DNA的起始浓度成正比。通过确定已完成相同循环数并且在其线性范围的PCR^TM反应中靶DNA扩增产物的浓度，可以确定在原始DNA混合物中特异靶序列的相对浓度。如果所述的DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNAs合成的cDNAs，可确定对应于各组织或细胞的从中获得靶序列的特异mRNA的相对量。PCR^TM产物浓度和相对mRNA量之间的正比例关系仅在PCR^TM反应的线性范围内是可靠的。

在曲线平坦区中靶DNA的最终浓度由反应混合物中试剂的可用性来决定，不受靶DNA的起始浓度所约束。因此，通过RT-PCR确定mRNA种类相对量所必须符合的首要条件是扩增的PCR^TM产物的浓度必须在PCR^TM反应处于曲线线性部分时取样。

定量RT-PCR实验能够成功确定特定mRNA种类相对量所必须符合的第二个条件是可扩增的cDNAs的相对浓度必须标准化至某个独立的标准。RT-PCR的目标是相对于样品中所有mRNA种类平均量，确定特定mRNA种类的量。在下面描述的实验中，β-肌动蛋的mRNA、天冬酰胺合成酶和脂皮质蛋白II(lipocortin II)被用作外部和内部标准，根据其对比出其他mRNAs的相对量。

用于竞争性PCR^TM的多数方案利用内部PCR^TM标准，大约与靶一样多的量。如果PCR扩增的产物在线性阶段取样，则这些策略是有效的。如果产物在反应接近平坦阶段时取样，则越少量的产物是相对具有代表性的。比较许多不同RNA样品产生的相对量，如当被测RNA样品差别表达时，被误解为产生了不同，RNAs的相对量呈现少于他们实际的量。如果内部标准比靶更加丰富，这不是一个重要的问题。如果内部标准比靶更丰富，可在RNA样品之间进行直接的线性比较。

上述讨论描述了用于临床来源的材料的RT-PCR试验的理论因素。在临床样品中存在的问题是它们具有可变的量(带来了标准化的问题)，并且它们具有可变的品质(使可靠的内部对照的共扩增成为必须，尤其是比靶更大的大小)。如果RT-PCR作为一种具有内部标准的相对定量的RT-PCR进行，这两个问题都能克服，其中内部标准是一种可扩增的cDNA片断，比靶cDNA片断大，并且其中编码内部标准的mRNA的量大概5-100倍高于编码靶的mRNA。该试验测量相对量，并非是各mRNA种类的绝对量。

可应用一种更常规的相对定量RT-PCR试验进行其它研究，采用外部标准方案(external standard protocol)。这些试验在它们的扩增曲线的线性部分中取样PCR^TM产物。取样的最佳PCR^TM循环数根据每种靶cDNA片断的操作经验来确定。并且，分离自不同组织样品的每种RNA群的反转录酶产物必须仔细地标准化，使可扩增的cDNAs的具有相等的浓度。该因素非常重要，因为试验测量绝对的mRNA量。绝对的mRNA含量仅在标准化样品中可被用作差别基因表达的测量。虽然扩增曲线的线性范围的经验确定和cDNA制备的标准化是繁琐和浪费时间的过程，RT-PCR试验结果优于那些获自采用内部标准的相对定量RT-PCR试验。

该优点的一个理由是没有内部标准/竞争物，在扩增曲线的线性范围中，所有的反应物可被转换为一种单一PCR^TM产物，因而提高试验的敏感性。另一个理由是只有一种PCR产物，用电泳凝胶或其它显示方法显示产物变得较不复杂，具有更小的背景并更易于翻译。

6.其他扩增方法

许多其他引物依赖的方法可用于扩增存在于给定模板样品中的寡核苷酸序列。最常见的扩增方法之一是聚合酶链反应(称为PCR^TM)，其详细描述在美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159，以及Innis等，1988中，其中的每一篇在此引入以供参考。

另一种用于扩增的方法是连接酶链反应(LCR)，公开在欧洲申请号320 308中，在此完整引入以供参考。美国专利4,883,750描述了一种与LCR相似的方法，使探针对与靶序列结合。也可使用美国专利5,912,148公开的基于PCR^TM和寡核苷酸连接酶试验(OLA)的方法。

可应用在本发明的实践中的其它扩增靶核酸序列的方法公开在美国专利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291和5,942,391，英国申请号2 202 328，以及PCT申请号PCT/US89/01025中，每一篇都在此完整引入以供参考。

PCT申请号PCT/US87/00880描述的Qbeta复制酶，也可用作本发明的扩增方法。在该方法中，具有一个与靶互补的区域的RNA复制序列在RNA聚合酶的存在下被加入到样品中。聚合酶将复制所述的复制序列，其可被检测出。

一种等温的扩增方法，其中限制性核酸内切酶和连接酶被用于实现靶分子的扩增，所述靶分子在限制位点的一条链上包含核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸，该方法也可用于本发明中核酸的扩增(Walker等，1992)。公开在美国专利5,916,779的链取代扩增(SDA)是另一种进行核酸等温扩增的方法，其涉及多轮的链取代和合成，即缺口平移法(nick translation)。

其他核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，其包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989；Gingeras等，PCT Application WO 88/10315，在此全部引入以供参考)。欧洲申请号329 822公开了一种核酸扩增过程，包含循环合成单链RNA(ssRNA)、ssDNA以及双链DNA(dsDNA)，也可被应用于本发明。

PCT申请WO 89/067009(在此完整引入以供参考)公开了一种核酸序列扩增方案，基于启动子区域/引物序列杂交到靶单链DNA(ssDNA)，接着转录该序列的许多RNA拷贝。该方案不是循环的，即新的模板并非从结果RNA转录物产生。其它扩增方法包括“race”和“一侧(one-sided)PCR^TM”(Frohman，1994；Ohara等，1989)。

G.分离方法

在一个阶段或另一个阶段，通常需要从试剂，如模板或多余引物，或从其它扩增产物中分离出扩增产物。比如，可采用标准的方法，通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。参见Sambrook等(1989)。当分离核酸时，变性PAGE是优选的。

可选择地，可采用层析技术来促进分离。在本发明中可采用许多类型的层析：吸附、分配、离子交换和分子筛，并且其中可采用许多专门的工艺，包括柱层析、纸层析、薄层层析和气相色谱(Freifelder，1982)。

分离的扩增产物可从凝胶中切下和洗脱，用于进一步操作。应用低熔点的琼脂糖凝胶，可通过加热凝胶，然后抽提核酸来分离条带。

可调节这些分离技术以适于临床应用，使之可处理大量的样品。然而，分离和检测PCRTM的新的工具使得临床医生可以立刻观察到成百上千或成千上万的样品。这些技术包括FMAT(荧光微量试验技术)、化学发光技术、序列检测系统(Applied Biosystems)和质谱技术。

以下是一些分离技术的例子，可应用于核酸。

1.凝胶电泳

在一个实施例中，扩增产物通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离，采用标准的方法(Sambrook等，1989)。

2.层析技术

可选择地，层析技术可用于促进分离。在本发明中可使用许多种类的层析技术：吸附、分配、离子交换和分子筛，并且其中可采用许多专门的工艺，包括柱层析、纸层析、薄层层析和气相色谱(Freifelder，1982)。另一个可选择的技术是经标记的cDNA产物，如生物素标记的或抗原标记的产物可分别被携带抗生物素蛋白或抗体的珠捕获。

3.微流技术

微流技术包括在一个平台，如由ACLARA BioSciences公司设计的微毛细管，或Caliper Technologies公司制作的LabChipTM“液体集成回路”上分离。这些微流装置仅需要毫微升体积的样品，与需要微升体积的其他分离技术形成对比。应用微流装置可实现基因分析过程的小型化。比如，公开的PCT申请号WO 94/05414、Northrup和White，在此引入以供参考，报导了一种集成的微-PCRTM装置，用于从样品中采集和扩增核酸。美国专利5,304,487、Wilding等，和美国专利5,296,375、Kricka等，讨论了用于收集和分析包含细胞的样品的装置，在此引入以供参考。美国专利5,856,174描述了一种可结合不同过程的设备以及涉及核酸分析的分析操作，在此引入以供参考。

4.毛细管电泳

在一些实施例中，需要提供一种其它的可选择的方式来分析扩增的基因。在这些实施例中，微毛细管电泳试验是预期可用的分析。

微毛细管阵列电泳通常涉及应用一种细小的毛细管或通道，其中充满或不充满特定的分离介质。样品电泳通过该毛细管发生了基于大小的分离。应用微毛细管电泳根据大小分离核酸的方法报导在如Woolley和Mathies(1994)中。通常微毛细管阵列电泳提供了一种快速的方法，用于基于大小的测序、PCR^TM产物分析和限制性片段的大小测定。这些毛细管的高比表面积可允许应用更高的电场而不会产生实质的热变性，从而允许更快速的分离。此外，当结合共焦成像方法时，这些方法提供了在10^-18摩尔(attomoles)范围内的灵敏度，其与放射性序列分析方法的灵敏度相当。包括微毛细管电泳装置的微流装置的显微制造在如Jacobsen等(1994)；Harrison等(1993)；Manz等(1992)；和美国专利5,904,824中有详细的讨论。典型地，这些方法包含在二氧化硅、硅或其它晶体物质或芯片上照相平板印刷蚀刻微米规模的通道，可适用于本发明。在一些实施例中，毛细管阵列可用与装置实体制作所述的相同的聚合材料来制作，使用这里描述的注射成型技术。

Tsuda等(1990)描述了矩形毛细管，一种圆柱形毛细玻璃管的变形。这些系统的优点是高效的热分散效果，这是由于其具有大的长-宽比率，并且它们具有高的比表面积以及高的检测灵敏度，适于光学柱体检测模式(optical on-column detectionmodes)。这些扁平的分离管道具有进行二维分离的能力，施加横穿分离的管道的力，样品带通过应用一种多管道阵列检测设备来检测。

在许多毛细管电泳方法中，用适当的分离/筛选基质填充毛细管，如融合的二氧化硅毛细管或蚀刻、机械或浇铸入平面基底的通道。典型地，本领域已知的许多筛选基质可被应用于微毛细管阵列中。这些基质的例子包括如羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及类似物。通常，选择特异的凝胶基质、跑胶缓冲液和跑胶条件，以使特定应用的分离达到最佳化，如针对核酸片断的大小、要求的分辨率以及天然或非变性的核酸分子的存在等因素进行选择。比如，跑胶缓冲液可包括变性剂、离液序列高的试剂如尿素或类似物，以变性样品中的核酸。

H.核酸的检测

在本发明中，核酸扩增产物将被检测和量化。在某些应用中，检测将通过视觉方式进行。典型的视觉可见的方法包括用溴乙锭染色，在UV光下查看条带。可选择地，如果扩增产物是用放射或荧光标记的核苷酸完整标记的，对分离的扩增产物进行掺入的辐射标记的放射闪烁扫描或进行荧光检测，或应用电和/或热脉冲信号(Affymax technology；Bellus，1994)。

在一个实施例中，扩增产物分离后，将一种标记的核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记。在另一个实施例中，探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。

在传统的方法中，检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等，1989)。前述方法的一个例子描述在美国专利5,279,721中，在此引入以供参考，其公开了一种用于自动化电泳和核酸转移的设备和方法。该设备可使电泳和印迹不经过凝胶的外部操作，非常适合于执行本发明的方法。

其它可用于本发明的实践中的核酸检测方法公开在美国专利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791中，在此引入以供参考。

1.质谱

在核酸检测方面最近的创新是质谱技术。质谱通过在真空电力分子并使它们因挥发而“飞行”，提供了一种“称量”个体分子的手段。在电和磁场结合的影响下，离子飞行轨迹依赖于它们的个体质量(m)和电荷(z)。对于低分子量分子，质谱已经成为常规的物理-有机常用技术，用于通过确定母体分子的离子的质量来分析和定性有机分子。并且，通过安排该母体分子的离子与其它粒子(如氩原子)碰撞，经由所谓的碰撞诱导的分裂(CID)，分子的离子被片段化，形成二级离子。该片段化方式/途径经常可获得详细的结构信息。本领域已知的质谱方法的其它应用总结在Methods in McCloskey(1990)中。

由于质谱的明显的分析优点，可提供高检测灵敏度、精确度，通过CID与MS/MS构型和速度获得的详细结构信息、以及在线数据转移至电脑相结合，应用质谱来进行核酸结构分析引起人们相当大的兴趣。总结该领域的评论包括Schram(1990)和Crain(1990)。对核酸应用质谱分析的最大障碍是难以挥发这些非常极性的生物聚合物。因此，“测序”被限制在低分子量的合成寡核苷酸，通过确定母体分子的离子质量来进行，并且通过如此，可验证原先已知的序列，或可选择地，通过二级离子(分裂的离子)的生成验证已知序列，借助在MS/MS构型利用中的CID，特别地，用于电离和挥发，快速原子轰击(FAB质谱)的方法或等离子解吸附(PD质谱)。作为一个例子，已经描述了应用FAB来分析用于化学合成寡脱氧核苷酸在受到保护的二聚阻滞物(Koster等，1987)。

两种电离/解吸附技术是电喷/离子喷(ES)和基质辅助激光解析/电离(MALDI)。ES质谱由Fenn等(1989)；WO90/14148提出，并且其应用概括在综述文章中(Smith等，1990；Ardrey，1992)。作为一种质量分析器，一种四极最频繁地被应用。由于多重离子峰(都可被用于质量计算)的存在，毫微微摩尔量样品的分子量测定非常精确。

相反，当一种飞行时间(TOF)配置被用作质量分析器时，MALDI质谱特别地引人注目。MALDI-TOF质谱已经由Hillenkamp等(1990)介绍过了。因此，在大多情况下，使用该技术没有产生多重的分子离子峰，与ES质谱相比，原则上该质量光谱显得更简单。分子量高达410,000道尔顿的DNA分子可被解吸和挥发(Williams等，1989)。更近地，在该技术中应用远红外线激光(IR)(与UV-激光相反)显示，可获得更大核酸的质量光谱，如合成的DNA、质粒DNA的限制酶片断、以及RNA转录物，多达2180个核苷酸(Berkenkamp等，1998)。Berkenkamp等(1998)也描述了如何通过限制的样品纯化分析DNA和RNA样品，应用MALDI-TOF IR。

在日本专利59-131909中，描述了一种装置，其可检测通过电泳、液体层析或高速凝胶过滤分离的核酸片断。通过在核酸中掺入通常不存在于DNA中的原子如S、Br、I或Ag、Au、Pt、Os、Hg来实现质谱检测。

2.能量转移

另一种用于检测核酸的方法涉及能量转移。带有荧光标记的标记杂交寡核苷酸探针是本领域熟知的技术，并且是敏感的、非辐射的方法，用于推动探针杂交的检测。最近开发的检测方法使用荧光能量转移(FET)方法，胜于在探针杂交检测中直接检测荧光强度。FET发生在供体荧光团和受体染料(其可以是荧光团或不是荧光团)之间，当其一(受体)的吸收光谱与另一(供体)的发散光谱交叠，两种染料紧密接近。具有这些特性的染料被称为供体/受体染料对或能量转移染料对。供体荧光团的激发状态的能量通过共振偶极诱导的偶极反应转移到邻近受体。这引起供体荧光团的衰减。在一些情况下，如果受体也是荧光团，荧光强度将增强。能量转移的效率高度依赖于供体和受体之间的距离，并且，预期这些关联的等式已经被提出(Forster，1948)。在能量转移效率为50％时的供体和受体染料之间的距离被称为Forster距离(Ro)。其它荧光衰减机制也是已知的，包括如电荷转移和碰撞衰减。

能量转移以及其它依赖两种染料近距离接近产生衰减的机制是引人注目的检测或鉴定核苷酸序列的方式，因为这种试验可在同种的操作形式下进行。同种试验形式比传统的探针杂交试验更简单，后者依赖单一荧光团标记的荧光检测，因为异种试验通常要求附加的步骤，以分离杂交的标记和游离的标记。几种用于FET杂交试验的形式记录在非同位素DNA探针技术(1992)中。

使用能量转移或其它荧光团衰减机制来检测核酸扩增的匀相测定法也已经被述及。Higuchi公开了一种通过监控由于结合到双链DNA而增强的溴乙锭荧光，实时检测DNA扩增的方法。该方法的敏感性是有限的，因为溴乙锭的结合不是靶特异性的，并且还检测到背景扩增产物。Lee等(1993)公开了一种实时检测方法，在PCR^TM过程中，一种双重标记的检测探针被以靶扩增特异的方式分裂。检测探针在扩增引物的下游杂交，所以Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性消化检测探针，分离形成能量转移对的两种染料。由于探针被分裂，荧光强度增强。PCT申请WO96/21144公开了连续荧光试验，其中，酶介导的核酸切割引起增强的荧光。建议将荧光能量转移应用在本方法中，但是仅用在使用单荧光标记的方法中，其通过杂交到靶而发生衰减。

杂交到靶序列的信号引物或检测探针已经被描述用于检测核酸扩增(美国专利5,547,861)，其作用在扩增引物的杂交位点的下游。信号引物被聚合酶以与扩增引物延伸相似的方式延伸。扩增引物的延伸以靶扩增依赖的方式取代信号引物的延伸产物，产生双链的二级扩增产物，其可作为靶扩增的指标被检测。由信号引物产生的二级扩增产物可以通过许多标记和报道基团，被切割产生特征性大小的片段的信号引物中的限制位点，捕获基团、以及三螺旋等结构特征，和用于双链DNA结合蛋白的识别位点进行检测。

本领域中已知的许多供体/受体染料对可被应用于本发明中。它们包括如异硫氰酸荧光素(FITC)/四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、FITC/Texas Red^TM(MolecularProbes)、FITC/1-嵌二萘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺(PYB)、FITC/异硫氰酸曙红(EITC)、1-嵌二萘磺酸N-羟基琥珀酰亚胺(PYS)/FITC、FITC/罗丹明X、FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)等。特定供体/受体荧光团对的选择不是特别重要的。对于能量转移衰减机制，仅需要供体荧光团的发射波长与受体的激发波长重叠，即在两种染料之间必须具有足够的光谱重叠，以产生有效的能量转移、电荷转移或荧光衰减。P-(二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)是一种非荧光受体染料，其可有效地从邻近的荧光团如荧光素或5-(2’-氨乙基)氨基萘(EDANS)中衰减荧光。任何可在本发明的检测核酸中产生荧光衰减的染料对适合应用于本发明的方法中，不管其衰减产生机制是怎样的。末端和内部标记方法都是本领域已知的，并可常规地用于连接在检测核酸中处于各自位点的供体和受体染料。

I.试剂盒

本发明也可包含试剂盒，以进行这里描述的任何方法。在一个非限制的实例中，用于反转录的引物、酶，用于扩增的酶和附加试剂，可被包含在一种试剂盒中。因而，所述试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包含用于RNA分离、扩增产物纯化的试剂、标记等。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

J.实施例

下面的实施例包括在本发明中，以证明本发明的优选的实施例。本领域的技术人员应该意识到，伴随着发明人所揭示的技术而公开在实施例中的技术在本发明的实施中作用良好，因而可认为构成了实施的优选方式。然而，根据本发明所揭示的，本领域的技术人员应该清楚，在特异的实施例中可进行很多的变化，其已被揭示并仍然获得同样的或相似的结果，不背离本发明的意愿和范围。

实施例1

材料和方法

AC133的定量PCR^TM。从1×10⁶人外周单核细胞制备mRNA，应用oligo-dT进行抽提。AC133的许多特异的3’和5’引物基于GeneBank公布的AC133 cDNA序列(Yin等，1997)设计。通过筛选，选择出高度特异的3’和5’引物。所有的用于AC133的PCR^TM都在标准方案下进行，扩增30轮，用β-肌动蛋白作为内部对照。试验的灵敏度通过在U-937细胞系中连续稀释人脐带内皮细胞或在人单核外周血中连续稀释纯化的CD34+细胞来评估。该过程的检测极限是每1×10⁶PMNC 1EPC，并且特异性高于90％。

CECs和EPCs的测量。在外周血中细胞的测量通过三色流式细胞计数，应用一组与CD45(除去造血细胞)、AC133和CD34反应的单克隆抗体。应用适当的分析入口来对EPC进行计数(Boyer等，2000)。用参比荧光珠计算绝对细胞数。每个外周血样品中获得至少100,000个细胞后，通过在CEC计数入口中集合足够量的事件(＞100，典型的为3-400)获得信息分析。该步骤的灵敏度和特异性可通过连续稀释人细胞因子动员的富集CD34+的MNC制备物，并且在U-937细胞系中来评估。该方法的检测极限为0.1细胞/μL，特异性高于90％(Boyer等，2000)。

实施例2

结果

RT-RCR在三位CRC患者以及两位健康的志愿者中进行，以分析AC133表达。对照来自准备用于骨髓移植的富集的外周单核祖/干细胞，在1×10⁶MNC中有CD34+细胞。值得注意的是患者1和患者2患有转移疾病，而患者3患有原生肿瘤，约在4周前切除，并显示低水平的AC133以及血浆VEGF水平(图1)。数据显示肿瘤负荷(手术)的减少与减少的外周血EPCs相关。

血清VEGF和其它血管生成细胞因子。细胞因子和VEGF在人个体的血浆中测量，应用市售的ELISA试剂盒测量VEGF和其它细胞因子(R&D，Minneapolis，MN)，这已经在其它地方有所描述(Shi等，2001；Shi等，2000)。

在来自三位CRC患者和两位健康的正常志愿者的血清样品中，用ELISA试验测定VEGF和基础FGF。数据(图2)显示，与正常志愿者相比，患者的血浆VEGF和FGF明显地升高。在所有三位患者中，VEGF水平呈现出确实与AC133信号成正比(图1)。此外，患者1和2是患有转移疾病的CRC患者，比患者3显示更高水平的AC133和血浆VEGF，患者3切除了Duke C结肠癌。其它血浆血管生成细胞因子，如氧化一氮，将采用前述的方法(Shi等，2001；Shi等，2000)寻找可选择的假设。

实施例3

AC133的RT-PCR和定量PCR^TM(Q-RT-PCR)分析

研究人群。58位CRC患者被募集到本研究中。携带内在的活性伤口、炎症、感染、少于4周的手术、近期心脏病发作或中风、或四肢缺血的患者是不符合要求的。所有患者在采集30cc外周血之前被要求签了知情同意书。

CEP阳性对照细胞。在本实验中使用获自健康志愿者的细胞因子动员的CD34+PBMNC。冰冻的CD34+富集的外周血单核细胞制剂在37℃中水浴解冻。用RBC裂解产物裂解红血细胞。然后将PBMNC细胞与1.5μL FITC标记的高亲和力、非中和性的MoAb一起孵育20分钟，该MoAbs针对藻红蛋白(PE；红色荧光)标记的抗CD34抗体(Becton Dickinson，San Jose，CA)，用PBS洗涤细胞。阳性细胞的数量与免疫球蛋白G同工型对照(FITC；Immunotech，Marceille，法国)比较，应用CoulterElite流式细胞仪(COULTER，Hialeah，FL)确定数量。不能生存的细胞通过7AAD(生存能力标记)来鉴定，用碘化丙啶染色。总数至少10,000事件被获取。总PBMNC中CD34+细胞存在0.56％。CD34+、7AAD(-)为96.1％。

RT-PCR。在患者中进行RT-PCR，用β-肌动蛋白作为对照。670bp的扩增产物进行测序验证，AC133仅在患者中被发现存在，但不存在于正常对照中。图3显示了在一些患者样品中AC133的水平发生提高。这些结果在使用其它患者样品的其它研究中被证实。

PCR^TM以总体积50μl进行，包含1×TaqMan缓冲液，5.5nM MgCl₂，200μMdATP、dCTP、dGTP和400μM dUTP，300nM每种引物，100nM探针，0.5单位AmpErase Uracril N糖基化酶(UNG)，1.25单位AmpliTaq Gold，以及10μl的cDNA。β-肌动蛋白和AC133扩增的每种样品都以双份进行。热循环条件包括在50℃2分钟和在95℃ 10分钟，接着进行40个循环的95℃ 15分钟和60℃ 1分钟。所有用于RT-PCRT的试剂购自Applied Biosystems(Foster City，CA)。使用的引物为：

AC133：左：AGCCTTCATCCACAGATGCT(SEQ ID NO：5)

右：TTTTGGATTCATATGCCTTCTG(SEQ ID NO：6)

GAPDH：左：CTTCACCACCATGGAGAAGGC(SEQ ID NO：7)

右：GGCATGGACTGTGGTCATGAG(SEQ ID NO：8)

数据翻译。靶的量对内部参考(GAPDH)归一化，相对于阳性对照通过C_t方法限定，公式如下：

其中，^ΔΔC_t＝{[C_t(AC133样品)-C_t(GAPDH样品)]-[C_t(AC133校准器)-C_t(GAPDH校准器)]}

AC133(CD133)的实时QPCR。实时定量RT-PCR应用AC133引物来进行，量化CEP。该试验基于TaqMan方法进行，应用ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)。通过荧光发射，当PCR^TM产物可检测时，该技术允许循环点的发现(C_t值与靶mRNA的起始量相关)。所使用的引物如下：

AC133：左：CATGTTTGGAGGATCTTGCTAGC(SEQ ID NO：9)

右：TTCCCGCACAGCCCC(SEQ ID NO：10)

探针：ATGGCCCTCGTACTCGGCTCCC(SEQ ID NO：11)

GAPDH：左：CTTCACCACCATGGAGAAGGC(SEQ ID NO：12)

右：GGCATGGACTGTGGTCATGAG(SEQ ID NO：13)

探针：CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT(SEQ ID NO：14)

在知情同意后采集外周血样品，直至分析前结果是未知的。4周内进行过手术、活动性关节炎、外伤和/或炎症患者不能参加本研究。试验基于Marchetti等(2002)所描述的方法，但GAPDH被用作内部对照。所有样品双份进行，来自细胞因子动员的外周干细胞的AC133+细胞作为阳性对照。CD133 mRNA仅在活动性CRC患者的外周血中被检测出，而健康志愿者中没有。(n＝10)。

AC133的实时Q-RT-PCR在带有或不带活动性CRC的患者中进行(n＝44)。在患有临床疾病的患者中，估计的AC133标记的中间值(4.2；范围：0.017-106.9)明显高于没有临床疾病的人(0.0017，范围：0.0-9.51)；p值＜0.001(Mann-Whitney测试)。当三个中间AC133值(0.01，0.05，0.1)被用作评估让步比(OR)的切断点时，区分活性或非活性的X射线照相术疾病状态的95％可信区间(CI)，所有这三点都是统计学有意义的OR，范围8.2-14.6(图1)。

令人感兴趣的是，AC133在三位带有上升的CEA的患者中升高，而不是CRC。CEP在带有复发CRC的患者中也升高，复发CRC是由升高的CEA导致的。一位患者由于甲状腺癌而带有上升的CEA。两个有切除肝转移疾病历史的高危患者带有升高的AC133，高达9。区别活性或非活性疾病状态的估计的AC133截留值显示在0.017，AUC 81％(图6)。该研究显示，AC133的实时Q RT-PCR与肿瘤状态相关，这是由内在的肿瘤血管生成引起的，并可被用作肿瘤新生的替代标记。

表1

结果	CD133切断点(等于或高于)
				临床活动性CRC否(N＝31)是(N＝13)让步比(95％CI)P值	0.0114(45.2)12(92.3)14.61.7-126.2)0.004	0.059(29)11(84.6)13.4(2.5-73.2)0.001	0.19(29)10(76.9)8.2(1.8-36.7)0.005

在没有根据本发明所揭示的内容进行不适当的试验的情况下，这里公开和主张的所有组合物和方法可被制作和执行。当本发明的组合物和方法已经以优选实施例的方式进行描述，本领域技术人员应清楚，在这里描述的组合物和方法中、以及在步骤中或在所述方法各步骤的顺序中都可进行变更，这些变更不背离本发明的思想、意愿和范围。更特别地，应清楚，某些化学和生理学相关的试剂可用于取代这里所描述的试剂，达到相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的相似的取代和更改被包括在本发明的意愿、范围和思想内，如附加的权利要求所限定的。

K.参考文献

以下的参考文献，提供了代表性的过程或其它详细材料，作为这里所提供内容的增补，特异性地引入到这里作为参考。

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美国专利5,279,721

美国专利5,296,375

美国专利5,304,487

美国专利5,428,148

美国专利5,547,861

美国专利5,554,744

美国专利5,574,146

美国专利5,602,244

美国专利5,840,873

美国专利5,843,640

美国专利5,843,650

美国专利5,843,651

美国专利5,843,663

美国专利5,846,708

美国专利5,846,709

美国专利5,846,717

美国专利5,846,726

美国专利5,846,729

美国专利5,846,783

美国专利5,849,481

美国专利5,849,486

美国专利5,849,487

美国专利5,849,497

美国专利5,849,546

美国专利5,849,547

美国专利5,851,772

美国专利5,853,990

美国专利5,853,992

美国专利5,853,993

美国专利5,856,092

美国专利5,856,174

美国专利5,858,652

美国专利5,861,244

美国专利5,863,732

美国专利5,863,753

美国专利5,866,331

美国专利5,866,366

美国专利5,900,481

美国专利5,904,824

美国专利5,905,024

美国专利5,910,407

美国专利5,912,124

美国专利5,912,145

美国专利5,912,148

美国专利5,916,776

美国专利5,916,779

美国专利5,919,626

美国专利5,919,630

美国专利5,922,574

美国专利5,925,517

美国专利5,928,862

美国专利5,928,869

美国专利5,928,905

美国专利5,928,906

美国专利5,929,227

美国专利5,932,413

美国专利5,932,451

美国专利5,935,791

美国专利5,935,825

美国专利5,939,291

美国专利5,942,391

欧洲申请329 822

欧洲申请320 308

英国申请2 202 328

日本申请59-131909

PCT申请WO 96/21144

PCT申请WO 90/14148

PCT申请WO 88/10315

PCT申请WO 90/07641

PCT申请WO 89/06700

PCT申请WO 94/05414

PCT申请US87/00880

PCT申请US89/01025

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Yin等，Blood，90：5002-5012，1997。

                              序列表

<110>林惠国(LIN，EDWARD H.)

     吴茜凤(WU，XIFENG)

     谢克平(XIE，KEPING)

<120>对AC133进行定量RT-PCR以在细胞样品中诊断癌症和监控血管生成活性

<130>UTFC：755WO

<140>PCT/US2003/026169

<141>2003-08-21

<150>US10/618,102

<151>2003-07-11

<150>US60/406,535

<151>2002-08-28

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>1

tgtacgaatt cgacagctac ttggctcaga c                              31

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>2

tctagctcga gcatgatctt tatgataacc                                30

<210>3

<211>3794

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(38)..(2635)

<400>3

ccaagttcta cctcatgttt ggaggatctt gctagct atg gcc ctc gta ctc ggc  55

                                         Met Ala Leu Val Leu Gly

                                           1               5

tcc ctg ttg ctg ctg ggg ctg tgc ggg aac tcc ttt tca gga ggg cag    103

Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Gly Asn Ser Phe Ser Gly Gly Gln

             10                  15                  20

cct tca tcc aca gat gct cct aag gct tgg aat tat gaa ttg cct gca    151

Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp Asn Tyr Glu Leu Pro Ala

         25                  30                  35

aca aat tat gag acc caa gac tcc cat aaa gct gga ccc att ggc att    199

Thr Asn Tyr Glu Thr Gln Asp Ser His Lys Ala Gly Pro Ile Gly Ile

     40                  45                  50

ctc ttt gaa cta gtg cat atc ttt ctc tat gtg gta cag ccg cgt gat    247

Leu Phe Glu Leu Val His Ile Phe Leu Tyr Val Val Gln Pro Arg Asp

 55                  60                  65                  70

ttc cca gaa gat act ttg aga aaa ttc tta cag aag gca tat gaa tcc    295

Phe Pro Glu Asp Thr Leu Arg Lys Phe Leu Gln Lys Ala Tyr Glu Ser

                 75                  80                  85

aaa att gat tat gac aag cca gaa act gta atc tta ggt cta aag att    343

Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Thr Val Ile Leu Gly Leu Lys Ile

             90                  95                 100

gtc tac tat gaa gca ggg att att cta tgc tgt gtc ctg ggg ctg ctg    391

Val Tyr Tyr Glu Ala Gly Ile Ile Leu Cys Cys Val Leu Gly Leu Leu

        105                 110                 115

ttt att att ctg atg cct ctg gtg ggg tat ttc ttt tgt atg tgt cgt    439

Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr Phe Phe Cys Met Cys Arg

    120                 125                 130

tgc tgt aac aaa tgt ggt gga gaa atg cac cag cga cag aag gaa aat    487

Cys Cys Asn Lys Cys Gly Gly Glu Met His Gln Arg Gln Lys Glu Asn

135                 140                 145                 150

ggg ccc ttc ctg agg aaa tgc ttt gca atc tcc ctg ttg gtg att tgt    535

Gly Pro Phe Leu Arg Lys Cys Phe Ala Ile Ser Leu Leu Val Ile Cys

                155                 160                 165

ata ata ata agc att ggc atc ttc tat ggt ttt gtg gca aat cac cag    583

Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly Phe Val Ala Asn His Gln

            170                 175                 180

gta aga acc cgg atc aaa agg agt cgg aaa ctg gca gat agc aat ttc    631

Val Arg Thr Arg Ile Lys Arg Ser Arg Lys Leu Ala Asp Ser Asn Phe

        185                 190                 195

aag gac ttg cga act ctc ttg aat gaa act cca gag caa atc aaa tat    679

Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Asn Glu Thr Pro Glu Gln Ile Lys Tyr

    200                 205                 210

ata ttg gcc cag tac aac act acc aag gac aag gcg ttc aca gat ctg    727

Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Asp Lys Ala Phe Thr Asp Leu

215                 220                 225                 230

aac agt atc aat tca gtg cta gga ggc gga att ctt gac cga ctg aga    775

Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly Ile Leu Asp Arg Leu Arg

                235                 240                 245

ccc aac atc atc cct gtt ctt gat gag att aag tcc atg gca aca gcg    823

Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile Lys Ser Met Ala Thr Ala

            250                 255                 260

atc aag gag acc aaa gag gcg ttg gag aac atg aac agc acc ttg aag    871

Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn Met Asn Ser Thr Leu Lys

        265                 270                 275

agc ttg cac caa caa agt aca cag ctt agc agc agt ctg acc agc gtg    919

Ser Leu His Gln Gln Ser Thr Gln Leu Ser Ser Ser Leu Thr Ser Val

    280                 285                 290

aaa act agc ctg cgg tca tct ctc aat gac cct ctg tgc ttg gtg cat    967

Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ser Leu Asn Asp Pro Leu Cys Leu Val His

295                 300                 305                 310

cca tca agt gaa acc tgc aac agc atc aga ttg tct cta agc cag ctg    1015

Pro Ser Ser Glu Thr Cys Asn Ser Ile Arg Leu Ser Leu Ser Gln Leu

                315                 320                 325

aat agc aac cct gaa ctg agg cag ctt cca ccc gtg gat gca gaa ctt    1063

Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro Pro Val Asp Ala Glu Leu

            330                 335                 340

gac aac gtt aat aac gtt ctt agg aca gat ttg gat ggc ctg gtc caa    1111

Asp Asn Val Asn Asn Val Leu Arg Thr Asp Leu Asp Gly Leu Val Gln

        345                 350                 355

cag ggc tat caa tcc ctt aat gat ata cct gac aga gta caa cgc caa    1159

Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro Asp Arg Val Gln Arg Gln

    360                 365                 370

acc acg act gtc gta gca ggt atc aaa agg gtc ttg aat tcc att ggt    1207

Thr Thr Thr Val Val Ala Gly Ile Lys Arg Val Leu Asn Ser Ile Gly

375                 380                 385                 390

tca gat atc gac aat gta act cag cgt ctt cct att cag gat ata ctc    1255

Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu Pro Ile Gln Asp Ile Leu

                395                 400                 405

tca gca ttc tct gtt tat gtt aat aac act gaa agt tac atc cac aga    1303

Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr Glu Ser Tyr Ile His Arg

            410                 415                 420

aat tta cct aca ttg gaa gag tat gat tca tac tgg tgg ctg ggt ggc    1351

Asn Leu Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Asp Ser Tyr Trp Trp Leu Gly Gly

        425                 430                 435

ctg gtc atc tgc tct ctg ctg acc ctc atc gtg att ttt tac tac ctg    1399

Leu Val Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Ile Val Ile Phe Tyr Tyr Leu

    440                 445                 450

ggc tta ctg tgt ggc gtg tgc ggc tat gac agg cat gcc acc ccg acc    1447

Gly Leu Leu Cys Gly Val Cys Gly Tyr Asp Arg His Ala Thr Pro Thr

455                 460                 465                 470

acc cga ggc tgt gtc tcc aac acc gga ggc gtc ttc ctc atg gtt gga    1495

Thr Arg Gly Cys Val Ser Asn Thr Gly Gly Val Phe Leu Met Val Gly

                475                 480                 485

gtt gga tta agt ttc ctc ttt tgc tgg ata ttg atg atc att gtg gtt    1543

Val Gly Leu Ser Phe Leu Phe Cys Trp Ile Leu Met Ile Ile Val Val

            490                 495                 500

ctt acc ttt gtc ttt ggt gca aat gtg gaa aaa ctg atc tgt gaa cct    1591

Leu Thr Phe Val Phe Gly Ala Asn Val Glu Lys Leu Ile Cys Glu Pro

        505                 510                 515

tac acg agc aag gaa tta ttc cgg gtt ttg gat aca ccc tac tta cta    1639

Tyr Thr Ser Lys Glu Leu Phe Arg Val Leu Asp Thr Pro Tyr Leu Leu

    520                 525                 530

aat gaa gac tgg gaa tac tat ctc tct ggg aag cta ttt aat aaa tca    1687

Asn Glu Asp Trp Glu Tyr Tyr Leu Ser Gly Lys Leu Phe Asn Lys Ser

535                 540                 545                 550

aaa atg aag ctc act ttt gaa caa gtt tac agt gac tgc aaa aaa aat    1735

Lys Met Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Asn

                555                 560                 565

aga ggc act tac ggc act ctt cac ctg cag aac agc ttc aat atc agt    1783

Arg Gly Thr Tyr Gly Thr Leu His Leu Gln Asn Ser Phe Asn Ile Ser

            570                 575                 580

gaa cat ctc aac att aat gag cat act gga agc ata agc agt gaa ttg    1831

Glu His Leu Asn Ile Asn Glu His Thr Gly Ser Ile Ser Ser Glu Leu

        585                 590                 595

gaa agt ctg aag gta aat ctt aat atc ttt ctg ttg ggt gca gca gga    1879

Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe Leu Leu Gly Ala Ala Gly

    600                 605                 610

aga aaa aac ctt cag gat ttt gct gct tgt gga ata gac aga atg aat    1927

Arg Lys Asn Leu Gln Asp Phe Ala Ala Cys Gly Ile Asp Arg Met Asn

615                 620                 625                 630

tat gac agc tac ttg gct cag act ggt aaa tcc ccc gca gga gtg aat    1975

Tyr Asp Ser Tyr Leu Ala Gln Thr Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Asn

                635                 640                 645

ctt tta tca ttt gca tat gat cta gaa gca aaa gca aac agt ttg ccc    2023

Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Asp Leu Glu Ala Lys Ala Asn Ser Leu Pro

            650                 655                 660

cca gga aat ttg agg aac tcc ctg aaa aga gat gca caa act att aaa    2071

Pro Gly Asn Leu Arg Asn Ser Leu Lys Arg Asp Ala Gln Thr Ile Lys

        665                 670                 675

aca att cac cag caa cga gtc ctt cct ata gaa caa tca ctg agc act    2119

Thr Ile His Gln Gln Arg Val Leu Pro Ile Glu Gln Ser Leu Ser Thr

    680                 685                 690

cta tac caa agc gtc aag ata ctt caa cgc aca ggg aat gga ttg ttg    2167

Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Gln Arg Thr Gly Asn Gly Leu Leu

695                 700                 705                 710

gag aga gta act agg att cta gct tct ctg gat ttt gct cag aac ttc    2215

Glu Arg Val Thr Arg Ile Leu Ala Ser Leu Asp Phe Ala Gln Asn Phe

                715                 720                 725

atc aca aac aat act tcc tct gtt att att gag gaa act aag aag tat    2263

Ile Thr Asn Asn Thr Ser Ser Val Ile Ile Glu Glu Thr Lys Lys Tyr

            730                 735                 740

ggg aga aca ata ata gga tat ttt gaa cat tat ctg cag tgg atc gag    2311

Gly Arg Thr Ile Ile Gly Tyr Phe Glu His Tyr Leu Gln Trp Ile Glu

        745                 750                 755

ttc tct atc agt gag aaa gtg gca tcg tgc aaa cct gtg gcc acc gct    2359

Phe Ser Ile Ser Glu Lys Val Ala Ser Cys Lys Pro Val Ala Thr Ala

    760                 765                 770

cta gat act gct gtt gat gtc ttt ctg tgt agc tac att atc gac ccc    2407

Leu Asp Thr Ala Val Asp Val Phe Leu Cys Ser Tyr Ile Ile Asp Pro

775                 780                 785                 790

ttg aat ttg ttt tgg ttt ggc ata gga aaa gct act gta ttt tta ctt    2455

Leu Asn Leu Phe Trp Phe Gly Ile Gly Lys Ala Thr Val Phe Leu Leu

                795                 800                 805

ccg gct cta att ttt gcg gta aaa ctg gct aag tac tat cgt cga atg    2503

Pro Ala Leu Ile Phe Ala Val Lys Leu Ala Lys Tyr Tyr Arg Arg Met

            810                 815                 820

gat tcg gag gac gtg tac gat gat gtt gaa act ata ccc atg aaa aat    2551

Asp Ser Glu Asp Val Tyr Asp Asp Val Glu Thr Ile Pro Met Lys Asn

        825                 830                 835

atg gaa aat ggt aat aat ggt tat cat aaa gat cat gta tat ggt att    2599

Met Glu Asn Gly Asn Asn Gly Tyr His Lys Asp His Val Tyr Gly Ile

    840                 845                 850

cac aat cct gtt atg aca agc cca tca caa cat tga tagctgatgt         2645

His Asn Pro Val Met Thr Ser Pro Ser Gln His

855                 860                 865

tgaaactgct tgagcatcag gatactcaaa gtggaaagga tcacagattt ttggtagttt  2705

ctgggtctac aaggactttc caaatccagg agcaacgcca gtggcaacgt agtgactcag  2765

gcgggcacca aggcaacggc accattggtc tctgggtagt gctttaagaa tgaacacaat  2825

cacgttatag tccatggtcc atcactattc aaggatgact ccctcccttc ctgtctattt 2885

ttgtttttta cttttttaca ctgagtttct atttagacac tacaacatat ggggtgtttg 2945

ttcccattgg atgcatttct atcaaaactc tatcaaatgt gatggctaga ttctaacata 3005

ttgccatgtg tggagtgtgc tgaacacaca ccagtttaca ggaaagatgc attttgtgta 3065

cagtaaacgg tgtatatacc ttttgttacc acagagtttt ttaaacaaat gagtattata 3125

ggactttctt ctaaatgagc taaataagtc accattgact tcttggtgct gttgaaaata 3185

atccattttc actaaaagtg tgtgaaacct acagcatatt cttcacgcag agattttcat 3245

ctattatact ttatcaaaga ttggccatgt tccacttgga aatggcatgc aaaagccatc 3305

atagagaaac ctgcgtaact ccatctgaca aattcaaaag agagagagag atcttgagag 3365

agaaatgctg ttcgttcaaa agtggagttg ttttaacaga tgccaattac ggtgtacagt 3425

ttaacagagt tttctgttgc attaggataa acattaattg gagtgcagct aacatgagta 3485

tcatcagact agtatcaagt gttctaaaat gaaatatgag aagatcctgt cacaattctt 3545

agatctggtg tccagcatgg atgaaacctt tgagtttggt ccctaaattt gcatgaaagc 3605

acaaggtaaa tattcatttg cttcaggagt ttcatgttgg atctgtcatt atcaaaagtg 3665

atcagcaatg aagaactggt cggacaaaat ttaacgttga tgtaatggaa ttccagatgt 3725

aggcattccc cccaggtctt ttcatgtgca gattgcagtt ctgattcatt tgaataaaaa 3785

ggaacttgg                                                         3794

<210>4

<211>865

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Met Ala Leu Val Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Gly Asn

  1               5                  10                  15

Ser Phe Ser Gly Gly Gln Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp

             20                  25                  30

Asn Tyr Glu Leu Pro Ala Thr Asn Tyr Glu Thr Gln Asp Ser His Lys

         35                  40                  45

Ala Gly Pro Ile Gly Ile Leu Phe Glu Leu Val His Ile Phe Leu Tyr

     50                  55                  60

Val Val Gln Pro Arg Asp Phe Pro Glu Asp Thr Leu Arg Lys Phe Leu

 65                  70                  75                  80

Gln Lys Ala Tyr Glu Ser Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Thr Val

                 85                  90                  95

Ile Leu Gly Leu Lys Ile Val Tyr Tyr Glu Ala Gly Ile Ile Leu Cys

            100                 105                 110

Cys Val Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr

        115                 120                 125

Phe Phe Cys Met Cys Arg Cys Cys Asn Lys Cys Gly Gly Glu Met His

    130                 135                 140

Gln Arg Gln Lys Glu Asn Gly Pro Phe Leu Arg Lys Cys Phe Ala Ile

145                 150                 155                 160

Ser Leu Leu Val Ile Cys Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly

                165                 170                 175

Phe Val Ala Asn His Gln Val Arg Thr Arg Ile Lys Arg Ser Arg Lys

            180                 185                 190

Leu Ala Asp Ser Asn Phe Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Asn Glu Thr

        195                 200                 205

Pro Glu Gln Ile Lys Tyr Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Asp

    210                 215                 220

Lys Ala Phe Thr Asp Leu Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly

225                 230                 235                 240

Ile Leu Asp Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile

                245                 250                 255

Lys Ser Met Ala Thr Ala Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Met Asn Ser Thr Leu Lys Ser Leu His Gln Gln Ser Thr Gln Leu Ser

        275                 280                 285

Ser Ser Leu Thr Ser Val Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ser Leu Asn Asp

    290                 295                 300

Pro Leu Cys Leu Val His Pro Ser Ser Glu Thr Cys Asn Ser Ile Arg

305                 310                 315                 320

Leu Ser Leu Ser Gln Leu Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro

                325                 330                 335

Pro Val Asp Ala Glu Leu Asp Asn Val Asn Asn Val Leu Arg Thr Asp

            340                 345                 350

Leu Asp Gly Leu Val Gln Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro

        355                 360                 365

Asp Arg Val Gln Arg Gln Thr Thr Thr Val Val Ala Gly Ile Lys Arg

    370                 375                 380

Val Leu Asn Ser Ile Gly Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu

385                 390                 395                 400

Pro Ile Gln Asp Ile Leu Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr

                405                 410                 415

Glu Ser Tyr Ile His Arg Asn Leu Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Asp Ser

            420                 425                 430

Tyr Trp Trp Leu Gly Gly Leu Val Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Ile

        435                 440                 445

Val Ile Phe Tyr Tyr Leu Gly Leu Leu Cys Gly Val Cys Gly Tyr Asp

    450                 455                 460

Arg His Ala Thr Pro Thr Thr Arg Gly Cys Val Ser Asn Thr Gly Gly

465                 470                 475                 480

Val Phe Leu Met Val Gly Val Gly Leu Ser Phe Leu Phe Cys Trp Ile

                485                 490                 495

Leu Met Ile Ile Val Val Leu Thr Phe Val Phe Gly Ala Asn Val Glu

            500                 505                 510

Lys Leu Ile Cys Glu Pro Tyr Thr Ser Lys Glu Leu Phe Arg Val Leu

        515                 520                 525

Asp Thr Pro Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Trp Glu Tyr Tyr Leu Ser Gly

    530                 535                 540

Lys Leu Phe Asn Lys Ser Lys Met Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr

545                 550                 555                 560

Ser Asp Cys Lys Lys Asn Arg Gly Thr Tyr Gly Thr Leu His Leu Gln

                565                 570                 575

Asn Ser Phe Asn Ile Ser Glu His Leu Asn Ile Asn Glu His Thr Gly

            580                 585                 590

Ser Ile Ser Ser Glu Leu Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe

        595                 600                 605

Leu Leu Gly Ala Ala Gly Arg Lys Asn Leu Gln Asp Phe Ala Ala Cys

    610                 615                 620

Gly Ile Asp Arg Met Asn Tyr Asp Ser Tyr Leu Ala Gln Thr Gly Lys

625                 630                 635                 640

Ser Pro Ala Gly Val Asn Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Asp Leu Glu Ala

                645                 650                 655

Lys Ala Asn Ser Leu Pro Pro Gly Asn Leu Arg Asn Ser Leu Lys Arg

            660                 665                 670

Asp Ala Gln Thr Ile Lys Thr Ile His Gln Gln Arg Val Leu Pro Ile

        675                 680                 685

Glu Gln Ser Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Gln Arg

    690                 695                 700

Thr Gly Asn Gly Leu Leu Glu Arg Val Thr Arg Ile Leu Ala Ser Leu

705                 710                 715                 720

Asp Phe Ala Gln Asn Phe Ile Thr Asn Asn Thr Ser Ser Val Ile Ile

                725                 730                 735

Glu Glu Thr Lys Lys Tyr Gly Arg Thr Ile Ile Gly Tyr Phe Glu His

            740                 745                 750

Tyr Leu Gln Trp Ile Glu Phe Ser Ile Ser Glu Lys Val Ala Ser Cys

        755                 760                 765

Lys Pro Val Ala Thr Ala Leu Asp Thr Ala Val Asp Val Phe Leu Cys

    770                 775                 780

Ser Tyr Ile Ile Asp Pro Leu Asn Leu Phe Trp Phe Gly Ile Gly Lys

785                 790                 795                 800

Ala Thr Val Phe Leu Leu Pro Ala Leu Ile Phe Ala Val Lys Leu Ala

                805                 810                 815

Lys Tyr Tyr Arg Arg Met Asp Ser Glu Asp Val Tyr Asp Asp Val Glu

            820                 825                 830

Thr Ile Pro Met Lys Asn Met Glu Asn Gly Asn Asn Gly Tyr His Lys

        835                 840                 845

Asp His Val Tyr Gly Ile His Asn Pro Val Met Thr Ser Pro Ser Gln

    850                 855                 860

His

865

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agccttcatc cacagatgct                                           20

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>6

ttttggattc atatgccttc tg                                        22

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>7

cttcaccacc atggagaagg c                                         21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>8

ggcatggact gtggtcatga g                                         21

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>9

catgtttgga ggatcttgct agc                                       23

<210>10

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>10

ttcccgcaca gcccc                                                15

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>11

atggccctcg tactcggctc cc                                        22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>12

cttcaccacc atggagaagg c                                         21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>13

ggcatggact gtggtcatga g                                         21

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>14

cctggccaag gtcatccatg acaacttt                                  28

Claims (27)

1.一种在人个体中诊断癌症的方法，其特征在于，该方法包括：

a)获得一种包含所述个体细胞的样品；

b)获得来自所述样品的细胞的RNA转录物；

c)用扩增AC133核酸片断的引物对所述RNA进行定量PCR^TM；和

d)将AC133扩增产物的量与在非癌细胞中的扩增产物的量作比较，

其中，与非癌细胞中AC133扩增产物的量相比，所述个体细胞中AC133扩增产物的量提高，指示所述个体患有癌症。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌症是直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、脑癌、白血病、肝癌、子宫内膜癌、前列腺癌、以及头颈癌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌症是非上皮癌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的非上皮癌是骨肉瘤、软组织肉瘤、或胃肠道间质瘤。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是单核细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞分离自先前诊断为癌症的人个体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品是获自外周循环系统的血。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，正向引物由以下DNA序列组成：5’-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3’(SEQ ID NO：1)。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反向引物由以下DNA序列组成：5’-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3’(SEQ ID NO：2)。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AC133扩增产物的提高还预测了肿瘤负荷。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AC133扩增产物的提高还预测了肿瘤复发。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含基于所述个体的细胞中AC133扩增产物的量的提高，制定治疗决策。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含为所述的个体治疗癌症。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，对所述个体用放射治疗、免疫治疗、化学治疗、激素治疗或基因治疗进行治疗。

15.一种在样品中定量内皮祖细胞的方法，其特征在于，该方法包括：

a)获得含有所述个体细胞的样品；

b)获得来自所述样品的细胞的RNA转录物；和

c)用扩增AC133核酸片断的引物进行定量PCR，

其中，所述样品的细胞中AC133扩增产物的量与标准曲线相比，可评估所述样品中内皮祖细胞的总量。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的标准曲线是通过系列稀释已知量的所述骨髓衍生的内皮祖细胞得到的。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法的精确度是99％。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，检测极限是每100万个细胞1个内皮祖细胞。

19.一种用于监控个体细胞中血管生成活性的方法，其特征在于，该方法包括：

a)获得一种包含所述个体细胞的样品；

b)获得来自所述样品的细胞的RNA转录物；和

c)用扩增AC133核酸片断的引物进行定量PCRTM；和

d)评估AC133扩增产物的量；

其中，所述个体的细胞中AC133扩增产物的量是所述个体细胞中血管生成活性的指标。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述样品是来自外周循环系统的血。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，还包含评估循环内皮细胞的量。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，还包含在所述样品中评估VEGF的水平。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，还包含建立所述个体的血管生成概貌。

24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的方法被用于检测血管损伤、自身免疫疾病、心肌梗塞或脓血症的存在。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的个体先前已经给予了抗血管生成治疗，并且所述的评估包含评估所述抗血管生成治疗的有效性。

26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述正向引物由以下DNA序列组成：5′-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3′(SEQ ID NO：1)。

27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述反向引物由以下DNA序列组成：5′-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3′(SEQ ID NO：2)。

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