NO346186B1 - Anvendelse av et syklisk peptid for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av en soppinfeksjon. - Google Patents

Description

SYKLISK ANTIMIKROBIELLE PEPTIDER

Oppfinnelsens målområde

Den foreliggende oppfinnelse relaterer til anvendelse av syklisk kationiske peptider for fremstilling av medikamenter for behandlingen av soppinfeksjoner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Antimikrobielle peptider (AMP) danner hjørnestenen til eukaryotisk immunitet og gir et førstelinjeforsvar mot gjennombrytelse av huden og slimoverflatene ved mikroorganismer. Eksempler på naturlig AMP inkluderer defensin og katelicidin peptidfamiliene. Disse AMP er heterogene i lengde, sekvens og struktur, men felles for de fleste er deres lille størrelse, netto kationiske landing og amfipatiske struktur. Små, kationiske antimikrobielle peptider er også blitt isolert fra mange bakterier, sopp, planter, invertebrater og vertebrater og vil derfor også se ut til å spille en rolle i prokaryotiske forsvar.

Naturlig AMP fremviser bredspektret aktivitet mot grampositive og gramnegative bakterier, gjær, sopp og innkapslede virus. Mikrobielle patogener ser ikke ut til å oppnå resistens mot disse kationiske peptidene og som slik har AMP blitt konservert som vitale medfødte immunverts forsvarsmolekyler gjennom tusener av evolusjonsår. Det er derfor ikke overraskende at AMP har blitt implisert som potensielle mål for terapi for et stort utvalg av infeksjoner. Imidlertid vil det faktum at det er teknisk utfordrende og kostbare å produsere i rekombinante systemer samt at de har potente kjemotaksiske og betennelsesbiologiske funksjoner utelukket naturlige AMP former som terapi.

I WO2006/018652 har vi vist at lineære peptider rike på visse basiske residuer slik som lysin eller arginin innehar antimikrobiell aktivitet, og, spesielt, antisoppaktivitet. I tillegg beskriver WO2004/050685 arginininneholdende peptider som er effektive til å inhibere vekst av soppatogener og er et ytterligere eksempel på peptider med antimikrobiell aktivitet. Det gjenstår imidlertid et behov for videre midler som kan bli benyttet i behandling eller forebyggelse av mikrobielle infeksjoner.

US 6,156,730 beskriver anti-fungale peptider. WO 9503327 beskriver peptidsammensetninger som har evne til å binde Lipid A delen av endotoksiner og dermed nøytraliserer Lipid A-toksisitet.

Oppsummering ifølge oppfinnelsen

Ifølge et første aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes anvendelse av et syklisk peptid bestående av 3-15 argininaminosyrer for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av en soppinfeksjon.

I en utførelsesform består peptidet av 5-13 aminosyrer. I en utførelsesform består peptidet av 3-7 aminosyrer.

I en utførelsesform er aminosyrene D-aminosyrer. I en utførelsesform er aminosyrene L-aminosyrer.

I en utførelsesform er peptidet R-R-R-R-R-R-R.

I en utførelsesform er infeksjonen en dermotafyttinfeksjon. I en utførelsesform er dermotafyttinfeksjonen forårsaket av en dermatofytt fra slektene Trichophyton, Epidermophyton eller Microsporum. I en utførelsesform er dermotafytten Trichophyton spp. I en utførelsesform er dermotafytten Trichophyton interdigitale. I en utførelsesform er dermotafytten Trichophyton rubrum. I en utførelsesform er soppinfeksjonen onykomykose. I en utførelsesform er infeksjonen en Tinea-infeksjon. I en utførelsesform er infeksjonen en ikke-dermatofyttinfeksjon.

De sykliske peptidene ifølge oppfinnelsen er ønskelig som terapeutiske midler siden de er høyt effektive, proteolytisk stabile, i det vesentlige saltinsensitive, ikke-hepatoksiske, ikke-hemolytiske og lette å syntetisere.

Den kationiske ladningen til peptidene ifølge oppfinnelsen er antatt å fremme assosiasjon av peptidet med de polare hodegruppene av mikrobielle membraner.

Stabiliseringen av de lavere gruppene i en mer tett konformasjon ved syklisering er antatt å forsterke denne attraksjonen og derved øke det antimikrobielle kraften til peptidene.

ifølge oppfinnelsen

ifølge oppfinnelsen

Som kjent for fagpersonen kan aminosyrer innplasseres i ulike klasser avhengig primært av de kjemiske og fysiske egenskapene til aminosyrens sidekjede. For eksempel er noen aminosyrer generelt betraktet å være hydrofile eller polare aminosyrer og andre er betraktet å være hydrofobe eller ikke-polare aminosyrer. Hydrofobe aminosyrer kan bli selektert fra gruppen av hydrofobe aminosyrer bestående av glysin, lausin, fenylalamin, prolin, alanin, tryptofan, valin, isoleucin, metionin, tyrosin og treonin; kationiske aminosyrer kan bli selektert fra gruppen bestående av ornitin, histidin, arginin og lysin. Som brukt heri, kan betegnelsene ”hydrofober” og ”kationisk” referere til aminosyrer som har en hydrofobisitet som er større enn eller lik

-1,10 og/eller en netto ladning som er større enn eller lik 0 som beskrevet i Fauchere og Pliska Eur. J. Med Chem. 10:39 (1983). En hydrofobisk eller ikke-polar aminosyre kan også referere til en aminosyre som har en sidekjede som er uladet ved fysiologisk pH ikke er polar og er generelt frastøtt av vandige løsninger. Aminosyrene kan være naturlig forekommende eller syntetiske.

ifølge oppfinnelsen

X og/eller Y kan være optiske isomerer av en hydrofobisk eller kationisk aminosyre som definert heri for eksempel D eller L aminosyrer. Fortrinnsvis er X og/eller Y D aminosyrer.

I et foretrukket aspekt ifølge oppfinnelsen består peptidet av minst 90%, for eksempel av minst 95% slik som 97-99% eller til og med 100%, av D aminosyrer.

I et foretrukket aspekt ifølge oppfinnelsen peptidet av av minst 90%, for eksempel av minst 95% slik som 97-99% eller til og med 100%, av L aminosyrer.

Oppfinnelsen inkluderer også kjente isomerer (strukturelle, stereo-, konformasjons & konfigurasjons), peptidomimetiske, strukturelle analoger av de ovennevnte aminosyrer, og de modifisert enten naturlig (f.eks. post-translasjonelle modifikasjon) eller kjemisk, inkludert, men ikke utelukkende, fosforylering, glykosylering, sulfonylering og/eller hydroksylering.

I tillegg kan aminosyresekvensen til peptidet bli modifisert slik at den resulterer i en peptidvariant som inkluderer substitusjon av minst en aminosyreresidu i peptidet med en aminosyreresidu, inkludert substitusjoner som utnytter D i stedet for L formen.

En eller flere av residuene av peptidet kan bli byttet med annen for å forandre, forsterke eller bevare den biologiske aktiviteten til peptidet. Slik en variant kan ha for eksempel minst omtrent 10% av den biologiske aktiviteten av det korresponderende ikke-variant peptidet. Konservative aminosyrer er ofte benyttet, dvs. substitusjoner av aminosyrer med like kjemiske og fysiske egenskaper som beskrevet over. Derfor kan for eksempel konservative aminosyresubstitusjoner involvere bytte av lysin for arginin, ornitin eller histidin; eller bytte arginin for lysin eller isoleucin, ornitin for histidin; eller bytte en hydrofob aminosyre med en annen. Etter substitusjonene er introdusert er variantene screenet for biologisk aktivitet.

Betegnelsen ”peptid” som benyttet heri betyr, i generelle termer, et flertall av aminosyreresiduer koblet sammen ved peptidbindinger. Det er benyttet omvekslende å bety det samme som polypeptid og protein.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det sykliske peptidet selektert fra gruppen bestående av:

R-R-R-R-R-R-R

Peptidene ifølge oppfinnelsenifølge oppfinnelsen er generelt syntetiske peptider.

Peptidene kan være isolert, rensede peptider eller varianter derav, som kan bli syntetisert in vitro, for eksempel ved en fast-fase peptidsyntese fremgangsmåte, ved enzymkatalysert peptidsyntese eller ved hjelp av rekombinant DNA teknologi.

Det beskrives også en prosess for fremstillingen av et peptid ifølge oppfinnelsen, prosessen omfatter syklisering av et peptid av formel (I) eller (II) ved reaksjon av peptidet med et koblingsreagens.

Koblingsreagenset kan være et hvilket som helst reagenssom er i stand til å danne et peptidbinding mellom to terminale (C og N terminal) aminosyreresiduer til peptidet når det er i dets lineære form, for eksempel, mellom to aminosyre ryggrader eller sidekjeder. Valget av koblingsmiddel kan påvirke effektiviteten av koblingen og derfor utbyttet av det sykliske peptidet. Eksempler på koblingsmidler nyttige i prosessen ifølge oppfinnelsen er vist i tabell 1 selv om den trenede fagpersonen vil være klar over andre kjente koblingsmidler som også er nyttige i oppfinnelsen. Fortrinnsvis er koblingsmidlet HATU - O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluroniumheksafluorfosfat.

Fortrinnsvis finner reaksjonen mellom peptidet og koblingsmidlet sted i nærværet av en base. Basen kan inkludere, men er ikke begrenset til, n-metylmorfolin (NMM) eller diisopropyl-etylamin (DIEA). Fortrinnsvis finner reaksjonen sted ved alkalisk pH, for eksempel mellom pH 8,5-9. Peptidet kan bli modifisert til å inkludere en beskyttelsesgruppe før dets reaksjon med koblingsmidlet. Beskyttelsesgrupper kan inkludere Pbf (2,2,4,6,7-pentametyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl), tBu (t-butyl-eter), Mtr (metoksytrimetylbenzen sulfonyl), Pmc (2,2,5,7,8-pentametyl-kromat-6-sulfonyl klorid), Mbh (4,4-dimetyloksybenzylhydrid), Tmob (2,4,6-trimetoksybenzyl), Aloc (allyloksykarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmetoksykarbonyl) og Boc (t-butyloksykarbonyl). Etter reaksjonen med koblingsmidlet kan beskyttelsesgruppen bli fjernet ved å kløyve av beskyttelsesgruppen under milde syrebetingelser, for eksempel i nærvær av en løsning av trifluor eddiksyre (TFA).

Under ryggradsyklisering av peptidet er peptidet ved C-terminalen av det lineære peptidet eksponert til en aktiverende gruppe av koblingsreagenset og som reaksjonen fortsetter er keto-enol intermediat produsert ved alfakarbonet til denne aminosyren. Enol (eller alkenol) intermediatet kan derfor føre til produksjon av to enantiomerer når den aktiverende gruppen er fjernet fra det tilstøtende karbonet og en peptidbinding er dannet. Denne racemiseringen, dvs. dannelsen av de respektive enantiomerene av den individuelle aminosyren (for eksempel dekstroomdreiende og levoomdreiende former (dvs. henholdsvis d og l isomerer)) og produksjon av diastereomerer av peptider som et hele, kan skje ved sete til syklisering ved aktivering ved koblingsmidlet benyttet. Siden det er ønskelig for peptidene ifølge oppfinnelsen å være enantiomerisk rene bør produksjon av uønskede diastereomerer bli redusert eller forebygget. For å redusere eller forebygge denne produksjonen av diastereomerer, og produsere en diastereomerisk rent peptid, kan peptidet ifølge oppfinnelsen bli modifisert til å inkludere en achiral enhet som forebygger racemisering av peptidet under syklisering.

Derfor i et videre foretrukket aspekt er peptidet ifølge oppfinnelsen, modifisert til å inkludere en enhet som forebygger dannelsen av peptid diastereomerer under syklisering. Som benyttet heri er ”racemisk peptid” en som inneholder mengder (typisk like menger) av de respektive optiske isomerer, for eksempel dekstroomdreiende og levoomdreiende former (dvs. henholdsvis d og l isomerer), av aminosyrene ved Cterminal til peptidet før syklisering av peptidet. Enheten introdusert inn i peptidet er generelt en achiral aminosyre som kan være en naturlig forekommende aminosyre eller en aminosyreanalog. Den achirale aminosyre kan bli selektert fra gruppen bestående av lysin, β-alanin, 3-aminopropionsyre, 4-amino butyrsyre, 5-aminopentansyre og 6-aminoheksansyre. I en utførelsesform er peptidet ifølge oppfinnelsen modifiser ved C-terminal til å inkludere en achiral aminosyre, for eksempel glysin.

Likeså som å modifisere peptidet ifølge oppfinnelsen og inkludere en enhet, som definert heri, ved C-terminal ende, er ratioen av de to enantiomerene dannet under syklisering til peptidet avhengig av flere faktorer slik som løsningsmiddel benyttet, inkuberingstid og temperatur under syklisering (dvs. reaksjon med koblingsmidlet) og den aktiverende gruppen benyttet for å fremme sykliseringen.

Den foreliggende oppfinnelse relaterer videre til sykliserte peptider som kan fremskaffes ved prosessen beskrevet heri.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter det sykliske peptidet en aminosyresekvens selektert fra gruppen bestående av:

R-R-R-R-R-R-R

DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR

For å identifisere aktive peptider som har liten eller ingen uønsket toksisitet for mammalske celler, kan individuelle peptider eller bibliotek av peptider blir laget og de individuelle peptidene eller peptider fra de bibliotekene kan ble screenet for antimikrobiell aktivitet og toksisitet, inkludert, men ikke begrenset til, antifungal, antibakteriell, antiviral, antiprotozoal, antiparasittisk aktivitet og toksisitet.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan eksistere i ulike former, slik som for eksempel frie syrer, frie baser, estere og andre promedikamenter, salter og tautomerer, og oppfinnelsen inkluderer alle variantformene av sammensetningene.

Derfor omfatter oppfinnelsen saltet eller promedikamentet til et peptid eller en peptidvariant ifølge oppfinnelsen.

Peptidet ifølge oppfinnelsen kan bli administrert i form av et farmasøytisk aksepterbart salt. Farmasøytiske aksepterbare salter ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli syntetisert fra foreldrepeptidet som inneholder en basisk eller syreenhet ved konvensjonelle kjemiske fremgangsmåter. Generelt kan slike salter bli fremstilt ved å reagere den frie syre eller baseformene av peptidet med. En støkiometrisk mengde av den passende basen eller syren i vann eller i et organisk løsningsmiddel, eller i en blanding av de to; generelt, er ikke-vandige medier lik eter, etyl acetal, etanol, isopropanol, eller acetonitril foretrukket. Lister av passende salter er funnet i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. utgave, de, Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, s. 1418, redegjørelsen av hvilket herved er inkorporert ved referanse; se også Stahl et al., eds,

”Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use”, Verlag Helvetica Chimica Acta og Wiley-VCH, 2002.

Oppfinnelsen inkluderer derfor farmasøytisk aksepterbare salter av peptidet ifølge oppfinnelsen hvori foreldrepreparatet er modifisert ved å lage syre eller basesalter derav for eksempel de konvensjonelle ikke-toksiske saltene eller de kvaternære ammoniumsaltene som er dannet, f.eks. fra uorganiske eller organiske syrer eller baser. Eksempler på slike sure tilsetningssalter inkluderer acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzenesulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamfer, kamfersulfonat, syklopentanepropionat, diglukonat, dodecylsulfat, etanesulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glykerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydroiodid, 2-hydroksyetanesulfonat, laktat, maleat, malonat, metanesulfonat, 2-naftalenesulfonat, nikotinat, oxalat, palmoat, pectinat, persulfat, 3-fenylpropionat, picrat, pivalat, propionat, suksinat, tartrat, tiocyanat, tosylat, og undecanoat. Basesalter inkluderer ammoniumsalter, alkaliske metallsalter slik som natrium og kaliumsalter, alkaliske jordmetallsalter slik som kalsium og magnesiumsalter, salter med organiske baser slik som disykloheksylamin salter, N-metyl-D-glutamin, og salter med aminosyrer slik som arginin, lysin, osv. Også, de basisk nitrogeninneholdende gruppene kan bli kvaternert med slike midler som lavere alkylhalider, slik som metyl, etyl, propyl, og butyl klorid, bromider og iodider; dialkyl sulfater lik dimetyl, dietyl, dibutyl; og diamyl sulfater, lange kjedehalider slik som decyl, lauryl, myristyl og stearyl klorider, bromider og iodider, aralkyl halider lik benzyl og fenetyl bromider og andre.

Salter av karboksylgrupper av et peptid eller en peptidvariant ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt på den vanlige måten ved å kontaktbringe peptidet med en eller flere ekvivalenter av en ønsket base slik som for eksempel, en metallisk hydroksidbase, f.eks. natrium hydroksid; et metallkarbonat eller bikarbonat slik som, for eksempel natrium karbonat eller bikarbonat; eller en aminbase slik som, for eksempel trietylamin, trietanolamin og lignende.

Det beskrives også promedikamenter av de aktive farmasøytiske forbindelsene til det ønskede peptidet, for eksempel der en eller flere funksjonelle grupper er beskyttet eller derivatisert men kan bli omdannet in vivo til den funksjonelle gruppen, som i tilfellet til estere av karboksylsyrer konverterbare in vivo til den frie syren, eller i tilfelle av beskyttede aminer, til den frie aminogruppen. Betegnelsen ”promedikament” som benyttet heri representerer spesielt strukturer som er raskt transformer in vivo til foreldrestrukturen, for eksempel ved hydrolyse i blod.

Det beskrives også en farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk effektiv mengde av et peptid ifølge oppfinnelsen, eller to eller flere ulike peptider ifølge oppfinnelsen.

Sammensetningen inkluderer også en farmasøytisk aksepterbar bærer, eksipient eller fortynningsmiddel. Uttrykket ”farmasøytisk aksepterbar” er benyttet heri til å referere til de preparater, materialer, sammensetninger og/eller doseringsformer som er, innen definisjonsområdet av sunn medisinsk bedømmelse, passende for bruk i kontakt med vevene fra mennesker eller, som tilfellet kan være, et dyr uten overdrevet toksisitet, irritasjon, allergisk respons, eller andre problemer eller komplikasjoner, som er i samsvar med en akseptabel fordel/risikoratio.

I et foretrukket aspekt frembringer oppfinnelsen bruken av et peptid ifølge oppfinnelsen i fremstillingen av et medikament for å behandle en soppinfeksjon.

Et soppatogen kan være derivert fra en sopp (inkludert gjær) selektert fra, men ikke begrenset til, slektene Candida spp., (f.eks. C.albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., (f.eks. T.rubrum og T.interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (e.g. Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp. (f.eks.

Malassezia Furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella spp.

I en foretrukket bruk ifølge oppfinnelsen er soppatogenet av slekten Trichophyton spp. eller Cryptococcus spp. For eksempel kan soppatogenet være Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale eller Cryptococcus neoformans.

Soppinfeksjonen kan være systemisk, topisk, subkutan, kutan eller mukosal infeksjon.

Topiske soppinfeksjoner i neglene og hud er generelt forårsaket av dermatofytter selv om noen ikke-dermatofytter slik som gjær også kan forårsake hudinfeksjoner.

Dermatofytt infeksjon kan inkludere en ringorminfeksjon for eksempel ringorm barbae (skjegg), ringorm capitis (hode), ringorm corporis (kropp), ringorm cruris (lyske), ringorm faciei (ansikt), ringorm manuum (hånd), ringorm pedis (fot), ringorm unguium (negl), ringorm (pytiriasis) versicolor, ringorm inkognito eller ringorm nigra.

Infeksjonen kan være derivert fra sopp av slektene Epidermophyton, Microsporum og Trichophyton spp. (f.eks. T. rubrum og T. interdigitale).

Dermatofytt infeksjon kan være en infeksjon i huden, lamina, stratum corneum, megler (fingernegler og tånegler) eller hår. Av spesiell omtale er dermatofytiske infeksjoner forårsaket av dermatofytt av slekten Trichophyton, Epidermophyton eller Microsporum. Dermatofytter som skal tjene som eksempler inkludere Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Microsporum audouinii, Microsporum gypseum, Microsporum nanum, Microsporum ferrugineum, Microsporum distortum, Microsporum fulvum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var. nodulare, Trichophyton tonsurans, Trichophyton soudanese, Trichophyton violaceum, Trichophyton megnini, Trichophyton schoenlenii, Trichophyton gallinae, Trichophyton krajdenii, Trichophyton yaoundei, Trichophyton equinum, Trichophyton erinacei og Trichophyton verrucosum.

I en bestemt utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den dermatofytiske infeksjon onykomykose. Betegnelsen ”onykomykose” inkluderer, men er ikke begrenset til, distal lateral subungual, overfladisk hvit, proksimal hvit subungual, sekundær dystrofisk, primær dystrofisk, endonyx, kandidal (f.eks. onykolysisk & kronisk mukokutan sykdom) typer av onykomykose og ringorm ungium.

Ikke-dermatofytisk sopp assosiert med onykomykose inkluder Aspergillus spp.

Cephalosporum spp. Fusarium oxysproum, Scopularis brevicaulis, Scutalidium spp.

Peptidene ifølge oppfinnelsen er sterke antimikrobielle peptider for et stort utvalg av patogene organismer. Imidlertid kan peptidene ifølge oppfinnelsen også være nyttige i behandlingen av andre tilstander inkludert, men ikke begrenset til, tilstander assosiert med mukosale infeksjoner, for eksempel cystisk fibrose, gastrointestinal, urogenital, urinær (f.eks. nyreinfeksjon eller cystitt) eller respiratoriske infeksjoner.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan også være nyttige i behandlingen eller forebyggelsen av infeksjoner assosiert, typisk med hud, inkludert for eksempel inter alia, sår, magesår og lesjoner, kutane sår slik som kutt eller brennmerker, og tilstander assosiert der med.

Betegnelsen ”behandling” relaterer til effekten av peptidene beskrevet heri det i å medbringe en fordel til pasienter hardt rammet med en (infeksiøs) sykdom, inkludert en forbedring i tilstanden til pasienten eller forsinkelse i sykdomsprogresjon.

Derfor beskrives videre et substrat til hvilket et peptid ifølge oppfinnelsen er påført eller festet. Fortrinnsvis er substratet passende for anvendelser på sår eller levering til skadesteder. Fortrinnsvis tillater substratet overføring av peptidene ifølge oppfinnelsen fra substratet til en sårseng for å oppnå deres antibiotikaeffekt. Substratet kan være en bandasje, for eksempel, sårbandasje. Bandasjen kan omfatte et stoffmateriale eller det kan være et kollagenliknende materiale.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan også finne anvendelse som/i et infeksjonsmiddel. I denne sammenhengen kan peptidet ifølge oppfinnelsen eller de farmasøytiske sammensetninger bli anvendt, enten alene eller i kombinasjon med andre desinfeksjonsmidler, til en overflate som skal behandles. Som benyttet heri kan ”overflate som skal behandles” være et substrat som definert heri eller en medisinsk anordning.

Pattedyr, fugler eller andre dyr kan bli behandlet med peptidene, sammensetningene eller fremgangsmåtene beskrevet heri. Slike pattedyr og fugler inkluderer mennesker, hunder, katter og buskap, slik som hester, kveg, sauer, geiter, høner og kalkuner og lignende. Videre kan planter også bli behandlet av peptidene, sammensetninger eller fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen.

Der individet er et dyr, kan fremgangsmåten anvendes på neglliknende deler, inkludert, men ikke utelukkende på, hover, klo og labber.

Fremgangsmåten kan inkludere i tillegg til peptidbehandling, behandlinger som kan forsterke peptidinntrengningen inn i neglen. Dette kan gjøres lettere ved kjemiske eller fysiske hjelpemidler. Fysiske behandlinger, slik som negletsing eller filing av dorsallaget av neglen kan forsterke permeabiliteten av peptidene ifølge oppfinnelsen. Kjemisk forsterking av neglpermeabilitet til peptidene ifølge oppfinnelsen kan bli oppnådd ved å bryte fysiske eller kjemiske bindinger innen neglplatekeratinet.

Neglbløtgjørende midler inkludert, men ikke begrenset til , urea og salisylsyre, øker hydratisering av neglen for å minke negltetthet og kan derfor øke permeabiliteten til peptidet ifølge oppfinnelsen. Sammensetninger inneholdende sulfhydrylgrupper vil kløyve disulfidbindinger i neglkeratinet og kan føre til destabilisering og økt permeabilitet av medikamenter.

For å oppnå den ønskede effekt(er), kan peptidet, en variant derav eller en kombinasjon derav, bli administrert som enkle eller oppdelte doseringer, for eksempel, av minst omtrent 0,01 mg/kg til omtrent 500 til 750 mg/kg, av minst omtrent 0,01 mg/kg til omtrent 300 til 500 mg/kg, minst omtrent 0,1 mg/kg til omtrent 100 til 300 mg/kg eller minst omtrent 1 mg/kg til omtrent 50 til 100 mg/kg av kroppsvekt eller minst omtrent 1 mg/kg til omtrent 20 mg/kg av kroppsvekt, selv om andre doseringer kan gi fordelaktige resultater. Mengden administrert vil variere avhengig av ulike faktorer inkludert, men ikke begrenset til, peptidet valgt og dets kliniske effekter, sykdommen, vekten, den fysiske tilstanden, helsen, alderen til pattedyret, hvorvidt forebyggelse eller behandling skal oppnås, og hvis peptidet er kjemisk modifisert.

Administrasjon av de terapeutiske midlene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan være i en enkel dose, i flere doser, på en kontinuerlig eller periodevis måte, avhengig av for eksempel mottakerens fysiologiske tilstand, hvorvidt formålet med administrasjon er terapeutisk eller profylaktisk, og andre faktorer kjent for den dyktige allmennlegen. Administrasjon av peptidene ifølge oppfinnelsen kan være essensielt kontinuerlig over en forhåndsvalgt tidsperiode eller kan være i en serie av atskilte doser. Både og lokal og systemisk administrasjon er overveid.

For å fremstille sammensetningen er peptider syntetisert eller på annen måte skaffet, renset som nødvendig eller ønsket, og så lyofilisert og stabilisert. Peptidet kan så bli justert til den passende konsentrasjon og valgfritt kombinert med andre midler. Den absolutte vekten av et gitt peptid inkludert i en enhetsdose kan variere vidt. For eksempel kan omtrent 0,01 til omtrent 2 g eller omtrent 0,01 til omtrent 500 g, av minst et peptid ifølge oppfinnelsen, eller et flertall av peptider spesifikt for en bestemt celletype bli administrert. Alternativt kan enhetsdoseringen variere fra omtrent 0,01 g til omtrent 50 g, fra omtrent 0,01 g til omtrent 35 g, fra omtrent 0,1 g til omtrent 25 g, fra omtrent 0,5 g til omtrent 12 g, fra omtrent 0,5 g til omtrent 8 g, fra omtrent 0,5 g til omtrent 4 g, eller fra omtrent 0,5 g til omtrent 2 g.

Derfor kan en eller flere passende enhets doseringsformer omfattende de terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen bli administrert ved et utvalg av ruter inkludert oral, parenteral (inkludert subkutan, intravenøs, intramuskulær og intraperitoneal), rektal, dermal, transdermal, intrathorax, intrapulmonær og intranasal (respiratorisk) ruter. De terapeutiske peptidene kan også bli formulert i en lipid formulering eller for opprettholdt frigivelse (for eksempel ved å benytte mikroinkapsling, se WO 94/07529, og US patent nr. 4,962,091). Formuleringene kan, hvor passende, være bekvemt presentert i diskret enhets doseringsformer og kan være fremstilt ved hvilken som helst av fremgangsmåtene vel kjent for det farmasøytiske fagfeltet. Slike fremgangsmåter kan inkludere trinnene av å mikse det terapeutiske midlet med væskebærere, faststoff matrikser, semifaststoff bærere, fint oppdelte faststoff bærere eller kombinasjoner derav, og så hvis nødvendig introdusere eller forme produktet inn i det ønskede leveringssystemet.

Når de terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen er fremstilt for oral administrasjon er de generelt kombinert med en farmasøytisk aksepterbar bærer, fortynningsmiddel eller eksipient for å danne en farmasøytisk formulering, eller enhets doseringsform. For oral administrasjon kan peptidene være til stede som et pulver, en granulær formasjon, en løsning, en suspensjon, en emulsjon eller i en naturlig eller syntetisk polymer eller resin for innføring av de aktive ingrediensene fra en tyggegummi. De aktive peptidene kan også være presentert som en stor pille, avføringsmiddel eller pasta. Oral administrerte terapeutiske peptider ifølge oppfinnelsen kan også bli formulert for vedvart frigivelse, dvs. peptidene kan bli lagt, mikroinnkapslet, eller på annen måte plassert innen en vedvarende leveringsanordning. Summen av de aktive ingrediensene i slike formuleringer omfatter fra 0,1 til 99,9% ved vekt av formuleringen.

Farmasøytiske formuleringer inneholdende de terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet ved å benytte velkjente og lett tilgjengelige ingredienser. For eksempel kan peptidet bli formulert med alminnelige eksipienter, fortynningsmidler, eller bærere, og formes over i tabletter, kapsler, løsninger, suspensjoner, pulvere, aerosoler og lignende. Eksempler på eksipienter, fortynningsmidler, og bærere som er passende for slike formuleringer inkluderer buffere, likeså som fyllmasser og ekstendere slik som stivelse, cellulose, sukker, mannitol og sure derivater. Bindemidler kan også bli inkludert slik som karboksymetyl cellulose, hydroksymetylcellulose, hydroksypropyl metylcellulose og andre cellulosederivater, alginater, gelatin og polyvinylpyrrolidon. Fuktemidler kan bli inkludert slik som glyserol, disintegreringsmidler slik som kalsium karbonat og natrium bikarbonat. Midler for å forsinke oppløsning kan også bli inkludert slik som parafin. Oppsugningsakseleratorer slik som kvaternære ammoniumsammensetninger kan også bli inkludert. Overflateaktive midler slik som cetylalkohol og glyserolmonostearat kan bli inkludert. Adsorberende bærere slik som kaolin og bentonitt kan bli tilsatt.

Smøremidler slik som talkum, kalsium og magnesium stearat, og faststoff polyetyl glykoler kan også bli inkludert. Konserveringsmidler kan også bli tilsatt.

Sammensetningene kan også inneholde fortykningsmidler slik som cellulose og/eller cellulosederivater. De kan også inneholde gummi slik som xantan, guar eller karbogummi eller arabisk gummi, eller alternativt polyetylen glykoler, betoner og montmorrilonitter og lignende.

For eksempel kan tabletter eller kapletter inneholdende peptidene ifølge oppfinnelsen inkludere buffere slik som kalsiumkarbonat, magnesiumoksid og magnesiumkarbonat. Passende buffere kan også inkludere eddiksyre i et salt, sitronsyre i et salt, borsyre i et salt og fosforsyre i et salt. Kapletter og tabletter kan også inkludere inaktive ingredienser slik som cellulose, pregelatinisert stivelse, silikon dioksid, hydroksyl propyl metyl cellulose, magnesium stearat, mikrokrystallinsk cellulose, stivelse, talkum, titanium dioksid, benzosyre, sitronsyre, maisstivelse, mineralolje, polypropylen glykol, natriumfosfat, sinkstearat, og lignende. Harde eller myke gelatinkapsler inneholdende minst et peptid ifølge oppfinnelsen kan inneholde inaktive ingredienser slik som gelatin, mikrokrystallinsk cellulose, natrium lauryl sulfat, stivelse, talkum og titanium dioksid, og lignende, likeså som væsker slik som polyetylen glykoler (PEG) og vegetabilsk olje. Videre er tarmbelagte kapletter eller tabletter inneholdende et eller flere peptider ifølge oppfinnelsen designet til å motstå oppløsning i magen og løses i det mer nøytrale til alkaliske miljøet i tolvfingertarmen.

De terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen kan også bli formulert som eliksirer eller løsninger for konvensjonell oral administrasjon eller som løsninger passende for parenteral administrasjon, for eksempel ved intramuskulær, subkutan, intraperitoneal eller intravenøse ruter. De farmasøytiske formuleringene til de terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen kan også ta form som en vandig eller anhydrøs løsning eller dispersjon, eller alternativt formen av en emulsjon eller suspensjon eller salve.

Derfor kan de terapeutiske peptidene bli formulert for parenteral administrasjon (f.eks. ved injeksjon, for eksempel, bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon) og kan bli presentert i enhets doseform i ampuller, forhåndsfylte srøyter, små volum infusjonscontainere eller i multidosecontainere. De aktive peptidene og andre ingredienser kan danne suspensjoner, løsninger, eller emulsjoner i olje eller vandige løsningsmidler, og kan inneholde formuleringssmidler slik som suspensjons-, stabiliserings og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan de aktive peptidene og andre ingredienser være i pulverform, oppnådd ved aseptisk isolering av sterilt faststoff eller ved lyofilisering fra løsning før sammensetning med en passende løsningsmiddel, f.eks. sterilt, pyrogenfritt vann, før bruk.

Disse formuleringene kan inneholde farmasøytiske aksepterbare bærere, løsningsmidler og adjuvanter som er vel kjent innen fagfeltet. Det er mulig for eksempel å fremstille løsninger ved å benytte en eller flere organiske løsningsmidler som er akseptable ut fra et fysiologiske ståsted, valgt i tillegg til vann, fra løsningsmidler slik som aceton, eddiksyre, etanol, isopropyl alkohol, dimetyl sulfoksid, glykol etere slik som produktene solgt under navnet ”Dowanol”, polyglykoler og polyetylen glykoler, C1-C4 alkyl estere av kortkjedesyrer, etyl eller isopropyl laktat, fettsyre triglyserider slik som produktene markedsført under navnet ”Miglyol”, isopropyl mytrisat, dyreoljer, mineraloljer og planteoljer og polysiloksaner.

Løsningsmidler eller fortynningsmidler omfattende peptidene ifølge oppfinnelsen kan inkludere sure løsninger, dimetylsulfon, N-(2-merkaptopropionyl) glysin, 2-n-nonyl-1,3-dioksolan og etyl alkohol. Fortrinnsvis er løsningsmidlet/fortynningsmidlet et surt løsningsmiddel, for eksempel, eddiksyre, sitronsyre, borsyre, melkesyre, propionsyre, fosforsyre, benzosyre, butyrsyre, malsyre, malonsyre, oksalsyre, ravsyre eller tartarsyre.

Også overveiet er kombinasjonsprodukter som inkluderer en eller flere peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse og en eller flere andre antimikrobielle eller antifungale midler, for eksempel polyener slik som amfotericin B, amfotericin B lipidkompleks (ABCD), liposomal amfotericin B (L-AMB), og liposomal nustatin, azoler og triazoler slik som voriconazol, fluconazol, ketoconazol, itraconazol, pozaconazol og lignende; glukan syntaseinhibitorer slik som caspofungin, micafungin (FK463), og V-echinocandin (LY303366); griseofulvin; allylaminer slik som terbinadin, flucytosin eller andre antifungale midler, inkludert de beskrevet heri. I tillegg er det også overveiet at peptidene kan være kombinert med topiske antifungale midler slik som ciclopirox olamin, haloprogin, tolnaftat, undecylenat, topikal nysatin, amorolfin, butenafin, naftifin, terbinafin, og andre topiske midler.

I tillegg kan peptidene bli formulert som vedvarende Frigivelsesdoseringsformer og lignende. Formuleringene kan bli satt sammen slik at de frigir det aktive peptidet for eksempel i en bestemt del av tarmen eller luftveiene, muligens over en tidsperiode. Belegg, hylstere, og beskyttelsesmatrikser kan bli laget for eksempel fra polymeriske substanser, slik som polylactide-glykolater, liposomer, mikroemulsjoner, mikropartikler, nanopartikler, eller voks. Disse beleggene, hylsterne, og beskyttelsesmatriksene er nyttige for å belegge iboende anordninger, f.eks. stenter, katetere, peritoneal dialyseslanger, dreneringsanordninger og lignende.

For topisk administrasjon kan de aktive midlene bli formulert som det er kjent innen fagfeltet for direkte påføring til målområdet. Former hovedsakelig beregnet for topisk påføring tar form av for eksempel kremer, melk, geler, pulvere, dispersjon eller mikroemulsjoner, lotioner fortykket i et større eller mindre omfang, impregnerte pader, salver eller sticks, aerosolformuleringer (f.eks. sprayer eller skum), såper, detergenter, lotioner eller såpestykker. Andre konvensjonelle former for dette formålet inkluderer sårforbindinger, belagte bandasjer eller andre polymerbelegg, salver, kremer, lotioner, pastaer, geleer, sprayer, og aerosoler. Derfor kan de terapeutiske peptidene ifølge oppfinnelsen bli levert via plastere eller bandasjer for dermal administrasjon. Alternativt kan peptidet bli formulert til å være del av et adhesive polymer, slik som polyakrylat eller akrylat/vinyl acetat kopolymer. For langtidsanvendelser kan det være ønskelig å benytte mikroporøse og/eller pustende støttelamineter slik at hydrering eller bløtgjøring av huden kan bli minimalisert. Støttelaget kan være av en hvilken som helst passende tykkelse som vil gi de ønskede beskyttelses og støttefunksjoner. En passende tykkelse vil generelt være fra omtrent 10 til omtrent 200 mikron.

Topisk administrasjon kan være i form av et neglbelegg eller lakk. For eksempel kan de antifungale peptidene bli formulert i en løsning for topisk administrasjon som inneholder etylacetat (NF), isopropylalkohol (USP), og butylmonoester av poly[metylvinyl eter/maleinsyre] i isopropylalkohol.

Farmasøytiske formuleringer for topisk administrasjon kan omfatte for eksempel en fysiologisk aksepterbar bufret saltløsning inneholdende mellom omtrent 0,001 mg/ml og omtrent 100 mg/ml, for eksempel mellom 0,1 mg/ml og 10 mg/ml, av en eller flere av peptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse spesifikt for indikasjon eller sykdommen som skal behandles.

Salver og kremer kan for eksempel bli formulert med en vandig eller oljet base med tilsetningen av passende fortykning og/eller gelatineringsmidler. Lotioner kan bli formulert med en vandig eller oljet base og vil generelt også inneholde en eller flere emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspenderingsmidler, fortykningsmidler eller fargestoffer. De aktive peptidene kan også bli levert via iontoforese, f.eks. som beskrevet i US patent nr.4,140,122; 4,383,529; eller 4,051,842. Prosentandelen ved vekt av et terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen til stede i en topisk formulering vil avhenge av ulike faktorer, men vil generelt være fra 0,01% til 95% av den totale vekten av formuleringen, og typisk 0,1-85% ved vekt.

Dråper, slik som øyedråper eller nesedråper kan bli formulert med en eller flere av de terapeutiske peptidene i en vandig eller ikke-vandig base som omfatter en eller flere dispergeringsmidler, oppløsningsmidler eller suspenderingsmidler. Væskesprayer kan bli pumpet, eller er hensiktsmessig avlevert fra trykksatte forpakninger. Dråper kan bli levert via en enkel øye dråpetellerflaske, via en plastikkflaske tilpasset å levere væskeinnhold dråpevis, eller via en spesialformet lukking .

Det terapeutiske peptidet kan videre bli formulert for topisk administrasjon i munnen eller halsen. For eksempel kan de aktive ingrediensene bli formulert som en pastill videre omfattende en smaksbase, vanligvis sukrose og akasia eller tragakant; pastiller omfattende sammensetningen i en inert base slik som gelatin og glyserin eller sukrose og akasia; og munnvask omfattende sammensetingen i en passende væskebærer.

Spesifikke ikke-begrensende eksempler på bærere og/eller fortynningsmidler som er nyttige i den farmasøytiske formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer vann og fysiologisk aksepterbar bufrede saltløsninger slik som fosfatbufret saltløsning pH 7,0-8,0.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan også bli administrert til luftveiene. For administrasjon ved inhalasjon eller utblåsning kan sammensetningen ta form av et tørt pulver for eksempel en pulvermiks av det terapeutiske midlet og en passende pulverbase slik som laktose eller stivelse. Terapeutiske peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også bli administrert i en vandig løsning når det administreres i en aerosol eller inhalert form. Derfor kan andre aerosolfarmasøytiske formuleringer omfatte for eksempel en fysiologisk aksepterbar bufret saltløsning inneholdende mellom omtrent 0,001 mg/ml og omtrent 100 mg/ml for eksempel mellom 0,1 og 100 mg/ml, slik som 0,5-50 mg/ml, 0,5-20 mg/ml, 0,5-10 mg/ml, 0,5-5 mg/ml eller 1-5 mg/ml av en eller flere av peptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse spesifikt for indikasjonen eller sykdommen som skal behandles.

Gjennom beskrivelsen eller kravene av denne spesifikasjonen betyr ordene ”omfatte” og ”inneholde” og variasjoner av ordene, for eksempel ”omfattende” og ”omfatter”, ”inkludert men ikke begrenset til”, og er ikke ment å (og gjør ikke) ekskludere andre enheter, tilsetninger, komponenter, heltall eller trinn.

Gjennom beskrivelsen og kravene til denne spesifikasjonen omfatter entallsformen også flertallsformen hvis ikke sammenhengen krever annet. Spesielt hvor ubestemt artikkel er benyttet er spesifikasjonen ment å bli forstått som forventende flertall likeså som entall, hvis ikke sammenhengen krever annet.

Kjennetegn, heltall, karakteristika, preparater, kjemiske enheter eller grupper beskrevet i sammenheng med et bestemt aspekt, utførelsesform eller eksempel ifølge oppfinnelsen er å bli forstått til å være anvendelig til et hvilket som helst annet aspekt, utførelsesform eller eksempel beskrevet heri hvis ikke inkompatibelt dermed.

EKSEMPLER

Materialer og fremgangsmåter

Eksempel 1 (kun til illustrasjon)

Syklisering av et 7 aminosyre polylysin peptid ble gjennomført ved å løse 1eq av beskyttet peptid med 1eq (eq=ekvivalent volum) av HATU i DMF (dimetylformamid) ved 100 mg/ml. For å øke pH ble 2,5eq av DIEA (diisopropyletylamin) tilsatt og progresjon av reaksjonen fulgte ved HPLC. Når ferdig ble peptidet presipitert i vann og vasket i videre vann. Peptidet ble så tørket og de-beskyttet med hydrofluorsyre for å produsere det endelige sykliske peptidet. Ionebyttekromatografi blir så benyttet for å erstatte hydrofluorsyre løsningsmidlet med eddiksyre før lyofilisering.

Eksempel 2

Syklisering av et 7 aminosyre polyarginin peptid ble gjennomført ved å kombinere 1eq av beskyttet peptid med 5eq av NaHCO3 (natrium bikarbonat) og 2eq av PyBOP oppløst i DMF ved 28,5 mg/ml. Reaksjonen ble fulgt av TLC og når ferdig ble peptidet presipitert i vann og vasket i videre vann. Peptidet ble så tørket og de-beskyttet med hydrofluorsyre for å produsere det endelige sykliske peptidet. Ionebyttekromatografi blir så benyttet for å erstatte hydrofluorsyre løsningsmidlet med eddiksyre før lyofilisering.

Eksempel 3

Syklisering av et 7 aminosyre polyarginin peptid:

Løsning 1: 57 g av HBTU (Mwt=379,3, 0,15 mmol) eller 57 g av HATU (M=380,3, 0,15 mmol) og 60 µl av 0,92 mg/ml NMM (n-metylmorfolin, Mwt=101,2, 0,55 mmol) ble løst i 2,86 ml av DMF.

Løsning 2: 288 mg av H-[Arg(Pbf)]7-OH (Mwt=2877,6, 0,1 mmol) (7 aminosyre polyarginin peptid) ble løst i 0,71 ml av DMF.

Løsning 2 ble tilsatt dråpevis til løsning 1 i løpet av 30 min. pH ble sjekket med vått pH papir og må være 8,5-9. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur over natt*. Blandingen ble konsentrert under vakuum. En løsning av NaHCO3 (5%) ble tilsatt. Presipitatet av beskyttet syklopeptid ble filtrert og vasket med vann.150-200 mg ble oppnådd. Kløyvingen av Pbf grupper ble gjennomført i TFA/vann (95/5, v/v) (10 ml for 1 g av beskyttet syklopeptid). Blandingen ble konsentrert og IPE ble tilsatt for å presipitere råproduktet.100-110 mg av rå sykloArg ble oppnådd.

(*Koblingen som benyttet HATU var komplett etter 5 timer. Kvantitet av NMM avhenger av overskudd av TFA i H-[Arg(Pfb)]7-OH).

De sykliske peptidene er syntetisert til å være minst 95% enantiomerisk rene, og tenderer å variere mellom 97 og 99%. De er minst 95% enantiomerisk rene som syntetisert ved denne fremgangsmåte.

Saltløsningsfortynning antifungal følsomhetstesting

Sensitiviteten av relevante soppstammer til de sykliserte peptidene ble bestemt ved å benytte Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI; tidligere NCCLS) godkjente standarder. Soppfølsomhet ble testet ved å benytte «Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard M38-P», og gjærfølsomhet ble testet ved å benytte “Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard – Second Edition M27-A”.

Saltløsningsfortynning antibakteriell følsomhetstesting

Sensitiviteten av relevante bakteriestammer til de sykliserte peptidene ble bestemt ved å benyttet Clinical Laboratyr Standard Institute (CLSI; tidligere NCCLS) godkjente standarder. Bakteriell følsomhet ble testet ved å benytte “Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Anaerobically; Approved Standard – Seventh Edition M7-A7”

Hemolyseanalyse

Peptidet under studiet ble alikvotert ved den ønskede konsentrasjon i triplikater i Nunc 96 brønners plater, og serie 1:1 fortynninger (100 µl) ble laget.100 µl av vasket (3 vasker av 50 ml HBSS) sammenslåtte humane røde blodceller (RNC) (1x10<8 >RBC/ml) ble tilsatt til testbrønnene og inkubert ved 37<o>C i 3 timer. Etter inkubering ble ennå 100 µl av HBSS tilsatt til alle brønnene og platen ble inkubert ved 4<o>C over natt.100 µl av supernatanten ble fjernet og plassert i en ny mikrotiterplate som ble lest i en Sunrise plateleser (Tascam) ved 450/620 nm. Kontrollbrønner (kvadruplikater) av buffer alene, buffer og RBC, og H2O og RBC ble også inkludert. Dataene ble plottet og statistisk analysert ved å benytte Graph Pad (Prism software).

Resultater

Sekvens av sykliserte peptider

Sekvensen av peptidene analysert er som følger:

Peptid1: Syklisk-K-K-K-K-K-K-K*

Peptid 2: Syklisk-R-R-R-R-R-R-R

Peptid 3: Syklisk-K-K-K-K-K-K-K-G*

Peptid 4: Syklisk-R-R-R-R-R-R-R-G

Peptid 5: CSyklisk-O-O-O-O-O-O-O-G*

Peptid 6: Syklisk-DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR-G

Peptid 7: Syklisk-DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO-G*

Peptid 8: Syklisk-DK-DK-DK-DK-DK-DK-DK-G*

* kun til illustrasjon

Forstavelsen ‘D-‘ indikerer At en D-isomer av aminosyren ble benyttet i syntesen av peptidet. ‘O’ representerer den ikke-naturlige aminosyren ornitin.

Sykliske peptider bestående av 3, 5, 9, 11, 13 eller 15 arginin eller lysin aminosyrer har blitt syntetisert og aktivitet har blitt bestemt (data ikke vist).

Antibakteriell aktivitet av sykliserte peptider (kun til illustrasjon)

Kulturer av E.coli og Staphylococcus ureus ble eksponent mot peptid 1 og MIC etter vekst over de følgende 16 timer ved 37<o>C var en 1 mM for begge organismer (tabell 2). Peptid 1 inhiberte total vekst av både E.coli og Staphylococcus ureus ved denne konsentrasjonen.

Dette eksperimentet ble gjentatt med peptid 2. MIC for peptid 2 versus E.coli var 0,1 mM; MIC for peptid 2 versus S. aureus var 1,0 mM. Dette indikerer en signifikant innvirkning av de sykliserte peptidene på bakteriell aktivitet.

Lineære peptider korresponderer i størrelse til peptider 1 og 2 viste signifikant aktivitet enn henholdsvis peptidene 1 og 2.

Antifungal aktivitet av sykliserte peptider versus Trichophyton rubrum

T. rubrum ømfintlighet mot peptidet 1-8 ble testet. Peptid 1 viste en MIC på 0,1 mM versus kulturer av T. rubrum (tabell 2). Peptid 2 viste en MIC på 0,25 mM versus kulturer av T. rubrum.

Linære peptider korresponderende i størrelser til peptider 1 og 2 viste signifikant lavere aktivitet enn henholdsvis peptidene 1 og 2.

Peptider 3-8 hadde en enkel glysinresidu introdusert inn i den sykliske peptidringen. Derfor er peptider 3-88 aminosyrer i lengde sammenliknet med 7 aminosyrer for peptider 1 og 2. Peptider 3-6 viste alle antifungal aktivitet mot T.rubrum (MIC (mM) henholdsvis 4,0, 2,0, 4,0, 1,0). Peptider 7-8 viste ikke antifungal aktivitet mot T.rubrum ved den maksimale konsentrasjon testet (4 mM).

Peptider 3-6 viste antifungal aktivitet, men introduksjon av den ikke-kationiske aminosyren glysin reduserte signifikant antifungal aktivitet. For eksempel kan dette bli sett i aktiviteten av peptid 2 (ingen glysin; MIC = 0,2 mM) sammenliknet med peptid 4 (glysin tilsatt; MIC = 2,0 mM) (tabell 2). Disse data viser at antifungal aktivitet er til stede i sykliske peptider av både og 7 og 8 aminosyrer i lengde, men at peptider av redusert kationisitet er mindre antifungale mot T.rubrum.

Inhibering av Trichophyton interdigitale ved sykliserte peptider

T. interdigitale ømfintlighet mot peptider 2-8 ble testet. Antifungal aktivitet av peptider 2-8 mot T. interdigitale er vist i tabell 2. Peptider 2, 4 og 6 er aktive mot T. interdigitale.

Inhibering av Cryptococcus neoformans ved sykliserte peptider

C. neoformans ømfintlighet mot peptider 4 og 6-8 ble testet ved å benytte ”referansefremgangsmåte for broth fortynning antifungal ømfintlighetstesting av gjær; godkjent standard – andre tugave M27-A”.

Tabell 2 viste at kationiske sykliske peptider 4 og 6-8 er antifungele versus den patogene gjæren C. neoformans (MIC = 1,0 mM, 0,5 mM, 2,0 mM og henholdsvis 0,5 mM).

Antimikrobielle aktivitet av peptid 2 versus selekterte mikrobielle patogener (kun til illustrasjon)

Den antimikrobielle aktiviteten av peptid 2 mot 60 utvalget mikrobielle patogener er vist i tabell 3. Som kan bli sett er den største antimikrobielle aktiviteten (dvs. laveste MIC) konsekvent sett mot sopp, spesielt dermatofytter, Scopulariopsis brevicaulis, Malassezia furfur, ikke-albican Candida spp og bakterien E.coli.

Effekt av bruken av enantiomeriske aminosyrer i de sykliserte peptidene Sammenlikning av den inhibitoriske effekten av all-L og all-D sykliske kationiske peptider er vist i tabell 2. Peptider 4 og 6 er all-L og all-D ekvivalente sykliske kationiske peptider inneholdende aminosyrene arginin (7 aa) og glysin (1 aa).

Antifungal aktivitet mot T. rubrum er større for all-D versjonen enn all-L versjonen (MIC = henholdsvis 1,0 og 2,0 mM). Antifungal aktivitet mot T. interdigitale er større for all-D versjonen enn all-L versjonen (MIC = 0,25 og henholdsvis 0,5 mM).

Antifungal aktivitet mot gjøren C. neoformans er større for all-D versjonen enn for all-L versjonen (MIC = 0,5 og henholdsvis 1,0 mM). Dette indikerer at all-D versjonen av dette peptidet er mer aktivt enn all-L versjonen.

Peptider 3 og 8 er all-L og all-D ekvivalente sykliske kationiske peptider inneholdende aminosyrene lysin (7 aa) og glysin (1 aa). Antifungal aktivitet mot T. rubrum er større for all-L versjonen enn all-D versjonen (MIC = 4,0 og henholdsvis > 4,0 mM). Ingen peptid viste antifungal aktivitet mot T. interdigitale (MIC >4,0 mM for begge peptider).

Hemolytisk aktivitet av sykliserte peptider

Den hemolytiske aktiviteten av sykliske kationiske peptider (tabell 4) er ubetydelig ved konsentrasjoner i overskudd av de som viser antifungal aktivitet.

Hepatotoksisitet av sykliserte peptider

Peptider 2, 9 og 10 viste ingen hepatotoksisitet ved konsentrasjoner lik de som vister antifungal aktivitet.

Tabell 1- koblingsreagenser

Tabell 2: Antimikrobiell aktivitet (MIC; mM) av sykliserte peptider versus utvalgte mikrobielle patogener

Tabell 3: Antimikrobiell aktivitet (MIC; mM) av peptid 2 versus utvalgte mikrobielle patogener

<1>

MRSA (Methicillin-resistant S. aureus)

<1 >Referansenummer: DM2006517; DM2006902; DM2006932; DM2006953; DM20061008; DM20061093; DM20061377

<1 >MSSA (Methicillin-sensitive S. aureus)

<1 >Referansenummers: 97.2935.K; 98.1695.K; 97.2637.D; 98.2028.X; 05.5240.R; 00.9523.R; 03.8996.T; 98.1515.F; 00.5472.R; 00.1039.P; 02.6225.E; 03.3200.J; 01.7995.S; 03.8951.G; 00.9521.M; 97.1636.D

<1 >MRSA (Methicillin-resistant S. aureus)

<2 >Reference Numbers: DM2006517; DM2006902; DM2006932; DM2006953; DM20061008; DM2006 1093; DM20061377

<3 >MSSA (Methicillin-sensitive S. aureus)

<4 >Reference Numbers: 97.2935.K; 98.1695.K; 97.2637.D; 98.2028.X; 05.5240.R; 00.9523.R; 03.8996.T; 98.1515.F; 00.5472.R; 00.1039.P; 02.6225.E; 03.3200.J; 01.7995.S; 03.8951.G; 00.9521.M; 97.1636.D

Tabell 4: Hemolytisk aktivitet av utvalgte peptider versus røde blodceller

Claims (14)

Patentkrav

1.

Anvendelse av et syklisk peptid bestående av 3-15 argininaminosyrer for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av en soppinfeksjon.

2.

Anvendelse ifølge krav 1, der peptidet består av 5-13 aminosyrer.

3.

Anvendelse ifølge krav 1, der peptidet består av 3-7 aminosyrer.

4.

Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, der aminosyrene er D-aminosyrer.

5.

Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, der aminosyrene er L-aminosyrer.

6.

Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, der peptidet er

R-R-R-R-R-R-R.

7.

Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, der infeksjonen er en dermotafyttinfeksjon.

8.

Anvendelse ifølge krav 7, der dermotafytten er fra slektene Trichophyton, Epidermophyton eller Microsporum.

9.Anvendelse ifølge krav 8, der dermotafytten er Trichophyton spp.

Anvendelse ifølge krav 9, der dermotafytten er Trichophyton interdigitale.

11.

Anvendelse ifølge krav 9, der dermotafytten er Trichophyton rubrum.

12.

Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, der soppinfeksjonen er onykomykose.

13.

Anvendelse ifølge kravene 1 – 6, der infeksjonen er en Tinea-infeksjon.

14.

Anvendelse ifølge kravene 1 – 6, der infeksjonen er en ikke-dermatofyttinfeksjon.