CN1100036C - 尿激酶原和尿激酶亲和配位体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类新的可作为尿激酶原和尿激酶亲和配位体的化合物，该化合物的制备方法，以及这类新亲和配位体在纯化生产尿激酶原和尿激酶(尤其是人尿激酶原和尿激酶)的应用。本发明还提供了新的用于纯化尿激酶原和/或尿激酶的亲和介质和方法。本发明可高效率、低成本的大规模生产人尿激酶原和尿激酶，尤其是高纯度的医用级产品。
Description
本发明涉及生物技术和生物医药领域，更具体地，本发明涉及一类新的尿激酶原和尿激酶的亲和配位体，其制备方法，以及这类新亲和配位体在纯化生产尿激酶原和尿激酶(尤其是人尿激酶原和尿激酶)的应用。本发明还涉及新的纯化尿激酶原和尿激酶的方法。这类新化合物还可用作抑制肿瘤的药物。
目前溶血栓类药物的世界市场是5亿美元，而且随着世界人口老龄化的进一步发展，对这类药物的需求量必然随着增加。尿激酶原是比尿激酶效果更好、副作用更小的溶血栓药物。世界上许多国家如日、美、德、法、意等一百多家公司和科研单位投入几亿美元研究其表达纯化方法。仅表达系统方面的研究就产生了54条专利(Wagner et.al.，Biotechnol.Bioeng.，1992，39(3)，320-326)。
我国北京大学生命科学学院，北京生物技术研究所，南京大学等单位也都成功地在不同的表达系统中表达了尿激酶原(Pro-UK)(Gao，Y.& Hu，M.，Biotechnol.Tech.，1994，8(3)，179-182.Hua et.al.，Biochem.Mol.Biol.Intl.1994，33(6)，1215-1220)。然而，到目前为止国内外都还没有找到简单经济的规模纯化分离手段。
现有的纯化技术不能经济高效地生产医疗用尿激酶，尤其是尿激酶原。锌离子螯合亲和层析，SP-Shephadex G-50阳离子交换层析和Shephadex G-100分子筛层析是几十年前发展的实验室规模纯化技术。在实际生产中，这种方法步骤多，每步之间需要对样品进行特殊处理。整个纯化过程操作复杂，回收率低。对比较稀释的样品，需要预先浓缩等。在市场激烈竞争的今天很难用于实际生产。固定化的抗体免疫亲和层析柱和肌蛋白(fibrin)亲和层析柱的纯化效果和回收率都有很大改进(Husain et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1981)，78(7)，4265-4269；Stump et.al.，J.Biol.Chem.，261(3)，1267-1270)。但是，由于抗体和肌蛋白(fibrin)在生产中不仅价值昂贵，易于变性失活，被化学和生物降解，也不能经受医疗用生物制品生产过程中必要的在线灭菌和在线清洁处理，而且其降解产物易于污染被纯化的产品，很难适应生产需要。把层析的基本介质改用微孔玻璃也没有从根本上改善生产工艺(叶建新等，军事医学科学院院刊，1987，11(2)：101)。尿激酶的纯化可用固定化的对氨基苯脒作为亲和层析的配基。但是由于这种亲和配基对胰蛋白酶一大类的酶之间没有辨别能力，在用于生产药用尿激酶和尿激酶原时可能有被其他胰蛋白酶类酶污染，存在潜在的危险。
肿瘤细胞能够分泌尿激酶原(Stephens et.al.，Cell Regul 1991，2(12)：1057-1065)。在肿瘤细胞扩散到新位置侵入基底膜之前，尿激酶原被激活，级次激活蛋白水解酶，降解细胞外基质，为肿瘤细胞的入侵准备条件(Kobayashi et.al.，Biochim Biophys Acta 1993 1178(1)：55-62)。因此，专一抑制尿激酶和尿激酶原的活性，有可能阻止蛋白水解酶群，从而消除肿瘤细胞侵入基底膜的条件，阻止和延缓肿瘤的扩散。为了能够抑制肿瘤细胞利用尿激酶或尿激酶原，本领域迫切需要开发与尿激酶原和尿激酶有强亲和力的抑制剂。
因此，本领域迫切需要开发与尿激酶原和尿激酶有强亲和力的物质，以便用作尿激酶原和尿激酶的抑制剂来抑制肿瘤，和/或用作亲和层析配位体来高效率、低成本的大规模生产尿激酶原和尿激酶。
本发明的一个目的是提供一类新的化合物，这类化合物与尿激酶原和尿激酶有强亲和力，因而可作为尿激酶原和尿激酶的亲和配位体用于尿激酶原和尿激酶的亲和纯化，和/或作为尿激酶原和尿激酶的抑制剂而用于抑制肿瘤。
本发明的另一目的是提供这类化合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供固定有该化合物的亲和介质。
本发明的另一目的是提供固定有该化合物的药物组合物。
本发明的另一目的是提供一种低成本、高效率的大规模生产尿激酶原和尿激酶的亲和技术工艺。
在本发明的第一方面，提供了一种下式(I)化合物，
式中，R1选自：氨基、单取代氨基、双取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；
R2和R3各自独立地选自：羧基、磺酸基、磷酸基；
R4选自：H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素；
Y选自：碳原子和氮原子；
Z选自：碳原子和氮原子；
Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自独立地选自：碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；
Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z组成的线状或/和分支状或/和环状饱和/或/和不饱和分子骨架使R1和R2相距13±3埃，R2和R3相距8±3埃，R1和R3相距13±3埃。
较佳地，式中，R4选自：卤原子、氨基。
在本发明的另一方面，提供了上述化合物的用途，它们被用作尿激酶原和尿激酶的亲和配位体而用于尿激酶原和尿激酶的亲和纯化。
在本发明的另一方面，提供了一种分离纯化尿激酶原和尿激酶的方法，在该方法中包括用亲和分离尿激酶原和尿激酶的步骤，而且在该亲和分离步骤中，使用本发明的上述的化合物作为尿激酶原和尿激酶亲和配位体。
较佳地，在该亲和分离步骤中，亲和介质吸附尿激酶原和尿激酶的条件为：用约pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠(25mM)平衡柱子、上样并用洗脱至基线；用约pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠+0.2M NaCl洗出尿激酶原。
更佳地，在亲和分离步骤之后，还可包括进一步的本领域常规的精制步骤。
在本发明的另一方面，提供了一种新的可用于分离纯化尿激酶原和尿激酶的亲和介质，该介质包括固相载体和偶联于固相载体上的本发明的亲和配位体。
在本发明的另一方面，还提供了上述化合物的另一用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物。并因此还提供了一种药物组合物，该组合物包括安全有效量的上述本发明化合物和药学上可接受的载体。
本发明人经过多年对尿激酶原和尿激酶的研究，在尿激酶原催化功能域空间结构中发现如下特点：酶的活性是由his57，asp102，ser195三个氨基酸残基的侧链实现的。其中asp102都是酸性基团，而且位于酶活性口袋的底部。这个特征是尿激酶识别其碱性氨基酸酶切位点的基础。在底物结合区的边缘，有两个碱性基团，精氨酸(arg35)侧链眯基和赖氨酸(lys143)的侧链氨基。天冬氨酸(asp102)的侧链羧基和精氨酸(arg35)侧链眯基相距为16.66埃；天冬氨酸(asp102)的侧链羧基和赖氨酸(lys143)的侧链氨基相距为17.15埃；精氨酸(arg35)侧链眯基和赖氨酸(lys143)的侧链氨基相距16.51埃。
推断尿激酶原中催化部分的分子结构，确定其活性部位并分析其结构特征。针对其结构特征，设计出对尿激酶催化结构域具有亲和作用的式(I)化合物有机化合物(亲和配位体)：
式中，R1选自：氨基、单取代氨基、双取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；
R2和R3各自独立地选自：羧基、磺酸基、磷酸基；
R4选自：H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素；
Y选自：碳原子和氮原子；
Z选自：碳原子和氮原子；
Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自独立地选自：碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；
Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z组成的线状或/和分支状或/和环状饱和/或/和不饱和分子骨架使R1和R2相距13±3埃()，R2和R3相距8±3埃()，R1和R3相距13±3埃()。
在Brookhaven蛋白数据库中，尿激酶原的空间结构的数据文件有1KDU、1LMW和1URK。经过计算机辅助分子模拟尿激酶原催化功能域的结构特征，并根据分子识别的原理而设计出本发明亲和配位体由分子骨架和若干个功能基团组成。其中，功能基团的作用是和尿激酶原催化功能域附近的特征氨基酸残基侧链发生亲和作用。分子骨架则是将各功能基团固定于合适的空间位置，以使功能基团发挥最佳和特异亲和作用。
根据尿激酶原催化功能域活性部位附近His57，Asp102，Ser195三个氨基酸残基的性质及空间分布的结构特征，所设计的亲和配位体的结构特征如式I所示。
在通式(I)其中，R1、R2、和R3是与尿激酶原催化功能域相互作用，从而产生亲和力的功能基团。其中，R1可以是任何碱性基团，如氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取得氨基，四取代氨基，眯基等；R2，R3可以是任何的酸性基团，如羧基，磺酸基，磷酸基等。
在通式(I)中，当本发明化合物被用于亲和配位体(例如通过固定在固相载体上而形成亲和层析基质)时，R4是连接基团或分子。本领域已知的各种连接基团或连接分子都可用作本发明的R4基团。合适的例子包括(但并不限于)：H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素。较佳地，R4基团选自：卤原子、氨基、羟基或羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、纤维素。较佳地，当R4连接于分子骨架时，不影响R1、R2、R3和尿激酶原的相互作用。
在通式(I)中，当本发明化合物被用作抑制尿激酶原和尿激酶的抑制剂(例如用于抑制肿瘤扩散时)，R4可以是H或卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基。
在通式(I)中，Xn1、Xn2、Xn3、Xn4和Y、Z构成了连接R1、R2、和R3或R1、R2、R3和R4的分子骨架。
Y选自：碳原子和氮原子；
Z选自：碳原子和氮原子；
Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自独立地选自：碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；
Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z组成的线状或/和分支状或/和环状饱和/或/和不饱和分子骨架使(1)R1、和R2相距13±3埃；(2)R′2，R3相距8±3埃；(3)R1和R3相距13±3埃。优选的分子骨架是式(II)、(III)、(IV)、(V)化合物中的分子骨架。
本发明的一些具体的优选化合物如下：
具有式(II)所示结构的化合物PU07：
R1是脒基，R2和R3是羧基，R4是氨基；
具有式(III)所示结构的化合物PU08：
R1是二甲胺基，R2是羧基，R3是磺酸基，R4是氨基；
具有式(IV)所示结构的化合物PU09：R1是三甲胺基，R2和R3是羧基，R4是氯；
具有式(V)所示结构的化合物PU10：
R1是脒基，R2和R3是羧基，R4是氨基。
本发明的化合物可作为分离人或动物的尿激酶原和尿激酶的亲和配位体，因而具有极大的应用价值，例如用于亲和层析。
亲和层析，又称为生物选择性吸附层析，已经成为纯化生物大分子活性物质不可缺少的分离技术。随着对生物制品中活性成分的纯度和需求量的增加，杂质含量的降低，传统分离技术如凝胶过滤和离子交换层析技术再也不能满足工业生产和学术研究的要求。
与其它方法相比，亲和层析方法具有以下几个明显的特点。亲和层析介质允许对生物分子选择地吸附和解离，可以取得很高的纯化倍数，常常为1000多倍。此外，蛋白在纯化过程中不仅得到浓缩，当结合到亲和配位体上时，蛋白的性质也更加稳定；其结果又提高了目标产品的活性回收率。因此，亲和分离技术非常适用于处理体积大，浓度低的生物活性物质。
在大规模生产的纯化工艺中，采用亲和层析技术可以大大减少纯化过程的步骤，从而减少了合格产品的生产时间和成本。当下游生产成本占总生产成本的80％时显得更加重要。在纯化过程的任何环节都可以使用亲和层析技术，但采用的越早，获得的经济效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology，4，954-958，1986)对生物制品生产工艺调查的结果显示，在所有被考察的工艺中，一步纯化效果最佳的单元操作中，有45％是利用亲和步骤获得的。
亲和分离介质的关键是亲和配位体(也可称为“亲和配基”)。亲和配位体必须能够选择性地和可逆地吸附生物大分子。传统的亲和配位体为亲和介质的成功使用奠定的基础。然而，在工业生产中，天然的亲和配位体，如抗体、辅酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺点：最突出的因素是成本昂贵，生物和化学性质不稳定，生产中难于维持结合活性，也不能经受在线清洁和消毒，因此，还可能被其它物质，如病毒和内毒素污染。针对根据尿激酶原和尿激酶的结构和性质，本发明人专门设计和合成了一系列化合物；这些化合物固定于层析介质上后，不仅能够提供高效的纯化倍数、重复性的结果，而且配基极少脱落。更适合工业化、大规模生产医用和试剂用尿激酶原和尿激酶。
如本文所用，烷基通常含有约1-8个碳原子，较佳地1-6个碳原子，更佳地1-4个碳原子，它可以是直链、支链或环状的饱和脂族烃基。合适的烷基例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。合适的环状脂族基团例子通常含有3-8个碳原子，而且包括环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基和苯基。
在制备本发明化合物时，可用常规的有机合成方法，依次将R1、R2和R3连接于X1、X2、X3、X4、X5所构成的骨架。可选用的方法包括(但并不限于)：亲核取代反应、缩合反应等。
本发明的新的式(I)化合物，因为与尿激酶原和尿激酶具有极高的亲和力，因此非常适合作为尿激酶原和尿激酶的亲和配位体，用于尿激酶原和尿激酶的亲和纯化。此外，本发明的亲和配位体很稳定，可以耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒，可以方便地满足GMP(Good Manufacturing Practice)标准。
本发明还提供了一种新的分离纯化尿激酶原和尿激酶的方法，其中用式(I)化合物作为亲和配位体进行亲和纯化。各种常规的亲和纯化技术都可用于本发明，不同点仅在于用本发明的式(I)化合物作为亲和配位体。
本发明还提供了一种新的可用于分离纯化尿激酶原和尿激酶的亲和介质，该介质包括固相载体和偶联于固相载体上的本发明的亲和配位体。在制备本发明亲和介质时，可以将用常规方法本发明的式(I)化合物偶联于常规的合适载体上，从而形成亲和介质。合适的固相载体的例子包括(但并不限于)：琼脂糖珠，硅胶珠，人工合成的聚合物珠等。
可用本发明纯化方法提纯的原料包括(但并不限于)：尿液、基因工程菌或细胞和动物生物反应器表达的人尿激酶原和尿激酶的发酵液或细胞培养液。
这种亲和技术工艺，由于利用尿激酶原和尿激酶和亲和配位体之间的高亲和力，因此经一步亲和纯化处理就可获得高纯度的产品，可以在大规模生产和实验室中经济高效地制备高纯度的人尿激酶原和尿激酶，降低生产成本，提高产品质量。
本发明化合物的另一主要用途是用作尿激酶原和尿激酶的抑制剂。因此，本发明还涉及一种药物组合物，该组合物包括安全有效量的上述本发明的化合物和药学上可接受的载体。
这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油、缓释剂以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内、口服的给药途径。尿激酶原和尿激酶以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的尿激酶原和尿激酶的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。通常，剂量为0.0001-10mg/千克体重，较佳地为0.001-5毫克/千克体重，更佳地为0.01-1毫克/千克体重。
在附图中，图1是式(II)化合物的制备流程图以及尿激酶原和尿激酶亲和介质(偶联有式(II)化合物的琼脂糖)的制备流程图。
下面结合实施例进一步详细地阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
式(II)化合物的制备
在该化合物中，R1是脒基，R2，R3是羧基，R4是氨基；在某一构象下，R1、和R2相距9.08埃；(2)R2，R3相距5.09埃；(3)R1和R3相距12.12埃；R4为氨基。
该化合物是用图1所示的方法合成的：将叔丁氧羰基(Boc)保护的天冬氨酸(2.33g，10.0mmol)溶于过量乙酐(20ml)中。室温搅拌1小时后利用旋转蒸发仪除去未反应的乙酐，得化合物1。化合物1溶于无水丙酮中，然后在搅拌下滴加对氨基苯脒(1.37g，10.1mmol)的碳酸氢钠溶液(0.5M，100ml)中，除去丙酮和水，再在90℃条件下，加水使固体物质刚好溶解，然后4℃放置过夜，结晶出来的产物-化合物2。将化合物2再与对硝基苯酚在甲碘化1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide methiodide)作用下生成化合物3。化合物3经过结晶纯化后与5-氨基间苯二酸(5-aminoisophthalic acid)(12mmol)在碳酸钠溶液(0.5M，30ml)中反应生成化合物4。然后经过三氟乙酸脱去保护氨基的BOC保护基团，得到式(II)化合物(即化合物PU07)。式(II)化合物再与环氧氯丙烷活化的琼脂糖层析介质在pH10反应得到亲和介质U07。
实施例2
式(II)化合物的亲和层析介质的制备和尿激酶原和尿激酶的亲和层析
制备亲和介质U07
将实施例1式(II)化合物溶解于50ml Na2CO3(0.5M，pH11.0)，加入到盛环氧基Sepharose 6B(100ml)的可密封瓶中，60℃摇振过夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Sepharose 6B经0.5 M醋酸(100ml)，0.1M NaOH(100ml)和蒸馏水(100ml×5)分别洗涤后，得到亲和层析介质，命名为U07，加入用20％乙醇储存待用。
亲和纯化尿激酶原和尿激酶
用pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠(25mM)平衡装有如上制得的亲和介质U07的层析柱。将尿中沉淀的尿激酶粗品，用平衡缓冲液溶解后，上样于该层析柱。用pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠(25mM)洗涤至基线(280nm紫外检测)，然后用pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠+0.2M NaCl从亲和层析柱上洗脱尿激酶。
结果表明，尿激酶一步纯化的回收率为95％，纯化倍数(Purification Factor)为20，清洁倍数(Clearance Factor)可达到30。
实施例3
式(IV)化合物的制备
该化合物是用如下方法合成的：将5-氨基-1，3-苯二甲酸(1.90g，21.00mmol，1.05eq)溶于碳酸氢钠溶液(0.5M，10ml)在搅拌下滴加入三氯三氮嗪(3.68g，20.0mmol，1eq)的丙酮冰水(1∶1)悬浮液。碳酸氢钠溶液(0.5M)用于保持反应体系的pH在6到7之间。反应进行大约两小时后，用TLC(硅胶，溶剂：甲醇/乙酸，95/5)和Ehrlich’s试剂检测不出芳香胺时，用旋转蒸发器除去丙酮。再用乙酸酸化水相，沉淀析出得到白色粉末，过滤，干燥得到中间产物I，4.3g(产率84％)。
用元素分析法测得：C，39.87；H，1.90；N，16.50％；
C11H6N4O4Cl2的理论值：C，40.14；H，1.84；N，17.03％
将对氨基苯甲脒盐酸盐(2.09g，20mmol，1eq)溶解于碳酸氢钠溶液(0.5M，10ml)与中间产物I(3.24g，20mmol，1eq)在NaHCO3(0.5M，15ml)中于pH6到7混合，并用NaHCO3(0.5M)维持pH在6-7，保温过夜。当用TLC(硅胶，溶剂：甲醇/乙酸，5/95)和Ehrlich’s试剂查不到芳香胺时停止反应，旋转蒸发浓缩后，用醋酸调节pH到6.5，析出灰色沉淀，得到式(IV)化合物(即化合物PU09)(5.0g，75％)。
用元素分析法测得：C，50.12；H，3.35；N，22.86％
C18H14N7O4Cl理论值：C，50.53；H，3.30；N：22.92％)
实施例4
式(IV)化合物的亲和层析介质的制备和亲和纯化尿激酶原和尿激酶
制备亲和介质U09
化合物PU09(200mg)溶解于NaHCO3(0.5M，10ml)中，与10ml氨基Sepharose混合，置于密封的容器中。在90℃振荡过夜。然后取出反应器中Sepharose经0.5M醋酸(50ml)和蒸馏水(100ml×5)分别洗涤后，制得亲和介质U09，加入用20％乙醇储存待用。
亲和纯化尿激酶原和尿激酶
大肠杆菌培养得到的尿激酶原包涵体，称取0.23g尿激酶原包涵体。溶解在17ml变性液(6M盐酸胍，10mM Tris，50mM ME pH8.5)中，4℃度震摇过夜。离心除去不溶物，将上清缓慢滴入剧烈搅拌的400ml复性液(2.5M urea，10mM Tris，50mM EDTA，pH8.8)中，4度搅拌24h。将复性液的pH调至4.5，离心后取上清。然后用亲和介质U09吸附后，再用平衡缓冲液洗柱至280nm紫外检测到基线后，用洗脱缓冲液从亲和层析柱上洗脱尿激酶原。尿激酶原一步纯化的回收率为80％，纯化倍数(Purification Factor)为15，清洁倍数(Clearance Factor)可达到26。
实施例5
对尿激酶活性的抑制作用
将化合物PU09(分子量为427.81)，称取0.0086g溶于1mL的缓冲液A(50mMTris pH7.8 10mMNaCl 0.5mMEDTA)。从中取出100ul，用缓冲液A稀释至1mL，依次稀释，得到浓度分别为20mM，2mM，200μM，20μM，2μM的系列的溶液。加入到气泡上升法测尿激酶活力的测活系统中，测定对尿激酶活力的抑制。根据实验所得出的抑制曲线发现，在10μM的浓度下，PU09已经能够显著抑制尿激酶的活力。
实施例6
药物组合物的制备
局部注射和/或肌肉注射液的具体成分和含量：
口服制剂的具体成分和含量：
这里，药学惰性物质指片剂、胶囊、口服水剂，包埋剂制备中用到的淀粉、缓释剂、粘结剂，载体等不影响化合物PU09生物活性的物质。
| 成分 | 含量 |
| 化合物PU09 | 20mg |
| 水 | 1ml |
| 总计 | 100％ |
| 成分 | 含量 |
| 化合物PU09 | 40mg |
| 药学惰性物质 | 260mg |
| 总计 | 100％ |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种式(I)化合物，其特征在于，
式中，R1选自：氨基、单取代氨基、双取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；
R2和R3各自独立地选自：羧基、磺酸基、磷酸基；
R4选自：H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素；
Y选自：碳原子和氮原子；
Z选自：碳原子和氮原子；
Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自独立地选自：碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；
Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z组成的线状或/和分支状或/和环状饱和或/和不饱和分子骨架使R1和R2相距13±3埃，R2和R3相距8±3埃，R1和R3相距13±3埃。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，式中，R4选自：卤原子、氨基。
3.按权利要求1所述的化合物，其特征在于，该化合物选自下组：
具有式(II)所示结构的化合物：具有式(IV)所示结构的化合物：
4.一种药物组合物，其特征在于，它包括安全有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
5.一种权利要求1所述化合物的用途，其特征在于，它被用于尿激酶原和尿激酶的亲和纯化。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该化合物是具有式(II)或(IV)所示结构的化合物。
7.一种分离纯化尿激酶原和/或尿激酶的方法，在该方法中包括用亲和分离尿激酶原和尿激酶的步骤，其特征在于，在该亲和分离步骤中，使用权利要求1所述的化合物作为尿激酶原和尿激酶亲和配位体。
8.按权利要求7所述的方法，其特征在于，该尿激酶原和尿激酶是人的。
9.一种用于亲和纯化层析介质，其特征在于，它包括固相载体和偶联于固相载体上的权利要求1所述的化合物。
10.一种权利要求1所述化合物的用途，其特征在于，它们被用于制备治疗肿瘤的药物。
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