JPH04120098A

JPH04120098A - 細胞増殖制御物質

Info

Publication number: JPH04120098A
Application number: JP2238944A
Authority: JP
Inventors: Toshiichi Nakamura; 敏一中村
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1992-04-21
Also published as: CA2051044A1; EP0475719A2; EP0475719A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は細胞増殖制御物質に関する。

（従来の技術）細胞増殖を制御する因子としては、従来からトランスフ
ォーミング増殖因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　　
ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ−β、以下ｒＴＧＦ−β
」という）が知られていた。ＴＧＦβは１９７８年にＭ
ｕＳＶ（マウスＲＮＡ肉腫ウィルス）で形質転換した細
胞の培養上清から発見された蛋白質であって、正常ラッ
ト腎臓由来のＮＲＫ細胞の軟寒天中における増殖を促進
する因子である。

ＴＧＦ−βは、形質転換（トランスフォーメーション）
に関連することがら、トランスフォーミング増殖因子と
名つけられ、腫瘍細胞に特異的に存在する物質と考えら
れていた。

しかし、その後の研究成果により、ＴＧＦ−βは正常組
織、とくに血小板に多く存在することが解明され、形質
転換のみならず生体内における多様な生理現象に関与す
ることか明らかとなった。

ヒト血小板から最初に純化されたＴＧＦ−βは現在ＴＧ
Ｆ−β１と命名され、ＴＧＦ−β類縁物質としては、こ
れまでもヒト、ラット、ブタ、ニワトリ等からβ１〜β
５の５種類が発見されている。

ＴＧＦ−βは哺乳動物のほとんど全ての細胞に対して何
らかの作用を示し、また種々の疾患に対しての治療的応
用が期待されている。ＴＧＦ−βの主な作用として、正
常培養線維芽細胞など間葉系の細胞に対する増殖促進、
肝細胞など上皮系細胞に対する増殖抑制、細胞分化の制
御、Ｔ細胞など免疫系細胞に対する増殖抑制、造血系細
胞に対する増殖制御などがｉｎ　　ｖｉｔｒｏで確認さ
れており、生体中での活性としては、創傷治癒の促進、
骨代謝、肝再生停止などへの関与が見いだされている。

他方、ＴＧＦ−β１の構造についての研究も進められ、
これまでの研究では、ＴＧＦ−β１は３９０個のアミノ
酸からなる前駆体く潜在型）として作られ、Ｃ末端側の
１１２個のアミノ酸に切断されたポリペブタイトが２分
子てダイマーとなり、活性型となることが解明されてい
る。

ＴＧＦ−βまたはその部分ペプタイドは動物細胞からの
精製や遺伝子組換え細胞での発現によって製造すること
ができ、臨床面への応用としては、例えば上皮系細胞の
増殖促進活性を利用した火傷、手術後などの創傷治癒剤
、湿疹治療剤、骨形成への関与から骨粗しよう療治療剤
、免疫系細胞の増殖抑制から臓器移植や免疫疾患におけ
る免疫制御などへの利用が試みられている。

しかし、ＴＧＦ−βの臨床応用には重大な問題が伴って
いた。すなわち、ＴＧＦ−βが、その名の由来のとおり
正常細胞をガン化させる作用、すなわちトランスフォー
メーション活性を有するという重大な欠陥である。ＴＧ
Ｆ−βを人体に投与するとガンを誘発する危険が大きく
、この点がＴＧＦ−βの実用化に対する大きな障害とな
っていた。

（発明が解決しようとする課題）ＴＧＦ−βは上記のように種々有効な作用効果をもち、
臨床への応用が期待されているにもかかわらず、ガン化
作用を有することか大きな障害となっていた。

したかって、ＴＧＦ−βの有する有効な作用効果を保持
しながら、ガン化活性（トランスフォーメーション活性
）を有しない物質は、ＴＧＦ−βの最大の欠点を除去し
、医薬品として理想的な物質としてその開発が待望され
ていた。

待望される活性としては、 ■ｉｎ　　ｖｉｔｒｏにおける正常培養線維芽細胞など
間葉系の細胞に対する増殖促進、肝細胞など上皮系細胞
に対する増殖抑制、細胞分化の制御、Ｔ細胞など免疫系
細胞に対する増殖抑制、造血系細胞に対する増殖抑制な
どの活性を有すること、■ｉＨｖｉｖｏにおける創傷治
癒の促進、並びに骨代謝、肝再生停止への関与などの活
性を有すること、　　　　　　　　　　　　　　　　　
　かつ、■トランスフォーメーション活性（正常ラット
腎臓由来ファイフロブラストＮＲＫ−４９Ｆ細胞の軟寒
天中でのコロニー形成誘導に代表される）を有しないこ
と、の全てを充足する生理活性物質を製造することが課題と
されていた。

（課題を解決するための手段）本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を続け
、本発明を完成するに至った。

本発明は、（１）下記物性を有するヒト血小板由来細胞増殖制御物
質ＰＤＧＩ−α。

記 ■ＩＮ酢酸水溶液においてバイオゲルＰ６０に吸着せず
、ｐＨ８条件下でＳ−セファロースに吸着する。

２１００℃、３分間処理によって約５０％失活し、０．
０６５Ｍジチオスレイトールによって１００％失活する
が、ＩＮ酢酸には安定である。

■５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量の測定において、非還元条件下で約２６ｋＤの単一バ
ンドを、還元条件下で約１３ｋＤ、約８ｋＤ、約５ｋＤ
の３本のバンドを示す。

■Ｃ４逆相ゲルカラムにおいて、３５〜５０％アセトニ
トリル水溶液傾斜溶出法でほぼ３７〜３９％フラクショ
ンに溶出する。

■ラット肝細胞を含む正常動物上皮系組ｍＭＡ胞の増殖
を抑制し、正常線維芽細胞の増殖を促進するが、しかし
軟寒天中においてＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニー形成を
促進する活性を示さない。

（２）下記Ｎ末端アミノ酸配列を有し、かつ、還元条件
下５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分
子量が下記である３個のサブユニットからなるヒト血小
板由来細胞増殖制御物質ＰＤＧＩ−α。

ａ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、約１３ｋＤｂ、ＡＬＤ
ＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、約８ｋＤｃ、ＮＱＨＮＰＧＡＳＡ
ＡＰＣ，約５ｋＤ（３）下記アミノ酸配列を有する３個
のサブユニットからなり、Ｓ−８結合してなるヒト血小
板由来細胞増殖抑制物質ＰＤＧＩ−α。

記ａ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＬＳＮＭ　Ｉ　ＶＲ８ＣＫｂ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＹ　Ｉ　ＤＦＲＫＤＬＧＷＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＬＡＬＹｃ、ＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＬＰ　Ｉ　ＶＹＹＶＧＲＬＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＰＫＶＥＱＬＳＮＭ　ＩＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＫＷ　Ｉ　ＨＥ　ＰＫＧＹＨＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＹＶＧＲＬＰＫＶＥＱＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＫＷ　Ｉ　ＨＥ　ＰＫＧＹＨＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＲ３ＣＫＣ３の発明である。

本発明のポリペブタイドにおいて、Ａはアラニン、Ｃは
システィン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、
Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン
、■はインロイシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｍは
メチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグ
ルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニ
ン、■はバリン、Ｗはトリプトファン、Ｙは千ロジンの
各アミノ酸を示す。

本発明を完成するに至った経緯は次のとおりである。

本発明者は、まず、動物組繊細胞に由来し成熟ラット初
代培養肝細胞のｉＨｖｉｔｒｏにおける増殖を促進する
因子である生理活性ポリペブタイドを発見し、成熟肝細
胞増殖因子（Ｈｅｐａｔ６ｃｙｔｏ　　Ｇｒｏｗｔｈ　
　Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）と命名しくＢｉｏｃｈｅｍ　
　Ｂｉｏｐｈｙｓ　　Ｒｅｓ　　Ｃｏｍｍｕｎ、１２２
，１４５０．１９８４）、その構造を解明する事に成功
したくヒトＨＧＦ　：　Ｎａｔｕｒｅ、３４２，４４０
．１９８９）。

つぎに、ＨＧＦを研究する課程において、ＨＧＦと同様
ヒト血小板中に存在するある種のベグタイド群が、ＨＧ
Ｆと逆に培養肝細胞の増殖を強く抑制する作用を持つ事
を発見したが、そのひとつがＴＧＦ−βであった。

本発明者はさらに研究を重ね、ＴＧＦ−βに近い構造を
持ち、培養肝細胞の増殖を抑制する作用を有しながら、
ＴＧＦ−βとは全く異なり、トランスフォーメーション
活性、すなわちＮＨＫ−４９Ｆ細胞の軟寒天中でのコロ
ニー形成を誘導する活性を全く示さない物質が存在する
事を発見した。さらにその構造を解明し、これを蛋白質
として得る事に成功し、本発明を完成するに至った。

本発明の蛋白質は次のようにして得ることができる。

例えば、ヒト血小板由来トランスフォミング増殖因子Ｔ
ＧＦ−βに、チロシンのカルボニル側ペプチド結合を特
異的に切断する酵素、例えば、キモトリプシンまたペプ
シンを低温（約０〜２℃）下で約１週間にわたり作用さ
せることによって得ることかてきる。

また、例えば、実施例１に示した方法にしたがって、ヒ
ト血小板から抽出精製することができる。すなわち、ヒ
ト血小板を超音波粉砕したのち遠心分離し、セファクリ
ルＳ−３００，バイオケルＰ−６０、Ｓ−セファロース
の各ゲルカラムで精製した後、Ｃ４逆相シリカゲル高速
液体クロマトグラフィーにより精製品を得ることができ
る。

また、本発明の物質は、サブユニットａ、ｂ、ｃからな
り、このうちサブユニットｂおよびＣは、サブユニット
ａのポリペブタイトが６５番目と６６番目の間で切断さ
れた配列と一致する事から、サブユニットａのポリペブ
タイドをコートする塩基配列を有する遺伝子を宿主細胞
に組み込んで発現させ、夕“イマーを形成させた後、適
切な酵素を用いて切断し、得ることができる。

さらに具体的には、通常用いられる遺伝子工学的な手法
、例えば次のような手順によって各サブユニットを製造
することができる。すなわち、０人の組ｍ細胞や血液、
血漿から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成
し、大腸菌由来プラスミドｐ　ＢＲ３２２、あるいはバ
クテリオファージλｇｔ１１などの組み換えベクターに
組み込む。

■大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＮＭ５１４などの宿主細胞に
組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作成する。

■本発明のＰＤＧＩ−αのアミノ酸配列をコードする塩
基配列に基づいて合成した部分オリゴヌクレオチドを３
２ｐなどの放射性元素でラベルしたプローブを用いてコ
ロニーハイブリダイゼーション法またはプラークハイブ
リダイゼーション法など゛によって目的のｃＤＮＡを選
択する。

■マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔ
ｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ、７４，５６０．１９７７＞
などによりｃＤＮＡ配列を決定し、 ■ＰＤＧＩ−αのサブユニットａの全アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡを含有するベクターから制限酵素によ
ってｃＤＮＡを切り出し、 ■適切な発現ベクター、例えば大腸菌由来のプラスミド
ｐＢＲ３２２、あるいは腫瘍ウィルスＳＶ４０などに制
限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、■マウスＣ
１２７細胞やサルＣ０３ｉ胞に導入して発現させて得る
ことができる。

つぎに、こうして得られたａ、ｂ、ｃ、３種のサブユニ
ットを化学的、または酵素的に結合させることによって
ＰＤＧＩ−αを得ることができる。

あるいは、サブユニットａのみを化学的、または酵素的
に結合させてダイマーとした後、セリンプロテアーゼな
どの適切なエンドプロテアーゼにより一方のサブユニッ
トのＮ末端から６５番目の千ロジンと６６番目のアスパ
ラギンの間に切断を入れることによりＰＤＧＩ−αを得
ることがてきる。

（実施例）以下、本発明の実施例について述べるが、もとより本発
明がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１（１）ヒト血小板からのＰＤＧＩ−αの単離・精製。

本発明のＰＤＧＩ−αは以下の手順に従ってヒト血小板
から単離・精製した。

ヒト血小板濃厚溶液２，０００人分を３０ＱＸｇ、５分
間遠心分離し、赤血球を除去した。上清を回収し、１０
，０００Ｘｇ、１５分間遠心分離し、得られた沈澱を約
８，０００ｍ１の水冷リン酸生理食塩水（以下ｒＰＢＳ
、という）（１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ添加、ｐＨ７，４）
で２回遠心洗浄した後、約２，５００ｍ１の氷冷ＰＢＳ
　（１０ｍｌｌ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４で懸濁し、２
５，０００Ｘｇ、４０分間遠心分離した。

得られた沈澱を約５．０００ｍ１の氷冷ＰＢＳ　（１０
ｍｌｌ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）に懸濁し水冷しなが
ら超音波処理（インンネーター　モデル２００Ｍ、クボ
タ社）した。充分に粉砕した後１０５．Ｏ○０×ｇ、６
０分間遠心分離し、上清を限外ろ過膜（ミニタン　ｃｕ
ｔ　　ｏｆｆ　　１０，０００、ミリボア社）にて約１
０倍に濃縮した。ＰＢＳ　（６Ｍ　　尿素、ｐＨ７，４
＞にて２８間透析後、尿素を８ＭＧ′ニー調整し、１０
５．０００Ｘｇ、３０分間遠心分離し上清を得た。

精製は、後記（２）に記載した方法に従って細胞増殖抑
制活性を指標として行った。

上記の試料をセファクリルＳ−３００（ファルマシア社
）ゲルカラムにて精製しく第１図）、溶出された活性画
分を限外ろ過膜にて濃縮した。ＩＮ酢酸水溶液にて透析
した後、バイオゲルＰ−６０ゲルカラムにて分離精製し
た。非吸着画分を凍結乾燥した後、ＩＮ酢酸水溶液にて
再溶解し、６Ｍ尿素を含む２５ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣ
１ｇ衝液（ｐＨ８，０）にて透析した。Ｓ−セファロー
ス（ファルマシア社）ゲルカラムに試料を添加し、非吸
着成分を同緩衝液にて洗浄した後、吸着画分をＯ−１Ｍ
ＮａＣ１水溶液のリニアグラジェントにて溶出しな（第
２図）。また、非吸着成分からＴＧＦ−β１を単離精製
した。

以下本発明の実施例では、このＴＧＦ−β１をＴＧＦ−
β標品として用いた。

得られたＰＤＧＩ−α画分をダイアフローメンブレンＹ
Ｍ−１０（ｃｕｔ　　ｏｆｆ　　１０，０００、アミコ
ン社）にて濃縮後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に
てＹＭＣＣ４ＨＰＬＣカラムに流し非吸着成分を同溶媒
にて洗浄した。０−９０％アセトニトリル水溶液のリニ
アグラジェントにて溶出し、得られたＰＤＧＩ−α画分
から減圧によりアセトニトリルを除去した後、０．１％
へブタフルオロ酢酸水溶液にてＹＭＣＣ４ＨＰＬＣカラ
ム（Ｃ４逆相ゲルカラム）に流した。非吸着成分を同溶
媒にて洗浄した後、３５〜５０％アセトニトリル水溶液
のリニアグラジェントにて溶出し、３７〜３９％フラク
ションにおいて精製ＰＤＧＩ−αを得た（第３図）。

精製ＰＤＧＩ−α、および本実施例中で得たＴＧＦ−β
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し
、銀染色した結果を第４図に示す。ＰＤＧＩ−αは約２
６ｋＤ、ＴＧＦ−βは約２５ｋＤの分子量を示した。

（２）成熟ラット初代培養肝細胞に対する増殖抑制作用
。

本実施例におけるＰＤＧＩ−α細胞増殖抑制作用は、以
下の手法により成熟ラット初代培養肝実質細胞を用いて
測定した。

ウィスター系ラットからコラーゲン還流法により肝実質
細胞を分離精製した。得られた肝実質細胞を５％の仔ウ
シ血清を釜むウィリアムスＥ培地（フローラボラトリー
社）に２．５×４０５個／　ｍｌの濃度で懸濁し、２４
ウェルマルチブレートに０．５ｍｌ／ウェルづつ播いた
。５％Ｃ○２．３０％０２．６５％Ｎ２の条件下、３７
℃で２０時間培養後、１×１０−７Ｍインスリン（シグ
マ社）　、１０ｎｇ／ｍ１ＥＧＦ（組換えヒトＥＧＦ、
アース化学社）を含む無血清ウィリアムスＥ培地に交換
すると共に、２．５■／ｍ１のウシ血清アルブミンを含
むリン酸食塩緩衝液に所定量のサンプルを溶解した溶液
５０μｍを添加した。

１２時間培養後１　、２５μｃ　ｉ　／ｍｌの［３Ｈ］
デオキシチミジンを１０μｌ／ウェル加え、コントール
群には［３Ｈ］デオキシチミジン添加１５分前に５μｇ
／　ｍｌのアフィディコリンを添加した。さらに２４時
間培養してトリチウムラベルした後、細胞をＰＨ７゜４
のリン酸食塩緩衝液で２回洗浄し、冷１０％トリクロロ
酢酸水溶液で固定した。細胞を１ウエル当たり０．５ｍ
ｌのＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その放射
能をガンマカウンターにより測定した。

また放射能測定後の試料を一部をとってローリ−法に従
い蛋白質量を測定した。被検試料を添加したとき肝実質
細胞に取り込まれたトリチウムの量をコントロールとの
カウントの差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白
質１■当たりに換算して、ＤＮＡ合成活性（ｃｐｍ／■
蛋白質）とした。

実施例２　　ＰＤＧＩ−αのＮ末端アミノ酸配列の決定
。

実施例１で得られた精製ＰＤＧＩ−α、およびＴＧＦ−
β（実施例１のＰＤＧＩ−α精製過程において得られた
）を２−メルカプトエタノール水溶液に溶解し、加熱処
理によって還元した後５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にて分離した。その結果、第５図に示す如＜Ｔ
ＧＦ−βは約１３ｋＤの単一のバンドを示すのに対して
、ＰＤＧＩ−αは約１３ｋＤ、約８ｋＤ、約５ｋＤの３
本のバンドを示した。これによりＴＧＦ−βが同じ分子
量を持つ２個のサブユニットからなるのに対して、ＰＤ
ＧＩ−αが異なる分子量を持つ３個のサブユニットから
なることが明らかとなった。以下各サブユニットをａ（
約１３ｋＤ＞、ｂ（約８ｋＤ＞、Ｃ（約５ｋＤ＞と呼ぶ
。ＰＤＧＩ−αを分離したケルから各ハントに相当する
部分を切り出し、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）にて抽出し、
ペプチドシークエンサ−（４７７、Ａ型、アブライトバ
イオシステムズ社）を用いてＮ末端アミノ酸配列を決定
した。その結果、ａ　：　ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、
ｂ　：　ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、ｃ　：　ＮＱＨＮ
ＰＧＡＳＡＡＰＣであった。

実施例３　　ＰＤＧＩ−αの全アミノ酸配列を次のよう
にして決定した。

実施例１で得られた精製ＰＤＧＩ−αを、２−メルカプ
トエタノール水溶液に溶解し加熱処理によってシスティ
ン結合を還元した後、各サブユニットペプチド鎖の極性
を下げるため塩化メタンスルフォニルによりＮ末端をメ
チルスルホン化した。Ｑ　、　　１９，１゜トリフルオ
ロ酢酸水溶液にてＹＭＣＣ４ＨＰＬＣカラムに流し、０
−５０％アセトニトリル水溶液のリニアグラジェントに
て３サブユニツトを分離した。

得られた各サブユニットをそれぞれキモトリプシン処理
し、再度ＨＰＬＣにて分離し、得られた１０〜３０アミ
ノ酸残基のペプチド鎖断片をペプチドシークエンサーを
用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。

その結果、３サブユニツトのアミノ酸配列を次の通り決
定した。

ａ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳ　　ＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹ
ＩＤＦＲＫＤＬＧＷ　　ＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣ
ＬＧＰＣＰＹ　　ＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱ
ＨＮＰ　　ＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹ
　　ＹＶＧＲＬＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲ８’ＣＫ　　
Ｃ３ｂ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳ　　ＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹ
ＩＤＦＲＫＤＬＧＷ　　ＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣ
ＬＧＰＣＰＹ　　ＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＬＡＬＹｃ、ＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡ　　ＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬ
ＰＩＶＹＹＶＧＲＬ　　ＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲ３Ｃ
ＫＣ８実施例４　　ＰＤＧＩ−αのラット肝細胞に対する増殖
抑制作用およびＮＲＫ−４９Ｆ細胞軟寒天中でのコロニ
ー形成に対する促進作用に関して、ＴＧＦ−βとの比較
を行った。

実施例１で得られた精製品を用いて、本発明のＰＤＧＩ
−αの作用効果をＴＧＦ−βと比較した。

細胞増殖抑制活性は、実施例１（２）記載の方法に従っ
て成熟ラット初代培養肝実質細胞に対する増殖抑制作用
により確認した。

トランスフォーメーション活性は以下の方法に従い、Ｎ
ＲＫ−４９Ｆ細胞の軟寒天中でのコロニー形成に対する
促進作用の有無により確認した。

ＮＲＫ−４９ＦＭ胞は１０％のウシ胎児血清を含むダル
ベツコのイーグル培地（フローラボラトリー社、米国：
以下ＤＭＥとする〉で前培養しトリプシン処理した後、
遠心により細胞を集めた。１０％のウシ胎児血清を含む
ＤＭＥＯ１３％寒天培地を４０℃に保ち、ＮＲＫ細胞を
３，０００個／　ｍｌの濃度となるよう添加し懸濁した
後、上皮細胞成長因子ＥＧＦ（マウス顎下腺由来＞２ｎ
ｇ／ｌｎｌ相当にＰＤＧ　ＩαとＴＧＦ−βを各々所定
量ＰＢＳに溶解したものを添加した。３５ｎｔｍ径のシ
ャーレに、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥｏ、６％寒
天培地を２ｍｌずつ播き、冷却固化後ＮＨＫ細胞を懸濁
した０、３％寒天培地を１ｍｌづつ播いた。室温にて固
化させた後、１０％Ｃ○　、　’）　５９６０２．６５
％Ｎ２の条件下３７°Ｃて１０日間培養した。培養終了
後、１０％フォルマリンを含むＰＢＳを添加して固定し
、顕微鏡観察により直径５０μｍ以上のコロニー数をカ
ウントした。

結果を第６図に示す。肝細胞に対する増殖抑制作用は両
者とも用量依存的に作用し、はとんど差を認めない。他
方、ＮＲＫ細胞のコロニー形成については両者に大きな
違いが認められる。すなわち、ＴＧＦ−βは明らかにコ
ロニー形成の促進作用を有し、その用量依存性は肝細胞
増殖抑制作用の増大に一致しているのに対して、ＰＤＧ
Ｉ−αはコロニー形成を促進せず、肝細胞増殖抑制がピ
ークに達する濃度の２倍量の添加によってもコロニー形
成は誘導されなかった。

これにより、本発明のＰＤＧＩ−αは肝細胞に対する増
殖抑制作用に関してはＴＧＦ−βと同じ作用効果を有す
るが、トランスフォーメーション活性を有さないことが
明らかとなった。

また、本実施例におけるＮＲＫ−４９Ｆ細胞の実験終了
時のコロニー形成状態について、顕微鏡観察した結果を
第７図に示す。

実施例５　上皮系細胞に対する本発明のＰＤＧ　Ｉαの
増殖抑制効果についてＴＧＦ−βとの比較を行った。

本発明のＰＤＧＩ−αの細胞増殖抑制効果を、株化され
た上皮系細胞であるＡ４３１とＢＲＬ−３Ａについて検
討した。Ａ４３１細胞、Ｂ　ＲＬ　−３Ａ細胞はガン研
究振興財団のｃｅ　１１　　ｂａｎｋ　（ＪＣＲＢ）よ
り入手した。各細胞を１０％のウシ胎児血清を含むＤＭ
Ｅ培地で前培養し、遠心により細胞を集めた。各細胞を
同培地で１．０ＸＩＯ’個／ｍｌに懸濁し、０．５ｍｌ
ずつウェルに播いた。２４時間培養後、所定量のＰＤＧ
Ｉ−αおよびＴＧＦ−βを添加した同培地に移した。２
０時間培養後、０．５μＣｉの［１２５Ｉ］デオキシウ
リジンを各ウェルに添加した。さらに４時間培養して細
胞に［１２５Ｉ］を取り込ませた後、細胞をｐＨ７，４
のＰＢＳで２回洗浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液
で固定し、１ウエル当たり０．５ｍｌのＩＮ水酸化ナト
リウム水溶液で細胞を可溶化し、その放射能をカンマカ
ウンターにより測定した。結果は１ウエル当たりのカウ
ント（ｃ　ｐｍ／ｗｅ　ｌ　１　）で表示した。

その結果、第８図に示す如＜Ａ４３１細胞（第８図−ａ
）に対する増殖抑制作用は、ＰＤＧＩ−αとＴＧＦ−β
との間に全く差を認めず、ＢＲＬ−３Ａ細胞（第８図−
ｂ）についても作用濃度にやや差はあるが、同様の増殖
抑制作用を示した。

（発明の効果）本発明のＰＤＧＩ−αは、ＴＧＦ−βと同じように肝細
胞の増殖を抑制する作用効果を有する。他方、ＴＧＦ−
βとは異なって、ガン化活性（トランスフォーメーショ
ン活性）をもたないという重要な作用効果を有する。

このため、細胞ガン化の副作用を有しない安全な細胞増
殖抑制効果として、湿疹治療剤、骨粗しよう療治療剤、
免疫制御薬剤等への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はセファクリルＳ−３００ゲルカラム精製におけ
る、蛋白質の溶出パターン。実施例１（１）。連続する実線は４９２ｒｖｎにおける吸光度を示し、他
方、・はＤＮＡ合成量を表し、折線で結んだ。第２図はＳ−セファロース精製における、蛋白質の溶出
パターン。実施例１（１）。連続する実線は４９２ｒｔ
ＩＴｌにおける吸光度を示し、他方、・はＤＮＡ合成量
を表し、折線で結んだ。破線は溶出溶媒のＮａＣ１濃度
を表す。第３図はＣ４逆相ゲルカラム精製における、蛋白質の溶
出パターン。実施例１（１）。実線は４９２訓における
吸光度、破線は、溶出溶媒のアセトニトリル濃度を表す
。第４図は非還元条件下における、本発明のＰＤＧ　Ｉ−
αとＴＧＦ−βの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動のパターン。実施例１（１）。第５図は還元条件下における、本発明のＰＤＧ　Ｉ　−
αとＴＧＦ−βの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動のパターン。実施例２゜第６図は本発明のＰＤＧＩ−αとＴＧＦ−βの、肝細胞
に対する増殖抑制作用（・実線）とＮＲＫ−４９Ｆ；ｌ
ｆｆ１胞の軟寒天中におけるコロニー形成誘導作用（○
破線）を表す。実施例４゜本発明のＰＤＧ　Ｉαは肝細
胞に対する増殖抑制作用を有するが、ＮＲＫ−４９Ｆ細
胞の軟寒天中におけるコロニー形成誘導作用を示さない
。第７図は本発明のＰＤＧＩ−αとＴＧＦ−βの、ＮＲＫ
−４９Ｆ細胞の軟寒天中におけるコロニー形成誘導作用
を顕微鏡観察した写真。実施例４゜（１）はコントロー
ルとしてＥＧＦ　（上皮細胞成長因子）２　ｐｇ　／　
ｍｌを添加し、（２）はＥＧＦ　　２ｎｇ／ｍｌととも
にＴＧＦ−β１　２ｎｇ／ｍｌを添加した。（３）はＥ
ＧＦ　　２ｎｇ／ｍｌとともに本発明のＰＤＧ　Ｉ−β
３　ｎｇ　／　ｔｎｌを添加した。（２）では直径５０
μｍ以上のコロニーが形成されたが、（３）では形成さ
れなかった。第８図は本発明のＰＤＧＩ−αとＴＧＦ−βの、Ａ４３
１細胞（第８図−ａ〉とＢＲＬ−３Ａ細胞（第８図−ｂ
）に対する増殖抑制作用を表す。実施例５゜ＰＤＧＩ−
α（・実線）、ＴＧＦ−β（○破線）とも増殖抑制作用
を示す。コントロールとして、ｌ○％牛脂児血清のみ添
加〈△）したものは増殖を抑制せず、他方１０２６牛脂
児血清無添加（ム）のものは増殖を示さなかった。

Claims

【特許請求の範囲】［１］下記物性を有するヒト血小板由来細胞増殖制御物
質ＰＤＧＩ−α。記（１）１Ｎ酢酸水溶液においてバイオゲルＰ６０に吸着
せず、ｐＨ８条件下でＳ−セファロースに吸着する。（２）１００℃、３分間処理によって約５０％失活し、
０．０６５Ｍジチオスレイトールによって１００％失活
するが、１Ｎ酢酸には安定である。（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量の測定において、非還元条件下で約２６ｋＤの単
一バンドを、還元条件下で約１３ｋＤ、約８ｋＤ、約５
ｋＤの３本のバンドを示す。（４）Ｃ４逆相ゲルカラムにおいて、３５〜５０％アセ
トニトリル水溶液傾斜溶出法でほぼ３７〜３９％フラク
ションに溶出する。（５）ラット肝細胞を含む正常動物上皮系組織細胞の増
殖を抑制し、正常線維芽細胞の増殖を促進するが、しか
し軟寒天中においてＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニー形成
を促進する活性を示さない。［２］下記Ｎ末端アミノ酸配列を有し、かつ、還元条件
下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分
子量が下記である３個のサブユニットからなるヒト血小
板由来細胞増殖制御物質ＰＤＧＩ−α。記ａ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、約１３ｋＤｂ、ＡＬＤ
ＴＮＹＣＦＳＳＴＥ、約８ｋＤｃ、ＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣ、約５ｋＤ［３］下記アミノ酸配列を有する３個のサブユニットか
らなり、Ｓ−Ｓ結合してなるヒト血小板由来細胞増殖制
御物質ＰＤＧＩ−α。記ａ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤ
ＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣ
ＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳ
ＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＬＰＫＶ
ＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳｂ、ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤ
ＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣ
ＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹｃ、ＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩ
ＶＹＹＶＧＲＬＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ