CN104045707B - 一种替度鲁肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药工艺领域,公开了一种替度鲁肽的纯化方法。该方法将替度鲁肽粗品用乙腈醋酸混合水溶液溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为10%‑30%,再用RP‑HPLC进行梯度洗脱,分离出纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%‑95%的替度鲁肽流份再次进行洗脱,混合在95%以上的替度鲁肽流份调整乙腈体积百分比低于15%、pH值为6‑7后析晶,离心后所得固体为纯品。本发明用醋酸乙腈混合溶解体系对替度鲁肽粗品前处理,而后以适宜的流动相进行RP‑HPLC梯度洗脱,最后通过盐析和脱盐纯化出品质较高的替度鲁肽纯品,与现有RP‑HPLC纯化方法相比,提高了纯化效率和收率。
Description
技术领域
本发明涉及医药工艺领域,具体的说是涉及一种替度鲁肽的纯化方法。
背景技术
替度鲁肽,英文名为Teduglutide,一种胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物,一种天然生成的激素,可减少胃排空和分泌,并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。该药增加了这些细胞的数量,后者可增加小肠吸收、减少腹泻。欧洲商品名为Revestive,在美国商品名为Gattex。在临床上用于治疗成人短肠综合征,该药成为首个被推荐应用于这种罕见却使患者极其虚弱疾病的药物。
有关替度鲁肽的现有技术多为其合成方法,而专门针对替度鲁肽纯化方面的报道极少,基本上都是作为合成中的一步简单提及,且多为采用液相色谱法进行纯化。如申请号为200910126363的中国专利公开了“胰高血糖素样肽-2类似物及其制备方法和用途”,其中在制备的最后涉及到替度鲁肽的纯化步骤,其是采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,最终收率为20%,纯度为98.5%。从该专利记载的内容能够看出,其纯化方法得到的替度鲁肽收率很低,并且在临床上替度鲁肽是以其醋酸盐形式使用的,现有专利如果转醋酸盐,其收率势必会因为损耗而进一步降低。此外,该专利采用的纯化方法只适用于纯度较高的替度鲁肽粗品,一旦纯度降低如只有20%-40%,如果将较低纯度的粗品纯化到较高的纯度就需要进行多次的RP-HPLC纯化,然而RP-HPLC纯化成本是较为昂贵的,这会造成投入和收益失衡,纯化效率低下。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种替度鲁肽的纯化方法,使得该纯化方法能够提高替度鲁肽的收率和纯化效率。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种替度鲁肽的纯化方法,包括以下步骤:
步骤1、将替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为10%-30%,得到替度鲁肽粗品溶液;
步骤2、将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20-40min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10-20次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;
其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5-6.5的硫酸-高氯酸混合水溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,乙腈梯度以体积百分比计从25%升至45%;
步骤3、将步骤2收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照步骤2的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
步骤4、混合步骤2和步骤3分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,调整替度鲁肽流份中乙腈体积百分比低于15%、pH值为6-7后静置析晶,离心后所得固体即为替度鲁肽纯品。
针对现有替度鲁肽纯化方法纯化效率、收率和纯度都不高的缺陷,本发明采用适宜的RP-HPLC方法以及通过调节乙腈浓度和pH的方法析晶,提高了替度鲁肽的纯度和收率,而且针对纯度较低的替度鲁肽粗品的纯化能够一次纯化到位,提高了纯化效率。
作为优选,步骤1所述乙腈-醋酸混合水溶液由体积百分比为30%-60%的醋酸、5%-20%乙腈和余量水组成,更优选地,所述乙腈-醋酸混合水溶液由体积百分比为40%的醋酸、15%乙腈和余量水组成。
申请号为200910126363的专利采用水作为溶剂,其溶解体积很大,会导致后续的反相纯化过程体积过载,无法进行有效分离。而本发明选择体积比30%-60%的醋酸和5%-20%的乙腈水溶液混合溶剂系统是和本发明整套纯化方法向配套的,能够保证替度鲁肽的溶解体积不会过载,提高纯化效率,不在该浓度的溶剂溶解的浓度会变低,导致样品溶解体积过大,不利于反相色谱的处理(会导致体积过载,纯化效率低)。
作为优选,步骤1所述替度鲁肽粗品和乙腈-醋酸混合水溶液的质量体积比为20g-50g:1L。将制备的粗肽的浓度控制在20g/L-50g/L有利于本发明所述方法的纯化效率,高于50g/L会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱,低于20g/L会使纯化效率低下。
在本发明步骤1中,用水将醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到10%-30%,当醋酸和乙腈的比例高于30%此范围的溶剂会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱,当醋酸和乙腈的比例低于10%会使样品析出,导致后续的反相色谱纯化无法进行。
作为优选,步骤2所述硫酸-高氯酸混合水溶液由体积百分比为0.1%-0.4%的硫酸、0.1%-0.4%高氯酸和余量水组成,更优选为由体积百分比为0.3%的硫酸、0.2%高氯酸和余量水组成。优选地,步骤2所述pH值用氨水调节,流动相A的pH值为6.0,所述梯度洗脱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。
本发明步骤2选择0.1%-0.4%的硫酸和0.1%-0.4%高氯酸两种酸用氨水调节后生成两种缓冲盐的A相是优化选择的结果,较现有技术(200910126363专利)采用0.1%TFA具有更好的分离效果。流动相A中缓冲盐的浓度低于所限定的范围使流动相缓冲能力变弱,导致样品不能完全洗脱且谱图变形达不到分离的要求。大于此范围,流动相A中缓冲盐的浓度过高对色谱系统损伤较大,甚至会部分产生盐析,导致无法纯化。另外,流动相A的pH值也非常重要,不在5.5-6.5范围达不到分离效果。洗脱系统中A相和B相的比例是影响本发明所述方法纯化效果的因素之一,B%低于25%样品不能冲洗下色谱柱,B%大于45%样品会提前冲出,都不能进行纯化。采用该溶剂系统纯化,分离效果较现有技术会大幅提高,本步的收率90%左右,所得样品的纯度在98%以上,大大提高收率和纯度,降低了生产成本。
作为优选,步骤4所述pH值用氨水调节,更优选为用体积百分比为20%的稀氨水调节,所述静置析晶优选为放置到2℃-8℃下2h以上析晶。
本发明步骤4可以通过常温旋蒸的方法将乙腈的比例降至15%以下,再将其pH值用20%的稀氨水调至6.0-7.0后放置到2-8摄氏度2小时以上,使替度鲁肽析出。通过对乙腈浓度以及pH值的合理调节,本发明能够将杂质溶解于溶液中,而通过盐析的方法将替度鲁肽析出,配合前述的RP-HPLC的纯化效果,能够保证纯化出的替度鲁肽达到较高的品质。
鉴于替度鲁肽在临床应用中本身不太稳定,需要以替度鲁肽醋酸盐形式存在,故本发明还包括将替度鲁肽纯品用RP-HPLC转醋酸盐步骤,具体为:
用磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.1%-0.8%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗,然后再以乙腈为流动相B、醋酸水溶液为流动相A进行RP-HPLC梯度洗脱15min-30min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品。
其中作为优选,所述磷酸水溶液中磷酸的体积半分比为60%-100%,所述冲洗时间为15min-30min。
优选地,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的3%-15%。
优选地,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中的醋酸体积百分比为0.1%-0.4%,乙腈的浓度以体积百分比计从10%升至55%,更优选地,醋酸水溶液中的醋酸体积百分比为0.1%,乙腈的浓度以体积百分比计从20%升至50%。
以不同纯度的替度鲁肽粗品(20%-90%)按照本发明的纯化方法进行纯化,结果显示,替度鲁肽收率可达到80%以上,纯度达到99%以上,明显优于申请号为200910126363的现有专利技术。此外,本发明同样采用20%-40%浓度的替度鲁肽粗品,按照上述专利纯化方法进行纯化,结果需要纯化5-6次方能达到95%以上纯度,且收率在20%以下。同时,经过试验验证,以本发明所述纯化方法为基础,改变其中某一个条件参数,结果显示纯化大多无法进行或者效率低下,无法达到本发明所述方法的纯化效果。
由以上技术方案可知,本发明通过醋酸-乙腈混合溶解体系对替度鲁肽粗品前处理,而后以适宜的流动相进行RP-HPLC梯度洗脱,最后通过控制乙腈浓度和pH值纯化出品质较高的替度鲁肽纯品,与现有单纯采用RP-HPLC纯化方法相比,节省了成本,提高了纯化效率和收率。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种替度鲁肽的纯化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种替度鲁肽的纯化方法进行详细说明。
实施例1:纯化纯度为20%的替度鲁肽粗品
将纯度为20%的替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(体积百分比,乙腈10%,醋酸40%)溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为15%,得到替度鲁肽粗品溶液;
将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5(用氨水调节)的硫酸-高氯酸混合水溶液(体积百分比,硫酸0.3%,高氯酸0.1%)为流动A相,以乙腈为流动B相,乙腈梯度以体积百分比计从25%至45%,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,规格为30cm×25cm;
将上述收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照上述的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
混合所有分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,通过常温旋蒸的方法将替度鲁肽流份中乙腈体积百分比降至15%以下,同时用体积百分比为20%的稀氨水调节pH值为6后放置到2-8摄氏度下2小时以上析晶,然后离心处理,所得固体即为替度鲁肽纯品,收率为84%,纯度为96.1%;
用60%磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加注射用水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.4%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗20min,然后再以乙腈为流动B相、醋酸水溶液为流动A相进行RP-HPLC梯度洗脱20min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品,收率为94%,纯度为99.2%;其中,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的5%,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中醋酸体积百分比为0.1%,乙腈的浓度为从20%升至50%。
实施例2:纯化纯度为50%的替度鲁肽粗品
将纯度为50%的替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(体积百分比,乙腈15%,醋酸30%)溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为20%,得到替度鲁肽粗品溶液;
将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5(用氨水调节)的硫酸-高氯酸混合水溶液(体积百分比,硫酸0.4%,高氯酸0.1%)为流动A相,以乙腈为流动B相,乙腈梯度以体积百分比计从25%至45%,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,规格为30cm×25cm;
将上述收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照上述的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
混合所有分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,通过常温旋蒸的方法将替度鲁肽流份中乙腈体积百分比降至15%以下,同时用体积百分比为20%的稀氨水调节pH值为6后放置到2-8摄氏度下2小时以上析晶,然后离心处理,所得固体即为替度鲁肽纯品,收率为89%,纯度为97.3%;
用65%磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加注射用水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.3%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗20min,然后再以乙腈为流动B相、醋酸水溶液为流动A相进行RP-HPLC梯度洗脱20min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品,收率为88%,纯度为99.3%;其中,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的8%,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中醋酸体积百分比为0.15%,乙腈的浓度为从22%升至52%。
实施例3:纯化纯度为80%的替度鲁肽粗品
将纯度为80%的替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(体积百分比,乙腈20%,醋酸35%)溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为25 %,得到替度鲁肽粗品溶液;
将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5(用氨水调节)的硫酸-高氯酸混合水溶液(体积百分比,硫酸0.25%,高氯酸0.2%)为流动A相,以乙腈为流动B相,乙腈梯度以体积百分比计从25%至45%,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,规格为30cm×25cm;
将上述收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照上述的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
混合所有分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,通过常温旋蒸的方法将替度鲁肽流份中乙腈体积百分比降至15%以下,同时用体积百分比为20%的稀氨水调节pH值为6后放置到2-8摄氏度下2小时以上析晶,然后离心处理,所得固体即为替度鲁肽纯品,收率为94.5%,纯度为98.1%;
用70%磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加注射用水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.35%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗20min,然后再以乙腈为流动B相、醋酸水溶液为流动A相进行RP-HPLC梯度洗脱20min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品,收率为92%,纯度为99.5%;其中,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的8%,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中醋酸体积百分比为0.2%,乙腈的浓度为从18%升至48%。
实施例4:纯化纯度为90%的替度鲁肽粗品
将纯度为90%的替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(体积百分比,乙腈5%,醋酸30%)溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为12%,得到替度鲁肽粗品溶液;
将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5(用氨水调节)的硫酸-高氯酸混合水溶液(体积百分比,硫酸0.4%,高氯酸0.1%)为流动A相,以乙腈为流动B相,乙腈梯度以体积百分比计从25%至45%,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,规格为30cm×25cm;
将上述收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照上述的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
混合所有分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,通过常温旋蒸的方法将替度鲁肽流份中乙腈体积百分比降至15%以下,同时用体积百分比为20%的稀氨水调节pH值为6后放置到2-8摄氏度下2小时以上析晶,然后离心处理,所得固体即为替度鲁肽纯品,收率为93.8%,纯度为98.3%;
用68%磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加注射用水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.3%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗20min,然后再以乙腈为流动B相、醋酸水溶液为流动A相进行RP-HPLC梯度洗脱20min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品,收率为92.9%,纯度为99.4%;其中,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的9%,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中醋酸体积百分比为0.2%,乙腈的浓度为从20%升至50%。
实施例5:对比试验
1、纯化效率对比试验
采用本发明实施例1-4方法和申请号为200910126363的现有专利技术纯化纯度为20%的替度鲁肽粗品(转醋酸盐步骤采用本发明转醋酸盐步骤),统计纯化次数以及纯度、收率,结果见表1.
表1纯化效率试验对比结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比方法 | |
纯化次数 | 1 | 1 | 1 | 1 | 6 |
纯度 | 99.2% | 99.3% | 99.5% | 99.4% | 98.7% |
收率 | 79% | 78% | 87% | 87.1% | 18% |
由表1可以看出,按照本发明所述处理方法即使纯化较低纯度的替度鲁肽粗品也能够一次达到较高纯度的替度鲁肽醋酸盐纯品,且收率较高。而对比方法需要6次才能达到95%以上纯度,且收率不到20%,纯化效率低下。
2、不同条件参数纯化试验结果
溶解替度鲁肽粗品的乙腈-醋酸混合水溶液中乙腈、醋酸体积百分比,乙腈-醋酸混合水溶液和替度鲁肽粗品的体积质量比参数不在本发明范围内会导致纯化效率降低,其余参数不在本发明范围内导致纯化无法正常进行。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种替度鲁肽的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、将替度鲁肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液溶解,然后加水稀释至乙腈和醋酸的体积百分比之和为10%-30%,得到替度鲁肽粗品溶液;
步骤2、将替度鲁肽粗品溶液用RP-HPLC进行梯度洗脱20-40min,从替度鲁肽主峰出现开始至替度鲁肽主峰结束分10-20次收集替度鲁肽流份,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用,分离出纯度在90%-95%的替度鲁肽流份进行下步纯化;
其中,所述梯度洗脱以pH值为5.5-6.5的硫酸-高氯酸混合水溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,乙腈浓度以体积百分比计从25%升至45%,采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相;
步骤3、将步骤2收集的替度鲁肽纯度在90%-95%的流份再次按照步骤2的方法进行RP-HPLC梯度洗脱,分离出替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份备用;
步骤4、混合步骤2和步骤3分离的替度鲁肽纯度在95%以上的替度鲁肽流份,调整替度鲁肽流份中乙腈体积百分比低于15%、pH值为6-7后静置析晶,离心后所得固体即为替度鲁肽纯品。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1所述乙腈-醋酸混合水溶液由体积百分比为30%-60%的醋酸、5%-20%乙腈和余量水组成。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1所述替度鲁肽粗品和乙腈-醋酸混合水溶液的质量体积比为20g-50g:1L。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2所述硫酸-高氯酸混合水溶液由体积百分比为0.1%-0.4%的硫酸、0.1%-0.4%高氯酸和余量水组成。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2和步骤4所述pH值用氨水调节。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4所述静置析晶为放置到2℃-8℃下2h以上析晶。
7.根据权利要求1-6任意一项所述方法,其特征在于,还包括将替度鲁肽纯品用RP-HPLC转醋酸盐步骤,具体为:
用磷酸水溶液溶解替度鲁肽纯品,然后加水稀释一倍后,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,先以乙腈为流动相B、以体积百分比为0.1%-0.8%的醋酸铵溶液为流动相A进行进行冲洗,然后再以乙腈为流动B相、醋酸水溶液为流动A相进行RP-HPLC梯度洗脱15min-30min,收集从替度鲁肽醋酸盐主峰出现开始至替度鲁肽醋酸盐主峰结束之间的流份,浓缩、冷冻干燥后即为替度鲁肽醋酸盐纯品。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述冲洗中乙腈终浓度为醋酸铵溶液和乙腈体积之和的3%-15%。
9.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述梯度洗脱中醋酸水溶液中的醋酸体积百分比为0.1%-0.4%,乙腈的浓度以体积百分比计从10%升至55%。
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