PL176007B1 - Nowe pochodne polipeptydu GLP-1 - Google Patents

Abstract

1. Nowe pochodne polipeptydu GLP-1, znamienne tym, ze posiada pierwszorzedowa strukture H2N-R-X-(Y)n-Z R oznacza His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu, w której -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-He-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (sekwencja numer 2) i gdzie koncowa grupa aminowa jest ewentualnie zabezpieczona przez kwas bursztynowy i grupa aminowa epsilon obu reszt Lys jest ewentualnie sukcynylowana oraz jej farmaceu- tycznie dopuszczalne sole, w których n oznacza zero lub jeden; X i Y oznacza arginine i Z oznacza grupe karboksylowa lub niepodstawiony amid. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne polipeptydu GLP-1 oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Nowe pochodne według wynalazku wykazują aktywność insulinotropową i są użyteczne do wzmacniania działania insuliny w organizmach ssaków. Sposoby leczenia polegają na podawaniu ssakom skutecznej ilości pochodnej GLP-1 insulinotropiny.

Sekwencja aminokwasowa GLP-1 jest znana. Ma ona następujący wzór:

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-AspVal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-AlaTrp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr:1)

Peptyd GLP-1 został ujawniony przez Lopez’a L. C. i wsp. (P. N. A. S., USA 80, 5485-5489, 1983); jest on również opisany przez Bell’a G. I. i wsp. w Nature, 302, 716-718 (1983), Heinrick’a G. i wsp. w Endocrinol., 115, 2176-2181 (1984) i Ghiglione M. i wsp. w Diabetologia, 27, 599-600 (1984).

Wiadomo, że w środowisku naturalnym peptyd GLP-1 jest przetwarzany i ulega konwersji do peptydu zawierającego 31 reszt aminokwasowych, konkretnie zawierającego reszty 7 do 37 peptydu GLP-1. Według piśmiennictwa, proces konwersji do GLP-1 (7-37) zachodzi w trzustce i jelitach. Peptyd 7-37, zwany w opisie również insulinotropiną jest hormonem wykazującym aktywność insulinotropową.

Insulinotropiną ma następującą sekwencję aminokwasową:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr:2)

Insulinotropiną, niektóre jej pochodne i ich zastosowanie do leczenia cukrzycy (Diabetes melitus) u ssaków zostały ujawnione w opisie patentowym PCT/US87/01005 (W087/06941). Pochodne insulinotropiny ujawnione w opisie zgłoszenia patentowego PCT/US87/01005 obejmują polipeptydy różniące się obecnością lub brakiem jednego lub większej liczby aminokwasów, które nie muszą być obecne w sekwencji występującej w stanie naturalnym. Do pochodnych insulinotropiny ujawnionych w opisie patentowym PCT/US87/01005 należą również niektóre

176 007 sole, estry i amidy przy końcowej grupie karboksylowej, które to sole i estry są zdefiniowane symbolem OM, w którym M oznacza dopuszczalny farmaceutycznie kation łub niższą grupę alkilową (Cj-Có) o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, a amidy są zdefiniowane jako -NR²R³, w którym r2 i R³ są takie same lub różne i oznaczają wodór lub niższą grupę alkilową (Ci-C6) o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.

Niektóre inne polipeptydy, wykazujące aktywność insulinotropową oraz ich pochodne, zostały ujawnione w opisie patentowym PCT/US89/01121 (W090/11296). Polipeptydy te, oznaczone symbolami GLP-1 (7-36), GlP-1 (7-35) i GLP-1 (7-34), mają odpowiednio, następujące sekwencje aminokwasowe:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (SEKWENCJA ID nr: 3),

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (SEKWENCJA ID nr: 4) i

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-LeuWal-Lys (SEKWENCJA ID nr: 5)

Pochodne polipeptydowe ujawnione w opisie patentowym PCT/US89/01121 obejmują polipeptydy posiadające mało znaczące podstawienia aminokwasowe lub dodatkowe aminokwasy, wprowadzone do struktury w celu zwiększenia możliwości sprzęgania z białkiem nośnikowym lub zwiększenia działania insulinotropowego. Do następnych pochodnych insulinotropiny ujawnionych w opisie patentowym PCT/US89/01121 należą sole, estry i amidy przy końcowej grupie karboksylowej, które to sole i estry są zdefiniowane symbolem OM, w którym M oznacza dopuszczalny farmaceutycznie kation lub niższą grupę alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym a amidy są zdefiniowane jako -NR²RL w którym R² i R³ są takie same lub różne i oznaczają wodór lub niższą grupę alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.

Wprowadzanie aktywnych leczniczo polipeptydów do organizmu ssaka związane jest z pewnymi trudnościami. Polipeptydy o sekwencjach nie zmienionych (pochodne) szybko są degradowane.

Celem wynalazku są nowe pochodne GLP-1. Nowe pochodne według wynalazku są szczególnie przydatne do podawania transdermalnego - drogą jontoforezy.

Jontoforeza polega na zastosowaniu różnicy potencjałów elektrycznych przebiegających przez skórę w połączeniu z powierzchniowym podaniem środka leczniczego. W wykonaniu tej techniki stosuje się dwie elektrody oraz pojemnik leku i źródło prądu. Wynikiem jontoforezy jest transport środków leczniczych poprzez skórę do wybranych miejsc lub do całego organizmu. Wiadomo ponadto, że w technice jontoforezy stosuje się różne wzorce przykładania napięcia, w tym takie metody jak elektroporację lub techniki prądu pulsacyjnego.

Do transdermalnego podawania leuprolidu, syntetycznego dziewięcioaminokwasowego analogu hormonu uwalniającego hormon luteinizujący, stosowano prąd elektryczny o niskim napięciu (Meyer B. R. i wsp., Clin, Pharmacol. Ther. 44, 607-612, 1988). Siddiqui O. i wsp. (J. Pharmaceutical Sciences 76,341-345,1987) opisali badania nadjontoforetycznym podawaniem insuliny szczurom a Miller L. L. i wsp. (J. Pharmaceutical Sciences 79, 490-493, 1990) oraz Bumette R. R. i wsp. (J. Pharmaceutical Sciences 75, 738-743, 1986) zreferowali prace nad transdermalną jontoforezą hormonu uwalniającego · gonadotropinę i hormonu uwalniającego

176 007 tyropropinę. Jako środek ułatwiający transdermalne dostarczanie leuprolidu i analogu CCK-8 (cholecystokininy-8) techniką jontoforezy, Srinivasan V. i wsp. zastosowali etanol (J. Pharmaceutical Sciences 79, 588-591, 1990).

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne polipeptydu GLP-1 o strukturze pierwszorzędowej:

H₂N-R-X-(Y)_n-Z, w którym R oznacza sekwencję aminokwasową:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2), w której to pochodnej końcowa grupa aminowa jest zablokowana resztą kwasu bursztynowego i grupy epsilon-aminowe w obydwu resztach Lys są sukcynylowane oraz jej dopuszczalne farmaceutycznie sole, w którym n jest 0 lub 1, X i Y oznaczają argininę, Z oznacza grupę karboksylową lub niepodstawiony amid. Nowa pochodna ma wartość liczby pI około 4,0 lub mniejszą, bądź wartość pl około 7,0 lub większą i ma aktywność insulinotropową.

Sposób wytwarzania nowej pochodnej polipeptydu, która jest przedmiotem wynalazku polega na tym, że stosuje się jeden lub więcej niż jeden z poniższych sposobów: (a) pochodną o strukturze pierwszorzędowej poddaje się reakcji z (C1-C6)alkanolem w obecności kwasu jako katalizatora, z wytworzeniem jej estru (C1-C6)alkilowego przy C-końcowym; (b) pochodną o strukturze pierwszorzędowej poddaje się reakcji z (C1-C6)alkanolem w obecności kwasu jako katalizatora, z wytworzeniem jej estru (C1-C6)alkilowego przy resztach Asp i/lub Glu; (c) pochodną karbonamidową o strukturze pierwszorzędowej syntetyzuje się metodą syntezy polipeptydu w fazie stałej; (d) deamiduje się resztę Gln; (e) alkiluje się lub amiduje się wolną grupę aminową na N-końcu i/lub przy grupie e jednej lub więcej niż jednej reszty Lys struktury pierwszorzędowej albo przez połączenie tych metod; (f) pochodną o strukturze pierwszorzędowej poddaje się reakcji z cyklicznym bezwodnikiem; (g) resztę zasadowego aminokwasu w strukturze pierwszorzędowej zastępuje się resztą kwaśnego lub obojętnego aminokwasu i (h) resztę obojętnego aminokwasu zastępuje się resztą kwaśnego aminokwasu i ewentualnie otrzymaną pochodną przekształca się w dopuszczalną farmaceutycznie sól.

Pochodne według wynalazku można również stosować w leczeniu skojarzonym, np. z innymi środkami przeciwcukrzycowymi (takimi jak sulfonylomoczniki).

Środki farmaceutyczne zawierające pochodną polipeptydu według wynalazku są użyteczne do wzmacniania działania insuliny w organizmie ssaka, przy czym są szczególnie przydatne w leczeniu niektórych postaci cukrzycy, zwłaszcza cukrzycy typu II.

Stosowane w opisie i zastrzeżeniach określenie pochodne obejmuje niewyłącznie polipeptydy o przedstawionej strukturze pierwszorzędowej, w których to polipeptydach na końcu karboksylowym został włączony jeden lub większa liczba L-aminokwasów, przy czym C-terminalna grupa karboksylowa tworzy ester z grupą alkilową (C1-C6) o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, bądź C-terminalna grupa karboksylowa tworzy karboksyamid lub podstawiony karboksyamid i w których to polipeptydach kwasowe reszty aminokwasowe (Asp i/lub Glu) tworzą ester lub karboksyamid oraz ich kombinacje.

Stosowane w opisie patentowym określenie reszta zasadowego L-aminokwasu obejmuje niewyłącznie powszechnie znane aminokwasy, Lys, Arg i His.

Używany w opisie termin pI oznacza teoretyczną wartość pI, wyliczoną przy użyciu dostępnego w handlu programu komputerowego znanego pod nazwą PCGENE (IntelliGenetics, Inc., 700 East El Camino Real, Mountain View, CA 94040).

W celu wyznaczenia punktu izoelektrycznego pI, zastosowano program komputerowy (PCGENE), gdyż dane uzyskane w ten sposób z dużą dokładnością odpowiadają danym otrzymanym doświadczalnie, jednocześnie użycie tego programu było możliwe, ponieważ znana jest sekwencja podstawowa polipeptydu.

Doświadczalnie otrzymuje się wartość punktu izoelektrycznego białek (pI) stosując metodę IEF (izoelektroogniskowanie), gdzie odczyt pl jest możliwy dzięki zastosowaniu wzorców -cząsteczek o znanej wartości pI. Natomiast punkt izoelektryczny aminokwasów oblicza się na podstawie pKa (-log ze stałej dysocjacji reszt kwasowych: -COOH i -NH3+). W zależności od

176 007 właściwości aminokwasu pI jest równy średniej arytmetycznej z pKai i pKa2 lub pKa2 i pKa3. Wartość tego punktu w przypadku,białka lub polipeptydu zależy zatem od wszystkich występujących w białku (polipeptydzie) reszt aminokwasowych zawierających grupy COOH i NH3*. Wyznaczanie pI białka tą metodą jest skomplikowane.

Zastosowano tu zatem program będący wynikiem zarówno prac doświadczalnych jak i teoretycznych, umożliwiający wyznaczenie pI badanych polipeptydów.

Stosowane w opisie określenie wzmacnianie działania insuliny obejmuje niewyłącznie jedno lub większą ilość pojęć takich jak zwiększanie syntezy insuliny, zwiększanie wydzielania insuliny, zwiększanie pobierania glukozy przez mięśnie i tkankę tłuszczową oraz obniżanie wytwarzania glukozy w wątrobie.

Polipeptydy według wynalazku wytwarza się syntetycznie. Przykładowo, polipeptydy te syntetyzuje się w automatycznej aparaturze do syntezy polipeptydów, takiej jak syntetyzer polipeptydów w fazie stałej typu Applied Biosystems (ABI)430A. Alternatywnie, te polipeptydy według wynalazku, w których Z oznacza COOH można wytwarzać stosując technologię rekombinacji DNA; sekwencję DNA kodującą dany polipeptyd łączy się operacyjnie z wektorem ekspresyjnym i stosuje do transformowania odpowiedniej komórki gospodarza. Transformowaną komórkę gospodarza hoduje się następnie w warunkach, w których zachodzi ekspresja polipeptydu. Wytworzony polipeptyd wyodrębnia się z hodowli. Można również zastosować kombinację syntezy z technikami rekombinacji DNA do wytwarzania pochodnych amidowych lub estrowych według wynalazku i/lub do wytwarzania fragmentów żądanego polipeptydu, po czym można łączyć te fragmenty w znany sposób.

Pochodne polipeptydów według wynalazku wytwarza się w znany sposób. Przykładowo, C-terminalne estry alkilowe polipeptydów według wynalazku wytwarza się w reakcji żądanego (Ci-C6)-alkanolu z żądanym polipeptydem wobec kwasu jako katalizatora, np. wobec HCl. Reakcje wytwarzania takich estrów alkilowych prowadzi się w odpowiednich warunkach, to znaczy w temperaturze około 50°C, w czasie od około godziny do około 3 godzin. Podobnie wytwarza się pochodne polipeptydowe według wynalazku zawierające estry alkilowe (Ci-Q,) przy resztkach Asp i/lub Glu takiego polipeptydu.

Pochodne karboksyamidowe polipeptydów według wynalazku można również wytwarzać znanymi metodami syntezy polipeptydów w fazie stałej. Metody te są między innymi opisane przez Stewart’a J. M. i wsp. (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co. Press, 1984). Jeśli występuje potrzeba wytworzenia pochodnych polipeptydowych według wynalazku o wartości pI około 4,0 lub niższej, pochodne te można otrzymać różnymi znanymi sposobami. Przykładowo, deamidacja reszty glutaminowej z wytworzeniem reszty kwasu glutaminowego, alkilacja lub amidowanie wolnych grup aminowych przy końcu aminowym i/lub grup ε-aminowych w resztach lizyny lub kombinacje tych metod dadzą w wyniku pochodne o niższych wartościach pI. W celu obniżenia pI pochodnej insulinotropiny do wartości poniżej około 3,89, niezbędne jest zmodyfikowanie obydwu dostępnych grup aminowych albo modyfikowanie przynajmniej jednej grupy aminowej i deamidacja glutaminy. Deamidowanie reszt glutaminowych prowadzi się w łatwy sposób przez zawieszenie żądanego polipeptydu według wynalazku w wodzie o pH wyższym od 8 i utrzymywanie w tym stanie przez czas kilku godzin.

Przykładowo, zależnie od wartości pH mieszaniny reakcyjnej, acetylacja insulinotropiny w warunkach zasadowych może prowadzić do pochodnej, w której nastąpiła amidacja zarówno N-terminalnej grupy aminowej i obydwu grup ε-aminowych. W rezultacie powstaje pochodna o teoretycznej wartości pI 3,61. Alternatywnie, acetylacja N-terminalnej grupy aminowej w połączeniu z deamidacjąjednej reszty glutaminowej w insulinotropinie do reszty kwasu glutaminowego daje pochodną o teoretycznej wartości pI 4,11.

Alternatywnym sposobem obniżenia wartości pI jest prowadzenie reakcji polipeptydu z cyklicznym bezwodnikiem; w reakcji tej następuje zablokowanie reszty zasadowej i wprowadzenie reszty kwasowej. Jako przykład można podać, że reakcja roztworu insulinotropiny (SEKWENCJA NR 2) w DMF wobec 8 równoważników trójetyloaminy z 8 równoważnikami bezwodnika kwasu bursztynowego daje N-bursztynianową pochodną insulinotropiny przy końcu aminowym i przy jej resztach Lys20 i Lys28.

176 007

Alternatywnie lub w połączeniu z wyżej podanymi sposobami można otrzymać pochodne polipeptydowe, które są przedmiotem wynalazku, na drodze modyfikacji sekwencji kodującej DNA dla danego polipeptydu w taki sposób, aby zastąpić zasadową resztę aminokwasową resztą aminokwasową kwaśną lub obojętną lub też obojętną resztę aminokwasową wymienić na kwaśną resztę aminokwasową. Takich zmian w pierwszorzędowej sekwencji polipeptydowej można również dokonać na drodze bezpośredniej syntezy danej pochodnej. Sposoby te są ogólnie znane specjalistom. Jest zrozumiałe, że pochodne te muszą wykazywać działanie insulinotropowe aby mogły być stosowane w praktyce.

Insulinotropową aktywność pochodnej polipeptydowej według wynalazku, w której to pochodnej polipeptyd nie zawiera aminokwasów 1-6 z GLP-1 albo z GLP-1 o skróconym łańcuchu, określa się następująco:

Z tkanki trzustkowej normalnych szczurów izoluje się wysepki trzustkowe Langerhansa postępując w sposób opisany przy Lacy’ego P. E. i wsp. (Diabetes, 16, 35-39, 1*967) z modyfikacją polegającą na tym, że produkt trawienia tkanki trzustkowej kolagenazą rozdziela się w gradiencie odczynnika Ficoll (27%, 23%, 20,5% i 11% w zrównoważonym roztworze soli Hanks’a, pH = 7,4). Wysepki zbiera się z powierzchni międzyfazowej 20,5%/11%, przemywa się i ręcznie się rozdziela pod stereomikroskopem w postaci wolnej od zewnętrznych produktów wydzielniczych i innych tkanek. Wysepki inkubuje się przez dobę w pożywce RPMI 1640 wzbogaconej ilością 10% płodowej surowicy bydlęcej i zawierającej 11 mM glukozy. Inkubację prowadzi się w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2. Następnie wysepki przenosi się do pożywki RPMI 1640 wzbogaconej ilością 10% płodowej surowicy bydlęcej i zawierającej 5,6 mM glukozy. Inkubację prowadzi się w czasie 60 minut w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2. Preparaty pochodnych polipeptydowych do badań przygotowuje się w postaci roztworów o stężeniach 1 nM i 10 nM w pożywce RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 16,7 mM glukozy. Około 8 do 10 wyizolowanych wysepek przenosi się pipetą do całkowitej objętości 250 pl roztworu zawierającego pochodną polipeptydową do wgłębień w 96-dołkowych płytkach do mikromianowania. Wysepki inkubuje się wobec pochodnej polipeptydowej w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 w czasie 90 minut. Następnie pobiera się próbki po 100 pl roztworu wolnego od wysepek i oznacza się w nich ilość insuliny metodą radioimmunologiczną w zestawie Equate Insulin RIA Kit (Binax, Inc. Portland, ME). .

Środki farmaceutyczne zawierające pochodne polipeptydowe można wytwarzać metodami znanymi w technologii farmaceutycznej. Przykładowo, pochodne polipeptydowe można łączyć z dopuszczalnym farmaceutycznie rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. Jeśli pochodne polipeptydowe według wynalazku mają być podawane dożylnie, domięśniowo lub podskórnie, stosuje się odpowiedni sterylny rozpuszczalnik, co jest ogólnie znane. Takie środki farmaceutyczne będą zawierały ilość pochodnej polipeptydowej wystarczającą do prawidłowego dawkowania w odpowiednim okresie czasu, co jest opisane poniżej.

Do celów podawania pochodnej polipeptydowej według wynalazku metodą jontoforezy sporządza się różne formy farmaceutyczne. Taką pochodną polipeptydową można przygotować w postaci roztworu albo w postaci żelu lub piany. Korzystne jest jednak, aby pochodna polipeptydową w takiej formie miała taki sam lub w przybliżeniu taki sam ładunek jak elektroda w pojemniku leku w stosowanym aparacie do jontoforezy. Ładunek tej pochodnej można kontrolować, na przykład stosując odpowiedni bufor. Jeśli stosuje się bufor, to korzystnie jest zastosować bufor posiadający ładunek przeciwny do tego, jaki posiada konkretna pochodna polipeptydową, która ma być podana. Alternatywnie, pochodna polipeptydową może działać jako swój własny bufor jeśli zastosuje się jej odpowiednią sól. Do czynników zmiennych w takich formach leków należą: stężenie pochodnej polipeptydowej, stężenie buforu o ile się go stosuje, siła jonowa tej formy i ko-rozpuszczalniki niewodne. Na ogół, dla uzyskania jak najwyższej wydajności transportu w procesie jontoforezy, korzystne jest zminimalizowanie w takich formach farmaceutycznych stężenia wszystkich składników jonowych z wyjątkiem pochodnej polipeptydowej. Dobranie takich stężeń mieści się w zakresie umiejętności specjalistów z tej dziedziny.

176 007

Znane są różne aparaty do jontoforezy. Znane i dostępne są różne materiały elektrod nadające się do tych celów. Do takich elektrod należą elektrody platynowe lub srebro/chlorek srebrowy. Wiadomo, że różnice pomiędzy elektrodami są związane z pewnymi różnicami w sprawności. Przykładowo, użycie elektrod platynowych powoduje hydrolizę prowadzącą do uwalniania się jonów wodorowych i następnych zmian w wartości pH. Zmiany pH mogą z kolei wpływać na stan jonizacji pochodnej polipeptydowej, a więc, na jej jontoforetyczny transport. Z drugiej strony, elektrody srebro-chlorek srebrowy nie hydrolizują wody, jeśli są stosowane w aparatach dojontoforezy. Jednak elektrody srebro-chlorek srebrowy wymagają obecności jonów chlorkowych, które mogą konkurować w indukowanym prądem elektrycznym transporcie przez skórę. Wybór elektrody odpowiedniej do użycia przy podawaniu pochodnych polipeptydowych według wynalazku metodą jontoforezy mieści się w zakresie umiejętności specjalistów.

Do oceny dostarczania pochodnych polipeptydowych i środków farmaceutycznych metodą jontoforezy można również stosować sposoby z zastosowaniem skrawków skóry świńskiej, np. opisaną przez Riviere J. E. i wsp. (J. Toxicol.-Cut.& Ocular Toxicol. 8,493-5(04 1989-1990).

Nowe pochodne polipeptydu według wynalazku można podawać nie tylko drogą jontoforezy chociaż jest to najskuteczniejsza metoda podawania tych polipeptydów. Dawki skuteczne w leczeniu cukrzycy dorosłych będą się mieścić w zakresie od około 1 pg/kg do 1,000 gg/kg masy ciała/dzień o ile pochodna polipeptydowa według wynalazku będzie podawana dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. Korzystny zakres dawek przy infuzjach dożylnych podczas i pomiędzy posiłkami wynosi około 4 do 10 ng/kg/minutę albo około 0,6 do 1,4 gg/dzień w przeliczeniu na pacjenta o wadze 100 kg. Należy jednak zaznaczyć, że możliwe sąrównież dawki wykraczające poza ten zakres. Odpowiednie dawki mogą i będą określane przez lekarza i będą uwarunkowane zaawansowaniem choroby i odpowiedzią na podaną pochodną oraz wiekiem, wagą, płcią i historią choroby pacjenta. Przy jontoforetycznym podawaniu nowej pochodnej polipeptydowej według wynalazku stosuje się dawki w zakresie od około 500 do 1000 gg/dzień. Także w tym przypadku, możliwe są dawki wykraczające poza ten zakres.

Przykład I

H2N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 0; X oznacza Arg; Z oznacza CONR²R³, w którym r2 i R³ oznaczają H; R oznacza

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly_-Gl^-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly_-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2),

Tytułowy peptyd syntetyzuje się wychodząc z żywicy p-metylobenzhydryloaminowej (w formie soli HCl) stosując syntetyzer polipeptydów w fazie stałej Applied Biosystems (ABI) 430A, prowadząc syntezę w wersji ABI 1,40 opartej na cyklach N-metylopirolidon/hydroksybenzotriazol t-BOC (grupa t-butyksykarbonyloksy). Na zakończenie syntezy, w ostatnim cyklu usuwano ostatnią grupę blokującą t-BOC. Stosowano następującą ochronę łańcucha bocznego aminokwasów: Arg (Tos) (grupa toluenosulfowa), Lyc (Cl-Z) (grupa benzyloksykarbonylowa podstawiona chlorem), Trp (CHO) (grupa aldehydowa), Glu (OCyHex) (grupa cykloheksylowa), Tyr (Br-Z) (grupa benzyloksykarbonylowa podstawiona bromem), Ser (Bzl) (grupa benzylowa), Thr (Bzl) (grupa benzylowa), Asp (OCyHex) (grupa cykloheksylowa) i His (BOM) (grupa benzyloksymetylowa). Prowadzono cykle syntezy według instrukcji firmy ABI z następującymi modyfikacjami: czas zasilania hydroksybenzotriazolu do pętli pomiarowej zwiększono z 6 sekund do 10 sekund w celu zapewnienia zasilania powtarzalnego i prawidłowego; czas dostarczania hydroksybenzotriazolu do naczynia aktywacyjnego zwiększono z 12 sekund do 18 sekund. W celu zapobieżenia zatykaniu się aparatu oparami generowanymi przez naczynie reakcyjne z bezwodnikiem octowym, zmodyfikowano cykl prowadzony w naczyniu reakcyjnym w ten sposób, że po każdym zasilaniu bezwodnikiem octowym utrzymywano zwiększone ciśnienie w zaworze zamykającym. Do aktywacji Glu zastosowano cykl aktywacji ABOC11 zamiast normalnie stosowanego cyklu ABOC12. Po ostatnim usunięciu N-końcowej grupy t-BOC (t-butoksykarbonylowa) otrzymano 2,65 g żywicy z polipeptydem. Następnie z

176 007 reszty Trp usunięto formylową grupę ochronną przezjednogodzinne łagodne wstrząsanie żywicy z polipeptydem w roztworze zawierającym 2 ml H₂O, 2 ml 70% etanoloaminy w metanolu i 16 ml dimetyloformamidu. Następnie żywicę przefiltrowano, przemyto kolejno dimetyloformamidem (3x10 ml), metanolem (3 x 10 ml) i dichlorometanem (3x10 ml). Przemytą żywicę suszono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 2,84 g żywicy.

W celu oddzielenia polipeptydu od żywicy, ilość 997 mg wysuszonej żywicy traktowano mieszaniną ciekłego fluorowodoru i 10% m-krezolu w temperaturze 0°C w czasie godziny. Następnie usuwano fluorowodór przez odparowanie i rozpuszczano polipeptyd w kwasie trójfluorooctowym. Polipeptyd wytrącano eterem etylowym uzyskując 403 mg produktu w postaci osadu o barwie białej. Analiza metodą HPLC wskazywała na niecałkowite usunięcie z polipeptydu grupy formylowej blokującej resztę Trp. Dla usunięcia tych pozostałych grup formylowych 40 mg tego polipeptydu rozpuszczano w mieszaninie 3,6 ml wody i 0,4 ml 70% etanoloaminy w metanolu i pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 0,35 ml kwasu trójfluorooctowego i zbierano osad przez wirowanie w czasie 5 minut z prędkością 14,000 obrotów/minutę. Zebrany osad rozpuszczano w 4 ml 6 M chlorowodorku guanidyny i poddawano chromatografii metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, stosując 1 calową kolumnę VYDAC C18 i gradient rozpuszczalników: 100% -> 40% A, 0% -> 60% B w czasie 60 minut i szybkość przepływu 10 ml/minutę (A oznacza układ: 0,1% kwas trójfluorooctowy / 95% H2O / 5% CH3CN a B oznacza CH3CN). Otrzymano 10,5 mg tytułowego polipeptydu.

Spektrometria masowa FAB: 35 11,4 (podstawowy + H przewidywany: 35 11)

Przykład II

H₂N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 0; X oznacza Arg; Z oznacza CO₂r1 w którym R¹ oznacza H; R oznacza

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2),

Stosując procedurę opisaną w przykładzie I zmodyfikowaną tak, aby otrzymać tytułowy polipeptyd, wytworzono ogółem 2,0 g żywicy z polipeptydem. Po traktowaniu 900 mg tej żywicy z polipeptydem fluorowodorem według przepisu podanego w przykładzie I po wytrąceniu eterem etylowym z roztworu w kwasie trójfluorooctowym otrzymano 340 mg polipeptydu. Następnie, tak jak w przykładzie 1,40 mg tego polipeptydu traktowano wodnym roztworem etanoloaminy, zakwaszano, wytrącono i poddawano chromatografii uzyskując 10 mg tytułowego polipeptydu.

Spektrometria masowa FAB: 35 11,9 (podstawowy + H przewidywany 35 12)

Przykład III no

H2N-R-X-(Y)_d-Z, w którym n ma wartość 1; X i Y oznacza Arg; Z oznacza CONR^ZR^J, w którym R² i R³ oznaczają H; R oznacza

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2),

Stosując procedurę opisaną w przykładzie I zmodyfikowaną tak, aby otrzymać tytułowy polipeptyd, wytworzono ogółem 1,3 g żywicy z polipeptydem. Po traktowaniu 1,3 g tej żywicy z polipeptydem fluorowodorem według przepisu podanego w przykładzie I, po wytrąceniu eterem etylowym z roztworu w kwasie trójfluorooctowym otrzymano 671 mg polipeptydu. Następnie, tak jak w przykładzie I, 7 mg tego polipeptydu traktowano wodnym roztworem etanoloaminy, zakwaszano, wytrącano i poddawano chromatografii uzyskując 4,2 mg tytułowego polipeptydu.

Spektrometria masowa FAB: 36 67,8 (podstawowy + H przewidywany 36 67,81)

176 007

P rzykład IV

H2N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 1; X i Y oznacza Arg; Z oznacza CO2R¹, w którym Ri oznacza H; R oznacza

His-Ala-Glu-Gly-T^h·-Phe-Thr-Sor-Asp-Val-Ser-Sor-Tyr-Leu-GluGly·-Gln-Λla-Ala-Lys-Glu-Pho-Ilo-Ala-Trp-Lou-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2),

Stosując procedurę opisaną w przykładzie I zmodyfikowaną tak, aby otrzymać tytułowy polipeptyd, wytworzono ogółem, 2,66 g żywicy z polipeptydem. Po traktowaniu 1,1 g tej żywicy z polipeptydem fluorowodorem według przepisu podanego w przykładzie I po wytrąceniu eterem etylowym z roztworu w kwasie trójfluorooctowym otrzymano 490 mg polipeptydu. Następnie, tak jak w przykładzie 1,10 mg tego polipeptydu traktowano wodnym roztworem etanoloaminy, zakwaszono, wytrącano i poddawano chromatografii uzyskując 3,8 mg tytułowego polipeptydu.

Spektrometria masowa FAB: 36 69,1 (podstawowy + H przewidywany 36 68,83)

Przykład V

H2N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 0; X oznacza Arg; Z oznacza CO2R¹, w którym Ri oznacza H; R oznacza pochodną

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Sor-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2), w której to pochodnej końcowa grupa aminowa jest zablokowana resztą kwasu bursztynowego (N-alfa-sukcynoilowana) i grupy epsilonaminowe w obydwu resztach Lys są sukcynoilowane.

Do roztworu 800 μΐ (0,24 |imola) insulinotropiny (SEKWENCJA ID nr:2) w 800 μl dimetyloformamidu (DMF) dodawano kolejno 200 μg (2,0 (imole) bezwodnika bursztynowego w 20 il (DMF i 200 ig (2,0 imole) trójetyloaminy w 10 il w DMF. Klarowny roztwór mieszano w czasie 3 godzin w temperaturze otoczenia. Postępując w sposób opisany w przykładzie I i uzyskano jeden główny produkt według analizy metodą HPLC z odwróconymi fazami z wydajnością około 90% (według wyliczenia opartego na pomiarze powierzchni piku z analizy HPLC). Produkt dodano do 10 ml wody, zakwaszono kwasem trójfluorooctowym do wartości pH 2 i liofilizowano do suchej pozostałości. Wysuszony liofilizat rozpuszczono w fazie ruchomej do HPLC i oczyszczono metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, postępując w sposób podany w przykładzie I. Otrzymano homogeniczny produkt, który według oznaczeń masowej analizy widmowej z desorpcją plazmy jest trójsukcynoiloinsulinotropiną.

Wyliczona masa cząsteczkowa (M+H): 36 56,68.

Oznaczona masa cząsteczkowa: 36,582.

Przykład VI

H2N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 0; X oznacza Arg; Z oznacza CO2R¹, w którym R1 oznacza H; R oznacza pochodną sekwencji

His-Ala-Glu-Gly-'Thr-Phe-Thr-Sor-Asp-Val-Sor-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Pho-Πo-Ala-Trp-L.eu-Val-Lys-CJly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2), heksa- i hepta- sukcynoilowaną.

Postępując w sposób podany w przykładzie V, ale stosując do reakcji 100 ig (0,03 (imola) insulinotropiny (SEKWENCJA ID nr:2) zamiast 800 ig (0,24 imola) tego polipeptydu przy takich samych ilościach wszystkich innych składników reaktywnychjakie podano w przykładzie V, po 16 godzinnym mieszaniu w temperaturze otoczenia otrzymano nowy produkt (na co

17(6007 wskazuje analiza metodą HPLC). Produkt ten izolowany w sposób podany w przykładzie V, według wskazań spektrometrii masowej (ES-MS) okazał się mieszaniną heksa- 'i hepta-sukcynoilowanej insulinotropiny. Wyliczona masa cząsteczkowa dla heksa-sukcynoilowanej insulinotropiny wynosi 39 55,68, oznaczona: 39 55,9. Wyliczona masa cząsteczkowa dla hepta-sukcynoilowanej insulinotropiny wynosi 40 55,68, oznaczona: 40 55,9.

Przykład VII

H2N-R-X-(Y)n-Z, w którym n ma wartość 0; X oznacza Arg; Z oznacza CO2RI w którym Ri oznacza H; R oznacza sekwencję

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-De-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEKWENCJA ID nr: 2),

Ilość 100 gg insulinotropiny (SEKWENCJA ID nr: 2) rozpuszczano w roztworze 50 gl DMF zawierającym 20 (gl wodnego roztworu buforu tricinowego (pH = 8,75) i mieszano przez dobę w temperaturze 37°C. Analiza metodą HPLC wykonana w sposób podany w przykładzie I wykazała obecność nowego piku, który ko-eluował z produktem wytworzonym na drodze totalnej syntezy według przykładu II.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 2,00 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowe pochodne polipeptydu GLP-1, znamienne tym, że posiada pierwszorzędową strukturę

   H2N-R-X-(Y)n-Z

   R oznacza His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu, w której -GlyGln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (sekwencja numer 2) i gdzie końcowa grupa aminowa jest ewentualnie zabezpieczona przez kwas bursztynowy i grupa aminowa epsilon obu reszt Lys jest ewentualnie sukcynylowana oraz jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, w których n oznacza zero lub jeden; X i Y oznacza argininę i Z oznacza grupę karboksylową lub niepodstawiony amid.
2. 2. Nowa pochodna polipeptydu według zastrz. 1 i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole w których n oznacza zero.
3. 3. Nowa pochodna polipeptydu według zastrz. 1 i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole w których n oznacza 1.
4. 4. Nowa pochodna polipeptydu według zastrz. 1 albo 2 albo 3 i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole w których Z oznacza grupę karboksylową.
5. 5. Nowa pochodna polipeptydu według zastrz. 4 i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole w których Z oznacza niepodstawiony amid.