JP2005502595A - インスリン指向性ペプチド誘導体 - Google Patents
インスリン指向性ペプチド誘導体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005502595A JP2005502595A JP2002587464A JP2002587464A JP2005502595A JP 2005502595 A JP2005502595 A JP 2005502595A JP 2002587464 A JP2002587464 A JP 2002587464A JP 2002587464 A JP2002587464 A JP 2002587464A JP 2005502595 A JP2005502595 A JP 2005502595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insulin
- exendin
- amino acid
- arg
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Description
【0001】
本発明は、II型糖尿病の処置に有用な活性なペプチド化合物に関する。特に、本発明は、インスリン指向性ペプチドエクセンジン−4の誘導体に関する。
【背景技術】
【0002】
同じ量のグルコースの経口投与が、注射よりもインスリンの分泌を刺激しうることが明らかにされてきた。その理由を探求する多くの研究により、インクレチンがこの現象に重要な役割を果たすことが確認された。
【0003】
インクレチンはペプチド化合物群であり、これらの中で、強い阻害活性を有する胃抑制性ペプチド(GIP)およびグルカゴン様ペプチド(GLP−1)が1985年に開示された。ここで2種類のGLP−1が存在し、1つは30アミノ酸残基から構成されるGLP−1(7−36)アミドであり、もう1つは31アミノ酸残基から構成されるGLP−1(7−37)である。これら2つは、インスリンの分泌を刺激するという同様の活性を有している。in vitroにおいて膵臓島細胞に作用するとき、1×10-10〜1×10-11mol/Lもの低い濃度のGLP−1でも、インスリンの分泌を刺激することができる。DNAおよびアミノ酸配列の分析により、これらのインスリン指向性ペプチドが、腸のタンパク質分解酵素の作用の下でグルカゴン前駆体「プログルカゴン」のタンパク質分解に由来することが明らかとなり、それゆえこれらはグルカゴン様ペプチドと呼ばれる。
【0004】
GLP−1の1つの特徴は、膵臓ベータ細胞を刺激してプロインスリンmRNAおよびプロインスリンを合成し、そしてインスリンを放出しうることである。膵臓ベータ細胞に対するGLP−1の作用は、グルコースの濃度に依存する。血液グルコース濃度が6mmol/Lより高い場合、GLP−1は、インスリンの分泌を顕著に刺激し、その濃度が一旦正常濃度に回復すると、GLP−1の刺激活性はもはや観察されなくなる。このような特徴は、II型糖尿病の処置に非常に有用である。近年のII型糖尿病患者に対する臨床試験により、インスリンの分泌を刺激し、グルコース濃度を低下させるGLP−1の作用も確認された。
【0005】
GLP−1(7−36)アミドの化学構造は、以下に示される:
【化1】
ここで、Hisはヒスチジンを、Alaはアラニンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、Thrはスレオニンを、Pheはフェニルアラニンを、Serはセリンを、Aspはアスパラギン酸を、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Leuはロイシンを、Glnはグルタミンを、Lysはリジンを、Ileはイソロイシンを、そしてArgはアルギニンを示す。
【0006】
国際特許出願WO91/11457は、GLP−1ペプチド7−34、7−35、7−36および7−37の類似体を開示しており、これらはII型糖尿病の処置に有用であった。
【0007】
メキシコドクトカゲ(Heloderma horridum)の毒液から分離されたペプチド化合物エクセンジン−4は、1996年のRegulaory PeptidesにJean−Pierre Ranfmanにより開示された。エクセンジン−4は、カルボキシル末端がアミド化された39のアミノ酸残基から構成される。エクセンジン−4の化学構造は以下に示される:
【化2】
ここで、Metはメチオニンを、Asnはアスパラギンを、そしてProはプロリンを示す。
【0008】
エクセンジン−4は、そのアミノ酸配列においてGLP−1と53%の相同性を共有する。さらに、エクセンジン−4は、GLP−1レセプターに結合して、インスリンの分泌を刺激する能力を有する。したがって、これは、インスリン指向性ペプチドと見なされる。
【0009】
米国特許番号05424286号は、インスリンの分泌の刺激作用について、エクセンジン−4とGLP−1との間で行ったいくつかの比較実験の結果を開示した。GLP−1と比較すると、エクセンジン−4は、インスリンの分泌を刺激する強い能力を有し、このような刺激活性を示すために低い濃度しか必要としないことが示された。さらに、エクセンジン−4は、GLP−1と比べin vivoにおいて長い半減期を有した。これらの特徴に照らして、エクセンジン−4は、II型糖尿病を処置するための望ましい治療薬となりうる。
【0010】
エクセンジン−4は、ペプチド合成装置により固相合成によるような、化学合成法により製造できるが、このような方法の高コストおよびそれによる販売価格により、エクセンジン−4は、市販に至っていない。それ故、市販のために、製造コストを削減するために遺伝子組み換え技術が試されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、インスリン指向性ペプチドエクセンジン−4のいくつかの誘導体を提供することに向けられる。このような誘導体は、インスリンの分泌を刺激し、血液グルコース濃度を低下させるのに役立つ。したがって、これらはII型糖尿病の処置に用いることができる。このような誘導体は、合成の化学手法により、およびより容易には、遺伝子組み換え技術により製造することができ、これは製造コストを削減することを可能とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、インスリン指向性ペプチドの誘導体およびこれらから製造される医薬的に許容可能な塩を提供する。前記インスリン指向性ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する:
【化3】
ここで、XはArg、Leu、IleまたはMetを、YはHis、ArgまたはLysを、ZはArg−OH、−OH、−NH2またはLys−OHを示し、そして、XがMetでYがArgの時、ZはNH2ではない。
【0013】
本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体は、特に配列表の<210>1−<210>4に表されるアミノ酸配列を有している。
【0014】
本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体は、両性化合物であり、いずれかの多数の無機塩基、並びに無機および有機酸と反応して塩を形成するのに充分に酸性もしくは充分に塩基性でありうる。通常酸性付加塩を形成するために利用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等のような無機酸;p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p−臭化フェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等のような有機酸である。このような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソブタン酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−1,4−ジオン酸塩、ヘキシン−1,6−ジオン酸塩、安息香酸塩、塩化安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブタン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシブタン酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−1−スルホン酸塩、ナフタレン−2−スルホン酸塩、マンデル酸塩、等が含まれる。好ましい酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸、特に塩酸のような鉱酸と塩を形成するものである。
【0015】
本発明の誘導体と反応させて塩を形成するために、アルカリを用いてもよい。このようなアルカリの代表例には、アンモニウム、アルカリ金属、アルカリ金属水酸化物、炭酸、および重炭酸が含まれる。典型的には、このようなアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウムおよび炭酸カルシウムが挙げられる。
【0016】
本発明の1つの見地は、固相合成によるインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、固相担体としてHMP樹脂を用いること、アミノ酸のアルファアミンを9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)で保護すること、インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従いペプチド合成装置で残基を合成すること、並びに分離、精製および凍結乾燥工程後に産物を得ること、を含む方法を提供する。
【0017】
他の見地として、本発明は、遺伝子組み換え技術によるインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、
a.インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い遺伝子フラグメントを合成すること、
b.遺伝子フラグメントのライゲーション、組み換えプラスミドの構築、細菌細胞の培養、および組み換えプラスミドの形質転換の後に、クローニングされた細菌株を得ること、
c.細菌株の発酵および細胞壁の破壊後に、封入体を抽出すること、
d.封入対の溶解、粗産物の分離、HPLCによる精製および凍結乾燥工程の後に、最終産物を得ること、
を含む、方法を提供する。
【0018】
また他の見地として、本発明は、インスリン指向性ペプチド誘導体およびそれから製造される医薬的に許容可能な塩の、II型糖尿病の処置への使用を提供する。
【0019】
本発明は、ペプチド化合物エクセンジン−4の新規な誘導体を提供し、これは、エクセンジン−4誘導体の範囲を広げるものである。本発明の誘導体は、インスリンの分泌を刺激し、血液グルコース濃度を低下させる生物学的活性を有する。これらは、II型真性糖尿病の処置に用いることができる。このような誘導体は、化学合成により、またより容易には、遺伝子組み換え技術により製造でき、これは製造コストを減少させることができる。さらに、このような誘導体の生物学的活性は、非肥満糖尿病(NOD)マウスによる薬力学研究により解明され、本発明の誘導体0.1μgをマウスの腹部に注射した場合、インスリン指向性ペプチド誘導体は、インスリンの分泌を増加させ、また血液グルコース濃度を低下させる明らかな作用を示した。
【実施例】
【0020】
以下の実施例は、例示であり、いかなる手段においても本発明の範囲を限定するものではない。
<実施例1> XがArg、YがLys、Zが−OHであるインスリン指向性ペプチド誘導体の、固相合成による製造
【0021】
(1)アミノ酸モノマー:
【表1】
ここで、Fmocは9−フルオレニルメトキシカルボニルを、BOCはtert−ブチルオキシカルボニルを、Trtはトリチルを、OtBuはtert−ブチルエステルを、tBuはtert−ブチルを示す。
【0022】
(2)装置および試薬:
装置:モデル433Aペプチド合成装置(アプライドバイオシステム社、米国)
試薬:N−メチルケトピロリジン、塩化メチレン、ヘキサヒドロピリジン、メタノール、ジメチルアミノピリジン/DMF N,N−ジイソプロピルエチルアミン/NMP、100mmole HBTU/DMF中0.5M HOBT、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド/NMP
ここで、DMFはN,N−ジメチルホルムアミドを、NMPはN−メチルピロリドンを、HOBTは1−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、HBTUは2−(1H−ベンゾトリアゾール−イル−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニウムヘキサフロロホスフェート)を示す。
【0023】
(3)工程
a.合成
例として0.25スケールの合成を行い、以下に記載する合成工程とした。
0.25gのHMP樹脂を秤量し、合成装置の反応容器に入れた。1mmolの種々の残基を、各々保護基を結合させて秤量し、カルボキシル末端からアミノ末端方向にインスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い合成装置で配列させた。25℃の室温で、Fmoc保護基を除去し、残基を活性化させ、活性化した残基をHMP樹脂に結合させる反応を、コンピュータプログラムの制御下で自動的に行った。このような反応は、全ペプチドが合成されるまで繰り返された。合成の完了後、側鎖保護基が結合した各々の残基を有する残基結合樹脂を、ペプチド合成装置で空気乾燥させ、その後秤量した。
b.保護基の除去および樹脂の分離
保護基が結合したインスリン指向性ペプチド誘導体の各々の残基を有する残基結合樹脂を、栓をしたエルレンマイヤーフラスコに入れ、その後以下に示す切断試薬を添加した。
【0024】
【表2】
30℃の一定温度で6時間電磁石による撹拌反応を行った。ろ過工程の後、水溶性のろ液を採取した。樹脂を少量のトリフロロ酢酸で洗浄した。採取した水溶性のろ液および洗浄溶液を混合し、エーテルを加えて沈殿させた。混合物をろ過し、得られた沈殿を少量のエーテルで洗浄した。除湿装置による蒸発の後、粗産物を得た。
c.HPLCによる精製および凍結乾燥
粗産物の分離および精製を予備HPLCを用いて行った。最終産物を、凍結および凍結乾燥工程の後に得た。産物の分子量をクロマトグラム−質量スペクトルの複合分析を用いて測定した。ペプチド誘導体は、理論分子量4300.6に対して、4316.7の分子量を有することがわかった。
【0025】
<実施例2> XがLeu、YがLys、ZがArg−OHであるインスリン指向性ペプチド誘導体の、遺伝子組み換え技術による製造
【0026】
A.インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従った遺伝子フラグメントの合成
【化4】
【0027】
B.クローニング
ライゲーション:
2つの試験管を用意し、A260nm=0.1(260nmにおける光学密度)のフラグメント(1)およびフラグメント(4)を1つの試験管に入れ、一方、同じ光学密度のフラグメント(2)およびフラグメント(3)をもう一方の試験管に入れた。そして、ポリヌクレオチドキナーゼバッファー、ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPを2つの試験管にそれぞれ添加した。反応混合物を37℃で60分間インキュベートし、遺伝子フラグメントの5’末端をリン酸化した。その後、2つの試験管を95℃の水浴に置き、10分間インキュベートした。加温のための水浴をやめて、室温にて自然に冷却し、その工程の間にアニーリング反応を行った。T4リガーゼおよびT4リガーゼバッファーを2つの試験管にそれぞれ添加し、遺伝子フラグメントのライゲーションのために、混合物を16℃にて一晩インキュベートした。
プラスミド:
Lac、PLまたはTacのようなプロモーターを含むプラスミドを試験管に入れ、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIにより消化した。消化したプラスミドをヒドロキシベンゼン:クロロホルム溶媒により抽出し、遠心分離により採取した。水相を残し、クロロホルム溶媒により3回洗浄した。遠心分離を続け、得られた水相をイソプロパノール溶媒で沈殿させ、その後遠心分離および空気乾燥工程を行った。
消化したプラスミドおよびライゲートしたフラグメントを混合した。T4リガーゼおよびリガーゼバッファーを混合物に添加した。ライゲーション反応を室温で3〜4時間行った。
宿主細菌細胞の培養:
E.coliJM103の細菌細胞をLB液体培地(10gのペプトン、5gの酵母抽出物および5gの塩化ナトリウムを含む1000mlのLB液体培地)中で37℃で4時間振盪しながらインキュベートした。細菌培養物を遠心分離した後、採取した細菌細胞を塩化カルシウム溶液で処理し、さらなる使用に備えて−4℃で保存した。
形質転換:
クローニングしたプラスミドをE.coliIM103宿主細胞に形質転換した。形質転換された細菌細胞を、氷浴中で30分間インキュベートし、その後42℃で2分間インキュベートした。細菌細胞をアンピシリン抗生物質を含む寒天プレートに広げ、37℃で一晩インキュベートした。その後コロニー選択を行い、組み換えプラスミドを含むコロニーを陽性コロニーとして保持した。
【0028】
C.発酵:
誘導体遺伝子を保持した組み換えプラスミドを含む選択コロニーを、LB液体培地中で振盪しながらインキュベートした。0.5mMのイソプロピルベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)をタンパク質誘導のために添加した。細菌細胞を一晩インキュベートし、遠心分離により採取した。発現したタンパク質を、12%のドデカンスルホン酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により同定した。
【0029】
D.封入体
各々300mlの細菌培養物を含む10個のビンを、上述した条件下で振盪しながらインキュベートした。タンパク質誘導工程の後、溶解液(1%塩化ナトリウムを含む20mMのリン酸バッファー、pH7.5)およびリゾチームを添加した。細菌培養物を30℃で30分間インキュベートし、その後遠心分離した。採取した沈殿を封入体の抽出のために6Mグアニジン塩酸塩(Gu・HCl)で処理した。遠心分離を続け、得られた上清を透析し、グアニジン塩酸塩を除去した。透析物を20mMリン酸バッファー(1%塩化ナトリウムおよび0.1%Tween80を含む、pH7.5)で3回洗浄し、そして封入体を得た。
【0030】
E.溶解
封入体を8Mカルバミド溶液に溶解した。塩酸を添加して50mMの濃度とした。臭化シアンを添加後、溶液を光を避けて窒素保護下で撹拌した。溶解反応を2時間行い、その後HPLC分析を行った。
【0031】
F.精製
溶解反応の完了後、粗産物をセファデックスG−25による分画クロマトグラフィーにより得、最終産物をHPLC精製により得た。固相合成の結果と同様に、測定されたペプチド誘導体の分子量は、理論分子量に一致することが、質量分析により示された。
【0032】
<実施例3> 薬力学研究
2時間絶食させた体重17±2gの非肥満糖尿病マウス(NODマウス)を用いて実験を行った。対照群1のマウスは2μgのインスリンの腹部注射を受け、対照群2のマウスは4μgのインスリンの腹部注射を受け、一方、試験群のものは、実施例1に記載されたように得られたインスリン指向性ペプチド誘導体の0.1μgの腹部注射を受けた。
【0033】
血液サンプルを異なる時間において採取した。血漿グルコース濃度を、血漿グルコース試験キット(健康省生物学製品上海研究所)を用いて測定した。結果を図に示す。インスリン指向性ペプチド誘導体の血液グルコースに対する低下作用が、非常に明白であることが観察できる。
【0034】
<実施例4> NODマウスにおける血液グルコースに対するエクセンジン−4(Lys20,Arg20)およびエクセンジン−4(Leu14,Lys20,Arg40)の低下作用
試料および方法:
NODマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。0.9%塩化ナトリウム溶液、エクセンジン−4(Lys20,Arg40)およびエクセンジン−4(Leu14,Lys20,Arg40)ペプチドを、アッセイに用いた。血漿グルコース試験キットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【0035】
一晩絶食させたNODマウスを3つの郡に分けた。第1群のマウスには、40%グルコースおよび1μgのエクセンジン−4(Lys20,Arg40)を含む200μlの溶液を腹部に注射した。第2群のマウスには、40%グルコースおよび2μgのエクセンジン−4(Leu14,Lys20,Arg40)を含む200μlの溶液を腹部に注射した。一方、第3群では、対象群として、マウスにグルコース溶液を腹部に注射した。
【0036】
30μlの血液サンプルを、あらかじめヘパリンで処理されたメモリ付きキャピラリーを用いて後方眼窩腔から直ちに採取した。サンプルを300μlの生理食塩水に入れ、塩水と混合した。3000rpmで遠心分離して赤血球を除去し、血清をグルコース測定のために保持した。異なる血液サンプルを30分後、60分後および120分後においてそれぞれ上述のように採取し、血清を分離した。3つの血漿サンプルのグルコース濃度を試験キットに記載された方法にしたがって測定し、血液グルコース濃度に対するGLP−1(7−36)の低下作用を検出した。
【0037】
図1に示すように、急激な増加の後、対照群の血液グルコース濃度は、徐々に正常濃度に戻る一方、試験群のグルコース濃度は、顕著な増加を示さずにすべての時間において正常濃度を維持していた。その理由は、エクセンジン−4誘導体の投与がインスリンの分泌を刺激し、それによりグルコース濃度の急激な変動を防止したものである。したがって、エクセンジン−4(Lys20,Arg40)およびエクセンジン−4(Leu14,Lys20,Arg40)の血液グルコースに対する低下作用は、この実験結果によって支持される。
【0038】
<実施例5> インスリン分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用
試料および方法:
NODマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。40%グルコース溶液、0.9%塩化ナトリウム溶液およびエクセンジン−4(Lys20,Arg40)を、実験に用いた。インスリンラジオイムノアッセイキットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【0039】
NODマウスを2つの群に分けた。50μlの血液サンプルを、あらかじめ1mg/mLヘパリンで内壁をすすいで空気乾燥させたメモリ付きキャピラリーを用いて、眼の静脈叢から採取した。2つの群のマウスに、5μgのエクセンジン−4(Lys20,Arg40)を含む200μlの生理食塩水をそれぞれ腹部に注射し、この時を0分として記録した。異なる血液サンプルを、5分後、10分後、20分後および30分後にそれぞれ上述のように採取した。採取後、各々の血液サンプルを、50μlの生理食塩水を含む遠心管に直ちに入れ、塩水と混合した。3000rpmでの遠心分離により赤血球を除去した。異なるサンプルのインスリン濃度をラジオイムノアッセイキットに記載された方法にしたがって測定し、インスリン分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用を検出した。
【0040】
図2に示すように、エクセンジン−4(Lys20,Arg40)の腹部注射は、インスリンの分泌を顕著に刺激することができる。
【0041】
<実施例6> C−ペプチド分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用
試料および方法:
健康なC57/BLマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。40%グルコース溶液、0.9%塩化ナトリウム溶液およびエクセンジン−4(Lys20,Arg40)を、実験に用いた。インスリンラジオイムノアッセイキットおよびC−ペプチドラジオイムノアッセイキットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【0042】
健康なC57/BLマウスを2つの群に分けた。50μlの血液サンプルをあらかじめ1mg/mLヘパリンで内壁をすすいで空気乾燥させたメモリ付きキャピラリーを用いて、眼の静脈叢から採取した。2つの群のマウスに、5μgのエクセンジン−4(Lys20,Arg40)を含む200μlの生理食塩水をそれぞれ腹部に注射し、この時を0分として記録した。異なる血液サンプルを、5分後、10分後、20分後および30分後にそれぞれ上述のように採取した。採取後、各々の血液サンプルを、50μlの生理食塩水を含む遠心管に直ちに入れ、塩水と混合した。3000rpmでの遠心分離により赤血球を除去した。異なるサンプルのC−ペプチド濃度をラジオイムノアッセイキットに記載された方法にしたがって測定し、C−ペプチド分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用を検出した。
【0043】
図3に示すように、エクセンジン−4(Lys20,Arg40)の腹部注射は、C−ペプチドの分泌を顕著に刺激することができる。
【図面の簡単な説明】
【0044】
本発明は、以下の図面および実施例を参照することにより、さらに例示されることとなる。
【図1】図1は、本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体についての薬力学研究の結果を示す。
【図2】図2は、実施例1で製造された産物の質量分析結果を示し、理論的な分子量4300.6および測定された分子量4316.7を示す。
【図3】図3は、エクセンジン−4(Lys20,Arg20)およびエクセンジン−4(Leu14,Lys20,Arg40)の血液グルコース低下作用の実験結果を模式的に示す。
【図4】図4は、インスリン分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用の実験結果を模式的に示す。
【図5】図5は、C−ペプチド分泌に対するエクセンジン−4(Lys20,Arg40)の刺激作用の実験結果を模式的に示す。
Claims (4)
- 配列表の<210>1−<210>4に示されるアミノ酸配列を有する、インスリン指向性ペプチドの誘導体およびこれから製造される医薬的に許容可能な塩。
- 固相合成による請求項1に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、固相担体としてHMP樹脂を用いること、アミノ酸のアルファアミンを9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)で保護すること、インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従いペプチド合成装置で残基を合成すること、並びに分離、精製および凍結乾燥工程後に産物を得ること、を含む方法。
- 遺伝子組み換え技術による請求項1に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、
a.インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い遺伝子フラグメントを合成すること、
b.遺伝子フラグメントのライゲーション、組み換えプラスミドの構築、細菌細胞の培養、および組み換えプラスミドの形質転換の後に、クローニングされた細菌株を得ること、
c.細菌株の発酵および細胞壁の破壊後に、封入体を抽出すること、
d.封入対の溶解、粗産物の分離、HPLCによる精製および凍結乾燥工程の後に、最終産物を得ること、
を含む、方法。 - 請求項1に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体およびそれから製造される医薬的に許容可能な塩の、II型糖尿病の処置への使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB011128569A CN1162446C (zh) | 2001-05-10 | 2001-05-10 | 促胰岛素分泌肽衍生物 |
PCT/CN2002/000316 WO2002090388A1 (fr) | 2001-05-10 | 2002-05-08 | Derives d'exendine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005502595A true JP2005502595A (ja) | 2005-01-27 |
JP2005502595A5 JP2005502595A5 (ja) | 2006-01-05 |
JP4287153B2 JP4287153B2 (ja) | 2009-07-01 |
Family
ID=4659603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002587464A Expired - Lifetime JP4287153B2 (ja) | 2001-05-10 | 2002-05-08 | インスリン指向性ペプチド誘導体 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7329646B2 (ja) |
EP (2) | EP2223938B1 (ja) |
JP (1) | JP4287153B2 (ja) |
KR (1) | KR100902208B1 (ja) |
CN (1) | CN1162446C (ja) |
AU (1) | AU2002257497B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0209685B8 (ja) |
CA (1) | CA2446394C (ja) |
WO (1) | WO2002090388A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009538356A (ja) * | 2006-05-26 | 2009-11-05 | アミリン・ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 鬱血性心不全の治療のための組成物および方法 |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6924264B1 (en) * | 1999-04-30 | 2005-08-02 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Modified exendins and exendin agonists |
CN1162446C (zh) * | 2001-05-10 | 2004-08-18 | 上海华谊生物技术有限公司 | 促胰岛素分泌肽衍生物 |
JP5107713B2 (ja) * | 2004-10-07 | 2012-12-26 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 遅延性のエキセンディン−4化合物 |
US7893017B2 (en) | 2004-10-07 | 2011-02-22 | Novo Nordisk A/S | Protracted GLP-1 compounds |
CN100429227C (zh) * | 2005-06-29 | 2008-10-29 | 常州制药厂有限公司 | Exendin4多肽片段 |
CN100374462C (zh) * | 2005-11-21 | 2008-03-12 | 大连帝恩生物工程有限公司 | 截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)、制法及其应用 |
CN101125207B (zh) | 2006-11-14 | 2012-09-05 | 上海华谊生物技术有限公司 | 带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途 |
HUE058307T2 (hu) * | 2007-01-08 | 2022-07-28 | Univ Pennsylvania | GLP-1 receptor antagonista veleszületett hiperinzulinizmus kezelésében történõ használatra |
RU2413528C2 (ru) | 2007-01-18 | 2011-03-10 | Открытое Акционерное Общество "Валента Фармацевтика" | Лекарственный препарат для лечения сахарного диабета на основе экзенатида и даларгина, применение и способ лечения |
CN101040936B (zh) * | 2007-04-28 | 2011-10-19 | 大连水产学院 | 防治鱼类寄生虫病的复方中草药制剂 |
CN101215324B (zh) * | 2007-12-26 | 2010-11-24 | 吉林大学 | 艾塞那肽短肽模拟肽及其在制备糖尿病治疗药物中的应用 |
KR100864584B1 (ko) * | 2008-02-25 | 2008-10-24 | 성균관대학교산학협력단 | 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의용도 |
CN101463078B (zh) * | 2009-01-12 | 2011-07-27 | 华东师范大学 | 一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成 |
CN101665799A (zh) * | 2009-06-29 | 2010-03-10 | 华东师范大学 | 一种Exendin-4衍生物的重组制备方法和应用 |
CN102712690B (zh) * | 2009-11-26 | 2016-04-13 | 吴晓琰 | 长效Exendin 4的类似物 |
CN102397558B (zh) * | 2010-09-09 | 2013-08-14 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途 |
CN102532301B (zh) * | 2010-12-31 | 2014-09-03 | 上海医药工业研究院 | 一类新型的Exendin-4类似物及其制备方法 |
CN106928341B (zh) * | 2011-03-30 | 2021-06-01 | 上海仁会生物制药股份有限公司 | 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法 |
UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
JP2016503771A (ja) | 2012-12-21 | 2016-02-08 | サノフイ | エキセンジン−4誘導体 |
HUE034308T2 (en) | 2013-03-21 | 2018-02-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Preparation of hydantoin-containing peptide products |
US10450343B2 (en) | 2013-03-21 | 2019-10-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
EP3080154B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-02-07 | Sanofi | Dual glp-1/gip receptor agonists |
WO2015086730A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Non-acylated exendin-4 peptide analogues |
EP3080149A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Dual glp-1/glucagon receptor agonists |
EP3080150B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-08-01 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists |
TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物 |
TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑 |
US9932381B2 (en) | 2014-06-18 | 2018-04-03 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists |
AR105319A1 (es) | 2015-06-05 | 2017-09-27 | Sanofi Sa | Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico |
AR105284A1 (es) | 2015-07-10 | 2017-09-20 | Sanofi Sa | Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991011457A1 (en) | 1990-01-24 | 1991-08-08 | Buckley Douglas I | Glp-1 analogs useful for diabetes treatment |
US5424286A (en) * | 1993-05-24 | 1995-06-13 | Eng; John | Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same |
DK144093D0 (ja) * | 1993-12-23 | 1993-12-23 | Novo Nordisk As | |
US6265204B1 (en) * | 1997-01-17 | 2001-07-24 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi |
JP2003522721A (ja) * | 1997-11-14 | 2003-07-29 | アミリン・ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 新規なエキセンジンアゴニスト化合物 |
EP1032587B2 (en) * | 1997-11-14 | 2013-03-13 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Novel exendin agonist compounds |
EP1180121B9 (en) | 1999-05-17 | 2004-09-08 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulinotropic peptides |
US6514500B1 (en) | 1999-10-15 | 2003-02-04 | Conjuchem, Inc. | Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!} |
US6506724B1 (en) | 1999-06-01 | 2003-01-14 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus |
EP1076066A1 (en) * | 1999-07-12 | 2001-02-14 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Peptides for lowering blood glucose levels |
US6528486B1 (en) | 1999-07-12 | 2003-03-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide agonists of GLP-1 activity |
AU2025401A (en) * | 1999-12-07 | 2001-06-18 | Yong-Hwa Lee | A bathtub for a pet dog |
CN1162446C (zh) * | 2001-05-10 | 2004-08-18 | 上海华谊生物技术有限公司 | 促胰岛素分泌肽衍生物 |
CN1363654A (zh) | 2001-07-19 | 2002-08-14 | 上海华谊生物技术有限公司 | 生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)的基因工程菌以及生产glp-1(7-36)的方法 |
-
2001
- 2001-05-10 CN CNB011128569A patent/CN1162446C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-05-08 JP JP2002587464A patent/JP4287153B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-08 AU AU2002257497A patent/AU2002257497B2/en not_active Expired
- 2002-05-08 KR KR1020037014451A patent/KR100902208B1/ko active IP Right Grant
- 2002-05-08 EP EP10001237.6A patent/EP2223938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-08 WO PCT/CN2002/000316 patent/WO2002090388A1/zh active Application Filing
- 2002-05-08 BR BRPI0209685A patent/BRPI0209685B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-08 EP EP02727167A patent/EP1386930A4/en not_active Withdrawn
- 2002-05-08 CA CA2446394A patent/CA2446394C/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-11-07 US US10/704,409 patent/US7329646B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009538356A (ja) * | 2006-05-26 | 2009-11-05 | アミリン・ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 鬱血性心不全の治療のための組成物および方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2446394A1 (en) | 2002-11-14 |
JP4287153B2 (ja) | 2009-07-01 |
CA2446394C (en) | 2016-08-16 |
KR100902208B1 (ko) | 2009-06-11 |
CN1162446C (zh) | 2004-08-18 |
AU2002257497B2 (en) | 2007-10-11 |
EP1386930A4 (en) | 2005-09-07 |
EP2223938A1 (en) | 2010-09-01 |
BR0209685A (pt) | 2004-07-13 |
EP1386930A1 (en) | 2004-02-04 |
CN1363559A (zh) | 2002-08-14 |
US20040142866A1 (en) | 2004-07-22 |
EP2223938B1 (en) | 2013-07-10 |
BRPI0209685B1 (pt) | 2016-03-01 |
WO2002090388A1 (fr) | 2002-11-14 |
BRPI0209685B8 (pt) | 2021-05-25 |
KR20030094386A (ko) | 2003-12-11 |
US7329646B2 (en) | 2008-02-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4287153B2 (ja) | インスリン指向性ペプチド誘導体 | |
JP4716641B2 (ja) | グルカゴン様ペプチド−1類似体 | |
JP4785206B2 (ja) | 修飾されたエキセンディン(Exendins)及びその使用 | |
EP1575490A2 (en) | Modified glucagon-like peptide-1 analogs | |
KR20110043687A (ko) | 포도당 의존적인 인슐린 분비 자극성 폴리펩타이드의 절단형 유사체 | |
CN111349155B (zh) | 一种胰高血糖素类似物及其制备方法和用途 | |
PL176007B1 (pl) | Nowe pochodne polipeptydu GLP-1 | |
KR20230088337A (ko) | Glp-1/gip 이중 작용제 | |
KR100997835B1 (ko) | 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편 | |
JP4194941B2 (ja) | マガイニン誘導体 | |
KR20230023658A (ko) | 장기 작용성 glp-1/gip 이중 작용제 | |
CN111171135A (zh) | 具有双重受体激动作用的胰高血糖素衍生肽及其用途 | |
CN111171134A (zh) | 胰高血糖素衍生肽及其用途 | |
WO2021249564A1 (zh) | 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法和应用 | |
KR20120093828A (ko) | 59번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인슐린 유사 성장 인자-1(igf-1)의 유사체 | |
JPH0786120B2 (ja) | ポリペプチド | |
CN113402598A (zh) | 一种索马鲁肽的固相合成方法 | |
EP3888667A1 (en) | Glucagon analogs and methods of use thereof | |
JP2023552500A (ja) | 長時間作用型グルカゴン誘導体 | |
JP2793216B2 (ja) | 粘膜による吸収を高める、ソルビン及び誘導ペプチド | |
WO2013063877A1 (zh) | 一种glp-1衍生物dlg3312及其固相化学合成方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050407 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050819 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080428 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081001 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20081202 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090127 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090129 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090310 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090326 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120403 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4287153 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120403 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130403 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130403 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140403 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |