KR20200016941A

KR20200016941A - N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 합성 방법

Info

Publication number: KR20200016941A
Application number: KR1020207000271A
Authority: KR
Inventors: 겐이치 노무라; 데루시게 무라오카; 미키마사 다나다; 다카시 에무라
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2020-02-17
Also published as: JP7550898B2; EP3636656A1; CN110799520A; EP3636656A4; KR20230169447A; KR102610527B1; US20200277327A1; US20230138226A1; US20230406879A1; WO2018225851A1; JPWO2018225851A1; CN110799520B; US11787836B2; US11542299B2; JP7229158B2; JP2023053290A; CN118772227A

Abstract

본 발명에 따른 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법은, Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체, 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 준비하는 공정, Fmoc 보호 아미노산 등의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하는 공정, 및 새로운 Fmoc 보호 아미노산 등을 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정을 포함하고, 펩타이드의 제조가 고상법에 의해 행해지는 경우에는, 얻어진 펩타이드를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 것을 특징으로 한다. 또한, 얻어진 펩타이드의 적어도 1개의 측쇄가, 염기성 조건하에서는 탈보호되지 않고 TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호되는 보호기를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 합성 방법

본 발명은, N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 합성에 있어서, 고순도로 또한 높은 합성 효율로 합성하는 것이 가능한 펩타이드의 신규한 합성 방법에 관한 것이다.

펩타이드는 의약품으로서 지금까지 40종 이상이 출시되어 있는 가치 높은 화학종이다(비특허문헌 1). 그 중에서도, 환상 펩타이드나 N-메틸화(혹은 N-알킬화)된 비천연형 펩타이드는, 지용성의 향상에 의한 막투과성의 향상이나, 가수분해 효소에 대한 내성 획득에 의한 대사 안정성의 향상이 전망되고 있다(비특허문헌 2). 최근, 세포 내로 이행시키거나 경구제로 하거나 하기 위한 관건이 되는 드러그-라이크(약 유사성: 바람직하게는, 막투과성과 대사 안정성의 양립을 나타낸다.) 환상 펩타이드에 대한 고찰이 진행되고 있다(비특허문헌 3, 4). 또한, 드러그-라이크 환상 펩타이드에 필요하게 되는 조건을 분명히 한 특허문헌이 공개되어(특허문헌 1), 창약에 있어서의 그 중요성과 그 인지도가 높아지고 있다.

한편으로, N-알킬아미노산 등으로 대표되는 비천연형 아미노산을 수많이 포함하는 펩타이드 합성법의 개발의 진척은 비교하면 한정적이다. 대부분이 천연형 펩타이드에서 확립된 수법을 그대로 비천연형 펩타이드에 적용하고 있다.

펩타이드의 합성법으로서, Fmoc법과 Boc법이 널리 알려져 있고, 이들 중 많은 지견은, 천연형 펩타이드의 합성법의 개발로부터 얻어졌다. Fmoc기는 산에 대해서 안정하기 때문에, N말단의 아미노기를 Fmoc기로 보호했을 경우, 그 탈보호 반응은 DBU나 피페리딘과 같은 염기에 의해 행한다. 그 때문에, 펩타이드 측쇄 작용기의 보호기로서, 예를 들어 산으로 탈보호 가능한 것을 이용하여, N말단의 아미노기의 선택적인 탈보호를 행하여 펩타이드쇄의 신장을 행한다. 자주 이용되는 보호기로서, Fmoc법에서는 아미노산 측쇄의 보호기로는 t-뷰틸(tBu)기나 트라이틸(Trt)기 등, 트라이플루오로아세트산(TFA) 정도의 산으로의 탈보호가 가능한 것을 채용할 수 있어, Boc법에 비해 온화한 조건에서, 수지로부터의 펩타이드의 절출 공정이나 측쇄 작용기의 보호기의 탈보호를 행할 수 있다.

그렇지만, 비교적 온화한 조건에서의 수지로부터의 절출 공정이나 측쇄 작용기의 보호기의 탈보호를 행할 수 있는 Fmoc법에 의한 고상 합성법에 있어서도, TFA를 이용한 수지로부터의 절출 공정 혹은 측쇄 작용기에 갖는 보호기의 탈보호 공정 에 있어서, N-알킬화된 펩타이드 합성에는 이하와 같은 문제점이 있음이 밝혀져 왔다.

통상, Fmoc법으로 펩타이드 합성을 행했을 경우, 수지로부터의 절출 공정이나 측쇄 작용기의 보호기의 탈보호는, TFA를 이용하는 것이 일반적이다. 많은 경우, 수지로부터의 절출 반응과 측쇄 작용기의 탈보호 반응을, 90% TFA 수용액을 이용하여, 동시에 행한다. 그렇지만, N-메틸화된 펩타이드, 특히 N-메틸아미노산이 연속하고 있는 서열의 경우에는, 옥사졸륨 경유로의 산 가수분해가 진행되어, 펩타이드쇄가 절단되어 버리는 부반응이 알려져 있다(비특허문헌 5, 6). 또한, 세린이나 트레오닌과 같은 β-하이드록시기를 갖는 아미노산이 서열 중에 포함되어 있는 펩타이드의 경우에는, TFA를 이용한 이들 공정에 있어서, 산 가수분해뿐만 아니라, N→O 아실 시프트 반응도 부반응으로서 진행되어, 뎁시펩타이드화되어 버릴 가능성이 있음이 알려져 있다(비특허문헌 7, 8).

이 산을 이용한 절출 공정 및 탈보호 공정에 있어서의 가수분해의 문제에 대해서는, 저농도의 TFA 용액을 이용하여, 반응 시간을 짧게 제어함으로써 회피하려고 하는 시도가 행해지고 있다. 예를 들어 Albericio 등의 보고에 의하면, NMe-IB-01212라고 명명된 펩타이드의 고상 합성 시, N-메틸화된 환상 헥사펩타이드에 포함되는 아미노기 상의 Boc기의 탈보호를 TFA-DCM(1:1)의 용액으로 행했을 경우, N-Me 부위에서의 펩타이드의 분해가 인정되었다. 분해를 피할 수 있도록, 보다 저농도의 TFA를 이용하거나, 반응 시간을 최소한으로 하거나 함으로써 개선을 시도하고 있지만, 충분한 개선에는 이르지 않았다(비특허문헌 9). 애초, 지금까지의 펩타이드 합성에 범용되는 보호기에서는, 저농도의 TFA 용액에서의 탈보호 공정에서는, 수지로부터의 절출 반응은 만족할 수 있는 속도로 진행되는 한편, 측쇄의 탈보호 반응이 진행되지 않거나, 진행이 극단적으로 늦는 경우가 있다.

또한, 고도로 N-메틸화된 펩타이드의 가수분해와 동일한 반응 기구로 진행되는 N말단의 Ac-MePhe의 절단을 막기 위해서, Fang 등은 TFA를 이용하여 반응 온도를 4℃까지 저하시켜 Arg 측쇄의 보호기인 Pbf기의 탈보호를 행하고 있다(비특허문헌 10). 그러나 온도를 낮추는 이 방법에 있어서도, Ac-MePhe의 절단을 완전히 다 막는 것은 어렵고, 목적물이 극대가 되는 시간에서 반응을 정지시키는 데에 그치고 있다.

더욱이, 탈보호 시의 문제점에 더하여, 신장 공정에 있어서의 저반응성의 문제도 알려져 있다. 새롭게 형성시키는 아마이드 결합의 N말단이 N-메틸아미노산인 경우, 그 2급 아민의 벌키함에 의해, 계속되는 아미노산과의 아마이드 형성 반응(신장 반응)이 충분히 진행되지 않는 경우가 있다(비특허문헌 2, 5).

이 신장 공정에서의 문제점에 대해서는, 완전히 동일한 반응 조건을 2번이나 그 이상 반복하는 것에 의해, 미반응점을 줄인다고 하는 궁리가 이루어져 왔다(2번 반복하는 방법은 더블 커플링으로 불리고 있다). 또한, 축합하는 아미노산의 활성화에 대해, 예를 들어 보다 고활성인 산 할라이드로 바꾸는 것에 의해, 축합 효율을 개선하려고 대처해 왔다(비특허문헌 11). 그렇지만, 더블 커플링과 같이 동일한 반응 조건을 반복하여 행하는 경우에는, 시간과 시약 비용이 2배나 그 이상 들어 버리고, 산 할라이드로의 축합을 행하는 경우에는, 용시 조제가 필요하고, 더욱이 생성된 산 할라이드가 펩타이드 합성의 공정 동안에 안정되게 존재할 수 있는지의 점에도 염려가 남는다. 또한, 반응에 의해 HCl이나 HF가 발생해 버리기 때문에, 탈보호 반응이 진행되어 버릴 염려가 있다고 하는 점도 문제가 될 수 있다.

그 외의 신장 공정에서의 저반응성의 개선책으로서는, 수지의 로딩량을 낮추는 것에 의해, 고상 상에서의 펩타이드쇄끼리의 밀도를 저감시켜 축합 효율을 높이거나 반응 용액을 고농도화하는 궁리가 시도되거나 해 왔다(비특허문헌 9). 또한 최근에는, 마이크로웨이브를 조사하는 것에 의해 반응 온도를 상승시켜, 축합 효율을 개선하려고 하는 대처도 이루어지고 있다(비특허문헌 12, 13).

그렇지만, N-메틸화된 펩타이드 합성에 있어서, 합성하는 펩타이드의 순도 저하나 수량 저하, 경우에 따라서는 목적물이 전혀 얻어지지 않을 염려에 대해서, 발본적인 해결책은 보고되어 있지 않다.

국제공개번호 WO 2013/100132 A1

S. R. Gracia, et al. Synthesis of chemically modified bioactive peptides: recent advances, challenges and developments for medicinal chemistry. Future Med. Chem., 2009, 1, 1289. J. Chatterjee, et al. N-Methylation of peptides: A new perspective in medicinal chemistry. Acc. Chem. Res., 2008, 41, 1331. J. E. Bock, et al. Getting in Shape: Controlling Peptide Bioactivity and Bioavailability Using Conformational Constraints. ACS Chem. Biol., 2013, 8, 488. K. Jpsephson, et al. mRNA display: from basic principles to macrocycle drug discovery. Drug Discovery Today, DOI:10.1016/j.drudis. 2013.10.011 M. Teixido, et al. Solid-phase synthesis and characterization of N-methyl-rich peptides. J. Peptide Res., 2005, 65, 153. J. Urban, et al. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int. J. Pept. Prot. Res., 1996, 47, 182. L. A. Carpino, et al. Dramatically enhanced N→O acyl migration during the trifluoroacetic acid-based deprotection step in solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Lett., 2005, 46, 1361. H. Eberhard, et al. N→O-Acyl shift in Fmoc-based synthesis of phosphopeptides. Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 1349. E. Marcucci, et al. Solid-Phase Synthesis of NMe-IB-01212, a Highly N-Methylated Cyclic Peptide. Org. Lett., 2012, 14, 612. W. -J. Fang, et al. Deletion of Ac-NMePhe1 From [NMePhe1]arodyn Under Acidic Conditions, Part 1: Effects of Cleavage Conditions and N-Terminal Functionality. Peptide Science Vol. 96, 97 L. A. Carpino, et al. Stepwise Automated Solid Phase Synthesis of Naturally Occurring Peptaibols Using FMOC Amino Acid Fluorides. J. Org. Chem., 1995, 60, 405. H. Rodriguez, et al. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of short chain N-methyl-rich peptides. J. Pept. Sci., 2010, 16, 136. R. Roodbeen, et al. Microwave Heating in the Solid-Phase Synthesis of N-Methylated Peptides: When Is Room Temperature Better? Eur. J. Org. Chem., 2012, 7106.

본 발명자들은, 드러그-라이크 펩타이드가 될 수 있는 N-알킬화된 아미노산을 포함하는 환상 펩타이드에 주목하여, 이와 같은 특징을 갖는 펩타이드 화합물을 패럴렐 합성하는 방법을 검토했다. 그 결과, 드러그-라이크 펩타이드가 될 수 있는 N-알킬화된 아미노산을 포함하는 환상 펩타이드에 있어서는, 지금까지의 TFA에 의한 합성 방법에서는, 상기의 기지 문헌에 기재된 화합물에 있어서 발견되고 있던 과제가 현저해져, 당해 환상 펩타이드가 단리될 수 없는 원인이 됨을 발견했다. 구체적으로는, N-알킬화된 아미노산을 포함하는 펩타이드의 경우에는, TFA를 이용한 산성 조건에서의 반응(고상으로부터의 절출 공정 혹은 측쇄 작용기의 보호기의 탈보호)에 있어서, 펩타이드쇄가 절단되어 버리는 부반응이 주반응이 되어, 목적으로 하는 펩타이드를 얻는 것이 곤란해짐을 발견했다. 또한, β-하이드록시기를 갖는 아미노산이 펩타이드 중에 포함되는 경우에는, 동일하게 TFA를 이용한 산성 조건에서의 반응에 있어서, N→O 아실 시프트 반응이 진행되어, 목적으로 하는 펩타이드를 얻는 것이 곤란해짐을 발견했다. 이들 문제점은, 상기의 기지 문헌의 화합물에 있어서 발견된 과제였지만, 본 발명자는, 더욱이, 다른 많은 펩타이드에 있어서도 마찬가지로 관찰되는 문제임을 발견했다. 이들 문제점에 더하여, 더욱이, β위에 한정하지 않고 하이드록시기를 골격 내에 갖는 아미노산을 포함하는 펩타이드를, TFA를 이용한 산성 조건에서 반응을 행했을 경우, 그 하이드록시기가 TFA 에스터화되어 버린다고 하는 문제점도 발견했다.

또한, 본 발명자들은, 드러그-라이크 펩타이드가 될 수 있는 N-알킬화된 아미노산을 포함하는 펩타이드 합성의 공업화를 고려했을 경우, 탈보호 반응이나 신장 반응 그 자체뿐만 아니라, 그 후처리 공정 및 대량 합성의 점에서도, 지금까지의 TFA를 이용하는 탈보호법으로는 공업화의 실현이 현저하게 곤란함을 발견했다. 예를 들어 TFA/DCM 용액을 농축에 의해 용매 증류제거하는 경우에는, 농축이 진행됨에 따라 TFA 농도가 상승되어 버려, 농축과 동시에 가수분해나 N→O-아실 시프트 등의 문제가 일어나, 결과적으로 목적 화합물이 얻어지지 않거나, 혹은 현저한 수율의 저하의 원인이 된다. 또한 농축 공정을 저온하에서 행할 필요성도 나온다. 비록 TFA가 저농도여도, 목적물에 비해서 TFA는 대과잉으로 포함되어 있기 때문에, 이들을 중화시켜 반응 정지를 하려고 하면, 가하는 염기의 양도 대과잉이 되어 버려, 대과잉의 염이 목적하는 펩타이드와 함께 잔류하게 되어, 정제 공정에 번잡함이 더해진다. 더욱이, TFA 그 자체는 펩타이드를 효과적으로 용해시키는 용매이지만, TFA 용액을 저농도화해 버리면, 펩타이드의 용해성의 저하로 연결된다. 용해성에 대해서는 공업화를 고려했을 경우뿐만 아니라, 많은 상이한 펩타이드 화합물을 한꺼번에 취급하는 패럴렐 합성에서는, 일군의 펩타이드에 대해서 높은 용해도를 갖는 용매를 선택할 필요성이 있다.

더하여, 본 발명자들은, 지금까지 적극적인 대처가 행해지고 있지 않았던, 측쇄에 보호기가 붙은 작용기를 갖는 Fmoc-아미노산의 보호기의 입체적인 크기를 저감시키는 것에 의한, 반응성의 향상에도 주목했다. 예를 들어 트레오닌(Thr)은 하이드록실기를 갖기 때문에, 계속되는 아실화 시에 아미노기에서 선택적으로 반응을 진행시키려면 하이드록실기에 대한 보호기가 필요해진다. 그렇지만 β-위에 분기한 2급 알코올을 측쇄 작용기로서 갖기 때문에, 그 벌키함 때문에 Thr의 보호체는 축합 효율이 비교적 낮다. Thr의 보호기로서 펩타이드 합성에서 일반적으로 이용되고 있는 것은, 아세틸(Ac)기, tBu기, Trt기, 벤질(Bn)기, t-뷰틸다이메틸실릴(TBS)기 등이지만(Albert Isidro-Llobet, et al. Amino Acid-Protecting Groups. Chem. Rev., 2009, 109, 2455., 와타나베 화학 시약 카탈로그 Amino acids & chiral building blocks to new medicine 2012-14), Trt기나 TBS기에 관해서는 그 벌키함때문에, 축합 효율이 저하되어 버린다. 또한, 산으로의 탈보호가 가능한 tBu기에서도, 탈보호에는 고농도의 TFA 조건이 필요해지기 때문에, 이미 기술한 탈보호 시의 문제점이 표면화된다. 그 외의 보호기에 대해서는 산을 이용하여 용이하게 제거할 수 있는 보호기라고는 할 수 없다. 즉, 축합 효율을 저감시키지 않는 입체적으로 작은 보호기이며, 한편 또한 상기의 산 가수분해나 N→O-아실 시프트의 문제를 회피할 수 있을 정도의 산에 의해 용이하게 탈보호가 가능한 보호기를 발견할 필요가 있다. 이와 동일한 것은, β-위에는 분기 부위를 가지지 않지만, N-치환에 의해 벌키해진 N-메틸세린(MeSer)이나, 그 외 하이드록시기를 작용기로서 갖는 아미노산의 경우에 널리 해당된다.

즉, 본 발명은, N-치환된 아미노산을 포함하는 펩타이드를 패럴렐 합성하여 가는 중에서 현저화됨이 발견된, TFA를 이용한 탈보호 공정에서의 펩타이드의 산 가수분해나 N→O-아실 시프트, 하이드록시기의 TFA 에스터화 등의 부반응의 문제를 경감할 수 있고, 또한 펩타이드의 용해성을 담보한 신규 반응 공정을 발견하는 것을 과제로 한다. 또한, 측쇄 작용기에 적절한 보호기(신장 시의 저반응성을 개선할 목적으로 보호기의 벌키함을 저감시킨다고 하는 관점과, 본 발명에 의한 탈보호 조건에서 탈보호 가능하다고 하는 관점에 있어서 적절한 보호기)를 이용하는 것에 의해, N-치환된 아미노산을 포함하는 펩타이드를 고순도로 또한 높은 합성 효율로 얻는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

즉, 다양한 서열을 가지는 N-치환된 아미노산을 포함하는 펩타이드 화합물을 패럴렐 합성함에 있어서,

(1) 산 첨가 시(고상으로부터의 분리 반응 시 및 측쇄 탈보호 반응 시)의 가수분해, 특히 N-치환된 아미노기에서 유래하는 가수분해를 억제하기 위해서 필요한 반응 조건을 발견하는 것,

(2) 산 첨가 시의 실용적인 후처리가 가능해지는 반응 조건을 발견하는 것,

(3) 비천연형 펩타이드 화합물의 특이한 용해성을 고려한 용매를 포함하는 반응 조건을 발견하는 것,

(4) 비천연형 펩타이드 화합물이, 하이드록실기 등의 작용기를 포함하는 경우에, 탈보호 후의 부반응(N→O 아실 시프트나 하이드록실기와 반응 시약의 부반응(예를 들어 TFA를 시약으로 했을 경우의 TFA 아실화 반응)을 억제하는 것

을 과제로 한다.

더하여, 아미노산 측쇄의 각 작용기에 대해서, 상기 4개의 조건을 만족하는 보호기를 발견하는 것을 과제로 한다.

더욱이, N-치환된 아미노산을 포함하는 펩타이드 화합물의 공업적인 생산도 고려하여, 특정의 서열에 대한 최적화에도 적용 가능한 제조 방법을 발견하는 것도 과제로 한다.

본 발명자들은, N-치환된 아미노산을 포함하는 환상 펩타이드의 효율적인 합성을 실현시키기 위해서, 기지 문헌에 기재된 화합물의 합성에, TFA를 이용한 종래의 펩타이드 합성법을 이용했을 경우에 나타난 과제에 더하여, 일반적으로 실시되는 개량 방법, 예를 들어, TFA의 농도를 저하시키는 방법, 혹은 반응 온도를 저하시키는 방법으로는 충분히 해결할 수 없었던, 가수분해나 N→O-아실 시프트의 진행의 억제, 실용적인 후처리법의 확립, 하이드록실기가 있는 경우의 TFA 에스터 형성의 억제, 펩타이드의 용해성을 담보할 수 있는 용매의 선택과 같은 수많은 과제를 해결할 수 있는 신규한 방법을 발견했다. 당해 신규한 방법에서는, 종래의 펩타이드 합성에서 사용되고 있던 TFA는 전혀 사용되지 않고, 목적물을 높은 선택성으로 얻는 것에 성공했다.

본 발명의 하나의 태양에서는, 고상으로부터의 절출 공정에는 TFA를 사용하지 않고, 보다 약한 산, 예를 들어 2,2,2-트라이플루오로에탄올(TFE)이나 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)과 같은 산을 이용한다. 더하여, 본 발명의 다른 태양에서는, 절출 공정에서는 탈보호되지 않는 측쇄 작용기의 보호기를 이용한다. TFE나 HFIP 등의 TFA보다 약한 산을 사용한 절출 공정에서는, TFA를 이용하는 경우와는 달리, 반응 후의 농축에 의해서도 아마이드 결합의 가수분해 등의 부반응의 속도는 충분히 작다. 특히, TFE나 HFIP 등의 TFA보다 약한 산을 사용했을 경우에는, 고도로 N-치환된 아미노산을 포함하는 펩타이드나, 보다 부반응이 생기기 쉬운 환화 펩타이드에서도 부반응 속도는 작다. 이 때문에, 목적 화합물을 주생성물로서 얻을 수 있다. 본 발명의 다른 태양에서는, 절출 공정에서는, (1) 펩타이드의 부반응(가수분해 등)을 억제하는 한편으로, 고상으로부터의 절출 반응이 원활히 진행되고, (2) 농축 등의 후처리를 행해도 부반응의 속도는 충분히 느리고, (3) 지용성이 높은 비천연 펩타이드에 대해서도 높은 용해성을 나타내고, (4) 측쇄 작용기의 보호기를 보지한 채로 절출이 가능해진다고 하는 조건을 만족시키는 시약을 이용한다. 이와 같은 조건을 만족시키는 시약을 이용함으로써, N-치환 아미노산을 많이 포함하는 펩타이드의 합성, 특히 N-알킬기를 많이 포함하는 드러그-라이크 펩타이드의 합성이 가능해진다. 이와 같은 조건을 만족시키는 시약은, 패럴렐 합성 시뿐만 아니라, 특정의 펩타이드를 공업적으로 합성하는 경우에도 이용할 수 있다.

본 발명의 하나의 태양에 있어서, 가수분해나 N→O-아실 시프트를 억제하고, 목적하는 주반응인 탈보호 반응을 촉진할 수 있도록 측쇄의 보호기를 탈보호할 수 있는, 펩타이드의 합성 방법을 제공한다. 가수분해나 N→O-아실 시프트의 진행에는, 산의 강도(양성자 농도)만이 중요해질 가능성이 있다. 그래서, TFA 등의 강산 대신에, 산성도를 약하게 한 약산을 이용함으로써, 가수분해나 N→O-아실 시프트의 진행을 억제할 수 있음을 발견했다. 또한, 목적하는 탈보호가 진행되려면, 산의 강도(양성자 농도)에 더하여, 보호되어 있는 작용기로부터, 보호기가 양이온종(카보 양이온이나 옥소늄 양이온)으로서 탈리되는 단계도 중요해지는 경우가 있다. 그래서, 보호기가 양이온종으로서 탈리되는 공정을 촉진하는 용매로서, 이온화능을 갖는 용매를 사용함으로써, 상기 약산으로의 탈보호가 촉진됨을 발견했다.

더하여, 특허문헌 1에 기재된 드러그-라이크 펩타이드의 효율 높은 합성법을 확립하기 위해, 중성 조건하에서 이온화 정도가 작은 측쇄를 갖는 아미노산의 측쇄 작용기, 예를 들어, Ser이나 Thr과 같은 아미노산의 측쇄 작용기인 하이드록실기, 그 외 하이드록시기를 측쇄 내에 갖는 알킬알코올기, Tyr과 같은 아미노산의 측쇄 작용기인 페놀기, His와 같은 아미노산의 측쇄 작용기인 이미다졸기, Asp나 Glu와 같은 아미노산의 측쇄 작용기인 측쇄 카복실산, 및 펩타이드 또는 아미노산의 주쇄의 카복실산의 보호기로서 수지로부터 절출할 때의 약산 조건하에서는 탈보호되지 않고, 상기의 약산 조건하에서는 탈보호할 수 있는 보호기를 발견했다.

더욱이 더하여, 신장 반응 시에 저반응성이 염려되는 β-하이드록시-α-아미노산(예를 들어 Thr, Ser, 및 그들의 유도체) 등의 아미노산이 보호기를 갖는 경우에, 상기의 약산 조건에서의 탈보호가 가능하고, 또한 신장 반응 시의 낮은 반응성을 개선할 수 있는 보호기를 발견했다.

즉, 본 발명은 다음과 같다.

〔1〕 이하의 공정:

1) 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산(Fmoc 보호 아미노산), 이하의 i) 및 ii)를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산 유연체(Fmoc 보호 아미노산 유연체), 또는 해당 Fmoc 보호 아미노산 및 해당 Fmoc 보호 아미노산 유연체의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드(Fmoc 보호 펩타이드)를 준비하는 공정;

i) Fmoc 골격을 갖는 적어도 1개의 보호기에 의해 보호되어 있는 주쇄의 아미노기,

ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,

2) 공정 1)에서 준비된 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 고상에 담지하는 공정,

3) 고상에 담지된 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여, 아미노기를 노출시키는 공정,

4) 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정, 및

5) 공정 4)에서 얻어진 펩타이드를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 공정

을 포함하는, 적어도 1개의 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법.

〔2〕 상기 공정 4)에서 얻어진 펩타이드를 구성하는 아미노산 또는 아미노산 유연체의 적어도 1개의 측쇄가, 염기성 조건하에서는 탈보호되지 않고 또한 제 1 산으로 탈보호되는 보호기로 보호되어 있으며, 상기 공정 5)의 전 또는 후에, 해당 제 1 산으로 해당 보호기를 탈보호하는 공정을 추가로 포함하고, 또한

상기 공정 5)에 있어서, 제 2 산을 이용하여 펩타이드를 절출하는, 〔1〕에 기재된 제조 방법으로서,

제 1 산 및 제 2 산이 모두 TFA보다도 약산이며, 또한 제 1 산의 산도가 제 2 산의 산도보다도 높은, 제조 방법.

〔3〕 이하의 공정:

1) 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산(Fmoc 보호 아미노산), 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산 유연체(Fmoc 보호 아미노산 유연체), 또는 해당 Fmoc 보호 아미노산 및 해당 Fmoc 보호 아미노산 유연체의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드(Fmoc 보호 펩타이드)를 준비하는 공정;

ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,

2) Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여, 아미노기를 노출시키는 공정,

3) 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정으로서, 이 공정에서 얻어지는 펩타이드를 구성하는 아미노산 또는 아미노산 유연체의 적어도 1개의 측쇄가, 염기성 조건하에서는 탈보호되지 않고 TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호되는 보호기를 갖는 공정, 및

4) 상기 측쇄의 보호기를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호하는 공정

〔4〕 펩타이드의 제조가 고상법에 의해 행해지는, 〔3〕에 기재된 제조 방법.

〔5〕 상기 공정 3)에서 얻어진 펩타이드를, 상기 공정 4)의 전 또는 후에 상기 공정 4)에서 이용되는 약산 조건보다도 더 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 공정을 추가로 포함하는, 〔4〕에 기재된 제조 방법.

〔6〕 펩타이드의 제조가 액상법에 의해 행해지는, 〔3〕에 기재된 제조 방법.

〔7〕〔1〕의 공정 4) 또는 〔3〕의 공정 3)이,

새롭게 첨가한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여 아미노기를 노출시키는 공정, 및

추가로 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정을 추가로 포함하고,

이들 공정을 1회 또는 복수회 반복하는, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

〔8〕 제조된 펩타이드가, 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기를 C말단측에 포함하고, 또한 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체를 N말단측에 포함하는, 〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

〔9〕 상기 1개의 반응점과 상기 또 1개의 반응점을 결합시켜, 상기 펩타이드를 환화시키는 공정을 추가로 포함하는, 〔8〕에 기재된 제조 방법.

〔10〕 상기 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체가 N말단에 있고, 또한 상기 결합이 아마이드 결합인, 〔9〕에 기재된 제조 방법.

〔11〕 상기 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체가 N말단에 있고, 또한 상기 결합이 탄소-탄소 결합인, 〔9〕에 기재된 제조 방법.

〔12〕 TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 행해지는 공정이, 수 중에서의 pKa의 값이 0∼9인 약산을, 이온화능 Y_OTs치가 양의 값이고 수 중에서의 pKa가 5∼14인 용매에 포함하는, 약산 용액을 이용하여 행해지는, 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

〔13〕 용매가 플루오로알코올인, 〔12〕에 기재된 제조 방법.

〔14〕 플루오로알코올이 TFE 또는 HFIP인, 〔13〕에 기재된 제조 방법.

〔15〕 측쇄의 보호기가, pH 1 내지 pH 7의 범위에서 탈보호되는 보호기이거나, 또는 10% 이하의 TFA에 있어서 탈보호되는 보호기인, 〔2〕 내지 〔14〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

〔16〕 측쇄의 보호기가 이하의 a)∼d)로부터 선택되는, 〔2〕 내지 〔15〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:

a) 측쇄의 보호기가 Ser, Thr, Hyp, 및 그들의 유도체의 측쇄의 하이드록실기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격기, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격 및 Boc 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;

b) 측쇄의 보호기가 Tyr 및 그의 유도체의 측쇄의 하이드록실기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격, Boc 골격 및 tBu 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;

c) 상기 측쇄의 보호기가 His 및 그의 유도체의 측쇄의 이미다졸환의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격 및 Trt 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;

d) 상기 측쇄의 보호기가 Asp, Glu, 및 그들의 유도체의 측쇄의 카복실산기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, tBu 골격, 페닐-EDOTn 골격 및 보호를 하는 카복실산기의 탄소 원자를 3개의 알콕시기가 치환한 골격으로 변환한 오쏘에스터 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;

＜MOM 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 1]

(식 중,

R1은 H이고, R2는 H이고, 또한 X는 메틸, 벤질, 4-메톡시벤질, 2,4-다이메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, 또는 2-트라이메틸실릴에틸이거나,

R1은 메틸이고, R2는 H이고, 또한 X는 에틸이거나,

R1, R2, R3은, 모두 메틸이거나, 또는

R1과 X는, 하나가 되어 -CH₂-CH₂-CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-를 형성하고, 또한 R2는 H이고

여기에서, R1, R2, 및 X 중 어느 하나가 메틸 또는 에틸인 경우, 이들 기는 추가로 알킬, 벤질, 또는 아릴로 치환되어 있어도 된다.)

＜Bn 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 2]

(식 중,

R1∼R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R6 및 R7은 알킬이거나,

R1, R2, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, R3은 메톡시이고, 또한 R6 및 R7은 H이거나,

R1 및 R3이 메톡시이고, R2, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R6 및 R7은 H이거나, 또는

R1, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R2와 R3은 하나가 되어 -O-CH₂-O-를 형성한다.)

＜Dpm 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 3]

(식 중,

R1∼R10은, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나, 또는

R1∼R4 및 R7∼R10은, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R5 및 R6은 하나가 되어 -O- 또는 -CH₂-CH₂-를 형성한다.)

＜Trt 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 4]

(식 중,

R1∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나,

R1, R2, 및 R4∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R3은, 메틸 또는 메톡시이거나,

R1은 Cl이고, 또한 R2∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나, 또는

R1∼R4, 및 R7∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R5와 R6은 하나가 되어 -O-를 형성한다.)

＜실릴 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 5]

(식 중,

R1∼R3은, 각각 독립적으로 알킬, 또는 아릴이다.)

＜Boc 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 6]

(식 중,

R1∼R9는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴이다.)

＜tBu 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 7]

(식 중,

R1∼R9는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴이다.)

＜페닐-EDOTn 골격을 갖는 보호기＞

[화학식 8]

(식 중,

R1∼R3은, 각각 독립적으로, H, 또는 메톡시이다).

본 발명에 의하면, N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드를 높은 합성 효율로 고순도로 얻을 수 있다.

예를 들어, 측쇄에 보호기를 갖는 아미노산을 포함하는 펩타이드 서열의 경우,

(1) 본 발명에 의해 발견한, TFA에 비해 약산인 산과 이온화능을 나타내는 용매의 조합에 의해, 펩타이드쇄의 산 가수분해나, β-하이드록시-α-아미노산(예를 들어, Ser, Thr, 및 그들의 유도체)이 포함되어 있는 서열에 있어서 일어날 수 있는 N→O-아실 시프트나 TFA 에스터화 등을 최소한으로 억제하여 탈보호할 수 있고, 또한

(2) 당해 아미노산을 아마이드 결합 형성 반응으로 신장시킬 때에, 일반적인 펩타이드 합성에 이용되고 있는 보호기를 갖고 있는 경우에 비해, 반응 속도 및 반응 효율을 개선시킬 수 있다.

[도 1] 도 1은, N-메틸아미노산을 서열 중에 포함하는 환상 펩타이드의 기본 합성 루트를 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 131), 목적물의 가수분해체(TM+H₂O) 및 목적물의 HFIP에 의한 가용매분해체(TM+HFIP)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 131), 목적물의 가수분해체(TM+H₂O) 및 목적물의 HFIP에 의한 가용매분해체(TM+HFIP)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133) 및 목적물의 N→O-아실 시프트체의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 5] 도 5는, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 131), 목적물의 가수분해체(TM+H₂O) 및 목적물의 HFIP에 의한 가용매분해체(TM+HFIP)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 6] 도 6은, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 131), 목적물의 가수분해체(TM+H₂O) 및 목적물의 HFIP에 의한 가용매분해체(TM+HFIP)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 도 7은, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133) 및 목적물의 N→O-아실 시프트체의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8은, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133) 및 목적물의 N→O-아실 시프트체의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 137) 및 목적물의 HFIP에 의한 가용매분해체(어느 아마이드 결합이 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 것)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 10] 도 10은, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/TFE(2% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 137) 및 목적물의 TFE에 의한 가용매분해체(어느 아마이드 결합이 TFE에 의해 가용매분해를 받은 것)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 11] 도 11은, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로 하고, 그 용액에 염기(DIPEA)를 가하여 반응을 정지시켰을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 135)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 12] 도 12는, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로 하고, 그 용액에 염기(DIPEA)를 가하여 반응을 정지시켰을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 13] 도 13은, Fmoc-Thr(Trt)-OH를 첨가했을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 112) 및 목적하는 펩타이드로부터 Thr이 빠진 것(화합물 113)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 14] 도 14는, Fmoc-Thr(THP)-OH를 첨가했을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 114)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 목적하는 펩타이드(화합물 114)로부터 Thr이 탈락한 것(화합물 113)은 검출되지 않았다.
[도 15] 도 15는, Fmoc-MeSer(DMT)-OH·0.75DIPEA를 이용하여 합성을 행했을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 115) 및 목적하는 펩타이드로부터 MeSer이 빠진 것(화합물 116)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 16] 도 16은, Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)를 이용하여 합성을 행했을 경우에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 115) 및 목적하는 펩타이드로부터 MeSer이 빠진 것(화합물 116)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 17] 도 17은, 5% TFA/DCE(5% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 131) 및 목적물의 가수분해체(TM+H₂O)의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 18] 도 18은, 5% TFA/DCE(5% TIPS)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133), 목적물의 N→O-아실 시프트체, 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물 및 목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 19] 도 19는, 5% TFA/DCE(5% TIPS)(0도)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133), 목적물의 N→O-아실 시프트체, 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물 및 목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 20] 도 20은, 5% TFA/DCE(5% TIPS)(25번)의 탈보호 조건하에 있어서의, 목적하는 펩타이드(화합물 133), 목적물의 N→O-아실 시프트체, 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물 및 목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물의 검출을 나타내는 LCMS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 21] 도 21은, 액상에 있어서의 신장 반응을 포함하는 합성법을 나타내는 도면이다.

어떤 태양에 있어서, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 적어도 1개의 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

1) 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산(Fmoc 보호 아미노산), 이하의 i) 및 ii)를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산 유연체(Fmoc 보호 아미노산 유연체), 또는, 해당 Fmoc 보호 아미노산 및 해당 Fmoc 보호 아미노산 유연체의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드(Fmoc 보호 펩타이드)를 준비하는 공정;

ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,

2) 공정 1)에서 준비한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 고상에 담지하는 공정,

3) 고상에 담지한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여, 아미노기를 노출시키는 공정,

5) 공정 4)에서 얻어진 펩타이드를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 공정.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 적어도 1개의 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,

4) 상기 측쇄의 보호기를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호하는 공정.

상기 펩타이드의 제조는, 고상법에 의해 행해지고 있어도, 액상법에 의해 행해지고 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 「펩타이드」는, 아미노산 및/또는 아미노산 유연체가 아마이드 결합 혹은 에스터 결합하여 형성되는 펩타이드이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5∼30잔기, 보다 바람직하게는 7∼15잔기, 더 바람직하게는 9∼13잔기의 펩타이드이다. 본 발명에 있어서 합성되는 펩타이드는, 1개의 펩타이드 중에, 적어도 1개 이상 N-치환되어 있는 아미노산 또는 아미노산 유연체(N-치환 아미노산이라고도 한다)를 포함하는 것으로 하고, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더 바람직하게는 5개 이상의 N-치환 아미노산을 포함한다. 이들 N-치환 아미노산은, 펩타이드 중에 연속하여 존재하고 있어도, 불연속으로 존재하고 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 펩타이드는, 직쇄 펩타이드여도 환상 펩타이드여도 되고, 환상 펩타이드인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 「환상 펩타이드」는, 본 발명의 방법에 의해 직쇄 펩타이드를 합성한 후에, 환화하는 것에 의해 얻을 수 있다. 환화는, 아마이드 결합과 같은 탄소-질소 결합에 의한 환화, 에스터 결합이나 에터 결합과 같은 탄소-산소 결합에 의한 환화, 싸이오에터 결합과 같은 탄소-황 결합에 의한 환화, 탄소-탄소 결합에 의한 환화, 혹은 헤테로환 구축에 의한 환화 등, 어떠한 형태여도 된다. 특별히 제한되지 않지만, 아마이드 결합 혹은 탄소탄소 결합 등의 공유 결합을 개재시킨 환화가 바람직하고, 측쇄의 카복실산기와 N말단의 주쇄의 아미노기에 의한 아마이드 결합을 개재시킨 환화가 특히 바람직하다. 환화에 이용되는 카복실산기나 아미노기 등의 위치는, 주쇄 상의 것이어도, 측쇄 상의 것이어도 되고, 환화 가능한 위치에 있으면, 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 「N-치환 아미노산」이란, 후술하는 「아미노산」 또는 「아미노산 유연체」 중, 주쇄 아미노기가, N-치환되어 있는 아미노산 또는 아미노산 유연체를 의미하고, N-메틸화 등의 N-알킬화되어 있는 아미노산 또는 아미노산 유연체가 바람직하다. N-치환 아미노산으로서 구체적으로는, 아미노산 또는 아미노산 유연체의 주쇄 아미노기가, NHR기이고, R은, 치환되어 있어도 되는 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 또는 사이클로알킬기인 것이거나, 또한 프롤린과 같이 N 원자에 결합한 탄소 원자와 α위로부터의 탄소 원자가 환을 형성하는 것을 들 수 있다. 치환되어 있어도 되는 각 기의 치환기는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 할로젠기, 에터기, 하이드록실기 등을 들 수 있다.

이와 같은 N-치환 아미노산으로서 구체적으로는, 알킬기, 아르알킬기, 사이클로알킬기 등이 바람직하게 이용된다.

본 발명에 있어서의 「아미노산」이란, α, β 및 γ 아미노산이며, 천연형 아미노산(본원에서는 천연형 아미노산이란 단백질에 포함되는 20종류의 아미노산을 가리킨다. 구체적으로는 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro를 가리킨다.)으로 한정되지 않고, 비천연형 아미노산이어도 된다. α-아미노산의 경우, L형 아미노산이어도 D형 아미노산이어도 되고, α,α-다이알킬아미노산이어도 된다. 아미노산 측쇄의 선택은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 수소 원자, 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기를 들 수 있다. 아미노산 측쇄는, 각각 치환기가 부여되어 있어도 되고, 예를 들어, N 원자, O 원자, S 원자, B 원자, Si 원자, P 원자를 포함하는 임의의 작용기 중에서 자유롭게 선택된다. 치환기의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개, 혹은 2개 이상 갖고 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 「아미노산 유연체」란, 바람직하게는 α-하이드록시카복실산을 의미한다. α-하이드록시카복실산의 측쇄는, 아미노산과 마찬가지로 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 수소 원자, 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기를 들 수 있다. α-하이드록시카복실산의 입체 구조는 아미노산의 L형에 대응하는 것이어도 D형에 대응하는 것이어도 된다. 측쇄는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, N 원자, O 원자, S 원자, B 원자, Si 원자, P 원자를 포함하는 임의의 작용기 중에서 자유롭게 선택된다. 치환기의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개, 혹은 2개 이상 갖고 있어도 된다. 예를 들어, S 원자를 갖고, 추가로 아미노기나 할로젠기 등의 작용기를 갖고 있어도 된다. β나 γ-아미노산의 경우에도 임의의 입체 배치가, α-아미노산의 경우와 마찬가지로 허용되고, 그 측쇄의 선택도 특별히 제한없이 α-아미노산의 경우와 마찬가지이다.

본 발명에 있어서 합성되는 펩타이드를 구성하는 「아미노산」, 「아미노산 유연체」에는 각각 대응하는 모든 동위체를 포함한다. 「아미노산」, 「아미노산 유연체」의 동위체는, 적어도 1개의 원자가, 원자 번호(양자수)가 동일하고, 질량수(양자와 중성자의 수의 합)가 상이한 원자로 치환된 것이다. 본 발명 펩타이드 화합물을 구성하는 「아미노산」, 「아미노산 유연체」에 포함되는 동위체의 예로서는, 예를 들어, 수소 원자, 탄소 원자, 질소 원자, 산소 원자, 인 원자, 황 원자, 불소 원자, 염소 원자를 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl을 들 수 있다.

아미노산 혹은 아미노산 유연체는, 치환기를 1개, 혹은 2개 이상 갖고 있어도 된다. 그와 같은 치환기로서, 예를 들어, O 원자, N 원자, S 원자, B 원자, P 원자, Si 원자, 할로젠 원자 유래의 치환기를 들 수 있다.

할로젠 유래의 치환기로서는, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I) 등을 들 수 있다.

O 원자 유래의 치환기로서는, 하이드록실(-OH), 옥시(-OR), 카보닐(-C=O-R), 카복실(-CO₂H), 옥시카보닐(-C=O-OR), 카보닐옥시(-O-C=O-R), 싸이오카보닐(-C=O-SR), 카보닐싸이오기(-S-C=O-R), 아미노카보닐(-C=O-NHR), 카보닐아미노(-NH-C=O-R), 옥시카보닐아미노(-NH-C=O-OR), 설폰일아미노(-NH-SO₂-R), 아미노설폰일(-SO₂-NHR), 설팜오일아미노(-NH-SO₂-NHR), 싸이오카복실(-C(=O)-SH), 카복실카보닐(-C(=O)-CO₂H)을 들 수 있다.

옥시(-OR)의 예로서는, 알콕시, 사이클로알콕시, 알켄일옥시, 알킨일옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 아르알킬옥시 등을 들 수 있다.

카보닐(-C=O-R)의 예로서는, 폼일(-C=O-H), 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알켄일카보닐, 알킨일카보닐, 아릴카보닐, 헤테로아릴카보닐, 아르알킬카보닐 등을 들 수 있다.

옥시카보닐(-C=O-OR)의 예로서는, 알킬옥시카보닐, 사이클로알킬옥시카보닐, 알켄일옥시카보닐, 알킨일옥시카보닐, 아릴옥시카보닐, 헤테로아릴옥시카보닐, 아르알킬옥시카보닐 등을 들 수 있다.

(-C=O-OR)

카보닐옥시(-O-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐옥시, 사이클로알킬카보닐옥시, 알켄일카보닐옥시, 알킨일카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 헤테로아릴카보닐옥시, 아르알킬카보닐옥시 등을 들 수 있다.

싸이오카보닐(-C=O-SR)의 예로서는, 알킬싸이오카보닐, 사이클로알킬싸이오카보닐, 알켄일싸이오카보닐, 알킨일싸이오카보닐, 아릴싸이오카보닐, 헤테로아릴싸이오카보닐, 아르알킬싸이오카보닐 등을 들 수 있다.

카보닐싸이오(-S-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐싸이오, 사이클로알킬카보닐싸이오, 알켄일카보닐싸이오, 알킨일카보닐싸이오, 아릴카보닐싸이오, 헤테로아릴카보닐싸이오, 아르알킬카보닐싸이오 등을 들 수 있다.

아미노카보닐(-C=O-NHR)의 예로서는, 알킬아미노카보닐, 사이클로알킬아미노카보닐, 알켄일아미노카보닐, 알킨일아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 헤테로아릴아미노카보닐, 아르알킬아미노카보닐 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -C=O-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 화합물을 들 수 있다.

카보닐아미노(-NH-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐아미노, 사이클로알킬카보닐아미노, 알켄일카보닐아미노, 알킨일카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 헤테로아릴카보닐아미노, 아르알킬카보닐아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여 -NH-C=O-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 화합물을 들 수 있다.

옥시카보닐아미노(-NH-C=O-OR)의 예로서는, 알콕시카보닐아미노, 사이클로알콕시카보닐아미노, 알켄일옥시카보닐아미노, 알킨일옥시카보닐아미노, 아릴옥시카보닐아미노, 헤테로아릴옥시카보닐아미노, 아르알킬옥시카보닐아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -NH-C=O-OR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 화합물을 들 수 있다.

설폰일아미노(-NH-SO₂-R)의 예로서는, 알킬설폰일아미노, 사이클로알킬설폰일아미노, 알켄일설폰일아미노, 알킨일설폰일아미노, 아릴설폰일아미노, 헤테로아릴설폰일아미노, 아르알킬설폰일아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -NH-SO₂-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 화합물을 들 수 있다.

아미노설폰일(-SO₂-NHR)의 예로서는, 알킬아미노설폰일, 사이클로알킬아미노설폰일, 알켄일아미노설폰일, 알킨일아미노설폰일, 아릴아미노설폰일, 헤테로아릴아미노설폰일, 아르알킬아미노설폰일 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -SO₂-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 화합물을 들 수 있다.

설팜오일아미노(-NH-SO₂-NHR)의 예로서는, 알킬설팜오일아미노, 사이클로알킬설팜오일아미노, 알켄일설팜오일아미노, 알킨일설팜오일아미노, 아릴설팜오일아미노, 헤테로아릴설팜오일아미노, 아르알킬설팜오일아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-SO₂-NHR 중의 N 원자와 결합한 2개의 H 원자는 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 되고, 또한 이들 2개의 치환기는 환을 형성해도 된다.

S 원자 유래의 치환기로서는, 싸이올(-SH), 싸이오(-S-R), 설핀일(-S=O-R), 설폰일(-S(O)₂-R), 설포(-SO₃H)를 들 수 있다.

싸이오(-S-R)의 예로서는, 알킬싸이오, 사이클로알킬싸이오, 알켄일싸이오, 알킨일싸이오, 아릴싸이오, 헤테로아릴싸이오, 아르알킬싸이오 등 중으로부터 선택된다.

설핀일(-S=O-R)의 예로서는, 알킬설핀일, 사이클로알킬설핀일, 알켄일설핀일, 알킨일설핀일, 아릴설핀일, 헤테로아릴설핀일, 아르알킬설핀일 등을 들 수 있다.

설폰일(-S(O)₂-R)의 예로서는, 알킬설폰일, 사이클로알킬설폰일, 알켄일설폰일, 알킨일설폰일, 아릴설폰일, 헤테로아릴설폰일, 아르알킬설폰일 등을 들 수 있다.

N 원자 유래의 치환기로서는, 아자이드(-N₃, 「아자이도기」라고도 한다), 사이아노(-CN), 1급 아미노(-NH₂), 2급 아미노(-NH-R), 3급 아미노(-NR(R')), 아미디노(-C(=NH)-NH₂), 치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R''), 구아니디노(-NH-C(=NH)-NH₂), 치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R''), 아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R'')를 들 수 있다.

2급 아미노(-NH-R)의 예로서는, 알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 알켄일아미노, 알킨일아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 아르알킬아미노 등을 들 수 있다.

3급 아미노(-NR(R'))의 예로서는, 예를 들어 알킬(아르알킬)아미노 등, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 등 중으로부터 각각 독립적으로 선택되는, 임의의 2개의 치환기를 갖는 아미노기를 들 수 있고, 이들 임의의 2개의 치환기는 환을 형성해도 된다.

치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R'')의 예로서는, N 원자 상의 3개의 치환기 R, R', 및 R''가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중으로부터 각각 독립적으로 선택된 기, 예를 들어 알킬(아르알킬)(아릴)아미디노 등을 들 수 있다.

치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R'')의 예로서는, R, R', R'', 및 R'''가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중으로부터 각각 독립적으로 선택된 기, 혹은 이들이 환을 형성한 기 등을 들 수 있다.

아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R'')의 예로서는, R, R', 및 R''가, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중으로부터 각각 독립적으로 선택된 기, 혹은 이들은 환을 형성한 기 등을 들 수 있다.

B 원자 유래의 치환기로서는, 보릴(-BR(R'))이나 다이옥시보릴(-B(OR)(OR')) 등을 들 수 있다. 이들의 2개의 치환기 R 및 R'는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 등 중으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, 혹은 이들은 환을 형성해도 된다.

이와 같이, 본 발명의 아미노산 혹은 아미노산 유연체에는, 통상 저분자 화합물에서 이용되는 O 원자, N 원자, S 원자, B 원자, P 원자, Si 원자, 할로젠 원자가 포함되는 다양한 치환기를 1개 혹은 2개 이상 갖고 있어도 된다. 이들 치환기는 추가로 다른 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다.

한편, 본 명세서에 있어서, 본 발명에서 합성되는 펩타이드를 구성하는 「아미노산」, 「아미노산 유연체」는, 각각, 「아미노산 잔기」, 「아미노산 유연체 잔기」라고 하는 경우도 있다.

본 발명에 있어서 「Fmoc 보호 아미노산」 및 「Fmoc 보호 아미노산 유연체」란, 각각 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는, 아미노산 및 아미노산 유연체이다:

ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기.

본 발명에 있어서의 「Fmoc 골격을 갖는 보호기」란, Fmoc기 또는 Fmoc기의 구성 골격의 임의의 위치에 임의의 치환기가 도입된 기를 의미한다. Fmoc 골격을 갖는 보호기로서 구체적으로는, 예를 들어, 9-플루오렌일메틸옥시카보닐(Fmoc)기, 2,7-다이-tert-뷰틸-Fmoc(Fmoc*)기, 2-플루오로-Fmoc(Fmoc(2F))기, 2-모노아이소옥틸-Fmoc(mio-Fmoc)기, 2,7-다이아이소옥틸 Fmoc(dio-Fmoc)기 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, Fmoc 골격을 갖는 보호기 대신에, 염기성 조건 혹은 염기성을 나타내는 구핵종(예를 들어, 피페리딘이나 하이드라진)으로 탈보호 가능한 보호기를 이용할 수도 있다. 이와 같은 보호기로서 구체적으로는, 예를 들어, 2-(4-나이트로페닐설폰일)에톡시카보닐(Nsc)기, (1,1-다이옥소벤조[b]싸이오펜-2-일)메틸옥시카보닐(Bsmoc)기, (1,1-다이옥소나프토[1,2-b]싸이오펜-2-일)메틸옥시카보닐(α-Nsmoc)기, 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥시-1-일리덴)-3-메틸뷰틸(ivDde)기, 테트라클로로프탈로일(TCP)기, 2-[페닐(메틸)설포니오]에틸옥시카보닐테트라플루오로보레이트(Pms)기, 에테인설폰일에톡시카보닐(Esc)기, 2-(4-설포페닐설폰일)에톡시카보닐(Sps)기 등을 들 수 있다. 또한, 산이나 염기 이외의 탈보호가 가능한 보호기를 이용할 수도 있다. 이와 같은 보호기로서 구체적으로는, 예를 들어, 팔라듐 등의 전이 금속 촉매 존재하에서의 수소 첨가로 탈보호 가능한 벤질옥시카보닐(Z)기, 팔라듐 촉매와 스캐빈저의 조합(예를 들어, 테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0)(Pd(PPh₃)₄)와 페닐실레인의 조합)으로 탈보호 가능한 알릴옥시카보닐(Alloc)기, 알킬싸이올 또는 아릴싸이올과 염기의 조합으로 탈보호 가능한 o-나이트로벤젠설폰일(oNBS, Ns)기, 2,4-다이나이트로벤젠설폰일(dNBS)기 및 다이싸이아석신오일(Dts)기, 전이 금속 촉매 존재하에서의 수소 첨가 혹은 아다이싸이온산 나트륨(Na₂S₂O₄) 등의 환원제에 의해 환원적으로 탈보호 가능한 p-나이트로벤질옥시카보닐(pNZ)기 등을 들 수 있다(참고 문헌: Amino Acid-Protecting Groups, Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504).

Fmoc법을 이용하는 본 발명에 있어서는, 예를 들어, 주쇄의 아미노기가 Fmoc기에 의해 보호되고, 필요에 따라서 측쇄의 작용기가 피페리딘이나 DBU 등의 염기성으로 절단되지 않는 보호기로 보호되고, 또한 주쇄의 카복실산기가 보호되어 있지 않은, Fmoc 보호 아미노산 또는 Fmoc 보호 아미노산 유연체를 바람직하게 이용할 수 있다. Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기와 보호기가 없는 카복실산기를 갖는 Fmoc 보호 아미노산 또는 Fmoc 보호 아미노산 유연체도 또한 바람직하게 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, Fmoc-보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드가 측쇄의 작용기를 갖는 경우, 해당 작용기는 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 측쇄의 작용기가 보호기로 보호되어 있는 경우, 임의의 조건에서 탈보호 가능한 주지의 보호기를 이용할 수 있다. 이와 같은 보호기로서는, 염기성 조건하에서 절단되지 않고, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호되는 보호기가 바람직하다. 산성으로 탈보호 가능한 보호기로서는, 예를 들어, pH 1 내지 pH 7의 범위, 바람직하게는 pH 2 내지 pH 6의 범위에서 탈보호 가능한 보호기를 들 수 있다. 혹은, 10% 이하의 TFA에 있어서 탈보호 가능한 보호기, 혹은, 후술하는 구조를 가지는 보호기를 이용할 수 있다. 본 발명에서는, 측쇄의 보호기로서는, 주지의 보호기를 사용할 수 있다. 예를 들어 이하의 문헌 i)이나 ii)의 기재에 보호기 중에서 상기 조건을 만족시키는 것을 측쇄의 보호기로서 채용할 수도 있다.

비특허문헌 i) Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition,

비특허문헌 ii) Chemical Reviews, 2009, 109(6), 2455-2504.

본 발명의 방법은, 패럴렐 합성에 의한 펩타이드 합성에 이용할 수 있다. 이 경우, 아미노산의 측쇄에 보호기는 반드시 필요하지는 않지만, 측쇄에 보호기가 필요한 경우에는, 이용되는 보호기가, 본 발명의 탈보호 조건하에 있어서 신속하게 탈보호되는 것이 바람직하다. 측쇄의 보호기는, 24시간 이내에 50%가 탈보호되는 것이 바람직하고, 4시간 이내에 90%가 탈보호되는 것이 특히 바람직하다. 이와 같은 조건을 만족시키는 보호기로서, 후술하는 Trt 골격, THP 골격, THF 골격, TBS 골격을 갖는 보호기가 바람직하다. 또한, 산에 의해 용이하게 탈보호할 수 있고 또한 신장 시에 높은 반응성을 갖기 위해서는, 작용기에 직결하는 보호기측의 원자에 적어도 1개 수소 원자가 치환되어 있는(Trt 골격의 보호기보다도 입체적으로 벌키함이 작은) 보호기가 바람직하다. 그 중, 수소 이외의 치환기가 환을 형성하고 있는 보호기가 보다 바람직하고, 특히 THP, THF가 바람직하다.

본 발명의 방법은 공업적인 펩타이드 합성에도 이용할 수 있다. 이 경우도, 패럴렐 합성과 마찬가지로, 반드시 아미노산의 측쇄에 보호기를 가질 필요는 없지만, 측쇄에 보호기를 갖는 경우에는, 패럴렐 합성과 마찬가지의 보호기를 갖는 것이 바람직하다. 합성되는 펩타이드의 서열에 탈보호 시의 가수분해 및 N→O-아실 시프트의 문제는 없지만, 보호기의 벌키함에 의한 신장 반응의 문제가 있는 경우에는, 탈보호 시에 일반적으로 이용되는 TFA 등의 강산을 이용해도 된다. 또한, 합성되는 펩타이드의 신장 반응에 문제가 없는 경우는, 벌키한 보호기를 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서 「TFA보다도 약산이 되는 조건」으로서, 바람직하게는, 수 중에서의 pKa의 값이 0∼9인 약산을, 이온화능 Y_OTs치가 양의 값이고 수 중에서의 pKa가 5∼14인 용매에 포함하는, 약산 용액을 이용하는 조건을 들 수 있다.

「수 중에서의 pKa의 값이 0∼9인 약산」으로서, 보다 바람직하게는 수 중에서의 pKa가 1∼5인 약산이다. 이와 같은 약산으로서 구체적으로는, 황산수소 테트라메틸암모늄(수 중에서의 pKa=2.0), 옥살산(수 중에서의 pKa=1.23), 말레산(수 중에서의 pKa=1.92) 등을 들 수 있다. TFA보다도 약산이 되는 조건을 만족시키면, 용매에 용해시키는 약산의 농도는 임의여도 된다.

「이온화능 Y_OTs치가 양의 값이고 수 중에서의 pKa가 5∼14인 용매」로서 바람직하게는, 플루오로알코올을 들 수 있다. 플루오로알코올이란, 알코올을 구성하는 탄소 원자 중 하이드록실기가 결합하고 있는 탄소 원자 이외의 탄소 원자에 불소 원자가 결합한 것의 총칭을 의미한다. 본 발명에 있어서는, 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀 등, 하이드록실기가 방향환에 결합한 것도 플루오로알코올에 포함된다. 플루오로알코올로서는, 2,2,2-트라이플루오로에탄올(TFE)이나 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, TFA보다도 약산이 되는 조건을 만족시키면, 상기 약산 용액에는 추가로 다른 유기 용매(예를 들어, 다이클로로메테인이나 1,2-다이클로로에테인 등)나 양이온 포착제(예를 들어, 트라이아이소프로필실레인 등) 등도 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서 Fmoc 보호 아미노산 또는 Fmoc 보호 아미노산 유연체가 그 측쇄에 보호기를 갖는 경우, 측쇄의 보호기로서 바람직하게는 이하의 것을 들 수 있다.

측쇄의 보호기가 Ser, Thr, Hyp, 및 그들의 유도체의 하이드록실기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격, 또는 Boc 골격을 갖는 보호기가 바람직하다.

[화학식 9]

MOM 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, MOM(R1=H, R2=H, X=Me), EE(R1=Me, R2=H, X=Et), MIP(R1=Me, R2=Me, X=Me), THP(R2=H, R1과 X 사이에 4개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), THF(R2=H, R1과 X 사이에 3개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), SEM(R1=H, R2=H, X=2-트라이메틸실릴에틸) 등을 들 수 있다. 골격 상의 치환기의 Me나 Et에 대해서는 다른 알킬기, 벤질기, 아릴기 등으로 치환되어 있는 것도 이용할 수 있다.

[화학식 10]

Bn 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Pis(R6=Me, R7=Me, 그 외의 R=H), PMB(R3=OMe, 그 외의 R=H), DMB(R1=OMe, R3=OMe, 그 외의 R=H) 등을 들 수 있다. 치환기의 Me 대신에 다른 알킬기를 이용해도 된다. 또한 벤젠환 상에 알킬기, 아릴기, 할로젠기 등이 치환되어 있어도 된다.

[화학식 11]

Dpm 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Dpm(모든 R=H)을 들 수 있다. 방향환 상에 알킬기, 아릴기, 알콕시기, 할로젠기 등이 치환되어 있어도 된다.

또한, R5와 R6 사이에 가교한 것, 예를 들어 산소 원자를 개재시켜 가교된 Xan기나, 탄소 원자 2개를 개재시켜 가교된 다이벤조수베릴기 등을 이용해도 된다.

[화학식 12]

Trt 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Trt(모든 R=H), Mmt(R3=Me, 그 외의 R=H), Mtt(R3=OMe, 그 외의 R=H), Dmt(R3=OMe, R8=OMe, 그 외의 R=H), Clt(R1=Cl, 그 외의 R=H) 등을 들 수 있다. 방향환 상에 알킬기, 아릴기, 알콕시기, 할로젠기 등이 치환되어 있어도 된다.

또한, R5와 R6 사이에 가교한 것, 예를 들어 산소 원자를 개재시켜 가교된 픽실(Pixyl)기를 이용할 수도 있다.

[화학식 13]

실릴 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, TBS(R1=Me, R2=Me, R3=tBu) 등을 들 수 있다. 이 Me나 tBu 대신에, 다른 알킬기, 아릴기 등이 치환되어 있어도 된다.

[화학식 14]

Boc 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Boc(모든 R=H)를 들 수 있지만, 다른 알킬기, 아릴기 등이 치환되어 있어도 된다.

그 외, 이하에 나타내는 보호기를 이용할 수도 있다.

[화학식 15]

이들 보호기 중에서, 특히 THP, Trt가 바람직하다. 또한 아미노산 잔기가 Ser인 경우에는, 측쇄의 보호기는 THP, Trt가 특히 바람직하고, 아미노산 잔기가 Thr인 경우에는, 측쇄의 보호기는 THP가 특히 바람직하다.

측쇄의 보호기가 예를 들어 Tyr, D-Tyr, Tyr(3-F) 등, 아릴기에 치환한 하이드록실기를 갖는 아미노산의 보호기인 경우, 예를 들어, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격, Boc 골격, tBu 골격을 갖는 보호기가 바람직하다.

[화학식 16]

MOM 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, MOM(R1=H, R2=H, X=Me), BOM(R1=H, R2=H, X=Bn), EE(R1=Me, R2=H, X=Et), THP(R2=H, R1과 X 사이에 4개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), THF(R2=H, R1과 X 사이에 3개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), SEM(R1=H, R2=H, X=2-트라이메틸실릴에틸) 등을 들 수 있다. 골격 상의 치환기의 Me나 Et에 대해서는 다른 알킬기, 벤질기, 아릴기 등으로 치환되어 있는 것도 이용할 수 있다.

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

Trt 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Trt(모든 R=H), Mmt(R3=Me, 그 외의 R=H), Mtt(R3=OMe, 그 외의 R=H), Clt(R1=Cl, 그 외의 R=H) 등을 들 수 있다. 방향환 상에 알킬기, 아릴기, 알콕시기, 할로젠기 등이 치환되어 있어도 된다.

[화학식 20]

[화학식 21]

[화학식 22]

tBu 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, tBu(모든 R=H)를 들 수 있다. H 이외의 알킬기, 아릴기 등이 치환되어 있어도 된다.

이들 보호기 중에서, 특히 tBu, Pis, Trt, Clt, THP, THF가 바람직하다. 또한 아미노산 잔기가 Tyr, D-Tyr인 경우에는, 측쇄의 보호기는 tBu, Trt, Clt, THP가 특히 바람직하고, 아미노산 잔기가 Tyr(3-F)인 경우에는, 측쇄의 보호기는 tBu, Pis가 특히 바람직하다.

측쇄의 보호기가 예를 들어 His, MeHis 등, 측쇄에 이미다졸을 갖는 아미노산의 보호기인 경우, 예를 들어, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Trt 골격을 갖는 보호기를 이용하는 것이 바람직하다.

[화학식 23]

MOM 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, MBom(R1=H, R2=H, X=4-메톡시벤질), 2,4-DMBom(R1=H, R2=H, X=2,4-다이메톡시벤질), 3,4-DMBom(R1=H, R2=H, X=3,4-다이메톡시벤질), EE(R1=Me, R2=H, X=Et), THP(R2=H, R1과 X 사이에 4개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), THF(R2=H, R1과 X 사이에 3개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것) 등을 들 수 있다. 골격 상의 치환기의 Me나 Et에 대해서는 다른 알킬기, 벤질기, 아릴기 등으로 치환되어 있는 것도 이용할 수 있다.

[화학식 24]

[화학식 25]

이들 중에서, 특히 Trt가 바람직하다. 또한 아미노산 잔기가 His, MeHis인 경우에는, 측쇄의 보호기는 Trt가 특히 바람직하다.

또한, 예를 들어, 주쇄의 카복실산기를 「유리된 또는 활성 에스터화된 카복실산기」로서 이용하는 경우에는 Asp, Glu, 및 그의 유도체의 측쇄의 카복실산기의 보호기로서, 또한, Asp, Glu, 및 그의 유도체의 측쇄의 카복실산기를 「유리된 또는 활성 에스터화된 카복실산기」로서 이용하는 경우에는 주쇄의 카복실산기의 보호기로서, 예를 들어, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, tBu 골격, 페닐-EDOTn 골격을 갖는 보호기를 이용할 수 있다. 또한, 카복실산기 유래의 탄소 원자에 3개의 알콕시기가 결합한 오쏘에스터 골격을 갖는 보호기도 카복실산의 보호기로서 이용할 수 있다. 이들 보호기를 형성하는 탄소 원자는 치환되어 있어도 된다.

[화학식 26]

MOM 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, BOM(R1=H, R2=H, X=Bn), THP(R2=H, R1과 X 사이에 4개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것), THF(R2=H, R1과 X 사이에 3개의 탄소 원자로 환구조를 가지는 것) 등을 들 수 있다. 골격 상의 치환기는 다른 알킬기, 벤질기, 아릴기 등으로 치환되어 있는 것도 이용할 수 있다.

[화학식 27]

Bn 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, Pis(R6=Me, R7=Me, 그 외의 R=H), PMB(R3=OMe, 그 외의 R=H), DMB(R1=OMe, R3=OMe, 그 외의 R=H), 피페로닐(R2와 R3에 산소 원자가 치환되어 있고, 그 산소 원자끼리가 1개의 탄소 원자로 가교되어 있는 구조이고, 그 외의 R=H) 등을 들 수 있다. 치환기의 Me 대신에 다른 알킬기를 이용해도 된다. 또한 벤젠환 상에 알킬기, 아릴기, 할로젠기 등이 치환되어 있어도 된다.

[화학식 28]

또한, R5와 R6 사이에 가교한 것, 예를 들어 탄소 원자 2개를 개재시켜 가교된 다이벤조수베릴기 등을 이용해도 된다.

[화학식 29]

[화학식 30]

tBu 골격을 갖는 보호기의 대표예로서는, tBu(모든 R=H), Mpe(R1=Me, R4=Me, 그 다른 R=H) 등을 들 수 있다. 다른 알킬기, 아릴기 등이 치환되어 있어도 된다.

[화학식 31]

페닐-EDOTn으로서는, (i) R1=R2=R3=OMe, (ii) R1=R2=OMe, R3=H, (iii) R1=R2=H, R3=OMe, 혹은 (iv) R1=R2=R3=H의 치환기의 조합을 갖는 것을 이용할 수 있다.

[화학식 32]

다이사이클로프로필메틸기를 이용할 수도 있다.

이들 중에서는, 특히 tBu, Pis, Trt가 바람직하다.

본 발명에 있어서 「Fmoc 보호 펩타이드」란 상기 「Fmoc 보호 아미노산」 및 상기 「Fmoc 보호 아미노산 유연체」의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 이와 같은 펩타이드로서, 예를 들어, 전술한 Fmoc 보호 아미노산과 Fmoc 보호 아미노산 유연체 중 어느 하나 또는 양쪽을 포함하여 2분자 이상 갖고 있는 다이펩타이드나 올리고펩타이드를 들 수 있다.

본 발명의 고상법에 의한 펩타이드의 합성에서는, 수지를 이용하여 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드(Fmoc 보호 아미노산 등이라고 하는 경우가 있다)를 고상에 담지할 수 있다. 이용되는 수지의 Fmoc 보호 아미노산 등과의 결합에 이용되는 기(수지 결합기)는, 산에 의한 펩타이드의 절출이 가능하면 특별히 한정되지 않는다. Fmoc 보호 아미노산 등의 담지량, 담지율에 대해서도 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어, 트라이틸클로라이드 수지(Trt 수지), 2-클로로트라이틸클로라이드 수지(Clt 수지), 4-메틸트라이틸클로라이드 수지(Mtt 수지), 4-메톡시트라이틸클로라이드 수지(Mmt)를 이용할 수 있다. 수지는, 특히, 고상 합성 핸드북(머크 주식회사 발행, 평성 14년 5월 1일 발행)에 기재되어 있는 산감수성으로서 「H(＜5% TFA in DCM)」로 판정되어 있는 수지 결합기를 갖는 것이 바람직하고, 이용되는 아미노산측의 작용기에 맞추어 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 아미노산측의 작용기로서 카복실산(주쇄 카복실산, 혹은, Asp나 Glu로 대표되는 측쇄 카복실산), 또는 방향환 상의 하이드록시기(Tyr로 대표되는 페놀기)를 이용하는 경우에는, 수지로서 트라이틸클로라이드 수지(Trt 수지) 혹은 2-클로로트라이틸클로라이드 수지(Clt 수지)를 이용하는 것이 바람직하다. 아미노산측의 작용기로서 지방족 하이드록시기(Ser이나 Thr로 대표되는 지방족 알코올기)를 이용하는 경우에는, 수지로서 트라이틸클로라이드 수지(Trt 수지), 2-클로로트라이틸클로라이드 수지(Clt 수지) 혹은 4-메틸트라이틸클로라이드 수지(Mtt 수지)를 이용하는 것이 바람직하다.

수지를 구성하는 폴리머의 종류에 대해서도 특별히 한정되지 않는다. 폴리스타이렌으로 구성되는 수지의 경우에는, 100-200mesh 혹은 200-400mesh의 어느 것을 이용해도 된다. 또한, 가교율에 대해서도 특별히 한정되지 않지만, 1% DVB(다이바이닐벤젠) 가교의 것이 바람직하다.

Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체, 혹은 Fmoc 보호 펩타이드의 C말단에 위치하는 아미노산의 유리된 카복실산기 또는 활성 에스터화된 카복실산기와 수지 결합기의 화학 반응에 의해, Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체, 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 수지에 담지시킨다. 이 때, 유리된 카복실산은, 아미노산 또는 아미노산 유연체의 주쇄 카복실산이어도 되고, 측쇄 카복실산(Asp 등)이어도 된다. 카복실산기 대신에, Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 C말단에 위치하는 아미노산의, 주쇄 또는 측쇄의 유리된 OH기, 혹은, 유리된 SH기를 고상과의 담지에 이용할 수도 있다.

고상에 담지한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기에 의해 탈보호하여, 아미노기를 노출시킨다. 여기에서 이용되는 염기는, 특별히 한정되지 않지만, 펩타이드 합성에서 일반적으로 사용되는 탈보호제를 이용할 수 있다(예를 들어, Amino Acid-Protecting Groups (Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504)). 그와 같은 탈보호제로서는, 예를 들어, 2급 아민, 아미딘 골격을 갖는 염기, 구아니딘 골격을 갖는 염기가 바람직하다. 2급 아민으로서 구체적으로는, 예를 들어, 피페리딘, 모폴린, 피롤리딘 및 피라진을 들 수 있다. 아미딘 골격을 갖는 염기로서 구체적으로는, 예를 들어, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU) 및 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨(DBN)을 들 수 있다. 구아니딘 골격을 갖는 염기로서 구체적으로는, 예를 들어, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘을 들 수 있다.

상기 노출된 아미노기와 새롭게 첨가한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 유리된 또는 활성 에스터화된 카복실산기를 축합하여, 펩타이드 결합을 형성한다.

아미노기와 카복실산기를 축합할 때의 축합제로서는, 아마이드 결합을 형성할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 펩타이드 합성에서 일반적으로 사용되는 축합제가 바람직하다(예를 들어, Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup (Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602)). 이러한 축합제로서 구체적으로는 예를 들어, 카보다이이미드 골격을 갖는 축합제를 들 수 있다. 예를 들어, 카보다이이미드 골격을 갖는 축합제는, 활성 에스터를 형성할 수 있는 하이드록시 화합물과 조합하여, 축합 반응에 이용할 수 있다. 카보다이이미드 골격을 갖는 축합제로서는, 예를 들어, N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(WSCI·HCl) 등을 들 수 있다(예를 들어, WATANABE Chemical의 카탈로그, Amino acids and chiral building blocks to new medicine 참조). 활성 에스터를 형성할 수 있는 하이드록시 화합물로서는, 예를 들어, 1-하이드록시-1H-벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸(HOAt), 2-사이아노 2-(하이드록시이미노)아세트산 에틸(oxyma), 3,4-다이하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진(HOOBt 또는 HODhbt), N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복시미드(HONB), 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(HOPfp), N-하이드록시석신이미드(HOSu), 6-클로로-1-하이드록시-1H-벤조트라이아졸(Cl-HOBt)을 들 수 있다(예를 들어, WATANABE Chemical의 카탈로그, Amino acids and chiral building blocks to new medicine 참조). 또한, 이들 골격을 갖는 염, 예를 들어 oxyma의 칼륨염인 K-oxyma 등도 이용할 수 있다. 이들 중에서는 특히 HOBt, HOAt, oxyma, HOOBt가 바람직하다. 그 중에서도, DIC와 HOAt를 조합하여 이용하는 것, 혹은 DIC와 oxyma를 조합하여 이용하는 것이 바람직하다. 그 외에, 포스포늄계 축합제·유로늄계 축합제로서 O-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염(HBTU), O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염(HATU), N-[1-(사이아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)다이메틸아미노(모폴리노)]유로늄 헥사플루오로인산염(COMU), O-[(에톡시카보닐)사이아노메틸렌아미노]-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염(HOTU), O-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로붕산염(TBTU), O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로붕산염(TATU), 1H-벤조트라이아졸-1-일옥시-트라이(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로인산염(PyBOP), 1H-벤조트라이아졸-1-일옥시트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로인산염(BOP), 브로모트라이(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로인산염(PyBroP), 클로로트라이(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로인산염(PyCloP), (7-아자벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로인산(PyAOP), 브로모트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로인산(Brop), 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온(DEPBT), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)유로늄 테트라플루오로붕산(TSTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)유로늄 헥사플루오로인산(HSTU), O-(3,4-다이하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진-3-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로붕산염(TDBTU), 테트라메틸싸이오유로늄 S-(1-옥사이도-2-피리딜)-N,N,N',N'-테트라플루오로붕산염(TOTT), O-(2-옥소-1(2H)피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로붕산(TPTU) 중 어느 하나와 N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 트라이에틸아민(TEA), 2,4,6-트라이메틸피리딘(2,4,6-콜리딘), 2,6-다이메틸피리딘(2,6-루티딘) 중 어느 것인가의 염기를 조합하여 축합 반응에 이용할 수 있다. 특히 HATU와 DIPEA를 조합하여 이용하는 것, 혹은 COMU와 DIPEA를 조합하여 이용하는 것이 바람직하다. 그 외에, N,N'-카보닐다이이미다졸(CDI), 1,1'-카보닐다이(1,2,4-트라이아졸)(CDT), 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴륨 염화물(DMT-MM), 프로필포스폰산 무수물(T3P) 등의 축합제를 이용할 수도 있다.

본 발명의 제조 방법은, 새롭게 첨가한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여 아미노기를 노출시키는 공정, 및

추가로 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정을 추가로 포함한다. 이들 공정은 1회 또는 복수회 반복해도 된다. 본 발명의 방법은, Fmoc 골격을 갖는 보호기의 탈보호와 다음의 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드와의 축합 반응을 반복하는 것에 의해 목적하는 펩타이드 서열을 얻는 것이 가능하다.

본 발명을 고상법으로 실시하는 경우, 목적하는 펩타이드가 얻어진 후, 고상으로부터의 절출이 행해진다(절출 공정). 또한, 절출 공정을 행하기 전에 펩타이드의 구조 변환이나 환화를 행하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서는, 절출 시점에서, 보호기로 보호되어 있는 측쇄 작용기는 탈보호되어 있어도, 되어 있지 않아도 되고, 어느 것인가의 보호기 중 일부만이 탈보호되어 있어도 된다. 측쇄 작용기가 보호된 채로, 절출 공정이 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 절출 공정의 반응 조건으로서 구체적으로는, 약산이 되는 조건이 바람직하고, 특히 TFA보다도 약산이 되는 조건이 바람직하다. 이와 같은 약산으로서 구체적으로는, 수 중에서의 pKa의 값이 TFA보다도 높은 값을 나타내는 산이 바람직하다. 보다 구체적으로는, pKa의 값이 0∼15의 범위에 있는 것이 바람직하고, 수 중에서의 pKa치가 6∼15의 범위에 있는 것이 보다 바람직하다. 본 공정에서 이용되는 TFA보다도 약산이 되는 산으로서는, 예를 들어, TFE, HFIP 등을 들 수 있다. 약산을 TFE/아세트산과 같이 2개나 그 이상을 임의의 비율로 조합해도 된다. 또한 DCM, DCE, 물 등의 임의의 용매를 임의의 비율로 혼합해도 된다. 이와 같은 약산과 용매의 조합으로서, 특히 TFE와 DCM의 조합이 바람직하다. 절출에 이용되는 용액에는, 다른 유기 용매나 시약(예를 들어, DIPEA 등)이나 양이온 포착제(예를 들어, 트라이아이소프로필실레인 등) 등을 첨가해도 된다.

합성된 펩타이드의 측쇄의 보호기를 탈보호하기 전에 절출 공정을 행하는 경우, 절출에 이용되는 약산은, 탈보호 반응에서 이용되는 산보다도 약산인 것이 바람직하다. 이 경우, 미리 TFA보다 약산이 되는 산도가 상이한 2종류의 산을 준비해 두고, 보다 약산이 되는 산을 절출에 이용한다.

합성된 펩타이드의 측쇄의 보호기를 탈보호한 후에 절출 공정을 행하는 경우, 절출에 이용되는 약산은, TFA보다 약산이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 측쇄의 보호기의 탈보호 공정에 있어서는, 가수분해나 N→O-아실 시프트 등의 부반응을 저감시키고 원하는 탈보호 반응을 선택적으로 행하는 것이 가능하다. 측쇄의 보호기의 탈보호는, TFA보다도 약산이 되는 조건에서 행하는 것이 바람직하다. 반응은 임의의 온도에서 행할 수 있고, 0∼40℃에서 행하는 것이 바람직하다. 탈보호 완결 시 혹은 탈보호 도중에 반응을 정지할 때에, 예를 들어 암모니아나 1급∼3급 아민 등의 염기를 이용할 수 있다. 또한 염기성 헤테로환 화합물(예를 들어 피리딘이나 이미다졸, 또한 그들의 유연체) 등을 이용할 수도 있다.

본 발명의 제조 방법으로 합성된 펩타이드에, 추가로 개변이나 수식을 가하는 경우, 그들 공정은 절출 공정의 전후 어느 것에 있어서도 실시할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 펩타이드는, 1개의 반응점을 측쇄에 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기를 C말단측에 포함하고, 또한 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체를 N말단측에 포함하는, 펩타이드일 수 있다. 이와 같은 펩타이드는, 예를 들어 C말단측의 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기가 포함되고, N말단측에 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체가 포함되도록, 원료의 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 및 Fmoc 보호 펩타이드를 선택하는 것에 의해 제조할 수 있다.

이 펩타이드는, 1개의 반응점과 또 1개의 반응점을 결합시켜 환화할 수 있다. 본 발명의 제조 방법은, 이와 같은 환화 공정을 포함할 수 있다. 구체적으로는, WO2013/100132의 기재에 기초하여 환화 공정을 실시할 수 있다.

환화 공정을, 절출 공정 후에 실시하는 경우는, 절출 공정에 의해 얻어진 반응 용액(절출 용액)을 감압하 농축한 잔사를 환화 공정에 이용해도 되고, 절출 용액을 그대로 환화 공정에 이용해도 된다.

본 발명에 있어서, 「카복실산 유연체」에는 아미노기와 카복실기를 동시에 가지고, 양자 사이의 원자수가 3개 이상인 화합물이나, 아미노기를 가지지 않는 다양한 카복실산 유도체나, 2잔기∼4잔기로 형성되는 펩타이드나, 주쇄 아미노기가 카복실산과의 아마이드 결합 등으로 화학 수식된 아미노산이 포함된다. 또한, 「카복실산 유연체」는, 환화에 사용할 수 있는 붕산이나 붕산 에스터 부위를 갖고 있어도 된다. 또한, 「카복실산 유연체」는, 이중 결합 부위나 삼중 결합 부위를 갖는 카복실산이어도 되고, 케톤이나 할라이드를 갖는 카복실산이어도 된다. 한편, 이들 화합물도 규정한 작용기 이외의 부분은, 치환되어도 되고, 예를 들어, 알킬기, 아르알킬기, 아릴기, 사이클로알킬기, 헤테로아릴기, 알켄일기, 알킨일기 등 중으로부터 선택(자유로운 치환기)된다.

환화 공정은, 상기 2개의 반응점을, 예를 들어, 아마이드 결합, 다이설파이드 결합, 에터 결합, 싸이오에터 결합, 에스터 결합, 싸이오에스터 결합, 또는 탄소-탄소 결합에 의해 환화하는 공정을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.

아마이드 결합 형성에 의한 환화는, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점(주쇄의 아미노기 혹은, 측쇄에 존재하는 아미노기)과 측쇄에 1개의 카복실산을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체의 반응점으로 아마이드 결합을 형성시키는 것에 의한 환화이다. 이들 반응에 있어서, 축합제로서는, 전술한 펩타이드 결합에서 이용되는 것과 마찬가지의 것을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 HATU와 DIPEA의 조합, COMU와 DIPEA의 조합 등을 이용하여 측쇄 카복실산과 N말단 주쇄의 아미노기를, 또는 측쇄 아미노기와 C말단 주쇄의 카복실산을 축합할 수 있다. 이 때, C말단측의 카복실산의 보호기와 환화에 제공하는 측쇄의 카복실산의 보호기, 혹은 N말단측의 주쇄의 아미노기의 보호기와 환화에 제공하는 측쇄의 아미노기의 보호기는, 그 직교성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 이 일련의 펩타이드 합성에 있어서 바람직한 보호기는 전술한 바와 같다.

탄소-탄소 결합 형성에 의한 환화는, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점과 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체의 반응점으로 탄소-탄소 결합을 형성시키는 것에 의한 환화이다. 구체적으로는, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점으로서 알켄일기를 선택하고, 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기의 반응점으로서 알켄일기를 선택하여, 전이 금속을 촉매로 한 탄소-탄소 결합 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 이 때, 촉매로서 사용하는 전이 금속으로서는, 예를 들어, 루테늄, 몰리브데넘, 타이타늄, 텅스텐을 들 수 있다. 예를 들어, 루테늄을 이용했을 경우는, 메타세시스 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 또한, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점, 및 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기의 반응점으로서 아릴 할라이드 및 보론산 혹은 보론산 유연체의 조합을 채용하여, 전이 금속을 촉매로 한 탄소-탄소 결합 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 이 때, 촉매로서 사용하는 전이 금속으로서는, 팔라듐, 니켈, 철을 들 수 있다. 예를 들어, 팔라듐을 이용했을 경우는, 스즈키 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 또한, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점, 및 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기의 반응점으로서 알켄일기 및 아릴 할라이드 혹은 알켄일 할라이드의 조합을 채용하여, 전이 금속을 촉매로 한 탄소-탄소 결합 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 이 때, 촉매로서 사용하는 전이 금속으로서는, 팔라듐, 니켈을 들 수 있다. 예를 들어, 팔라듐을 이용했을 경우는, Heck형의 화학 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 또한, 예를 들어, N말단의 아미노산 잔기, N말단의 아미노산 유연체 잔기 또는 N말단 카복실산 유연체의 반응점, 및 측쇄에 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기의 반응점으로서 아세틸렌기 및 아릴 할라이드 혹은 알켄일 할라이드의 조합을 선택하여, 전이 금속을 촉매로 한 탄소-탄소 결합 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다. 이 때, 촉매로서 사용하는 전이 금속으로서는, 팔라듐, 구리, 금, 철을 들 수 있다. 예를 들어, 팔라듐과 구리의 조합을 이용했을 경우는, 소노가시라 반응에 의해 환화 반응을 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 얻어진 생성물을 필요에 따라서 정제할 수 있다. 예를 들어, 역상 컬럼이나, 분자체 컬럼 등의 펩타이드의 일반적인 정제 방법을 이용할 수 있다. 또한, 적절한 용매를 이용하여 결정화나 고화에 의해 정제할 수도 있다. 정제 전에 감압하 농축을 하는 것도 가능하다.

한편, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 원용된다.

실시예

본 발명은, 이하의 실시예에 의해 더 예시되지만, 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

한편, 실시예 중에서는 이하의 약호를 사용했다.

DCM 다이클로로메테인

DCE 1,2-다이클로로에테인

DMF N,N-다이메틸폼아마이드

DIC N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드

DIPEA N,N-다이아이소프로필에틸아민

DBU 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센

NMP N-메틸-2-피롤리돈

FA 폼산

TFA 트라이플루오로아세트산

TFE 2,2,2-트라이플루오로에탄올

HFIP 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로아이소프로필알코올

HOAt 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸

HOBt 1-하이드록시벤조트라이아졸

WSCI·HCl 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염

TBME t-뷰틸 메틸 에터

TIPS 트라이아이소프로필실레인

HATU O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염

또한, 펩타이드 합성 및, 고상 합성에 이용하는 반응 용매는 펩타이드 합성용(와타나베 화학, 와코 순약으로부터 구입)을 이용했다. 예를 들어 DCM, DMF, NMP, 2% DBU in DMF, 20% 피페리딘 in DMF 등이다. 또한, 물을 용매로서 가하지 않는 반응에서는, 탈수 용매, 초탈수 용매, 무수 용매(간토 화학, 와코 순약 등에서 구입)를 이용했다.

LCMS의 분석 조건은, 표 1과 같다.

실시예 1. N-메틸아미노산을 서열 중에 포함하는 환상 펩타이드의 기본 합성 루트

N-메틸아미노산을 서열 중에 포함하는 환상 펩타이드의 합성은, Fmoc법에 의한 고상 합성을 채용하여, 이하의 5단계의 공정에 의한 도 1에 기재된 합성 루트로 행했다.

A) 펩타이드 합성기를 이용하고 Fmoc법에 의해, 그 측쇄의 카복실산을 2-클로로트라이틸 레진에 담지시킨 Asp의 N말단으로부터 펩타이드를 신장시키는 공정

B) 2-클로로트라이틸 레진으로부터 펩타이드를 절출하는 공정

C) 절출한 펩타이드의 Asp의 측쇄의 카복실산(백색원 유닛)과 펩타이드쇄 N말단(삼각 유닛)의 아미노기를 축합하여, 아마이드 결합에 의해 환화하는 공정

D) 펩타이드쇄에 포함되는 측쇄 작용기의 보호기를 탈보호하는 공정

E) 분취 HPLC에 의해 화합물을 정제하는 공정.

본 실시예에 있어서는, 특별히 기술이 없는 한, 이 기본 합성 루트에 기초하여 환상 펩타이드의 합성을 행했다.

펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성에 이용하는 Fmoc-아미노산

본 실시예에 기재하는 펩타이드 합성에 있어서, 펩타이드 합성기에 의한 합성(상기 공정 A)에는, 이하의 Fmoc-아미노산을 이용했다.

Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-D-Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-MePhe-OH, Fmoc-MeAla-OH, Fmoc-MeGly-OH, Fmoc-MeLeu-OH, Fmoc-Phe(4-CF3)-OH, Fmoc-b-Ala-OH, Fmoc-b-MeAla-OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Met(O2)-OH, Fmoc-Phe(3-Cl)-OH, Fmoc-MeVal, 및 Fmoc-Val-OH.

이들은 와타나베 화학, Chempep사, 또는 Chem-Impex사 등에서 구입했다.

Fmoc-MeSer(DMT)-OH, Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH, Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH, Fmoc-Hyp(Et)-OH, 및 Fmoc-γEtAbu-OH, Fmoc-nPrGly-OH.

이들은, 문헌에 기재된 방법으로 합성했다(문헌: 국제공개번호 WO 2013/100132 A1).

Fmoc-Ser(THP)-OH(화합물 1), Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2), Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6), Fmoc-MeHis(Trt)-OH(화합물 7), Fmoc-D-Tyr(THP)-OH(화합물 8), Fmoc-D-Tyr(Pis)-OH(화합물 11), Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH(화합물 13), Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH(화합물 16), 및 Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OH(화합물 22).

이들은 이하와 같이 합성했다. 한편, 이들 합성한 Fmoc-아미노산은, 펩타이드 합성뿐만 아니라, 측쇄 작용기의 보호기 혹은 C말단 카복실산기의 보호기의 탈보호 검토에도 이용했다.

실시예 1-1:

(2S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)프로판산(화합물 1, Fmoc-Ser(THP)-OH)의 합성

[화학식 33]

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-하이드록시프로판산(Fmoc-Ser-OH, 와타나베 화학으로부터 구입, 1.0g, 3.06mmol)과 p-톨루엔설폰산 피리디늄(PPTS, 0.038g, 0.153mmol)의 혼합물에 톨루엔(10mL)을 가하고, 감압하 톨루엔을 증류제거함으로써 공비에 의해 포함되어 있는 수분을 제거했다. 얻어진 잔사에 초탈수 테트라하이드로퓨란(THF, 6.1mL)과 3,4-다이하이드로-2H-피란(1.9mL, 21.3mmol)을 가하고, 질소 분위기하, 50도에서 4시간 교반했다. LCMS(SQDFA05)로 원료의 소실을 확인 후, 혼합물을 25도까지 냉각하고, 아세트산 에틸(6mL)을 가했다. 계속하여 포화 염화 나트륨 수용액(6mL)을 가하여 유기층을 세정하고, 수층을 아세트산 에틸(6mL)로 추출했다. 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 이것을 추가로 포화 염화 나트륨 수용액(6mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 감압하 증류제거했다.

얻어진 잔사를 테트라하이드로퓨란(THF, 12.2mL)에 용해시키고, 그 다음에 pH 8.0으로 조제한 1.0M 인산 완충액(12.2mL)을 가했다. 이 혼합물을 50도에서 3시간 교반했다. 25도까지 냉각한 후, 아세트산 에틸(12.2mL)을 가하고, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 아세트산 에틸(12.2mL)을 가하여 추출을 행한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(12.2mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 감압하, 25도에서 30분 건조시켰다.

얻어진 잔사를 다이클로로메테인(7mL)에 용해시키고, 그 다음에 헵테인(16.6mL)을 가했다. 제어한 감압하(∼100hPa), 다이클로로메테인만을 증류제거하고, 얻어진 혼합물을 여과하여 고체를 얻었다. 이 헵테인으로의 세정 조작을 2번 반복했다. 얻어진 고체를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시켜, 1.40g의 잔사를 얻었다.

얻어진 잔사에 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 25mL)와 pH 2.1의 0.05M 인산 수용액(70mL)을 가하고, 25도에서 5분간 교반한 후, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 25mL)를 가하여 추출한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(25mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 감압하 용매를 증류제거했다. 잔사를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시킴으로써, (2S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)프로판산(화합물 1, Fmoc-Ser(THP)-OH, 1.22g, 30mol%의 t-뷰틸 메틸 에터(TBME)가 잔류)을 얻었다. 얻어진 Fmoc-Ser(THP)-OH는 -25도의 냉동고에서 보존했다.

LCMS(ESI) m/z=410.2 (M-H)^-

유지 시간: 0.81분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-2:

(2S,3R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)뷰탄산(화합물 2, Fmoc-Thr(THP)-OH)의 합성

[화학식 34]

(2S,3R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-하이드록시뷰탄산 1수화물(Fmoc-Thr-OH의 1수화물, 도쿄 화성으로부터 구입, 5.0g, 13.9mmol)과 p-톨루엔설폰산 피리디늄(PPTS, 0.175g, 0.70mmol)의 혼합물에 톨루엔(50mL)을 가하고, 감압하 톨루엔을 증류제거함으로써 공비에 의해 포함되어 있는 수분을 제거했다. 얻어진 잔사에 초탈수 테트라하이드로퓨란(THF, 28mL)과 3,4-다이하이드로-2H-피란(8.8mL, 97mmol)을 가하고, 질소 분위기하, 50도에서 4시간 교반했다. LCMS(SQDFA05)로 원료의 소실을 확인 후, 혼합물을 25도까지 냉각하고, 아세트산 에틸(30mL)을 가했다. 계속하여 포화 염화 나트륨 수용액(30mL)을 가하여 유기층을 세정하고, 수층을 아세트산 에틸(30mL)로 추출했다. 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 이것을 추가로 포화 염화 나트륨 수용액(30mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 감압하 증류제거하여, 조생성물을 9.3g 얻었다.

얻어진 조생성물 중, 4.65g을 테트라하이드로퓨란(THF, 30mL)에 용해시키고, 그 다음에 pH 8.0으로 조제한 1.0M 인산 완충액(30mL)을 가했다. 이 혼합물을 50도에서 4시간 교반했다. 25도까지 냉각한 후, 아세트산 에틸(30mL)을 가하고, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 아세트산 에틸(30mL)을 가하여 추출을 행한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(30mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 감압하, 25도에서 30분 건조시켰다.

얻어진 잔사를 다이에틸 에터(50mL)에 용해시키고, 그 다음에 헵테인(50mL)을 가했다. 제어한 감압하(∼100hPa), 다이에틸 에터만을 증류제거하고, 얻어진 혼합물을 여과하여 고체를 얻었다. 이 헵테인으로의 세정 조작을 2번 반복했다. 얻어진 고체를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시켜, Fmoc-Thr(THP)-OH의 나트륨염(2.80g, 6.26mmol)을 얻었다.

얻어진 전량의 Fmoc-Thr(THP)-OH의 나트륨염에 아세트산 에틸(50mL)과 pH 2.1의 0.05M 인산 수용액(140mL)을 가하고, 25도에서 5분간 교반한 후, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 아세트산 에틸(50mL)을 가하여 추출한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(50mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 감압하 용매를 증류제거했다. 잔사를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시킨 후, 얻어진 고체를 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 50mL)에 용해시키고, 용매를 감압하 증류제거했다. 추가로 펌프로 감압하, 25도에서 1시간 건조시킴으로써, (2S,3R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)뷰탄산(화합물 2, Fmoc-Thr(THP)-OH, 2.70g, 30mol%의 t-뷰틸 메틸 에터(TBME)가 잔류)을 THP 보호 상의 부제 탄소에서 유래하는 다이아스테레오머로서 얻었다. 얻어진 Fmoc-Thr(THP)-OH는 -25도의 냉동고에서 보존했다.

LCMS(ESI) m/z=424.2 (M-H)^-

유지 시간: 0.84분, 0.85분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-3:

(2S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)프로판산(화합물 6, Fmoc-MeSer(THP)-OH)의 합성

[화학식 35]

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-하이드록시프로판산(Fmoc-MeSer-OH)은 문헌에 기재된 방법으로 합성했다(문헌: 국제공개번호 WO 2013/100132 A1). (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-하이드록시프로판산(Fmoc-MeSer-OH, 15g, 43.9mmol)의 테트라하이드로퓨란(88mL) 용액에, p-톨루엔설폰산 피리디늄(PPTS, 0.552g, 2.197mmol)과 3,4-다이하이드로-2H-피란(23.85mL)을 가하고, 50도에서 4시간 교반했다. 혼합물을 25도까지 냉각하고, 아세트산 에틸(90mL)을 가했다. 계속하여 포화 염화 나트륨 수용액(90mL)으로 유기층을 세정하고, 수층을 아세트산 에틸(90mL)로 추출했다. 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 이것을 추가로 포화 염화 나트륨 수용액(90mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 감압하 증류제거했다.

얻어진 잔사 중, 15.0g을 테트라하이드로퓨란(175mL)에 용해시키고, 그 다음에 pH 8.0으로 조제한 1.0M 인산 완충액(175mL)을 가했다. 이 혼합물을 50도에서 3시간 교반했다. 25도까지 냉각한 후, 아세트산 에틸(175mL)을 가하고, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 아세트산 에틸(175mL)을 가하여 추출을 행한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(175mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거했다.

얻어진 잔사를 다이클로로메테인(100mL)에 용해시키고, 그 다음에 헵테인(250mL)을 가했다. 제어한 감압하(∼100hPa), 다이클로로메테인만을 증류제거하고, 얻어진 혼합물을 여과하여 고체를 얻었다. 이 헵테인으로의 세정 조작을 2번 반복했다. 얻어진 고체를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시켰다.

얻어진 잔사에 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 250mL)와 pH 2.1의 0.05M 인산 수용액(700mL)을 가하고, 25도에서 5분간 교반한 후, 유기층과 수층을 분리했다. 수층에 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 250mL)를 가하여 추출한 후, 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 수용액(250mL)으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 감압하 용매를 증류제거했다. 잔사를 펌프로 감압하, 25도에서 2시간 건조시킴으로써, (2S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)프로판산(화합물 6, Fmoc-MeSer(THP)-OH, 9.0g, 30mol%의 t-뷰틸 메틸 에터(TBME)가 잔류)을 얻었다. 얻어진 Fmoc-MeSer(THP)-OH는 -25도의 냉동고에서 보존했다.

LCMS(ESI) m/z=426.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.86분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-4:

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-(1-트라이틸-1H-이미다졸-4-일)프로판산(화합물 7, Fmoc-MeHis(Trt)-OH)의 합성

[화학식 36]

3000mL의 플라스크에, (S)-3-(1H-이미다졸-4-일)-2-(메틸아미노)프로판산 염산염(75g, 364.71mmol)의 다이클로로메테인(1000mL) 용액과 다이클로로다이메틸실레인(51g, 395.16mmol), 트라이에틸아민(40g, 395.30mmol)을 가했다. 계속하여, (클로로메테인트라이일)트라이벤젠(Trt-Cl, 111g, 398.17mmol)의 다이클로로메테인(500mL) 용액과 트라이에틸아민(40g, 395.30mmol)을 가했다. 얻어진 반응 용액을 가열 환류하, 4시간 교반하고, 추가로 20도에서 2시간 교반했다. 반응 용액에 메탄올을 가하여 반응을 정지하고, 계속하여 감압하, 용매를 증류제거했다. 트라이에틸아민으로 pH를 8∼8.5로 하여, 125g의 고체를 얻었다.

얻어진 고체에 1,4-다이옥세인(1000mL), 탄산 칼륨(84g, 603.39mmol), 물(1000mL)을 가했다. 추가로 탄산 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)(9H-플루오렌-9-일)메틸(Fmoc-OSu, 102g, 302.38mmol)을 가하고, 0도에서 2시간 교반했다. 얻어진 반응 용액을 다이에틸 에터(2000mL)로 세정한 후, 아세트산을 이용하여 용액의 pH를 6∼7로 조정했다. 얻어진 고체를 여과함으로써, (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-(1-트라이틸-1H-이미다졸-4-일)프로판산(화합물 7, Fmoc-MeHis(Trt)-OH, 155g)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=634.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.07분 (분석 조건 SQDAA05)

실시예 1-5:

(2R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)페닐)프로판산(화합물 8, Fmoc-D-Tyr(THP)-OH)의 합성

[화학식 37]

(R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-하이드록시페닐)프로판산(Fmoc-D-Tyr-OH, 와타나베 화학으로부터 구입, 500mg, 1.24mmol)과 촉매량의 파라톨루엔설폰산 피리디늄(PPTS, 15.6mg, 0.062mmol)에 톨루엔(5.0mL)을 가하고, 감압하 톨루엔을 증류제거함으로써 공비에 의해 포함되어 있는 수분을 제거했다. 얻어진 잔사를 테트라하이드로퓨란(THF)(2.5mL)에 용해시키고, 3,4-다이하이드로-2H-피란(785μL, 8.68mmol)을 가하고, 질소 분위기하, 50도에서 4시간 교반했다. 반응액을 25도로 냉각하고, 아세트산 에틸(3mL)을 가했다. 계속하여 포화 식염수(3mL)를 가하여 유기층을 세정하고, 수층을 아세트산 에틸(3mL)로 추출했다. 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 이것을 추가로 포화 식염수(3mL)로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 감압하 건조시켜 596mg의 잔사를 얻었다.

얻어진 잔사(300mg)를 테트라하이드로퓨란(THF)(2.5mL)에 용해시키고, 1.0M의 인산 수용액(pH 8.0, 2.5mL)을 가하고 50도에서 3시간 교반했다. 반응액에 아세트산 에틸(3mL)을 가하고, 유기층과 수층을 분리하고, 수층을 아세트산 에틸(3mL)로 추출했다. 얻어진 모든 유기층을 혼합하고, 포화 식염수(3mL)로 2회 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 감압하 30분 건조시켰다.

얻어진 잔사를 다이클로로메테인(DCM)(2mL)에 용해시키고, 헵테인(5mL)을 가했다. 다이클로로메테인(DCM)만을 이배퍼레이터에 의해 제거하고, 얻어진 백색 고체를 여과에 의해 모았다. 얻어진 백색 고체에 대해서, 마찬가지의 조작을 2회 반복했다. 그와 같이 하여 얻어진 백색 고체를 펌프로 감압하 2시간 건조시켰다.

상기의 백색 고체에 t-뷰틸 메틸 에터(TBME)(4.6mL)와 0.05M 인산 수용액 (pH 2.1, 13mL)을 가하고, 25도에서 5분 교반했다. 유기층을 분리한 후, 수층을 t-뷰틸 메틸 에터(TBME)(4.6mL)로 추출했다. 얻어진 유기층을 모아 포화 식염수(4.6mL)로 2회 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 감압하 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 역상 크로마토그래피(Wakosil 25C18 10g, 물/아세토나이트릴)에 의해 정제함으로써 (2R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)페닐)프로판산(화합물 8, Fmoc-D-Tyr(THP)-OH, 173mg)을 THP 보호 상의 부제 탄소에서 유래하는 다이아스테레오머로서 57%의 수율로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=488.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.92분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-6:

2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(화합물 9)의 합성

[화학식 38]

2-페닐프로판-2-올(Wako사부터 구입, 2.0g, 14.7mmol)의 다이에틸 에터(Et₂O) 용액(4.8mL)에 1.9M NaHMDS의 테트라하이드로퓨란(THF) 용액(850μL, 1.62mmol)을 적하에 의해 22도에서 가했다. 반응액을 동일한 온도에서 20분 교반한 후, 0도로 냉각하고, 2,2,2-트라이클로로아세토나이트릴(1.47mL, 14.7mmol)을 적하하면서 가했다. 반응액을 0도에서 10분 교반한 후, 15도로 승온하고, 추가로 1시간 교반했다. 반응액을 이배퍼레이터에 의해 농축하고, 얻어진 잔사에 헥세인(1.8mL)과 메탄올(65μL)을 가하고 15도에서 15분 교반했다. 얻어진 고체를 여과하고, 헥세인(2.0mL)으로 3회 세정하여, 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(화합물 9)을 4.19g 얻었다. 추가로 정제는 하지 않고 이대로 반응에 이용했다.

¹H NMR (Varian 400-MR, 400 MHz, CDCl₃) δ 1.89 (6H, s), 7.28 (1H, m), 7.36 (2H, m), 7.43 (2H, m), 8.20 (1H, brs)

실시예 1-7:

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-하이드록시페닐)프로판산 (R)-메틸(화합물 10, Fmoc-D-Tyr-OMe)의 합성

[화학식 39]

질소 분위기하, (R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-(tert-뷰톡시)페닐)프로판산(Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH, 와타나베 화학으로부터 구입, 5.0g, 10.88mmol)과 메탄올(8.80mL, 218mmol)의 혼합물에 염화 싸이오닐(1.59mL, 21.76mmol)을 0도에서 적하했다. 얻어진 반응 용액을 25도에서 3시간 교반하고, 계속하여 감압하, 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 아세트산 에틸에 용해시키고, 용액을 포화 염화 나트륨 수용액으로 2번 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과로 고체를 제거하고, 감압하, 용매를 증류제거하여, 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-하이드록시페닐)프로판산 (R)-메틸(화합물 10, Fmoc-D-Tyr-OMe, 4.50g)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=418.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.81분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-8:

(R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산 (화합물 11, Fmoc-D-Tyr(Pis)-OH)의 합성

[화학식 40]

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-하이드록시페닐)프로판산 (R)-메틸(화합물 10, Fmoc-D-Tyr-OMe, 100mg, 0.24mmol)의 테트라하이드로퓨란(THF) 용액(240μL)에 별도 조정한 10M 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(화합물 9)의 사이클로헥세인 용액(60μL)과 촉매량의 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 4.55μL, 0.036mmol)를 0도에서 적하하면서 가했다. 반응액을 25도에서 1시간 교반한 후, 동량의 10M 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(화합물 9)의 사이클로헥세인 용액(60μL)과 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 4.55μL, 0.036mmol)를 다시 가하고, 반응액을 25도에서 추가로 30분 교반했다. 반응액을 다이클로로메테인(DCM)으로 희석하고, 포화 탄산수소 나트륨 수용액을 가했다. 다이클로로메테인으로 추출 후, 포화 식염수로 유기층을 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사에 다이클로로메테인(DCM)/헥세인 = 1/1의 용액을 가하고, 여과에 의해 침전물을 제거했다. 여액을 이배퍼레이터에 의해 농축하고, 얻어진 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(purif pack(등록상표) SIZE 20, 헥세인/아세트산 에틸)로 정제하여, 혼합물로서 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산 (R)-메틸(Fmoc-D-Tyr(Pis)-OMe)을 얻었다.

전술한 얻어진 혼합물을 다이클로로에테인(DCE)(535μL)에 용해시키고, 수산화 트라이메틸 주석(IV)(Me₃SnOH, 58.1mg, 0.321mmol)을 가하고, 60도에서 7시간 교반했다. 반응액에 수산화 트라이메틸 주석(IV)(Me₃SnOH, 29.1mg, 0.161mmol)을 추가로 가하고, 60도에서 15시간 교반했다. 반응액을 이배퍼레이터에 의해 농축하고, t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 1mL)와 0.05M 인산 수용액(pH 2.1, 2mL)을 가하고, 25도에서 5분 교반했다. 유기층을 분리한 후, 수층을 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 1mL)로 2회 추출했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피(purif pack(등록상표) SIZE 20, 다이클로로메테인/메탄올)로 정제하여, (R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산(화합물 11, Fmoc-D-Tyr(Pis)-OH, 33mg)을 2단계 수율 39%로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=522.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.00분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-9:

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-하이드록시페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 12, Fmoc-Tyr(3-F)-OMe)의 합성

[화학식 41]

(S)-2-아미노-3-(3-플루오로-4-하이드록시페닐)프로판산(H₂N-Tyr(3-F)-OH, Astatech사부터 구입, 2.0g, 10.0mmol)을 10% 탄산 나트륨 수용액에 녹인 후, 적하 깔때기로, 탄산 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)(9H-플루오렌-9-일)메틸(Fmoc-OSu, 3.39g, 10.0mmol)의 1.4-다이옥세인(35mL)의 용액을 0도에서 첨가했다. 반응액을 25도에서 40분 교반한 후, 물(35mL), 다이에틸 에터(70mL)를 가하고, 다이에틸 에터로 3회 세정했다. 5N 염산 수용액으로 수층의 pH를 2∼3으로 조정한 후, 아세트산 에틸로 3회 추출(100mL×3)했다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 추가로 정제는 하지 않고서 얻어진 잔사(4.08g)를 그대로 다음의 반응에 이용했다.

상기의 잔사(1.04g)를 메탄올(10mL)에 녹이고, 싸이오닐 클로라이드(SOCl₂, 539μL, 7.38mmol)를 적하하면서 0도에서 가했다. 반응액을 60도에서 1시간 교반한 후, 실온에 냉각하고, 이배퍼레이터를 이용하여 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사에 아세트산 에틸, 물을 가하고, 아세트산 에틸로 2회 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(purif pack(등록상표) SIZE 200, 헥세인/아세트산 에틸)로 정제하여, 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-하이드록시페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 12, Fmoc-Tyr(3-F)-OMe, 900mg, 2.07mmol)을 2단계 수율 84%로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=436.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.82분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-10:

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-(tert-뷰톡시)-3-플루오로페닐)프로판산(화합물 13, Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH)의 합성

[화학식 42]

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-하이드록시페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 12, Fmoc-Tyr(3-F)-OMe, 300mg, 0.689mmol)의 테트라하이드로퓨란(THF) 용액(690μL)에 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 tert-뷰틸(308μL, 1.72mmol)과 촉매량의 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 13.1μL, 0.103mmol)를 0도에서 적하하면서 가했다. 반응액을 25도에서 1시간 교반한 후, 동량의 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 tert-뷰틸(308μL, 1.72mmol)과 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 13.1μL, 0.103mmol)를 다시 가하고, 반응액을 25도에서 추가로 1시간 교반했다. 반응액을 다이클로로메테인(DCM)으로 희석하고, 포화 탄산수소 나트륨 수용액을 가했다. 다이클로로메테인으로 추출 후, 포화 탄산수소 나트륨 수용액, 포화 식염수로 유기층을 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(purif pack(등록상표) SIZE 60, 헥세인/아세트산 에틸)로 정제하여, 혼합물로서 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-(tert-뷰톡시)-3-플루오로페닐)프로판산 (S)-메틸(Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OMe)을 얻었다.

전술한 얻어진 혼합물(40mg)을 다이클로로에테인(DCE)(810μL)에 용해시키고, 수산화 트라이메틸 주석(IV)(Me₃SnOH, 29.4mg, 0.163mmol)을 가하고, 60도에서 1시간 교반했다. 반응액에 폼산(15.35μL, 0.407mmol)을 가한 후, 역상 크로마토그래피(Wakosil 25C18 10g, 0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)에 의해 정제함으로써 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-(tert-뷰톡시)-3-플루오로페닐)프로판산(화합물 13, Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH, 27mg, 56.5μmol)을 2단계 수율 93%로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=478.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.94분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-11:

피롤리딘-1,2-다이카복실산 2-(2-페닐프로판-2-일) (S)-1-((9H-플루오렌-9-일)메틸)(화합물 14, Fmoc-Pro-OPis)의 합성

[화학식 43]

2-페닐-2-프로판올(14.2g, 104mmol)과 탈수 다이에틸 에터(35mL)의 혼합물에, 질소 분위기하, 실온에서 1.9M NaHMDS(테트라하이드로퓨란 용액, 0.85mL, 1.62mmol)를 3분 이상에 걸쳐 적하하고, 그 후 실온에서 30분간 교반했다.

계속하여, 반응액을 0도로 빙랭하고, 트라이클로로아세토나이트릴(11.5mL, 115mmol)을 5분 이상에 걸쳐 적하했다. 혼합물을 0도에서 10분간, 그 후 빙욕으로부터 제거하고 실온에서 추가로 1시간 교반했다. 얻어진 혼합물을 0도로 빙랭하고, (S)-1-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)피롤리딘-2-카복실산(Fmoc-Pro-OH, 42.3g, 125mmol)과 다이클로로메테인(100mL)의 혼합물을 15분에 걸쳐 가했다. 0도에서 30분 교반한 후, 여과하고, 헥세인-다이클로로메테인(5/1) 용액으로 세정하고, 계속하여 감압하, 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인-아세트산 에틸)로 정제하여, 피롤리딘-1,2-다이카복실산 2-(2-페닐프로판-2-일) (S)-1-((9H-플루오렌-9-일)메틸)(화합물 14, Fmoc-Pro-OPis, 26.3g, 57.7mmol)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=456.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.76분 (분석 조건 SQDAA50)

실시예 1-12:

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-(4-클로로페닐)프로판산(화합물 16, Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH)의 합성

[화학식 44]

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(4-클로로페닐)프로판산(Fmoc-Phe(4-Cl)-OH, 170g, 402.96mmol)의 톨루엔(2.5 L) 용액에 파라폼알데하이드(48g, 1.60mol)와 10-캄파설폰산(CSA, 4.6g, 19.83mmol)을 가하고, 110도에서 16시간 교반했다. 계속하여 반응 용액을 포화 탄산수소 나트륨 수용액(1L)으로 2회, 포화 염화 나트륨 수용액(1L)으로 2회 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거하고, 감압하, 용매를 증류제거하여 160g의 4-(4-클로로벤질)-5-옥소옥사졸리딘-3-카복실산 (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸을 얻었다.

마찬가지의 조작으로 조제한 별개 로트와 혼합한 4-(4-클로로벤질)-5-옥소옥사졸리딘-3-카복실산 (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸(230g, 530.10mmol)의 다이클로로메테인(2.5L) 용액에 트라이에틸실레인(881g, 7.58mol)과 트라이플루오로아세트산(TFA, 2518g, 22.28mol)을 혼합하고, 30도에서 12시간 교반했다. 계속하여 감압하, 용매를 증류제거하고, 얻어진 잔사를 다이클로로메테인/헥세인(1/10, v/v)에서 재결정하는 것에 의해, (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-3-(4-클로로페닐)프로판산(화합물 16, Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH, 205g)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=436.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.99분 (분석 조건 SQDAA05)

실시예 1-13:

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 21, Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OMe)의 합성

[화학식 45]

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-하이드록시페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 12, Fmoc-Tyr(3-F)-OMe, 200mg, 0.459mmol)을 THF(460μL)에 녹인 후, 별도 조정한 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(화합물 9, 322mg, 1.15mmol)과 촉매량의 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 8.73μL, 0.069mmol)를 0도에서 적하하면서 가했다. 반응액을 실온에서 30분 교반 후, 동량의 2,2,2-트라이클로로아세트이미드산 2-페닐프로판-2-일(322mg, 1.15mmol)과 촉매량의 보론 트라이플루오라이드-에틸 에터 컴플렉스(BF₃-OEt, 8.73μL, 0.069mmol)를 0도에서 적하하면서 가했다. 반응액을 실온에서 30분 추가로 교반한 후, 반응액을 다이클로로메테인으로 희석하고, 포화 탄산수소 나트륨 수용액을 빙랭하 가했다. 다이클로로메테인으로 추출 후, 포화 식염수로 유기층을 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사를 다이클로로메테인/헥세인=1/1(20mL, 10mL)로 2회 세정하고, 백색 고체를 여과에 의해 제거했다. 얻어진 액을 농축하고, 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(purif pack(등록상표) SIZE 20, 헥세인/아세트산 에틸, 0.1% 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA))로 정제하여, 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 21, Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OMe, 210mg, 0.379mmol)을 83%의 수율로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=554.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.09분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-14:

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산(화합물 22, Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OH)의 합성

[화학식 46]

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산 (S)-메틸(화합물 21, Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OMe, 210mg, 0.379mmol)을 다이클로로에테인(DCE)(1.26mL)에 용해시키고, 수산화 트라이메틸 주석(IV)(Me₃SnOH, 137mg, 0.379mmol)을 가하고, 60도에서 3시간 교반했다. 반응액을 이배퍼레이터에 의해 농축하고, t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 2.0mL)와 0.05M 인산 수용액(pH 2.1, 4.0mL)을 가하고, 25도에서 15분 교반했다. 유기층을 분리한 후, 수층을 t-뷰틸 메틸 에터(TBME, 1mL)로 2회 추출했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하 증류제거하고, 추가로 펌프로 건조시켰다. 얻어진 잔사를 0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액으로 녹이고, 15분 교반한 후, 얻어진 용액을 역상 크로마토그래피(Wakosil 25C18 30g, 0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴)에 의해 정제함으로써 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-(3-플루오로-4-((2-페닐프로판-2-일)옥시)페닐)프로판산(화합물 22, Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OH, 190mg, 0.352mmol)을 수율 93%로 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=538.2 (M-H)^-

유지 시간: 1.00분 (분석 조건 SQDFA05)

펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성에 이용하는 레진과 Fmoc-아미노산의 결합체의 합성

펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성에 이용하는 레진과 Fmoc-아미노산의 결합체는, 이하와 같이 합성했다.

실시예 1-15:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-(피페리딘-1-일)뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 50, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip)의 합성

[화학식 47]

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-(피페리딘-1-일)뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 50, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip)은, 문헌에 기재된 방법으로 합성했다(문헌: 국제공개번호 WO 2013/100132 A1).

본 명세서에서는, 폴리머나 레진과 화합물이 결합했을 경우, 폴리머나 레진 부위를 ○로 표기하는 경우가 있다. 또한, 레진 부위의 반응점을 명확하게 할 목적으로, ○에 접속시켜 반응 부위의 화학 구조를 표기시키는 경우가 있다. 예를 들어, 상기의 구조 (Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50))에서는, 레진의2-클로로트라이틸기가 Asp의 측쇄 카복실산과 에스터 결합을 개재시켜 결합하고 있다. 한편, pip란 피페리딘을 의미하고, 상기의 구조에서는 C말단의 카복실산기가 피페리딘과 아마이드 결합을 형성하고 있다.

실시예 1-16

Fmoc-Asp-piptBu(화합물 51)의 측쇄 카복실산에서 레진과 결합시킨 화합물(화합물 52)의 합성

실시예 1-16-1:

3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 53, Fmoc-Asp(OtBu)-piptBu)의 합성(한편, piptBu란 4-(tert-뷰틸)피페리딘을 의미하고, 여기에서는 C말단의 카복실산기가 4-(tert-뷰틸)피페리딘과 아마이드 결합을 형성하고 있는 것을 나타내고 있다.)

[화학식 48]

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(tert-뷰톡시)-4-옥소뷰탄산(10g, 24.30mmol)과 4-(tert-뷰틸)피페리딘 염산염(4.10g, 23.09mmol)과 1-하이드록시벤조트라이아졸 1수화물(HOBt, 3.61g)을 DMF(80mL)에 용해하고, 0도에서1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(WSCI·HCl, 5.59g)을 가하고, 0도에서 30분간 교반했다. 계속하여, 4-메틸 모폴린(2.54mL)을 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응 용액에 헥세인-아세트산 에틸(1/1, v/v, 500mL)을 가하고, 유기층을 포화 염화 암모늄 수용액으로 2회, 포화 탄산수소 나트륨 수용액으로 2회, 포화 염화 나트륨 수용액으로 1회 세정했다. 얻어진 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거하고, 감압하, 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(이동층: 헥세인-아세트산 에틸)로 정제하여, 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 53, Fmoc-Asp(OtBu)-piptBu, 11.5g, 21.51mmol)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=535.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.17분 (분석 조건 SQDAA05)

실시예 1-16-2:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산(화합물 51, Fmoc-Asp-piptBu)의 합성

[화학식 49]

3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 53, Fmoc-Asp(OtBu)-piptBu, 2.0g, 3.74mmol)에 톨루엔을 가하고, 감압하, 용매를 증류제거함으로써, 공비에 의해 포함되는 물을 제거했다. 얻어진 잔사를 다이클로로메테인(1.66mL)에 용해하고, 칼 피셔 측정으로, 포함되는 수분량이 110ppm인 것을 확인했다. 계속하여, 0도에서 5분간 교반하고, 트라이플루오로아세트산(TFA, 1.66mL)을 0도에서 적하하고, 5분간 교반했다. 반응 용액을 실온으로 되돌리고, 4시간 교반을 계속했다. 혼합물을 0도로 냉각하고, 트라이에틸아민(3.1mL)을 적하했다. 혼합물을 다이클로로메테인(30mL)으로 희석하고, 5% 인산이수소 나트륨 수용액(5% NaH₂PO₄ aq, pH 4.4)으로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거한 후에, 감압하, 20도에서 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 ¹⁹F NMR 측정(DMSO-d6)하여, TFA의 잔류가 확인되었기 때문에, 잔사를 다시 다이클로로메테인(30mL)으로 희석하고, 5% 인산이수소 나트륨 수용액(5% NaH₂PO₄ aq, pH 4.4)으로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거한 후에, 감압하, 20도에서 용매를 증류제거하여, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산(화합물 51, Fmoc-Asp-piptBu, 1.73g)을 얻었다. ¹⁹F NMR로 TFA의 잔류가 검출 한계 이하인 것을 확인했다.

LCMS(ESI) m/z=479.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.00분 (분석 조건 SQDAA05)

실시예 1-16-3:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 52, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu)의 합성

[화학식 50]

필터 부가 반응 용기에 2-클로로트라이틸클로라이드 레진(1.60mmol/g, 100-200mesh, 1% DVB, 와타나베 화학으로부터 구입, 4.52g, 7.23mmol)과 탈수 다이클로로메테인(72mL)을 넣고 25도에서 10분간 진탕했다. 질소압을 걸어 다이클로로메테인을 제거한 후, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산(화합물 51, Fmoc-Asp-piptBu, 1.73g)과 탈수 다이클로로메테인(72mL)에 탈수 메탄올(1.17mL) 및 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 3.02mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하여, 15분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 탈수 다이클로로메테인(72mL)에 탈수 메탄올(9.0mL)과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 3.02mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하고, 90분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 다이클로로메테인을 넣어 5분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거했다. 이 다이클로로메테인으로의 레진의 세정을 5회 반복하고, 얻어진 레진을 감압하에서 하룻밤 건조시켜, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(4-(tert-뷰틸)피페리딘-1-일)-4-옥소뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 52, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu, 5.23g)을 얻었다.

얻어진 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu(화합물 52, 16.5mg)를 반응 용기에 넣고, 20% 피페리딘/DMF 용액(1mL)을 가하고, 25도에서 30분간 진탕했다. 반응 혼합액으로부터 30μL를 취출하고, 이것을 DMF(2.97mL)로 희석하고, 그 흡광도(301.2nm)를 측정하여(Shimadzu, UV-1600PC(셀 길이 1.0cm)를 이용하여 측정), Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu(화합물 52)의 로딩량을 0.356mmol/g으로 산출했다.

한편, 마찬가지로 합성한 로딩량이 상이한 별도 로트에 대해서도 펩타이드 합성에 사용했다.

실시예 1-17:

Fmoc-Asp-MeOctyl(화합물 54)의 측쇄 카복실산으로 레진과 결합시킨 화합물(화합물 55)의 합성

실시예 1-17-1:

3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 56, Fmoc-Asp(OtBu)-MeOctyl)의 합성(한편, MeOctyl이란 N-메틸옥테인-1-아민을 의미하고, 여기에서는 C말단의 카복실산기가 N-메틸옥테인-1-아민과 아마이드 결합을 형성하고 있는 것을 나타내고 있다.)

[화학식 51]

300mL의 플라스크에 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(tert-뷰톡시)-4-옥소뷰탄산(Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 8.00g, 19.44mmol)과 DMF(65mL)를 가하고 실온에서 5분간 교반했다. 계속하여 4-메틸모폴린(2.57mL)과 O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염(HATU, 8.87g, 23.33mmol)을 가하고, 0도에서 5분간 교반했다. 추가로, N-메틸옥테인-1-아민(3.35mL, 18.47mmol)을 2분간에 걸쳐 적하하고, 얻어진 반응 용액을 0도에서 30분간 교반했다. 이 반응 용액에, 헥세인-아세트산 에틸(1/1, v/v, 400mL)을 가하고, 물(400mL), 포화 염화 암모늄 수용액(400mL), 50% 탄산수소 나트륨 수용액(400mL), 물(400mL×2), 포화 염화 나트륨 수용액(400mL)으로 세정했다. 얻어진 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 제거하고, 감압하, 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인-아세트산 에틸)로 정제하여, 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 56, Fmoc-Asp(OtBu)-MeOctyl, 10.2g, 19.00mmol)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=537.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.84분 (분석 조건 SQDFA50)

실시예 1-17-2:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산(화합물 54, Fmoc-Asp-MeOctyl)의 합성

[화학식 52]

3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산 (S)-tert-뷰틸(화합물 56, Fmoc-Asp(OtBu)-MeOctyl, 8.1g, 15.09mmol)에 톨루엔을 가하고, 감압하, 용매를 증류제거함으로써, 공비에 의해 포함되는 물을 제거했다. 얻어진 잔사에 다이클로로메테인(탈수, 6.7mL)에 용해하고, 칼 피셔 측정으로, 포함되는 수분량이 380ppm인 것을 확인했다. 계속하여, 0도에서 5분간 교반하고, 트라이플루오로아세트산(TFA, 6.7mL)을 0도에서 5분간에 걸쳐 적하하고, 그 후 5분간 교반했다. 반응 용액을 실온으로 되돌리고, 4시간 교반을 계속했다. 혼합물을 0도로 냉각하고, 트라이에틸아민(12.62mL)을 적하했다. 혼합물을 다이클로로메테인(100mL)으로 희석하고, 5% 인산이수소 나트륨 수용액(5% NaH₂PO₄ aq)으로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거한 후에, 감압하, 20도에서 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 ¹⁹F NMR 측정(DMSO-d6)하여, TFA의 잔류가 확인되었기 때문에, 잔사를 다시 다이클로로메테인에 용해하고, 5% 인산이수소 나트륨 수용액(5% NaH₂PO₄ aq)으로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 고체를 여과로 제거한 후에, 감압하, 20도에서 용매를 증류제거하여, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산(화합물 54, Fmoc-Asp-MeOctyl, 6.61g, 13.75mmol)을 얻었다. ¹⁹F NMR로 TFA의 잔류가 검출 한계 이하인 것을 확인했다.

LCMS(ESI) m/z=481.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.65분 (분석 조건 SQDAA50)

실시예 1-17-3:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 55, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-MeOctyl)의 합성

[화학식 53]

필터 부가 반응 용기에 2-클로로트라이틸클로라이드 레진(1.60mmol/g, 100-200mesh, 1% DVB, 와타나베 화학으로부터 구입, 16.3g, 26.1mmol)과 탈수 다이클로로메테인(261mL)을 넣고 25도에서 10분간 진탕했다. 질소압을 걸어 다이클로로메테인을 제거한 후, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산(화합물 54, Fmoc-Asp-MeOctyl, 6.28g, 13.07mmol)과 탈수 다이클로로메테인(261mL)에 탈수 메탄올(4.23mL) 및 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 10.9mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하고, 15분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 탈수 다이클로로메테인(261mL)에 탈수 메탄올(32.4mL)과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 10.9mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하고, 90분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 다이클로로메테인(261mL)을 넣어 5분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거했다. 이 다이클로로메테인으로의 레진의 세정을 2회 반복하고, 얻어진 레진을 감압하에서 하룻밤 건조시켜, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(메틸(옥틸)아미노)-4-옥소뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 55, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-MeOctyl, 18.2g)을 얻었다.

로딩량: 0.366mmol/g

한편, 마찬가지로 합성한 로딩량이 상이한 별개 로트에 대해서도 펩타이드 합성에 사용했다.

실시예 1-18:

Fmoc-Asp-Pro-OPis(화합물 57)의 측쇄 카복실산으로 레진과 결합시킨 화합물(화합물 58)의 합성

실시예 1-18-1:

1-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(알릴옥시)-4-옥소뷰타노일)피롤리딘-2-카복실산 (S)-2-페닐프로판-2-일(화합물 59, Fmoc-Asp(OAll)-Pro-OPis)의 합성

[화학식 54]

이미 기재한 방법으로 조제한 피롤리딘-1,2-다이카복실산 2-(2-페닐프로판-2-일) (S)-1-((9H-플루오렌-9-일)메틸)(화합물 14, Fmoc-Pro-OPis, 20.0g, 43.9mmol)의 탈수 DMF(40mL) 용액을 수욕으로 20도로 냉각했다. 이것에 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센(DBU, 6.57mL, 43.9mmol)을 7분에 걸쳐 적하하고, 그 후 실온에서 5분간 교반했다. 계속하여, 반응액을 0도로 냉각하고, 피리딘 염산염(5.07g, 43.9mmol)을 가하고, 0도에서 10분간 교반했다. 그 후, (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(알릴옥시)-4-옥소뷰탄산(Fmoc-Asp(OAll)-OH, 17.35g, 43.9mmol), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(WSCI·HCl, 11.8g, 61.4mmol), 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸(HOAt, 7.17g, 52.7mmol)의 혼합물을 가하고, 추가로 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 7.6mL, 43.9mmol)을 7분에 걸쳐 0도에서 적하했다. 반응액을 실온에서 20분 교반했다. 얻어진 반응액에 헥세인(50mL), 다이에틸 에터(50mL), 포화 탄산수소 나트륨 수용액(10mL), 포화 염화 나트륨 수용액(50mL)을 가하고, 수층을 다이에틸 에터로 2번 추출했다. 얻어진 유기층을 모두 합치고, 포화 염화 나트륨 수용액(50mL)으로 3번 세정한 후, 황산 나트륨으로 건조했다. 감압하, 용매를 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(이동층: 헥세인-아세트산 에틸)로 정제하여, 1-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(알릴옥시)-4-옥소뷰타노일)피롤리딘-2-카복실산 (S)-2-페닐프로판-2-일(화합물 59, Fmoc-Asp(OAll)-Pro-OPis, 24.5g, 40.1mmol)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=611.4 (M+H)⁺

유지 시간: 1.03분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-18-2:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-((S)-2-(((2-페닐프로판-2-일)옥시)카보닐)피롤리딘-1-일)뷰탄산(화합물 57, Fmoc-Asp-Pro-OPis)의 합성

[화학식 55]

1-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-(알릴옥시)-4-옥소뷰타노일)피롤리딘-2-카복실산 (S)-2-페닐프로판-2-일(화합물 59, Fmoc-Asp(OAll)-Pro-OPis, 24.16g, 39.6mmol)과 테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0)(Pd(PPh₃)₄, 0.114g, 0.099mmol)을 300mL의 2구 플라스크에 넣고, 플라스크 내를 질소 치환했다. 계속하여 다이클로로메테인(40mL)을 가하고, 실온에서 교반한 후, 수욕으로 14도로 냉각했다. 페닐실레인(3.30mL, 26.7mmol)을 5분에 걸쳐 적하하고, 반응액을 질소 분위기하 14∼17도에서 35분간 교반했다. 계속하여, SH실리카(Fuji Silysia제, 5g)와 메탄올(32.1mL)을 가한 후, Kieselgel 60(15g)을 가했다. 추가로 메탄올(30mL), SH 실리카(Fuji Silysia제, 5g), Kieselgel 60(25g)을 가하고, 혼합물을 17∼24도에서 액상이 무색이 될 때까지 교반했다. 얻어진 혼합물을 셀라이트 여과하고, 다이클로로메테인-메탄올(10/1, v/v)로 세정하고, 감압하, 용매를 증류제거하여, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-((S)-2-(((2-페닐프로판-2-일)옥시)카보닐)피롤리딘-1-일)뷰탄산(화합물 57, Fmoc-Asp-Pro-OPis)의 조생성물(25.38g)을 얻었다. 얻어진 조생성물은 정제하지 않고, 계속되는 레진으로의 담지에 이용했다.

LCMS(ESI) m/z=571.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.88분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 1-18-3:

(S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-((S)-2-(((2-페닐프로판-2-일)옥시)카보닐)피롤리딘-1-일)뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 58, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis)의 합성

[화학식 56]

필터 부가 반응 용기에 2-클로로트라이틸클로라이드 레진(1.60mmol/g, 100-200mesh, 1%DVB, 와타나베 화학으로부터 구입, 47.8g, 76.48mmol)과 탈수 다이클로로메테인(150mL)을 넣고 25도에서 35분간 진탕했다. 질소압을 걸어 다이클로로메테인을 제거한 후, 조제한 (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-((S)-2-(((2-페닐프로판-2-일)옥시)카보닐)피롤리딘-1-일)뷰탄산(화합물 57, Fmoc-Asp-Pro-OPis, 21.94g, 38.4mmol)의 탈수 다이클로로메테인(115mL)에 탈수 메탄올(3.11mL) 및 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 32.1mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하여, 45분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 탈수 다이클로로메테인(100mL)에 탈수 메탄올(55mL)과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 25mL)을 가한 혼합액을 반응 용기에 첨가하여, 90분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거한 후, 다이클로로메테인(100mL)을 넣어 5분간 진탕했다. 질소압을 걸어 반응액을 제거했다. 이 다이클로로메테인(100mL)으로의 레진의 세정을 4회 반복하고, 얻어진 레진을 감압하에서 15시간 반 건조시켜, (S)-3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-4-옥소-4-((S)-2-(((2-페닐프로판-2-일)옥시)카보닐)피롤리딘-1-일)뷰탄산-2-클로로트라이틸 레진(화합물 58, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis, 61.55g)을 얻었다.

얻어진 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(화합물 58, 12.3mg)를 반응 용기에 넣고, DMF(0.2mL) 및 피페리딘(0.2mL)을 가하고, 25도에서 30분간 진탕했다. 반응 용기에 DMF(1.6mL)를 가한 후, 반응 혼합액으로부터 0.4mL를 취출하고, 이것을 DMF(9.6mL)로 희석하고, 그 흡광도(301.2 nm)를 측정했다(Shimadzu, UV-1600 PC(셀 길이 1.0cm)를 이용하여 측정). 다음의 계산식에 의해, Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(화합물 58)의 로딩량을 0.3736mmol/g으로 산출했다.

(흡광도(301.2nm)×1000×50)/(레진 중량(mg)×7800) = (0.717×1000×50)/(12.3×7800) = 0.3736mmol/g

실시예 2. 펩타이드 합성기에 의한 펩타이드의 화학 합성(공정 A∼공정 C)

특별한 기재가 없는 한, 상기의 기본 합성 루트에서의 펩타이드 합성은 이하의 방법으로 행했다.

실시예 2-1: 자동 합성기에 의한 펩타이드 고상 합성(공정 A)

펩타이드 합성기(Multipep RS; Intavis사제)를 이용하여, Fmoc법에 의해 펩타이드 합성을 행했다. 조작의 상세한 수순에 대해서는 합성기에 부속된 매뉴얼에 따랐다.

N말단이 Fmoc로 보호된 아스파라긴산의 측쇄의 카복실산 부위와 결합한 2-클로로트라이틸 레진(1컬럼당 100mg)과, 각종 Fmoc-아미노산(0.6mol/L, Fmoc-MeHis(Trt)-OH의 경우는 0.5mol/L)과 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸(HOAt) 혹은 oxyma(0.375mol/L)의 NMP 용액과, 다이아이소프로필 카보다이이미드(DIC)의 N,N-다이메틸폼아마이드(DMF) 용액(10% v/v)을 합성기에 세팅했다. 한편, Fmoc-아미노산이 Fmoc-Ser(THP)-OH(화합물 1), Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2), 또는 Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)인 경우는, 이들 Fmoc-아미노산은 NMP 용액에 있어서 oxyma와 공존시키고, 추가로 몰리큘러 시브스 4A 1/8(와코 순약 공업) 혹은 몰리큘러 시브스 4A 1/16(와코 순약공업)을 첨가하여 합성기에 세팅했다.

Fmoc 탈보호 용액으로서 다이아자바이사이클로운데센(DBU)의 DMF 용액(2% v/v)을 이용했다. 레진을 DMF로 세정한 후, Fmoc기를 탈보호하고, 그 다음에 새로운 Fmoc 아미노산과의 축합 반응을 행했다. 이것을 1사이클로 하여, 이 사이클을 복수회 반복함으로써 레진 표면 상에 펩타이드를 신장시켰다.

실시예 2-2: 신장된 펩타이드의 레진으로부터의 절출(공정 B)

상기의 방법에 의해 신장된 펩타이드의 N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DMF로 세정했다. 계속하여 DCM에서 레진을 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축했다.

실시예 2-3: 절출한 펩타이드의 환화(공정 C)

절출 후에 감압하 농축한 잔사를 DMF/DCM(1/1, v/v, 8mL)에 용해했다. 0.5M O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)/DMF 용액(이용한 레진 상의 몰수(로딩량(mmol/g)에 사용한 레진량(통상은 0.10g)을 곱한 것)에 대해서 1.5등량이 되는 용량)과 DIPEA(이용한 레진 상의 몰수에 대해서 1.8등량)을 가하고, 실온에서 2시간 진탕했다. 그 후, 감압하 용매를 증류제거했다. 목적하는 환상 펩타이드의 생성을 LCMS 측정에 의해 확인했다.

이상의 방법에 의해, 후술하는 탈보호 반응의 검토에 이용하는 펩타이드 Pep1-Pep7을 합성했다. Pep1∼Pep7의 서열을 표 2-1에, 구조를 표 2-2에, LCMS 데이터를 표 2-3에 나타낸다. 이후에 행하는 탈보호 조건의 검토(탈보호 시에 나타나는 가수분해나 N→O-아실 시프트의 문제의 정도, 혹은 검토하는 용액에 공존시키는 펩타이드)는, 이 과정에 있어서 얻어진 환상 펩타이드를 포함하는 잔사를 이용하여 평가했다.

[표 2-1]

[표 2-2]

[표 2-3]

실시예 3. 약산(수 중에서의 pKa가 0∼9)과 용매(Y _OTs 치가 양의 값이고, 약산성이며(수 중에서의 pKa가 5∼14), 또한 구핵성이 낮은 용매)의 약산 용액을 이용한, 펩타이드의 측쇄 작용기의 보호기의 탈보호(공정 D)

실시예 3-1. Fmoc-아미노산의 측쇄 작용기의 보호기의 상기 약산 용액에 의한 탈보호 가능성

펩타이드 합성에 이용하는 Fmoc-아미노산의 측쇄 작용기의 보호기가, TFA보다도 약산이 되는 조건, 즉 수 중에서의 pKa가 0∼9인 약산을, Y_OTs치가 양의 값이고, 약산성이며(수 중에서의 pKa가 5∼14), 또한 구핵성이 낮은 용매에 용해한 용액 중에서 탈보호 가능한지 여부를 검토했다.

구체적으로는, 약산으로서 황산수소 테트라메틸암모늄(pKa 2.0)을 이용하고, 또한 용매로서, HFIP(Y_OTs치가 3.82(문헌치: Prog. Phys. Org. Chem. 1990, 17, 121-158), pKa 9.30)를 이용했다. 보다 구체적으로는, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS) 혹은 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)의 어느 하나의 용액을 이용했다.

실시예 3-1-1: 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)의 조제

0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)은, HFIP(11.66mL), TIPS(0.24mL), DCE(0.10mL)를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 68.5mg의 황산수소 테트라뷰틸암모늄을 용해시켜 조제했다.

실시예 3-1-2: 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액 (2% TIPS)의 조제

0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)은, HFIP(11.66mL), TIPS(0.24mL), DCE(0.10mL)를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 34.3mg의 황산수소 테트라뷰틸암모늄을 용해시켜 조제했다.

이하의 method A 혹은 method B에 의해, 측쇄에 보호기가 붙은 Fmoc-아미노산, 또는 측쇄에 보호기가 붙은 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드의 탈보호를 행했다.

실시예 3-1-3: method A

측쇄에 보호기가 붙은 Fmoc-아미노산(4.0umol)과 펩타이드(이미 합성한 환상 펩타이드 Pep 1∼Pep 6 중 어느 하나(환화 후의 잔사); 최대로 3.66umol)의 혼합물에 대해, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(0.20mL) 혹은 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(0.40mL)을 가하고 3분간 진탕하고, 그 후 25도에서 정치하고, 일정 시간 후에 LCMS(FA05)를 측정했다. 탈보호의 진행은, 탈보호체와 피보호체의 UV 에어리어비로부터 산출했다.

실시예 3-1-4: method B

측쇄에 보호기가 붙은 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드(이미 합성한 환상 펩타이드 Pep 1∼Pep 6 중 어느 하나(환화 후의 잔사); 최대로 3.66umol)에 대해, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)(0.20mL) 혹은 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)(0.40mL)를 가하고 3분간 진탕하고, 그 후 25도에서 정치하고, 일정 시간 후에 LCMS(FA05)를 측정했다. 탈보호의 진행은, 탈보호체와 피보호체의 UV 에어리어비로부터 산출했다.

method A 및 method B에 이용한 펩타이드는, 이미 기재한 방법에 의해 신장 및 레진으로부터의 절출을 하고, 추가로 이미 기재한 방법에 의해 환화 반응 후, 감압하 농축을 행한 잔사를 다이클로로메테인에 용해하고 시험관에 10등분한 후, 용매를 다시 감압하 농축을 행한 것을 이용했다.

평가 결과는 이하의 표 3과 같다.

탈보호 후의 Fmoc-아미노산의 LCMS 측정 결과는 이하와 같다.

Fmoc-Tyr(3-F)-OH(run3, run4, run15의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=422.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.73분 (분석 조건 SQDFA05)

Fmoc-MeHis-OH(run5의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=392.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.47분 (분석 조건 SQDFA05)

Fmoc-MeSer-OH(run8의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=342.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.67분 (분석 조건 SQDFA05)

Fmoc-Ser-OH(run10의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=328.2 (M+H)⁺

유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05)

Fmoc-Pro-OH(run11의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=338.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.75분 (분석 조건 SQDFA05)

Fmoc-D-Tyr-OH(run12∼14의 탈보호 생성물)

LCMS(ESI) m/z=404.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.72분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 57]

Pep 1(화합물 101)의 탈보호 생성물(run1, run2의 탈보호 생성물, 화합물 131)

LCMS(ESI) m/z=1424.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 58]

Pep 2(화합물 102)의 탈보호 생성물(run6의 탈보호 생성물, 화합물 132)

LCMS(ESI) m/z=1526.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.89분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 59]

Pep 3(화합물 103)의 탈보호 생성물(run7의 탈보호 생성물, 화합물 133)

LCMS(ESI) m/z=1474.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 60]

Pep 5(화합물 105)의 탈보호 생성물(run9의 탈보호 생성물, 화합물 135)

LCMS(ESI) m/z=1331.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.74분 (분석 조건 SQDFA05)

이 결과로부터, 이들 보호기는 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS) 혹은 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)의 조건에서 탈보호가 진행됨을 확인할 수 있었다.

한편, 측쇄의 보호기는, TFE-DCM(1/1, v/v) 용액, 혹은 TFE-DCM(1/1, v/v)/DIPEA(이용한 레진의 로딩량에 이용한 레진량을 곱하여 나온 이론량의 몰수에 대해서 1.8equiv.을 첨가) 용액을 이용한 펩타이드 절출 조건에서는 영향을 받지 않는다. 따라서, 절출 공정에 계속되는, 펩타이드 주쇄의 N말단과 Asp 측쇄의 카복실산 부위에서의 분자내 환화에서는, 아미노산 측쇄 작용기는 보호된 채로 유지된다. 이것에 의해, 아미노산 측쇄의 작용기가 구핵종으로서 작용하는, 바람직하지 않은 환화 반응을 억제할 수 있다.

3-2. Fmoc-아미노산의 측쇄 작용기의 보호기를 상기 약산 용액으로 탈보호했을 때의, 가수분해 및 N→O-아실 시프트체 생성의 억제 가능성

실시예 3-2-1:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101, Pep1)의, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 레진 담지량: 0.342mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 기재한 방법으로 H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101)을 합성했다. 환화 후, 감압하 농축을 행한 잔사를 다이클로로메테인에 용해하고 시험관에 10등분한 후, 용매를 다시 감압하 농축을 행했다.

이 10등분한 1개의 시험관에 대해, 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 68.5mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.20mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 24시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행한 바, 측쇄의 탈보호(D-Tyr(tBu)의 tBu기의 탈보호)의 완결을 확인할 수 있었다. 또한 이때, 목적하는 탈보호된 펩타이드(화합물 131)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스 스펙트럼을 나타내는 화합물)와 가수분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 수분으로 가용매분해된 것의 매스 스펙트럼을 나타내는 화합물)의 비는 72:10:18이었다(도 2). 한편, 본 실시예에 기재된 「TM+H₂O」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 가수분해를 받은 화합물을 나타내고, 「TM+HFIP」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 화합물을 나타낸다.

도 2의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 131)

LCMS(ESI) m/z=1424.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

가수분해체 (TM+H₂O)

LCMS(ESI) m/z=1442.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

HFIP에 의한 가용매분해체 (TM+HFIP)

LCMS(ESI) m/z=1592.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.69분, 0.71분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 3-2-2:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101, Pep1)의, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

화합물 101(Pep1)을 합성한 후, 상기의 조작에 있어서 10등분한 다른 1개에 대해, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 34.3mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 24시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(D-Tyr(tBu)의 tBu기의 탈보호)는 81%진행되고, 이 때, 목적하는 탈보호된 펩타이드(화합물 131)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)와 가수분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 수분으로 가수분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 비는 93:3:4였다(도 3). 한편, 「TM+H₂O」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 가수분해를 받은 화합물을 나타낸다. 마찬가지로, 「TM+HFIP」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 화합물을 나타낸다.

도 3의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 131)

LCMS(ESI) m/z=1424.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

가수분해체

LCMS(ESI) m/z=1442.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

HFIP에 의한 가용매분해체

LCMS(ESI) m/z=1592.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.69분, 0.71분 (분석 조건 SQDFA05)

후술하는 비교예와 같이, H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101, Pep1)은, 5% TFA/DCE의 조건에서 탈보호하면, 25도에서 2시간 반 후에는 가수분해가 87% 진행되어 버렸다.

이에 반해서, 동일 펩타이드 서열에 대해서, 5% TFA 대신에 0.1M 또는 0.05M의 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)를 이용함으로써, 가수분해체(및 가용매분해체)의 생성을 큰폭으로 저감시킬 수 있었다. 또한 이 결과는, TFA보다도 약산이 되는 조건을 만족시키면, 약산의 농도를 임의로 조절할 수 있을 가능성을 시사한다.

실시예 3-2-3:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 103, Pep3)의, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 로딩: 0.316mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 기재한 방법으로 H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 103, Pep3)을 합성했다. 환화 후, 감압하 농축을 행한 잔사를 다이클로로메테인에 용해하고 시험관에 10등분한 후, 용매를 다시 감압하 농축을 행했다.

이 10등분한 1개의 시험관에 대해, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 34.3mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 정치하고, 4시간의 단계에서 LCMS(SQDFA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(MeSer(DMT)의 DMT기의 탈보호, 및 Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)의 완결을 확인할 수 있었다. 또한 이때, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물)와 목적하는 펩타이드의 N→O-아실 시프트체(뎁시펩타이드)의 LC에서의 UV 에어리어비는, 96:4였다. 반응 개시부터 22시간, 25도에서 정치한 단계에서 LCMS(SQDFA05)의 측정을 행한 결과는, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물)와 목적하는 펩타이드의 N→O-아실 시프트체(뎁시펩타이드)의 LC에서의 UV 에어리어비는, 83:17이었다(도 4).

도 4의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물)

LCMS(ESI) m/z=1474.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

N→O-아실 시프트체

LCMS(ESI) m/z=1474.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05)

후술하는 바와 같이, H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 103, Pep3)은, 5% TFA/DCE의 조건에서 탈보호하면, 25도에서 2시간 후에는 N→O-아실 시프트가 70% 진행되어 버렸다.

이에 반해서, 동일 펩타이드 서열에 대해서, 5% TFA 대신에 0.05M의 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)를 이용함으로써, N→O-아실 시프트체의 생성을 큰폭으로 저감시킬 수 있었다.

실시예 3-2-4:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101, Pep1)의, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

화합물 101(Pep1)을 합성한 후, 상기의 조작에 있어서 10등분한 다른 1개에 대해, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 18.0mg의 옥살산을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(D-Tyr(tBu)의 tBu기의 탈보호)는 완결되고, 이 때, 목적하는 탈보호된 펩타이드(화합물 131)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)와 가수분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 수분으로 가수분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 비는 79:17:4였다(도 5). 한편, 「TM+H₂O」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 가수분해를 받은 화합물을 나타낸다. 마찬가지로, 「TM+HFIP」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 화합물을 나타낸다.

도 5의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 131)

LCMS(ESI) m/z=1423.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

가수분해체

LCMS(ESI) m/z=1441.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

HFIP에 의한 가용매분해체

LCMS(ESI) m/z=1591.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.68분, 0.71분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 3-2-5:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 101, Pep1)의, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

화합물 101(Pep1)을 합성한 후, 상기의 조작에 있어서 10등분한 다른 1개에 대해, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 23.2mg의 옥살산을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(D-Tyr(tBu)의 tBu기의 탈보호)는 완결되고, 이 때, 목적하는 탈보호된 펩타이드(화합물 131)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)와 가수분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 수분으로 가수분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 비는 81:12:7이었다(도 6). 한편, 「TM+H₂O」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 가수분해를 받은 화합물을 나타낸다. 마찬가지로, 「TM+HFIP」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 화합물을 나타낸다.

도 6의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 131)

LCMS(ESI) m/z=1423.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

가수분해체

LCMS(ESI) m/z=1441.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

HFIP에 의한 가용매분해체

LCMS(ESI) m/z=1591.4 (M+H)⁺

유지 시간: 0.68분, 0.71분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 3-2-6:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 103, Pep3)의, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

화합물 103(Pep3)을 합성한 후, 상기의 조작에 있어서 10등분한 다른 1개에 대해, 0.05M 옥살산/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 18.0mg의 옥살산을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(SQDFA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(MeSer(DMT)의 DMT기의 탈보호, 및 Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)의 완결을 확인할 수 있었다. 또한 이때, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물)와 목적하는 펩타이드의 N→O-아실 시프트체(뎁시펩타이드)의 LC에서의 UV 에어리어비는, 86:14였다(도 7).

도 7의 데이터를 이하에 나타낸다.

LCMS(ESI) m/z=1473.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

N→O-아실 시프트체

LCMS(ESI) m/z=1473.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 3-2-7:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 103, Pep3)의, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호

화합물 103(Pep3)을 합성한 후, 상기의 조작에 있어서 10등분한 다른 1개에 대해, 0.05M 말레산/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 23.2mg의 옥살산을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(SQDFA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(MeSer(DMT)의 DMT기의 탈보호, 및 Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)의 완결을 확인할 수 있었다. 또한 이때, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물)와 목적하는 펩타이드의 N→O-아실 시프트체(뎁시펩타이드)의 LC에서의 UV 에어리어비는, 86:14였다(도 8).

도 8의 데이터를 이하에 나타낸다.

LCMS(ESI) m/z=1473.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

N→O-아실 시프트체

LCMS(ESI) m/z=1473.5 (M+H)⁺

유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05)

이들 결과로부터, 약산으로서 황산수소 테트라메틸암모늄(pKa 2.0) 대신에, 옥살산(pKa 1.23)이나 말레산(pKa 1.92)을 이용했을 경우에서도, 가수분해나 가용매분해, N→O-아실 시프트를 억제하면서 탈보호를 진행시킬 수 있었다.

실시예 3-2-8:

H-Ala-Phe(4-CF3)-Trp-Trp-MeLeu-MeGly-MeGly-Pro-Hyp(Et)-Ser(Trt)-Asp-pip(tBu)의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 107, Pep7)의, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS)를 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호와 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/TFE(2% TIPS)를 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호의 비교

Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu(화합물 52, 로딩: 0.356mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 기재한 방법으로 H-Ala-Phe(4-CF3)-Trp-Trp-MeLeu-MeGly-MeGly-Pro-Hyp(Et)-Ser(Trt)-Asp-pip(tBu)의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 107)을 합성했다. 환화 후, 감압하 농축을 행한 잔사를 다이클로로메테인에 용해하고 시험관에 10등분한 후, 용매를 다시 감압하 증류제거했다.

이 10등분한 1개의 시험관에 대해, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 23.32mL, TIPS: 0.48mL, DCE: 0.20mL를 혼합한 용액에 205.8mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)는 완결되고, 이 때, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 137)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 UV 에어리어비는 53:47이었다(도 9). 한편, 「TM+HFIP」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 화합물을 나타낸다.

[화학식 61]

도 9의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 137)

LCMS(ESI) m/z=1492.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.90분 (분석 조건 SQDFA05)

HFIP에 의한 가용매분해체(어느 것인가의 아마이드 결합이 HFIP에 의해 가용매분해를 받은 것)

LCMS(ESI) m/z=1660.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

10등분한 다른 또 1개의 시험관에 대해, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/TFE 용액(2% TIPS)(TFE: 23.32mL, TIPS: 0.48mL, DCE: 0.20mL를 혼합한 용액에 205.8mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 25도에서 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 4시간 후에는 측쇄의 탈보호(Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)는 96% 진행되고, 이 때, 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 TFE로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)는 LCMS에서 검출 한계 이하였다. 반응을 20시간 후에 확인한 바, 측쇄의 탈보호(Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)는 완결되고, 이 때, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 137)와 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 TFE로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 UV 에어리어비는 97:3이었다(도 10). 한편, 본 실시예 중에 기재된 「TM+TFE」란, 목적물(TM)이 TFE에 의해 용매화된 화합물(임의의 아마이드 결합의 하나가 TFE에 의해 가용매분해를 받은 화합물)을 나타낸다.

도 10의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 137)

LCMS(ESI) m/z=1492.2 (M+H)⁺

유지 시간: 0.90분 (분석 조건 SQDFA05)

TFE에 의한 가용매분해체(어느 것인가의 아마이드 결합이 TFE에 의해 가용매분해를 받은 것)

LCMS(ESI) m/z=1592.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.75분 (분석 조건 SQDFA05)

이상의 결과는, 약산을 용해시키는 용매로서 HFIP 대신에 TFE를 이용하는 것이 가능함을 나타냈다. 또한 이 결과는, Y_OTs치가 양의 값이고, 용매 자체가 약산성이며(수 중에서의 pKa가 5∼14), 또한 구핵성이 낮다고 하는 조건을 만족시키면, 임의의 용매를 사용할 수 있을 가능성을 시사한다.

실시예 3-2-9:

0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 탈보호 조건으로서 이용한 탈보호, 및 그 용액에 염기(DIPEA)를 가해서의 반응 정지

Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 로딩: 0.342mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 기재한 방법으로 H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser(Trt)-Gly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-Pro-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 환상 화합물(화합물 105, Pep5)을 합성했다. 환화 후, 감압하 농축을 행한 잔사를 다이클로로메테인에 용해하고 시험관에 10등분한 후, 용매를 다시 감압하 농축을 행했다.

이 10등분한 2개의 시험관에 대해, 각각 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 68.5mg의 황산수소 테트라뷰틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(SQDFA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)는 완결되고, 이 때, 목적하는 탈보호된 펩타이드(화합물 135) 이외의 가용매분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 용매인 HFIP로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)나, 가수분해체(펩타이드의 어느 것인가의 아마이드 결합이 수분으로 가용매분해된 것의 매스를 나타내는 화합물)의 매스를 나타내는 피크는 검출되지 않았다(도 11). 이 반응 혼합물에 각각 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 14μL, 황산수소 테트라메틸암모늄에 대해서 2등량)을 가하고 1개의 시험관은 25도에서 18시간 정치를 하고, 또 1개의 시험관은 감압하 농축을 행했다. 이들의 LCMS(SQDFA05)를 측정한 바, 탈보호된 목적하는 펩타이드 이외의 가용매분해체나 가수분해체의 매스를 나타내는 피크는, 이 시점에서도 검출되지 않았다(도 11).

[화학식 62]

도 11의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 135)

LCMS(ESI) m/z=1331.9 (M+H)⁺

유지 시간: 0.74분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 3-2-10:

이 10등분한 2개의 시험관에 대해, 각각 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)(HFIP: 11.66mL, TIPS: 0.24mL, DCE: 0.10mL를 혼합한 용액으로부터 4mL를 빼내고, 이것에 68.5mg의 황산수소 테트라메틸암모늄을 용해시킨 것)을 0.40mL 가했다. 러버 셉텀으로 시험관에 마개를 하고, 3분간 진탕한 후에 25도에서 4시간 정치하고, LCMS(FA05)로 반응의 확인을 행했다. 그 결과, 측쇄의 탈보호(MeSer(DMT)의 DMT기의 탈보호, 및 Ser(Trt)의 Trt기의 탈보호)는 완결되고, 탈보호된 목적하는 펩타이드(화합물 133)와 목적하는 펩타이드의 N→O-아실 시프트체(뎁시펩타이드)의 LC에서의 UV 에어리어비는, 93:7이었다.

이 반응 혼합물에 각각 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 14μL, 황산수소 테트라메틸암모늄에 대해서 2등량)을 가하고 1개의 시험관은 25도에서 18시간 정치를 하고, 또 1개의 시험관은 DIPEA를 가한 직후에 감압하 농축을 행했다. 이들의 LCMS(FA05)를 측정한 바, 18시간 정치한 것에 관해서는 목적 펩타이드와 그의 N→O-아실 시프트체의 UV 에어리어비는 변화하지 않고, 감압하 농축을 행한 것에 관해서는, 목적 펩타이드와 그 N→O-아실 시프트체의 UV 에어리어비는 98:2가 되었다(도 12).

도 12에 기재된 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 133)

LCMS(ESI) m/z=1474.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

N→O-아실 시프트체

LCMS(ESI) m/z=1474.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05)

이상의 결과는, 탈보호 반응 종료 후(혹은 반응을 정지하고 싶을 때)에 DIPEA를 가함으로써, 가수분해(가용매분해)나 N→O-아실 시프트의 문제를 억제한 상태에서 후처리가 가능함을 나타냈다.

실시예 4. 측쇄 하이드록실기의 보호기로서 THP기를 이용했을 경우의 Thr과 MeSer의 반응성

신장 반응 시의 저반응성이 염려되는 Thr과 MeSer의 측쇄 하이드록실기의 보호기로서 THP기를 이용했을 경우의 반응성에 대해 이하의 실험을 행했다.

실시예 4-1:

레진 상에서 신장된 펩타이드이고, N말단에 N-메틸아미노기가 있는 화합물(H-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-2-Cl-Trt-resin)-pip에 대한 Fmoc-Thr(Trt)-OH와 Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)의 신장 반응성의 비교 평가

신장 반응성의 비교 평가는, 입체 장애에 의해 아미노기의 반응성이 낮은 MePhe(3-Cl)를 N말단에 갖는 서열로 행했다.

Fmoc-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 108)는 이미 기재한 방법으로 조제한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 로딩: 0.329mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 기재한 방법으로 합성했다.

얻어진 Fmoc-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 108)에 다이클로로메테인(600uL)을 가하고, 30분 정치하여 레진을 팽윤시켰다. 액상을 제거한 후, 계속하여 레진을 DMF(600uL)로 3번 세정했다. 얻어진 레진에 2% DBU/DMF(v/v, 600uL)를 가하고 20분간 진탕시키고, 액상을 제거했다. 레진을 DMF(600uL)로 3번 세정했다.

이 레진에 대해, 0.60M Fmoc-Thr(Trt)-OH/0.375M oxyma의 NMP 용액(300uL)과 10%(v/v) DIC/DMF(300uL)를 혼합한 용액, 혹은 0.60M Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)/0.375M oxyma의 NMP 용액(300uL)과 10%(v/v) DIC/DMF(300uL)를 혼합한 용액을 가하고 진탕했다. 진탕 중, 1시간, 2시간, 4시간의 단계에서 반응 중의 레진을 각각 ∼10mg씩 취출하고, 취출한 레진을 DMF(600uL)로 3번 세정하고, 추가로 2% DBU/DMF(v/v, 600uL)를 가하고 20분간 진탕시키고, 액상을 제거했다. 레진을 DMF(600uL)로 3번, 추가로 다이클로로메테인(600uL)으로 3번 세정했다.

얻어진 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)을 가하고 10분간 진탕하고, 레진을 여과로 제거한 후에, 액상을 감압하 농축했다. 잔사를 LCMS(분석 조건 SQDFA05)로 분석했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

표 중에 있어서의 미반응체/신장체의 비는 LC의 UV 에어리어비를 나타낸다. 표 중의 미반응체는 H-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp-pip(화합물 109)를 의미하고, 신장체는, H-Thr(Trt)-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp-pip(화합물 110: Fmoc-Thr(Trt)-OH를 첨가했을 경우) 혹은 H-Thr(THP)-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp-pip(화합물 111: Fmoc-Thr(THP)-OH를 첨가했을 경우)를 의미한다.

[화학식 63]

미반응체(화합물 109)

LCMS(ESI) m/z=1422.9 (M+H)⁺

유지 시간: 0.77분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 64]

신장체(Thr(Trt))(화합물 110)

LCMS(ESI) m/z=1766.2 (M+H)⁺

유지 시간: 0.92분 (분석 조건 SQDFA05)

[화학식 65]

신장체(Thr(THP))(화합물 111)

LCMS(ESI) m/z=1608.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.80분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 4-2:

H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr(PG)-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip를 합성기로 합성했을 때의, Fmoc-Thr(Trt)-OH 혹은 Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)의 신장 반응성

입체 장애에 의해 반응성이 낮은 MePhe를 N말단에 갖는 서열, 및 Thr의 아미노기에 대해서 입체적으로 벌키한 MeLeu를 N말단에 갖는 서열에 대해서 Thr을 신장시키는 것에 의해, 신장 반응성을 검토했다.

H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr(PG)-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(Thr 측쇄의 PG는 보호기를 나타내고, 본 실험에서는 Trt 보호 혹은 THP 보호를 나타낸다)는, 이미 기재한 방법으로 조제한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 실시예에 기재된 Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 의해, 펩타이드의 신장을 행했다. 그 때에, Thr의 신장에 있어서는 Fmoc-Thr(Trt)-OH 혹은 Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)를 이용했다.

펩타이드의 신장 후, N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DMF 및 DCM으로 세정했다.

레진을 DCM으로 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다.

절출 후, Fmoc-Thr(Trt)-OH를 이용했을 때에는, 계속하여 4N HCl/1,4-다이옥세인(19.5uL)과 TIPS(0.25mL)와 DCM(0.73mL)을 혼합한 용액을 이용하여 25도에서 5분간 진탕하여 Thr(Trt)의 Trt기의 탈보호를 행하고, 계속하여 DIPEA(24uL)를 가함으로써 산의 중화를 하고, LCMS로 신장 반응성을 검토했다.

이 생성물의 LCMS의 결과를 도 13에 나타낸다. 목적하는 펩타이드(화합물 112, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)와 목적하는 펩타이드로부터 Thr이 빠진 것(화합물 113, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu- MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)이 동일 유지 시간 0.69분에 있어서 나타났다. 또한 MS(네거티브 모드)로부터, Thr이 탈락한 펩타이드가 대략 30% 포함되어 있었다.

[화학식 66]

도 13의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적물(화합물 112, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)

LCMS(ESI) m/z=1373.6 (M+H)⁺

유지 시간: 0.69분 (분석 조건 SQDAA50)

[화학식 67]

목적물-Thr(화합물 113, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu- MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)

LCMS(ESI) m/z=1272.6 (M+H)⁺

유지 시간: 0.69분 (분석 조건 SQDAA50)

이 생성물의 LCMS의 결과를 도 14에 나타낸다. Fmoc-Thr(Trt)-OH를 첨가했을 경우와는 대조적으로, Fmoc-Thr(THP)-OH를 첨가했을 경우는, 목적하는 펩타이드(화합물 114, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr(THP)-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)로부터 Thr이 탈락한 것(화합물 113, H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu- MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)은 검출되지 않았다. 한편, Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)를 이용했을 때에는, 레진으로부터의 절출 후에 탈보호의 조작을 행하지 않고서, 절출 용액을 그대로 LCMS 측정했기 때문에, Thr 측쇄의 THP 보호는 잔존한 채였다.

[화학식 68]

도 14의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적물(화합물 114)

LCMS(ESI) m/z=1458.1 (M+H)⁺

유지 시간: 0.73분 (분석 조건 SQDFA05)

이상의 결과로부터, 일반적인 펩타이드 합성에서 Thr을 신장시킬 때에 사용되고 있는 Fmoc-Thr(Trt)-OH와 비교하여 Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2)의 반응성은 높음이 나타났다. 특히 N말단이 N-알킬화된 벌키한 아미노기를 신장시킬 때에는 높은 축합 효율을 달성할 수 있음이 나타났다. 또한 계속되는 신장 반응에 있어서, Thr(THP)의 N말단 아미노기에 대한 벌키한 Fmoc-아미노산(이 경우는 Fmoc-MeLeu-OH)의 신장도 문제 없이 진행됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4-2:

H-MeSer(PG)-MeVal-MeHis(Trt)-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis(Trt)-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis를 합성기로 합성했을 때의, Fmoc-MeSer(DMT)-OH 혹은 Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)를 이용했을 경우의, MeSer의 신장 반응성의 확인

H-MeSer(PG)-MeVal-MeHis(Trt)-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis(Trt)-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(MeSer 측쇄의 PG는 보호기를 나타내고, 본 실험에서는 DMT 보호 혹은 THP 보호를 나타낸다)는, 이미 기재한 방법으로 조제한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(화합물 58, 로딩량 0.3736mmol/g, 100mg)를 레진으로서 이용하여, 이미 실시예에 기재된 Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 의해, 펩타이드의 신장을 행했다. 그 때에, MeSer의 신장에 있어서는 Fmoc-MeSer(DMT)-OH 혹은 Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)를 이용했다.

얻어진 레진을 감압하 건조시킨 후, 각각의 레진을 30mg씩 취출했다.

취출한 각각 30mg의 레진을 DCM에서 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축했다.

얻어진 잔사에, 이미 기재한 방법으로 조제한 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 1.3mL 가하고, 잔사를 용해시킨 후, 실온에서 1시간 정치하고, Tyr(3-F)의 측쇄 tBu 보호 이외의 측쇄 보호기(MeSer 측쇄의 DMT 보호 혹은 THP 보호, 및 MeHis 측쇄의 Trt 보호) 및 주쇄 C말단의 Pis 보호를 탈보호하고, LCMS를 측정함으로써, 반응의 확인을 행했다.

Fmoc-MeSer(DMT)-OH·0.75DIPEA를 이용하여 합성을 행했을 경우의 LCMS의 결과를 도 15에 나타낸다. 목적하는 펩타이드(화합물 115, H-MeSer-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)와 목적하는 펩타이드로부터 MeSer이 빠진 화합물(화합물 116, H-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)이 동일 유지 시간 0.50분으로 나타났다.

또한 MS(네거티브 모드)로부터, MeSer이 빠진 펩타이드(화합물 116, H-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)가 50% 포함되어 있음을 알 수 있었다.

[화학식 69]

도 15의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적물(화합물 115)

LCMS(ESI) m/z=1559.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.50분 (분석 조건 SQDFA50)

목적물-MeSer(화합물 116)

LCMS(ESI) m/z=1458.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.50분 (분석 조건 SQDFA50)

[화학식 70]

이에 반해서, Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)를 이용하여 합성을 행했을 경우의 LCMS의 결과를 도 16에 나타낸다. 목적하는 펩타이드(화합물 115, H-MeSer-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)와 목적하는 펩타이드로부터 MeSer이 빠진 화합물(화합물 116)이 동일 유지 시간 0.50분에 있어서 나타났지만, MS(네거티브 모드)로부터, MeSer이 빠진 펩타이드(화합물 116, H-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)는10% 이하임이 확인되었다.

도 16의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적물(화합물 115)

LCMS(ESI) m/z=1559.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.50분 (분석 조건 SQDFA50)

목적물-MeSer(화합물 116)

LCMS(ESI) m/z=1458.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.50분 (분석 조건 SQDFA50)

이상의 결과로부터, Fmoc-MeSer(DMT)-OH와 비교하여 Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)의 반응성은 높아, N말단이 N-메틸화된 아미노기에 대한 신장 시에는 높은 축합 효율을 달성할 수 있음이 나타났다.

5.5% TFA 중에서의 환화된 펩타이드의 탈보호(비교예)

비교예 1:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 101, Pep-1)의 측쇄 보호기의 탈보호(D-Tyr(tBu)의 tBu 보호의 탈보호)(5% TFA/DCE(5% TIPS)를 이용했을 경우)

이미 기재한 방법으로 합성한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 레진 담지량 0.373mmol/g, 100mg)를 이용하여, 합성기 상에서 펩타이드 신장을 행하여, H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip를 얻었다.

계속하여 DCM으로 레진을 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축했다.

얻어진 잔사를 DMF/DCM(1/1, v/v, 8mL)에 용해하고, O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 21mg)/DMF 용액(0.5M)과 DIPEA(12μL)/DMF(88μL) 용액을 가하고 실온에서 2시간 교반했다. LCMS 측정(분석 조건 SQDFA05)으로 반응의 확인을 하여, H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 101, Pep-1)의 생성을 확인했다.

LCMS(ESI) m/z=1480.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.93분 (분석 조건 SQDFA05)

그 후, 감압하 용매를 증류제거하고, 얻어진 잔사에 5% TFA/DCE(5% TIPS)(8mL, 함유 수분량은 <200ppm인 것을 칼 피셔 측정으로 확인)를 가하고 2시간 30분 교반했다. 감압하, 용매를 증류제거하고, 잔사의 LCMS(FA05) 측정을 행한 바, 목적물인 H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 131)과, 그의 가수분해체(어느 것인가의 아마이드 결합이 가수분해된 것)의 MS가 확인되고, 대응하는 UV 에어리어의 비는 13:87이었다(도 17). LC의 측정 결과를 도 17에 나타낸다. 한편, 본 실시예 중에 기재된 「TM+H₂O」란, 목적물의 어느 것인가의 아마이드 결합의 하나가 가수분해를 받은 화합물을 나타낸다.

[화학식 71]

도 17의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적물(화합물 131, H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물)

LCMS(ESI) m/z=1424.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

가수분해체(H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물의, 어느 것인가의 아마이드 결합이 가수분해된 것)

LCMS(ESI) m/z=1442.0 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

이 결과로부터, 5% TFA/DCE(5% TIPS)를 이용한 탈보호에 있어서는, 고도로 N-메틸화되어 있고 특히 N-메틸아미노산이 연속하는 서열을 갖는 환상 펩타이드의 경우에는, 목적물의 대략 9할이 가수분해되어, 목적물의 취득이 곤란해짐이 확인되었다.

비교예 2:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 103, Pep3)의 측쇄 보호기(MeSer 측쇄의 DMT 보호 및 Ser 측쇄의 Trt 보호)의 탈보호(5% TFA/DCE(5% TIPS)를 이용했을 경우)

이미 기재한 방법으로 합성한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(화합물 50, 레진 담지량 0.316mmol/g, 100mg)를 이용하여, 합성기 상에서 펩타이드 신장을 행하여, H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip를 얻었다.

계속하여 DCM으로 레진을 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다.

펩타이드의 레진으로부터의 절출 조작을 2번 반복하고, 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축했다.

얻어진 잔사를 DMF/DCM(1/1, v/v, 8mL)에 용해하고, O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 18mg)/DMF 용액(0.5M)과 DIPEA(9.9μL)/DMF(39.6μL) 용액을 가하고, 실온에서 2시간 교반했다. LCMS 측정(SQDFA05)으로 반응의 확인을 한 바, H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 103, Pep3)로부터 MeSer의 측쇄의 DMT 보호가 벗겨진 것이 70%(LCMS(ESI) m/z = 1716.2 (M+H)⁺, 유지 시간: 1.06분), MeSer의 측쇄의 DMT 보호 및 Ser의 측쇄의 Trt 보호의 양쪽이 벗겨진 것이 30%(LCMS(ESI) m/z = 1474.1 (M+H)⁺, 유지 시간: 0.78분) 확인되었다. 비율은 LC의 UV 에어리어비에 의해 산출했다. 그 후, 감압하 용매를 증류제거하고, 잔사를 다이클로로메테인에 용해시키고, 시험관에 10등분했다. 이들을 감압하 농축하고, 다이클로로메테인을 제거했다. 한편, 전술한 실시예에 있어서 사용된 「환화 후의 잔사」란, 이 10등분한 후에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 가리킨다.

이 중의 하나의 시험관에 5% TFA/DCE(5% TIPS)(0.8mL, 함유 수분량은 32.5ppm, 칼 피셔로 측정)를 가하여 3분간 진탕하고, 그 후 25도에서 2시간 정치했다. 감압하, 용매를 증류제거하고, 잔사의 LCMS(FA05) 측정을 행한 바, 목적물인 H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 133)과, 목적물의 N→O-아실 시프트체와, 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것과, 목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것의 UV 에어리어비는17:46:32:5인 것이 확인되었다. LC의 측정 결과를 도 18에 나타낸다.

[화학식 72]

도 18의 데이터를 이하에 나타낸다.

목적하는 펩타이드(화합물 133, H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물)

LCMS(ESI) m/z=1473.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 N→O-아실 시프트체(목적물의 2개의 하이드록실기 중, 어느 한쪽 또는 양쪽에서 N→O-아실 시프트가 진행된 화합물)

LCMS(ESI) m/z=1473.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.62분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1569.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.89분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1665.9 (M+H)⁺

유지 시간: 0.99분 (분석 조건 SQDFA05)

이 결과로부터, MeSer이나 Ser 등의 β-하이드록실기를 갖는 아미노산을 서열 중에 포함하는 경우에는, 5% TFA/DCE(5% TIPS)를 이용한 탈보호에 있어서는, N→O-아실 시프트가 진행되어 버리는 것이 확인되었다. 또한 이 조건하에서의 탈보호에 있어서는, 2개의 측쇄 하이드록실기 중 어느 한쪽, 혹은 양쪽이 TFA 에스터화되어 버리는 것이 확인되었다. 이들 바라지 않는 반응에 의해, 목적물의 취득이 곤란해지는 것이 확인되었다.

N→O-아실 시프트체의 생성이나 하이드록실기의 TFA 에스터화를 억제하는 것을 목적으로 하여, 반응 온도를 0도로 저하시킨 시험, 및 TFA 농도를 저하시킨 시험을 행했다.

비교예 3:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 103, Pep3)의 측쇄 보호기(MeSer 측쇄의 DMT 보호 및 Ser 측쇄의 Trt 보호)의 탈보호(5% TFA/DCE(5% TIPS)를 이용하여 0도에서 행했을 경우)

상기 환화 후, 10등분한 중 1개의 시험관에, 5% TFA/DCE(5% TIPS)(0.8mL, 함유 수분량은 36.6ppm, 칼 피셔로 측정)를 0도에서 가하고 1분간 진탕하고, 그 후 0도인 채로 4시간 정치했다. 반응 용액의 LCMS(FA05) 측정을 행한 바, 목적물인 H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 133)과 목적물의 N→O-아실 시프트체와 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것과 목적물의 N→O-아실 시프트체의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것의 UV 에어리어비는 56:12:21:11인 것이 확인되었다. LC의 측정 결과를 도 19에 나타낸다.

도 19의 데이터를 이하에 나타낸다.

LCMS(ESI) m/z=1473.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

LCMS(ESI) m/z=1473.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.65분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1569.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.89분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 N→O-아실 시프트체의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1569.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.73분 (분석 조건 SQDFA05)

비교예 4:

H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 103, Pep3)의 측쇄 보호기(MeSer 측쇄의 DMT 보호 및 Ser 측쇄의 Trt 보호)의 탈보호(2% TFA/DCE (5% TIPS)를 이용하여 25도에서 행했을 경우)

상기 환화 후, 10등분한 중 1개의 시험관에, 2% TFA/DCE(5% TIPS)(0.8mL, 함유 수분량은 30.1ppm, 칼 피셔로 측정)를 25도에서 가하고 1분간 진탕하고, 그 후 실온에서 4시간 정치했다. 반응 용액의 LCMS(FA05) 측정을 행한 바, 목적물인 H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pip의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄 카복실산으로 아마이드 결합을 형성한 화합물(화합물 133)과, 목적물의 N→O-아실 시프트체와, 목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것과, 목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것과, 목적물의 N→O-아실 시프트체의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 것의 UV 에어리어비는 30:34:24:3:9인 것이 확인되었다. LC의 측정 결과를 도 20에 나타낸다.

도 20의 데이터를 이하에 나타낸다.

LCMS(ESI) m/z=1473.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05)

LCMS(ESI) m/z=1473.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.65분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 1개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1569.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.89분 (분석 조건 SQDFA05)

목적물의 2개의 하이드록실기가 TFA 에스터화된 화합물

LCMS(ESI) m/z=1665.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.99분 (분석 조건 SQDFA05)

LCMS(ESI) m/z=1569.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.73분 (분석 조건 SQDFA05)

이상의 결과로부터, N→O-아실 시프트의 문제나 화합물 중에 포함되는 하이드록실기의 TFA 에스터화라고 하는 문제는, 반응 온도를 저하시키는 것이나, 보다 저농도의 TFA 용액을 이용하는 것만으로는 완전하게는 해결할 수 없었다.

실시예 6. 본 발명의 패럴렐 합성(고상법)에의 적용

실시예 6-1:

N말단의 아미노기와 아스파라긴산의 측쇄 카복실산기로 아마이드환화한 펩타이드군의 합성

C말단이 아마이드화(피페리딘,4-(tert-뷰틸)피페리딘, N-메틸옥테인-1-아민의 어느 것인가로 아마이드화)되어 있거나, 혹은 C말단에 프롤린이 결합하고 있는 아스파라긴산의 측쇄의 카복실산기와, N말단의 주쇄 아미노기가 아마이드 결합에 의해 환화된 펩타이드군을 합성했다.

화합물 50(화합물 48(Fmoc-Asp-pip)을 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진) 혹은 화합물 52(화합물 51(Fmoc-Asp-piptBu)을 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진) 혹은 화합물 55(화합물 54(Fmoc-Asp-MeOctyl)를 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진) 혹은 화합물 58(화합물 57(Fmoc-Asp-Pro-OPis)을 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진) 중 어느 것인가 100mg을 이용하고, Fmoc 아미노산으로서 Fmoc-MeVal-OH, Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH(화합물 15), Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH(화합물 16), Fmoc-MeHis(Trt)-OH(화합물 7), Fmoc-MePhe-OH, Fmoc-MeSer(DMT)-OH(화합물 5), Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6), Fmoc-MeAla-OH, Fmoc-nPrGly-OH(화합물 20), Fmoc-MeGly-OH, Fmoc-Hyp(Et)-OH(화합물 18), Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(THP)-OH(화합물 2), Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH(화합물 13), Fmoc-Phe(4-CF3)-OH, Fmoc-Phe(3-Cl)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Met(O2)-OH, Fmoc-b-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH 등을 이용하여 펩타이드의 신장을 행했다. (MeSer의 신장에 있어서는 PS-53, PS-54(표 5-1)에 있어서는 Fmoc-MeSer(DMT)-OH(화합물 5)를 이용하고, 그 이외에 대해서는 Fmoc-MeSer(THP)-OH(화합물 6)를 이용했다.) 이미 실시예에 기재된 Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 의해, 펩타이드의 신장을 행했다. 펩타이드의 신장 후, N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DMF로 세정했다.

계속하여 DCM으로 레진을 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 이용한 레진 상의 몰수(로딩량(mmol/g)에 사용한 레진량(통상은 0.10g)을 곱한 것)에 대해서 1.8등량이 되는 용량)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축했다.

얻어진 잔사를 DMF/DCM(1/1, v/v, 8mL)에 용해하고, 0.5M O-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)/DMF 용액(이용한 레진의 몰수(레진의 로딩량(mmol/g)에 사용한 레진량(0.1g)을 곱한 것)에 대해서 1.5등량이 되는 용량)과 DIPEA(이용한 레진의 몰수에 대해서 1.8등량)를 가하고 실온에서 2시간 교반했다. 그 후, 감압하 용매를 증류제거했다.

얻어진 잔사에 대해서, 탈보호는 이하와 같이 행했다.

서열 중에 Tyr(3-F,tBu)을 포함하는 경우에는, 이미 기재한 방법으로 조제한 0.1M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 2mL 가하고 잔사를 용해시킨 후, 실온 혹은 30도에서 24시간 정치했다. 서열 중에 Tyr(3-F)을 포함하지 않는 경우에는, 이미 기재한 방법으로 조제한 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP 용액(2% TIPS)을 4mL 가하고 잔사를 용해시킨 후, 실온에서 4시간 정치했다. 일정 시간 정치한 후, 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 70μL)을 가하고, 감압하 용매를 증류제거했다.

감압하, 용매를 증류제거한 후, DMF에 용해했다. 불용물을 필터 여과로 제거한 후, preparative-HPLC로 정제하여, 표제의 아마이드환화된 환상 펩타이드(PS-1∼PS-54)를 얻었다. PS-1∼PS-54의 서열을 표 5-1에, 구조를 표 5-2에, 또한, 얻어진 펩타이드의 매스 스펙트럼의 값과 액체 크로마토그래피의 유지 시간과 순도 및 수량을 표 5-3에 각각 나타낸다.

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 5-3]

실시예 7. 본 발명의 액상법에의 적용

액상법에서의 신장 반응을 포함하는 합성을 이하에 나타낸다.

부분적인 액상법에의 응용

액상에서의 Fmoc-Ala-OSu(화합물 152)와 H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 151)의 커플링을 포함하는, 환상 펩타이드(화합물 154, H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis-MeGly-Pro-Asp-Pro-OH의 주쇄 N말단의 아미노기와 Asp의 측쇄 카복실산기 사이에 아마이드 결합을 형성한 환상 펩타이드)의 합성

액상법에서의 신장 반응을 포함하는 도 21에 기재된 합성 루트로, 펩타이드의 합성을 행했다.

실시예 7-1:

H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 151)의 합성

[화학식 73]

이미 기재한 방법으로 합성한 Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(화합물 58, 로딩량 0.3736mmol/g, 200mg)를 사용하여, 이미 실시예에 기재된 Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 의해, 펩타이드의 신장을 행했다. 펩타이드의 신장 후, N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DMF로 세정했다.

계속하여 DCM으로 레진을 재팽윤시킨 후, 레진에 TFE/DCM(1/1, v/v, 4mL)과 다이아이소프로필에틸아민(24μL)을 가하고 실온에서 2시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 계속하여 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 남은 레진을 추가로 TFE/DCM(1/1, v/v, 2mL)으로 2회 세정했다. 얻어진 모든 절출 용액을 혼합하고, 감압하 농축하여, 표제의 화합물(화합물 151, H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis, 113.8mg)을 얻었다. 정제는 행하지 않고 다음의 공정에 이용했다.

LCMS(ESI) m/z=1860.9 (M+H)⁺

유지 시간: 0.72분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 7-2:

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산 (S)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일(화합물 152, Fmoc-Ala-OSu)의 합성

[화학식 74]

(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-Ala-OH, 1.00g, 3.21mmol)과 1-하이드록시피롤리딘-2,5-다이온(HOSu, 0.554g, 4.82mmol)과 다이클로로메테인(6.4mL)을 질소 분위기하 혼합했다. 이 혼합물을 0도로 빙랭하고, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(WSCI·HCl, 0.924g, 4.82mmol)을 가하고, 얻어진 반응 용액을 0도에서 1시간, 실온에서 15시간 교반했다. 계속하여, 감압하, 용매를 증류제거하고, 얻어진 잔사를 역상 실리카 겔 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산 (S)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일(화합물 152, Fmoc-Ala-OSu, 1.05g)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=409.3 (M+H)⁺

유지 시간: 0.80분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 7-3:

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산 (S)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일(화합물 152, Fmoc-Ala-OSu)과 H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 151)의 커플링과, 계속되는 탈Fmoc 반응

[화학식 75]

얻어진 H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 151, 113.8mg)의 다이클로로메테인(245μL) 용액에, 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산 (S)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일(화합물 152, Fmoc-Ala-OSu, 26.2mg)과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 12.8μL)을 가하고, 25도에서 1시간 교반했다. 계속하여, 반응 용액에 메틸아민(40% 메탄올 용액, 11.9μL)을 가하고 30분간 교반한 후, DBU(11.1μL)를 가하고 추가로 30분간 교반했다. 얻어진 반응 용액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제를 행하고, 얻어진 프랙션을 동결건조했다. 얻어진 잔사를 다이클로로메테인에 용해시키고, 포화 탄산수소 나트륨 수용액과 포화 염화 나트륨 수용액으로 세정하여, H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 153, 79.3mg, 0.041mmol)를 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=1931.8 (M+H)⁺

유지 시간: 0.73분 (분석 조건 SQDFA05)

실시예 7-4:

H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis-MeGly-Pro-Asp-Pro-OH의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄의 카복실산기가 아마이드환화된 화합물(화합물 154)의 합성(화합물 153의 환화 반응과, 계속되는 탈보호 반응)

[화학식 76]

얻어진 H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(화합물 153, 79.3mg, 0.041mmol)를 DMF(20mL)와 다이클로로메테인(20mL)에 용해시키고, HATU(17.2mg, 0.045mmol)와 다이아이소프로필에틸아민(10.8μL, 0.062mmol)을 가하고, 25도에서 2시간 교반했다. 계속하여, 감압하, 용매를 증류제거한 후, 0.05M 황산수소 테트라메틸암모늄/HFIP(2% TIPS) 용액(본 실시예에 이미 기재한 방법으로 조제, 8mL)을 가하고 25도에서 1시간 정치했다. 얻어진 반응 용액에 다이아이소프로필에틸아민(140μL)을 가하고, 감압하, 용매를 증류제거했다. 얻어진 잔사를 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제를 행하고, 얻어진 프랙션을 동결건조함으로써, H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis-MeGly-Pro-Asp-Pro-OH의 N말단 아미노기와 Asp 측쇄의 카복실산기가 아마이드환화된 화합물(화합물 154, 59mg, 0.040mmol,98%)을 얻었다.

LCMS(ESI) m/z=1469.7 (M+H)⁺

유지 시간: 0.61분 (분석 조건 SQDFA05)

액상에서의 세그먼트 커플링을 포함하는 전술한 펩타이드 합성과 같이, 본 발명의 합성법은 액상법에도 적용 가능하다.

본 발명에 의하면, 의약품으로서의 유용성을 기대할 수 있는 N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드를, 고순도로 또한 높은 합성 효율로 합성할 수 있다. 본 발명은, 의약품의 원료가 될 수 있는 N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 공업적인 생산의 분야 등에 있어서 유용하다.

Claims

이하의 공정:
1) 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산(Fmoc 보호 아미노산), 이하의 i) 및 ii)를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산 유연체(Fmoc 보호 아미노산 유연체), 또는 해당 Fmoc 보호 아미노산 및 해당 Fmoc 보호 아미노산 유연체의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드(Fmoc 보호 펩타이드)를 준비하는 공정;
i) Fmoc 골격을 갖는 적어도 1개의 보호기에 의해 보호되어 있는 주쇄의 아미노기,
ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,
2) 공정 1)에서 준비된 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 고상에 담지하는 공정,
3) 고상에 담지된 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여, 아미노기를 노출시키는 공정,
4) 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정, 및
5) 공정 4)에서 얻어진 펩타이드를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 공정
을 포함하는, 적어도 1개의 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 공정 4)에서 얻어진 펩타이드를 구성하는 아미노산 또는 아미노산 유연체의 적어도 1개의 측쇄가, 염기성 조건하에서는 탈보호되지 않고 또한 제 1 산으로 탈보호되는 보호기로 보호되어 있으며, 상기 공정 5)의 전 또는 후에, 해당 제 1 산으로 해당 보호기를 탈보호하는 공정을 추가로 포함하고, 또한
상기 공정 5)에 있어서, 제 2 산을 이용하여 펩타이드를 절출하는, 제조 방법으로서,
제 1 산 및 제 2 산이 모두 TFA보다도 약산이며, 또한 제 1 산의 산도가 제 2 산의 산도보다도 높은, 제조 방법.
이하의 공정:
1) 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산(Fmoc 보호 아미노산), 이하의 i) 및 ii)의 작용기를 각각 적어도 1개 갖는 아미노산 유연체(Fmoc 보호 아미노산 유연체), 또는 해당 Fmoc 보호 아미노산 및 해당 Fmoc 보호 아미노산 유연체의 양쪽 또는 어느 한쪽을 포함하는 펩타이드(Fmoc 보호 펩타이드)를 준비하는 공정;
i) Fmoc 골격을 갖는 적어도 1개의 보호기에 의해 보호되어 있는 주쇄의 아미노기,
ii) 유리된 또는 활성 에스터화된 적어도 1개의 카복실산기,
2) Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여, 아미노기를 노출시키는 공정,
3) 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정으로서, 이 공정에서 얻어지는 펩타이드를 구성하는 아미노산 또는 아미노산 유연체의 적어도 1개의 측쇄가, 염기성 조건하에서는 탈보호되지 않고 TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호되는 보호기를 갖는 공정, 및
4) 상기 측쇄의 보호기를, TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 탈보호하는 공정
을 포함하는, 적어도 1개의 N-치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산 유연체를 포함하는 펩타이드의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
펩타이드의 제조가 고상법에 의해 행해지는, 제조 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 공정 3)에서 얻어진 펩타이드를, 상기 공정 4)의 전 또는 후에 상기 공정 4)에서 이용되는 약산 조건보다도 더 약산이 되는 조건하에서 고상으로부터 절출하는 공정을 추가로 포함하는, 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
펩타이드의 제조가 액상법에 의해 행해지는, 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 항의 공정 4) 또는 제 3 항의 공정 3)이,
새롭게 첨가한 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드의 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 염기로 탈보호하여 아미노기를 노출시키는 공정, 및
추가로 새로운 Fmoc 보호 아미노산, Fmoc 보호 아미노산 유연체 또는 Fmoc 보호 펩타이드를 첨가하여, 아마이드 결합을 형성하는 공정을 추가로 포함하고,
이들 공정을 1회 또는 복수회 반복하는, 제조 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
제조된 펩타이드가, 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유연체 잔기를 C말단측에 포함하고, 또한 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체를 N말단측에 포함하는, 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 1개의 반응점과 상기 또 1개의 반응점을 결합시켜, 상기 펩타이드를 환화시키는 공정을 추가로 포함하는, 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체가 N말단에 있고, 또한 상기 결합이 아마이드 결합인, 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 또 1개의 반응점을 갖는 아미노산 잔기, 아미노산 유연체 잔기 또는 카복실산 유연체가 N말단에 있고, 또한 상기 결합이 탄소-탄소 결합인, 제조 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
TFA보다도 약산이 되는 조건하에서 행해지는 공정이, 수 중에서의 pKa의 값이 0∼9인 약산을, 이온화능 Y_OTs치가 양의 값이고 수 중에서의 pKa가 5∼14인 용매에 포함하는, 약산 용액을 이용하여 행해지는, 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
용매가 플루오로알코올인, 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
플루오로알코올이 TFE 또는 HFIP인, 제조 방법.
제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
측쇄의 보호기가, pH 1 내지 pH 7의 범위에서 탈보호되는 보호기이거나, 또는 10% 이하의 TFA에 있어서 탈보호되는 보호기인, 제조 방법.
제 2 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
측쇄의 보호기가 이하의 a)∼d)로부터 선택되는, 제조 방법:
a) 측쇄의 보호기가 Ser, Thr, Hyp, 및 그들의 유도체의 측쇄의 하이드록실기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격 및 Boc 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;
b) 측쇄의 보호기가 Tyr 및 그의 유도체의 측쇄의 하이드록실기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, 실릴 골격, Boc 골격 및 tBu 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;
c) 상기 측쇄의 보호기가 His 및 그의 유도체의 측쇄의 이미다졸환의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격 및 Trt 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;
d) 상기 측쇄의 보호기가 Asp, Glu, 및 그들의 유도체의 측쇄의 카복실산기의 보호기인 경우, 이하의 화학식으로 표시되는 MOM 골격, Bn 골격, Dpm 골격, Trt 골격, tBu 골격, 페닐-EDOTn 골격 및 보호를 하는 카복실산기의 탄소 원자를 3개의 알콕시기가 치환한 골격으로 변환한 오쏘에스터 골격으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기;
＜MOM 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1은 H이고, R2는 H이고, 또한 X는 메틸, 벤질, 4-메톡시벤질, 2,4-다이메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, 또는 2-트라이메틸실릴에틸이거나,
R1은 메틸이고, R2는 H이고, 또한 X는 에틸이거나,
R1, R2, R3은, 모두 메틸이거나, 또는
R1과 X는, 하나가 되어 -CH₂-CH₂-CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-를 형성하고, 또한 R2는 H이며
여기에서, R1, R2, 및 X 중 어느 하나가 메틸 또는 에틸인 경우, 이들 기는 추가로 알킬, 벤질, 또는 아릴로 치환되어 있어도 된다.)
＜Bn 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R6 및 R7은 알킬이거나,
R1, R2, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, R3은 메톡시이고, 또한 R6 및 R7은 H이거나,
R1 및 R3이 메톡시이고, R2, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R6 및 R7은 H이거나, 또는
R1, R4, 및 R5는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 할로젠이고, 또한 R2와 R3은 하나가 되어 -O-CH₂-O-를 형성한다.)
＜Dpm 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R10은, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나, 또는
R1∼R4 및 R7∼R10은, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R5 및 R6은 하나가 되어 -O- 또는 -CH₂-CH₂-를 형성한다.)
＜Trt 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나,
R1, R2, 및 R4∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R3은, 메틸 또는 메톡시이거나,
R1은 Cl이고, 또한 R2∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이거나, 또는
R1∼R4, 및 R7∼R15는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 알콕시, 또는 할로젠이고, 또한 R5와 R6은 하나가 되어 -O-를 형성한다.)
＜실릴 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R3은, 각각 독립적으로 알킬, 또는 아릴이다.)
＜Boc 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R9는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴이다.)
＜tBu 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R9는, 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴이다.)
＜페닐-EDOTn 골격을 갖는 보호기＞

(식 중,
R1∼R3은, 각각 독립적으로, H, 또는 메톡시이다).