KR20220082001A - Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량법 - Google Patents

Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량법 Download PDF

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Abstract

Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물로부터 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 측정하는 것을 통해서, 상기 화합물을 정확하게 정량할 수 있음을 발견했다.

Description

Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량법
본 발명은, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량법에 관한 것이다.
분자 펩티드 화합물(분자량 500∼2000)을 이용하여, 단백-단백 상호작용 저해, 아고니스트, 분자 샤프롱으로 대표되는 tough target으로의 창약을 가능하게 하는 창약 기술 개발이 근년 주목을 모으고 있다. 이들 화합물은 일반적으로 고상(固相) 상에서 N말단을 Fmoc기로 보호한 아미노산을 신장시킴으로써 합성된다. 의약품의 제조에 있어서, 품질 관리의 관점에서 원재료의 함량을 평가하는 것은 매우 중요하고, ICHQ11에 있어서, GMP 상의 출발 물질로 설정된 원재료에 대해서는 적절한 품질 관리 항목을 마련할 것이 요구되고 있다. Fmoc-아미노산을 출발 물질로 했을 경우, 그 함량은 적정(滴定)으로 평가하는 것이 일반적이고, 그 이외에도 정량 NMR이 이용된다. 시험의 간편성에서 적정법이 가장 사용되고 있지만, 그 측정물에 카복실산 등의 산이 불순물로서 포함되어 있는 경우, 함량 측정의 정확성이 상실되는 결점이 있다. 또한, 정량 NMR은 작용기 레벨로 수소 원자의 핵수를 직접 또한 정확하게 잴 수 있다고 하는 장점이 있는 한편으로, HPLC나 GC와 같은 크로마토그래프법과는 달리 다성분을 분리할 수 없다.
Fmoc기는 아미노기를 함유하는 화합물의 보호기로서 다용되고 있는 보호기이다. 이 Fmoc기는, 자외부(UV) 흡수가 있기 때문에, 크로마토그래프법으로의 정량이 가능하다. 또한 Fmoc기를 제거할 때에 생기는 다이벤조풀벤(DBF)을 이용하여, 폴리머 비즈 상의 Fmoc기의 로딩량을 정량하는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 1, 2, 3).
William S. N. et al. Biotechnol. Bioeng. 1998, 61, 55-60. Laszlo V. et al. J. Chromatogr. A 2000, 869, 171-179. Freeman C. E. et al. Talanta 2005, 65, 574-577.
전술한 바와 같이, Fmoc기는, 자외부(UV) 흡수가 있기 때문에, 크로마토그래프법으로의 정량이 가능하다. 그렇지만, 화합물마다 동일 파장에 있어서의 몰 흡광 계수는 상이하고, 또한, 어느 조건하에서 몰 흡광 계수가 동일 화합물에서도 크로마토그래프법에 있어서의 용출 시의 용매 조성이 변화되면, 몰 흡광 계수가 상이한 경우도 있기 때문에, 정량하는 화합물마다, 함량이 확인된 그 화합물의 표품을 준비할 필요가 있다. 예를 들어, 천연 아미노산으로 이루어지는 Fmoc-아미노산의 정량을 크로마토그래프법으로 실시하는 경우, 그 Fmoc-아미노산의 표품은 벌써 많은 메이커로부터 판매되고 있기 때문에, 크로마토그래프법으로 표품과 Fmoc-아미노산을 비교하는 것에 의해 정량하는 것이 가능하다. 한편으로, 근년 사용되고 있는 비천연 아미노산이나 Fmoc기로 보호된 펩티드의 경우는, 그 아미노산이나 펩티드의 표품의 입수가 곤란하기 때문에, 크로마토그래프법으로 측정하는 경우, 그들의 표품을 하나하나 합성 후, 함량을 확인할 필요가 있다.
또한, 상기의 선행기술문헌은, 폴리머 비즈 상의 Fmoc기의 로딩량을 평가하고 있지만, 이것은 Fmoc기를 갖는 다른 불순물도 포함한 정량 평가이다. 더욱이, Fmoc기를 제거하여 생성되는 다이벤조풀벤은 불안정한 분자이며, 시간이 경과됨에 따라 분해되어 나가기 때문에, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량 정밀도의 저하의 원인이 될 수 있다.
본 발명은, 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 하나의 표품만 있으면, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물을, 의약품을 제조하기 위해서 필요한 소수점 첫째자리까지 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제의 해결 수단으로서 이하를 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
1) Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물 자체를 정량하는 것은 아니고, 해당 화합물로부터 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 간접적인 수법에 의해, 해당 화합물을 정량하는 신규한 방법을 발견했다.
2) 조(粗)생성물 중의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 순도와, Fmoc 골격을 갖는 보호기의 제거 후에 생성되는 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량에 기초하여, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 함량을 의약품의 원료 품질 관리에 요구되는 소수점 첫째자리까지 산출할 수 있음을 발견했다.
3) 순도의 측정 조건을, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 측정 조건과 마찬가지로 함으로써, 오차가 적은, 정확한 함량의 산출을 가능하게 했다.
4) Fmoc 골격을 갖는 보호기의 탈보호 반응의 반응율이 100%이며, 부반응이 거의 0%인 반응 조건을 발견하여, 보다 정확한 정량을 가능하게 했다.
5) Fmoc 골격을 갖는 보호기의 제거 후에 생성되는 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체를 산과 혼합하는 것에 의해, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 안정성을 향상시켜, 보다 참값에 가까운 값을 산출할 수 있음을 발견했다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
본 발명은, 이하의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 정량법에 관한 것이다.
(A1) 조생성물 중에 포함되는, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(이하, 제 1 Fmoc 화합물이라고 하는 경우가 있다)의 함량을 정량하는 방법으로서,
용액(이하, 제 1 용액이라고 하는 경우가 있다) 중, 제 1 Fmoc 화합물로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 포함하는, 방법.
(A2) 용액(이하, 제 2 용액이라고 하는 경우가 있다) 중, 표품으로서 이용하는 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 갖는 아미노기 함유 화합물(이하, 제 2 Fmoc 화합물이라고 하는 경우가 있다)로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 추가로 포함하고,
제 1 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량과 제 2 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 대비하는 것에 의해, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)을 산출하는, (A1)에 기재된 방법.
(A3) 제 1 용액 및 제 2 용액에 있어서, 탈보호 반응이 정량적으로 진행되는, (A2)에 기재된 방법.
(A4) 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적을 측정하는 것에 의해, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는, (A1) 내지 (A3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A5) 조생성물의 Fmoc 순도에 의해, 함유율을 보정하는 것을 추가로 포함하고,
여기서 「Fmoc 순도」란, 조생성물에 포함되는 모든 종류의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물의 함량의 합계에 대한 제 1 Fmoc 화합물의 함량의 비율인, (A2) 내지 (A4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A6) (i) 제 1 Fmoc 화합물의 피크 면적과 (ii) 조생성물 중의 제 1 Fmoc 화합물 이외의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물의 각 피크 면적에 기초하여, Fmoc 순도를 산출하는, (A5)에 기재된 방법.
(A7) 내표준 물질에 의해, 함유율을 보정하는 것을 추가로 포함하는, (A2) 내지 (A6) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A8) 제 1 용액 중에 포함되는 내표준 물질(이하, 제 1 내표준 물질이라고 하는 경우가 있다)의 함량과, 제 2 용액 중에 포함되는 내표준 물질(이하, 제 2 내표준 물질이라고 하는 경우가 있다)의 함량을 대비하는 것을 포함하는, (A7)에 기재된 방법.
(A9) 제 1 내표준 물질의 피크 면적과 제 2 내표준 물질의 피크 면적을 측정하는 것에 의해, 제 1 및 제 2 내표준 물질의 함량을 각각 정량하는, (A8)에 기재된 방법.
(A10) 제 1 및 제 2 내표준 물질이, 안트라센, 페난트렌, 나프탈렌, 벤젠, 톨루엔, 트라이페닐렌, 및 나프타센으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, (A8)∼(A9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A11) 제 1 및 제 2 내표준 물질이 안트라센인, (A8)∼(A10) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A12) 각 피크 면적을 크로마토그래프법에 의해 측정하는, (A4), (A6), (A9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A13) 크로마토그래프법이 액체 크로마토그래프법 또는 가스 크로마토그래피법인, (A12)에 기재된 방법.
(A14) 각 피크 면적을 동일한 측정 조건에서 측정하는, (A12) 또는 (A13)에 기재된 방법.
(A15) Fmoc 골격을 갖는 보호기가 하기 식(1)로 표시되는, (A1) 내지 (A14) 중 어느 하나에 기재된 방법:
Figure pct00001
(식 중,
R1∼R8은, 독립적으로, 수소, C1-C8 알킬, C1-C8 플루오로알킬, 할로젠, 설포, 및 트라이메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
R9∼R10은, 독립적으로, 수소, 또는 메틸이다.)
(A16) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기, Fmoc(2,7tb)기, Fmoc(1Me)기, Fmoc(2F)기, Fmoc(2,7Br)기, mio-Fmoc기, dio-Fmoc기, tdf-Fmoc기, Fmoc(2TMS)기, Fmoc(2so3h)기, sm-Fmoc기, 또는 rm-Fmoc기인, (A1) 내지 (A15) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A17) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기인, (A1) 내지 (A16) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A18) 제 1 Fmoc 화합물 및/또는 제 2 Fmoc 화합물이, 고상에 담지되어 있지 않은, (A1) 내지 (A17) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A19) 제 1 Fmoc 화합물 및/또는 제 2 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산, 펩티드, 또는 저분자 유기 화합물인, (A1) 내지 (A18) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A20) 제 1 Fmoc 화합물 및/또는 제 2 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산 또는 펩티드인, (A1) 내지 (A19) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A21) 상기 아미노산이 α-아미노산 또는 β-아미노산인, (A19) 또는 (A20)에 기재된 방법.
(A22) 상기 아미노산의 주쇄의 카복시기가 유리의 카복시기인, (A19) 내지 (A21) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A23) 상기 펩티드가 α-아미노산 및/또는 β-아미노산을 포함하거나, 또는 α-아미노산 및/또는 β-아미노산으로 이루어지는, (A19) 또는 (A20)에 기재된 방법.
(A24) 상기 염기가 유기 염기인, (A1) 내지 (A23) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A25) 상기 염기가, 아민, 아미딘 골격을 갖는 염기, 및 구아니딘 골격을 갖는 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 1종인, (A1) 내지 (A24) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A26) 상기 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센(DBU), 2,3,6,7-테트라하이드로-1H,5H-9-아자벤조[ij]퀴놀리진, 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥테인(DABCO), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨, 7-메틸-1,5,7-트리아자바이사이클로[4.4.0]데카-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 1-메틸피리딘, N,N＇-다이메틸피페라진, N-메틸모폴린, N-에틸모폴린, p-다이메틸아미노피리딘, 피리딘, 모폴린, 다이사이클로헥실아민, p-다이메틸아미노피리딘, 다이아이소프로필에틸아민, 피리딘, 피페라진, 및 테트라 뷰틸암모늄 플루오라이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (A24)에 기재된 방법.
(A27) 상기 염기가 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기인, (A1) 내지 (A26) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A28) 상기 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센(DBU), 2,3,6,7-테트라하이드로-1H,5H,-9-아자벤조[ij]퀴놀리진, 1,4-다이아자바이사이클로[2,2,2]옥테인(DABCO), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨, 7-메틸-1,5,7-트리아자바이사이클로[4.4.0]데카-5-엔, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 1-메틸피리딘, N,N＇-다이메틸피페라진, N-메틸모폴린, N-에틸모폴린, 및 p-다이메틸아미노피리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (A27)에 기재된 방법.
(A29) 상기 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센인, (A27)에 기재된 방법.
(A30) Fmoc 골격을 갖는 보호기의 제거 후에, 제 1 및/또는 제 2 용액에 산을 가하는 것을 추가로 포함하는, (A1) 내지 (A29) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A31) 상기 산이 유기산 및/또는 무기산인, (A30)에 기재된 방법.
(A32) 상기 유기산이, 시트르산, 옥살산, 말레산, 황산수소 테트라메틸암모늄, 폼산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 모노플루오로아세트산, 다이플루오로아세트산, 트라이클로로아세트산, 모노클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (A31)에 기재된 방법.
(A33) 상기 무기산이, 인산, 붕산, 염산, 질산, 황산, 브로민화 수소산, 포스폰산, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (A31) 또는 (A32)에 기재된 방법.
(A34) 제 1 및/또는 제 2 용액의 용매가, 비양성자성 극성 용매인, (A1)∼(A33) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A35) 상기 비양성자성 극성 용매가, DMF, DMA, NMP, DMSO, 또는 아세토나이트릴인, (A34)에 기재된 방법.
(A36) 0℃∼50℃의 반응 온도에서 보호기를 탈보호하는, (A1) 내지 (A35) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A37) 함유율(중량%)이, 하기 식:
Figure pct00002
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이다.)
또는, 하기 식:
Figure pct00003
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
ISS는, 제 2 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
IST는, 제 1 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이다.)
또는 하기 식:
Figure pct00004
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
PS는, Fmoc 순도이다.)
또는, 하기 식:
Figure pct00005
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
ISS는, 제 2 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
IST는, 제 1 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
PS는, Fmoc 순도이다.)
으로부터 산출되는, (A2) 내지 (A36) 중 어느 하나에 기재된 방법.
또한 본 발명은, 이하의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체를 안정화하는 방법에도 관한 것이다.
(B1) 조생성물에 포함되는 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체를 안정화하는 방법으로서, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체와 산을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
(B2) Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(이하, Fmoc 화합물이라고 하는 경우가 있다)로부터 해당 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거하는 것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체와 산을 혼합하는 것을 포함하는, (B1)에 기재된 방법.
(B3) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 하기 식(1)로 표시되는, (B2)에 기재된 방법:
Figure pct00006
(식 중,
R1∼R8은, 독립적으로, 수소, C1-C8 알킬, C1-C8 플루오로알킬, 할로젠, 설포, 및 트라이메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
R9∼R10은, 독립적으로, 수소, 또는 메틸이다.)
(B4) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기, Fmoc(2,7tb)기, Fmoc(1Me)기, Fmoc(2F)기, Fmoc(2,7Br)기, mio-Fmoc기, dio-Fmoc기, tdf-Fmoc기, Fmoc(2TMS)기, Fmoc(2so3h)기, sm-Fmoc기, 또는 rm-Fmoc기인, (B2) 또는 (B3)에 기재된 방법.
(B5) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기인, (B2) 내지 (B4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(B6) 상기 Fmoc 화합물이 고상에 담지되어 있지 않은 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 저분자 유기 화합물인, (B2) 내지 (B5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(B7) 상기 Fmoc 화합물이 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산, 펩티드, 또는 저분자 유기 화합물인, (B2) 내지 (B6) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(B8) 상기 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산 또는 펩티드인, (B2) 내지 (B7) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(B9) 상기 아미노산이 α-아미노산 또는 β-아미노산인, (B7) 또는 (B8)에 기재된 방법.
(B10) 상기 펩티드가 α-아미노산 및/또는 β-아미노산을 포함하거나, 또는 α-아미노산 및/또는 β-아미노산으로 이루어지는, (B7) 또는 (B8)에 기재된 방법.
(B11) 상기 산이 유기산 및/또는 무기산인, (B2)에 기재된 방법.
(B12) 상기 유기산이, 시트르산, 옥살산, 말레산, 황산수소 테트라메틸암모늄, 폼산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 모노플루오로아세트산, 다이플루오로아세트산, 트라이클로로아세트산, 모노클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (B11)에 기재된 방법.
(B13) 상기 무기산이, 인산, 붕산, 염산, 질산, 황산, 브로민화 수소산, 포스폰산, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (B11)에 기재된 방법.
또한 본 개시는, 이하의 안정화제에도 관한 것이다.
(C1) 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체를 안정화하기 위한 안정화제.
(C2) 산인, (C1)에 기재된 안정화제.
(C3) 상기 산이 유기산 및/또는 무기산인, (C2)에 기재된 안정화제.
(C4) 상기 유기산이, 시트르산, 옥살산, 말레산, 황산수소 테트라메틸암모늄, 폼산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 모노플루오로아세트산, 다이플루오로아세트산, 트라이클로로아세트산, 모노클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (C3)에 기재된 안정화제.
(C5) 상기 무기산이, 인산, 붕산, 염산, 질산, 황산, 브로민화 수소산, 포스폰산, 및, 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (C3)에 기재된 안정화제.
혹은, 본 개시는, 이하의 아미노기 함유 화합물의 정량법에도 관한 것이다.
(D1) 조생성물 중에 포함되는 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(이하, Fmoc 화합물이라고 하는 경우가 있다)로부터 생성된 아미노기 함유 화합물의 함량을 정량하는 방법으로서,
Fmoc 화합물로부터 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거하는 것에 의해 생성된 아미노기 함유 화합물의 함량을 정량하는 것을 포함하는, 방법.
(D2) 상기 아미노기 함유 화합물의 함량을 크로마토그래프법에 의해 측정하는, (D1)에 기재된 방법.
(D3) 상기 크로마토그래프법이 친수성 상호작용 크로마토그래프법(HILIC)인, (D2)에 기재된 방법.
(D4) 상기 크로마토그래프법에 의한 검출기가 하전화 입자 검출기(CAD) 및/또는 질량 분석계인, (D2) 내지 (D3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D5) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 하기 식(1)로 표시되는, (D1) 내지 (D4) 중 어느 하나에 기재된 방법:
Figure pct00007
(식 중,
R1∼R8은, 독립적으로, 수소, C1-C8 알킬, C1-C8 플루오로알킬, 할로젠, 설포, 및 트라이메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
R9∼R10은, 독립적으로, 수소, 또는 메틸이다.)
(D6) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기, Fmoc(2,7tb)기, Fmoc(1Me)기, Fmoc(2F)기, Fmoc(2,7Br)기, mio-Fmoc기, dio-Fmoc기, tdf-Fmoc기, Fmoc(2TMS)기, Fmoc(2so3h)기, sm-Fmoc기, 또는 rm-Fmoc기인, (D1) 내지 (D5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D7) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 Fmoc기인, (D1) 내지 (D6) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D8) 상기 Fmoc 화합물이, 고상에 담지되어 있지 않은, (D1) 내지 (D7) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D9) 상기 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산, 펩티드, 또는 저분자 유기 화합물인, (D1) 내지 (D8) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D10) 상기 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산 또는 펩티드인, (D1) 내지 (D9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D11) 상기 아미노산이 α-아미노산 또는 β-아미노산인, (D9) 또는 (D10)에 기재된 방법.
(D12) 상기 펩티드가 α-아미노산 및/또는 β-아미노산을 포함하거나, 또는 α-아미노산 및/또는 β-아미노산으로 이루어지는, (D9) 또는 (D10)에 기재된 방법.
(D13) 상기 아미노산의 주쇄의 카복시기가 유리의 카복시기인, (D9) 내지 (D12) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D14) 상기 Fmoc 골격을 갖는 보호기가 염기로 제거되는, (D1) 내지 (D13) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D15) 상기 염기가 유기 염기인, (D14)에 기재된 방법.
(D16) 상기 염기가, 아민, 아미딘 골격을 갖는 염기, 및 구아니딘 골격을 갖는 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 1종의 염기인, (D14) 또는 (D15)에 기재된 방법.
(D17) 상기 유기 염기가 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0〕-7-운데센(DBU), 2,3,6,7-테트라하이드로-1H,5H-9-아자벤조[ij]퀴놀리진, 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥테인(DABCO), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨, 7-메틸-1,5,7-트리아자바이사이클로[4.4.0]데카-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 1-메틸피리딘, N,N＇-다이메틸피페라진, N-메틸모폴린, N-에틸모폴린, p-다이메틸아미노피리딘, 피리딘, 모폴린, 다이사이클로헥실아민, p-다이메틸아미노피리딘, 다이아이소프로필에틸아민, 피리딘, 피페라진, 및 테트라 뷰틸암모늄 플루오라이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (D15)에 기재된 방법.
(D18) 상기 염기가 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기인, (D14) 내지 (D17) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(D19) 상기 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기가 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센(DBU), 2,3,6,7-테트라하이드로-1H,5H,-9-아자벤조[ij]퀴놀리진, 1,4-다이아자바이사이클로[2,2,2]옥테인(DABCO), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨, 7-메틸-1,5,7-트리아자바이사이클로[4.4.0]데카-5-엔, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 1-메틸피리딘, N,N＇-다이메틸피페라진, N-메틸모폴린, N-에틸모폴린, 및 p-다이메틸아미노피리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (D18)에 기재된 방법.
(D20) 상기 3급 아민을 1개 또는 복수를 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기가 1,8-다이아자바이사이클로〔5.4.0〕-7-운데센인, (D18) 또는 (D19)에 기재된 방법.
본 발명의 방법에 의하면, 분석 시료 중에 포함되는, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 함량을, 고정밀도로 간편하게 정량하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은, 의약품을 제조하기 위해서 필요한 품질 레벨로 상기 화합물을 정량하기 위한 극히 유용한 수법이 될 수 있다.
[도 1] 도 1은, 실시예 1에 있어서의 표준 용액(Fmoc-Gly-OH를 DBU 처리한 용액)의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 2] 도 2는, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-NMe-Val-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 3] 도 3은, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-Pro-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 4] 도 4는, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-NMe-Ala-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 5] 도 5는, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-Ile-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 6] 도 6은, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-NMe-Leu-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 7] 도 7은, 실시예 1에 있어서 조 Fmoc-NMe-Gly-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 8] 도 8은, 실시예 2에 있어서의 표준 용액(Fmoc-Gly-OH를 DBU 처리한 용액)의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 9] 도 9는, 실시예 2에 있어서 조 Fmoc-Val-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 10] 도 10은, 실시예 2에 있어서 조 Fmoc-Phe-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 11] 도 11은, 실시예 2에 있어서 조 Fmoc-NMe-Val-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 12a] 도 12a는, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 12b] 도 12b는 도 12a의 일부 구간에 있어서의 확대도이다.
[도 13] 도 13은, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리하기 전의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 14] 도 14는, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 15a] 도 15a는, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Phe-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 15b] 도 15b는, 도 15a의 일부 구간에 있어서의 확대도이다.
[도 16] 도 16은, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Phe-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리하기 전의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 17] 도 17은, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-Phe-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 18a] 도 18a는, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-NMe-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 18b] 도 18b는, 도 18a의 일부 구간에 있어서의 확대도이다.
[도 19] 도 19는, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-NMe-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리하기 전의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 20] 도 20은, 실시예 3에 있어서의 조 Fmoc-NMe-Val-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 21] 도 21은, 실시예 5에 있어서의 본 발명의 DBF에 의한 정량법을 이용하여 산출한 각 Fmoc-아미노산의 함유율과 정량 NMR에 의해 산출한 각 Fmoc-아미노산의 함유율이라는 비교를 나타낸 도면이다.
[도 22] 도 22는, 실시예 6에 있어서의 H-NMe-Gly-OH의 표준 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 23] 도 23은, 실시예 6에 있어서의 조 Fmoc-NMe-Gly-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU로 처리한 후의 해당 시료 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 24] 도 24는, 실시예 6에 있어서의 H-NMe-Gly-OH의 표준 용액의 크로마토그램과 DBU에서의 처리 후의 조 Fmoc-NMe-Gly-OH를 포함하는 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 25] 도 25는, 실시예 7에 있어서의 표준 용액(Fmoc-Gly-OH를 DBU 처리한 용액)의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 26] 도 26은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Phe-Phe-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU 처리한 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 27] 도 27은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-Gly-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU 처리한 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 28] 도 28은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-Leu-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU 처리한 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 29] 도 29는, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-bAla-OH를 포함하는 시료 용액을 DBU 처리한 용액의 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
[도 30] 도 30은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Phe-Phe-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 31] 도 31은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-Gly-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 32] 도 32는, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-Leu-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
[도 33] 도 33은, 실시예 7에 있어서의 조 Fmoc-Gly-bAla-OH를 포함하는 시료 용액에 대해, DBU에서의 처리 전과 처리 후의 각 시료 용액의 크로마토그램을 비교한 도면이다.
(약호)
본 명세서에 있어서 사용되는 기호, 약호의 의미를 이하에 나타낸다.
Fmoc: 9-플루오렌일메톡시카보닐
DBF: 다이벤조풀벤
DBU: 1,8-다이아자바이사이클로〔5.4.0〕-7-운데센
DMF: N,N-다이메틸폼아마이드
DMA: N,N-다이메틸아세트아마이드
NMP: N-메틸피롤리돈
DMSO: 다이메틸설폭사이드
TFA: 트라이플루오로아세트산
TFE: 2,2,2-트라이플루오로에탄올
TMS: 트라이메틸실릴
CH3CN: 아세토나이트릴
Na2SO4: 황산 나트륨
Pip: 피페리딘
HILIC: 친수성 상호작용 크로마토그래피
CAD: Charged Aerosol Detector
HPLC: 고속 액체 크로마토그래피
GC: 가스 크로마토그래피
PDA: Photodiode Array
Gly: 글리신
Ala: 알라닌
Val: 발린
Leu: 류신
Ile: 아이소류신
Met: 메티오닌
Phe: 페닐알라닌
Tyr: 티로신
Trp: 트립토판
His: 히스티딘
Lys: 리신
Arg: 아르기닌
Ser: 세린
Thr: 트레오닌
Asp: 아스파라긴산
Glu: 글루타민산
Asn: 아스파라긴
Gln: 글루타민
Cys: 시스테인
Pro: 프롤린
Cha: 사이클로헥실알라닌
cLeu: 사이클로류신
NMe: N-메틸
bAla: β-알라닌
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 조생성물 중 또는 분석 시료 중의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(이하에 있어서, 제 1 Fmoc 화합물이라고 하는 경우가 있다)의 함량을 정량하는 방법에 관한 것이다.
어느 태양에 있어서, 상기 방법은, 용액(이하, 제 1 용액이라고 하는 경우가 있다) 중, 제 1 Fmoc 화합물로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 포함한다.
어느 태양에 있어서, 상기 방법은, 제 1 용액과는 별개의 용액(이하, 제 2 용액이라고 하는 경우가 있다) 중, 표품으로서 이용하는 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 갖는 아미노기 함유 화합물(이하, 제 2 Fmoc 화합물이라고 한다)로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 추가로 포함한다. 이 경우, 제 1 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량과 제 2 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 대비하는 것에 의해, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)을 산출할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「분석 시료」는 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물을 포함하는 시료를 말한다. 분석 시료로서는, 여과나 흡착, 재결정, 증류, 추출, 크로마토그래피 등을 이용하는 것에 의해, 분석 시료 유래의 불순물이나, 수분, 유기염, 무기염, 잔류 용매 등의 불순물이 제거된 조생성물을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「함량」은, 분석 시료(조생성물) 중 혹은 용액 중에 포함되어 있는, 임의의 물질의 양, 예를 들어, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물, 아미노기 함유 화합물(탈보호체), 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체, 내표준 물질 등의 양을 의미한다.
본 발명에 있어서의 「아미노기 함유 화합물」은, 제1급 아미노기 및/또는 제2급 아미노기를 갖는 임의의 화합물을 의미한다. 아미노기 함유 화합물에 포함되는 아미노기의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1∼2개, 더 바람직하게는 1개이다. 아미노기 함유 화합물로서는, 예를 들어, 아미노산, 펩티드, 저분자 유기 화합물 등을 들 수 있다. 아미노기 함유 화합물은, 고상(예를 들어, 고상 합성용 수지)에 담지되어 있어도, 담지되어 있지 않아도 된다.
본 명세서에 있어서 「고상 합성용 수지」는, 고상법에 의한 펩티드 화합물의 합성에 이용할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 고상 합성용 수지로서, 구체적으로는, 예를 들어, CTC 수지, Wang 수지, SASRIN 수지, 트라이틸 클로라이드 수지(Trt 수지), 4-메틸트라이틸 클로라이드 수지(Mtt 수지), 4-메톡시트라이틸 클로라이드 수지(Mmt) 등의 산성 조건에서 제거 가능한 것을 들 수 있다. 수지는, 이용되는 아미노산측의 작용기에 맞추어 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 아미노산측의 작용기로서 카복실산(주쇄 카복실산, 혹은, Asp나 Glu로 대표되는 측쇄 카복실산), 또는, 방향환 상의 하이드록시기(Tyr로 대표되는 페놀기)를 이용하는 경우에는, 수지로서, 트라이틸 클로라이드 수지(Trt 수지) 혹은 2-클로로트라이틸 클로라이드 수지(CTC 수지)를 이용하는 것이 바람직하다. 아미노산측의 작용기로서 지방족 하이드록시기(Ser나 Thr로 대표되는 지방족 알코올기)를 이용하는 경우에는, 수지로서, 트라이틸 클로라이드 수지(Trt 수지), 2-클로로트라이틸 클로라이드 수지(CTC 수지) 혹은 4-메틸트라이틸 클로라이드 수지(Mtt 수지)를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 본 명세서 중에서, 수지를 레진이라고 기재하는 경우도 있다.
수지를 구성하는 폴리머의 종류에 대해서도 특별히 한정되지 않는다. 폴리스타이렌으로 구성되는 수지의 경우에는, 100-200mesh 혹은 200-400mesh의 어느 것을 이용해도 된다. 또한, 가교율에 대해서도 특별히 한정되지 않지만, 1% DVB(다이바이닐벤젠) 가교의 것이 바람직하다. 또한, 수지를 구성하는 폴리머의 종류로서 Tentagel 또는 Chemmatrix를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아미노산」은, 「천연 아미노산」이어도 「아미노산 유연체」여도 된다. 본 명세서에 있어서 「아미노산」, 「천연 아미노산」, 「아미노산 유연체」를, 각각, 「아미노산 잔기」, 「천연 아미노산 잔기」, 「아미노산 유연체 잔기」라고 하는 경우가 있다.
「천연 아미노산」이란, α-아미노카복실산(α-아미노산)이며, 단백질에 포함되는 20종류의 아미노산을 가리킨다. 구체적으로는, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro를 가리킨다.
「아미노산 유연체」는, 특별히 한정되지 않지만, β-아미노산, γ-아미노산, D형 아미노산, N치환 아미노산, α,α-2치환 아미노산, 하이드록시카복실산, 비천연형 아미노산(측쇄가 천연과 상이한 아미노산; 예를 들어, 비천연형의 α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산)을 포함한다. α-아미노산의 경우, D형 아미노산이어도 되고, α,α-다이알킬아미노산이어도 된다. β-아미노산이나 γ-아미노산의 경우도, α-아미노산과 마찬가지로, 임의의 입체 배치가 허용된다. 아미노산 측쇄의 선택은 특별히 제한을 마련하지 않지만, 수소 원자 외에도 예를 들어 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기로부터 자유롭게 선택된다. 각각은 치환기가 부여되어 있어도 되고, 그들 치환기도 예를 들어, N 원자, O 원자, S 원자, B 원자, Si 원자, P 원자를 포함하는 임의의 작용기 중에서 자유롭게 선택된다(즉, 치환되어 있어도 되는 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기 등).
아미노산의 주쇄 아미노기는, 비치환(NH2기)이어도 되고, 치환되어 있어도 된다(즉, -NHR기: R은, 예를 들어, 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 사이클로알킬이며, 또한 프롤린과 같이 N 원자에 결합한 탄소쇄와 α위의 탄소 원자가 환을 형성하고 있어도 된다). 이와 같은 주쇄 아미노기가 치환되어 있는 아미노산을, 본 명세서에 있어서 「N치환 아미노산」이라고 칭한다. 본 명세서에 있어서의 「N치환 아미노산」으로서는, 바람직하게는 N-알킬아미노산(예를 들어, N-C1-C6 알킬아미노산, N-C1-C4 알킬아미노산, N-메틸아미노산 등), N-사이클로알킬아미노산, N-사이클로알킬알킬아미노산, N-아릴아미노산, N-아르알킬아미노산 등이 예시되지만, 이들로 한정되지 않는다.
아미노산의 주쇄 카복시기는, 비치환(카복시기: COOH기)이어도 되고, 또한 에스터기를 형성하고 있어도 된다(즉, -COOR기: R은, 예를 들어, 치환되어 있어도 되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 사이클로알킬이다). 이와 같은 주쇄 카복시기가 에스터기를 형성하고 있는 아미노산을, 본 명세서에 있어서 「아미노산 에스터」라고 칭한다. 본 명세서에 있어서의 「아미노산 에스터」로서는, 아미노산 C1-10 알킬 에스터, 아미노산 벤질 에스터, 아미노산〔2,4-다이(C1-C25 알콕시)페닐〕메틸 에스터, 아미노산(3,4,5-트라이C1-C25 알콕시페닐)메틸 에스터, 아미노산 메틸 에스터, 아미노산 에틸 에스터, 아미노산 tert-뷰틸 에스터, 아미노산 트라이틸 에스터, 아미노산 (3,4,5-트라이옥타데콕시페닐)메틸 에스터, 아미노산〔2-(12-도코속시도데콕시)-9-(3-플루오로페닐)플루오렌-9-일〕에스터, 〔2,4-다이(도코속시)페닐〕메틸 에스터 등이 예시되지만, 이들로 한정되지 않는다.
아미노산의 주쇄 카복시기는, 아마이드기를 형성하고 있어도 된다(즉, -CONR1R2기: R1 및 R2는, 예를 들어, 수소, 치환되어 있어도 되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 및 사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다). 이와 같은 주쇄 카복시기가 아마이드기로 치환되어 있는 아미노산을, 본 명세서에 있어서 「아미노산 아마이드」라고 칭한다. 본 명세서에 있어서의 「아미노산 아마이드」로서는, 아미노산 C1-C10 알킬 아마이드, 아미노산 벤질 아마이드, 아미노산 비스〔4-(도코속시)페닐〕메틸아마이드(AJIPHASE(등록상표)) 등이 예시되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 「측쇄」란, 아미노산의 측쇄, 또는 환상 펩티드의 환상부의 측쇄 등의 문맥으로 사용되고, 각각의 주쇄 구조에 포함되지 않는 부분을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「펩티드」에는, 2 이상의 아미노산이 연결된 직쇄상 또는 환상의 펩티드가 포함되고, 아미노산은, 「천연 아미노산」이어도 「아미노산 유연체」이어도 된다.
펩티드를 구성하는 「천연 아미노산」, 「아미노산 유연체」에는 각각 대응하는 모든 동위체를 포함한다. 「천연 아미노산」, 「아미노산 유연체」의 동위체는, 적어도 1개의 원자가, 원자 번호(양자수)가 동일하고, 질량수(양자와 중성자의 수의 합)가 상이한 원자로 치환된 것이다. 본 발명의 펩티드를 구성하는 「천연 아미노산」, 「아미노산 유연체」에 포함되는 동위체의 예로서는, 수소 원자, 탄소 원자, 질소 원자, 산소 원자, 인 원자, 황 원자, 불소 원자, 염소 원자 등이 있고, 각각, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 35S, 18F, 36Cl 등이 포함된다.
본 발명에 있어서, 「유기 화합물」이란, 탄소를 포함하는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서 「저분자 유기 화합물」이란, 분자량이 작은 탄소를 포함하는 화합물을 의미하고, 그 분자량은 1500돌턴 이하가 바람직하다.
본 발명에 있어서 「Fmoc 골격을 갖는 보호기」란, Fmoc기 또는 Fmoc기의 구성 골격의 임의의 위치에 임의의 치환기가 도입된 기를 의미한다. 이와 같은 Fmoc 골격을 갖는 보호기로서 구체적으로는 하기 식(1)로 표시되는 보호기를 들 수 있다
Figure pct00008
(식 중,
R1∼R8은, 독립적으로, 수소, C1-C8 알킬, C1-C8 플루오로알킬, 할로젠, 설포, 및 트라이메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
R9∼R10은, 독립적으로, 수소 또는 메틸이다.).
Fmoc 골격을 갖는 보호기로서 보다 구체적으로는, 예를 들어, 9-플루오렌일메틸옥시카보닐(Fmoc)기, 2,7-다이-tert-뷰틸-Fmoc(Fmoc(2,7tb))기, 1-메틸-Fmoc(Fmoc(1Me))기, 2-플루오로-Fmoc(Fmoc(2F))기, 2,7-다이브로모-Fmoc(Fmoc(2,7Br))기, 2-모노아이소옥틸-Fmoc(mio-Fmoc)기, 2,7-다이아이소옥틸-Fmoc(dio-Fmoc)기, 2,7-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)-Fmoc(tdf-Fmoc)기, 2,7-비스(트라이메틸실릴)-Fmoc(Fmoc(2TMS))기, (2-설포-9H-플루오렌-9-일)메톡시카보닐기(Fmoc(2so3h)), [(1S)-1-(9H-플루오렌-9-일)에톡시]카보닐기(sm-Fmoc), [(1R)-1-(9H-플루오렌-9-일)에톡시]카보닐기(rm-Fmoc) 등을 들 수 있다. 이들 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 도입하기 위한 시약은, 구입할 수 있거나, 혹은 기지의 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서 「Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물」이란, 아미노기 함유 화합물이 갖는 제1급 아미노기 및/또는 제2급 아미노기의 적어도 1개가, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서 「Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노산」이란, 주쇄 및/또는 측쇄의 아미노기의 적어도 1개가, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호되어 있는, 천연 아미노산 또는 아미노산 유연체이다.
본 발명에 있어서 「Fmoc기로 보호된 아미노기 함유 화합물」이란, 아미노기 함유 화합물이 갖는 제1급 아미노기 및/또는 제2급 아미노기의 적어도 1개가, Fmoc기로 보호된 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서 「Fmoc기로 보호된 아미노산」이란, 주쇄 및/또는 측쇄의 아미노기의 적어도 1개가, Fmoc기로 보호된, 천연 아미노산 또는 아미노산 유연체이다. Fmoc기로 보호된 아미노산, Fmoc기로 보호된 천연 아미노산, Fmoc기로 보호된 아미노산 유연체를, 「Fmoc-아미노산」, 「Fmoc-천연 아미노산」, 「Fmoc-아미노산 유연체」라고 각각 말하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 이용할 수 있는 Fmoc기로 보호된 아미노산을 이하에 예시하지만, 그들로 한정되지 않는다. 이들 Fmoc기로 보호된 아미노산의 상당수는 측쇄가 보호 혹은 무보호, 아민 부위가 보호 혹은 무보호인 상태로 구입할 수 있다. 구입할 수 없는 것은, 기지의 방법에 의해 합성할 수 있다.
Figure pct00009
본 발명에 있어서 「Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 펩티드」란 상기 「Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노산」을 포함하는 펩티드를 의미한다. 이와 같은 펩티드로서, 예를 들어, 전술한 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 천연 아미노산과 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노산 유연체의 어느 것 또는 양쪽을 포함하고, 2개 이상의 아미노산을 갖고 있는 다이펩티드나 올리고펩티드를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「Fmoc기로 보호된 펩티드」란 상기 「Fmoc기로 보호된 아미노산」을 포함하는 펩티드를 의미한다. 이와 같은 펩티드로서, 예를 들어, 전술한 Fmoc기로 보호된 천연 아미노산과 Fmoc기로 보호된 아미노산 유연체의 어느 것 또는 양쪽을 포함하고, 2개 이상의 아미노산을 갖고 있는 다이펩티드나 올리고펩티드를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「알킬」이란, 지방족 탄화수소로부터 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 1가의 기이며, 골격 중에 헤테로원자(탄소 및 수소 원자 이외의 원자를 말한다.) 또는 불포화의 탄소-탄소 결합을 함유하지 않고, 수소 및 탄소 원자를 함유하는 하이드로카빌 또는 탄화수소기 구조의 부분 집합을 갖는다. 해당 알킬은 직쇄상, 또는 분지쇄상의 것을 포함한다. 알킬로서는, 탄소 원자수 1∼20(C1-C20, 이하 「Cp-Cq」란 탄소 원자수가 p∼q개인 것을 의미한다.)의 알킬이며, 바람직하게는 C1-C10 알킬, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬, C1-C4 알킬 등을 들 수 있다. 알킬로서는, 구체적으로는, 메틸, 에틸, 프로필, 뷰틸, 펜틸, 헥실, 아이소프로필, tert-뷰틸, sec-뷰틸, 1-메틸프로필, 1,1-다이메틸프로필, 2,2-다이메틸프로필, 1,2-다이메틸프로필, 1,1,2-트라이메틸프로필, 1,2,2-트라이메틸프로필, 1,1,2,2-테트라메틸프로필, 1-메틸뷰틸, 2-메틸뷰틸, 3-메틸뷰틸, 1,1-다이메틸뷰틸, 1,2-다이메틸뷰틸, 1,1-다이메틸뷰틸, 1,2-다이메틸뷰틸, 1,3-다이메틸뷰틸, 2,2-다이메틸뷰틸, 2,3-다이메틸뷰틸, 3,3-다이메틸뷰틸, 1-에틸뷰틸, 2-에틸뷰틸, 아이소펜틸, 네오펜틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「플루오로알킬」은, 상기 「알킬」의 하나 또는 복수의 수소 원자가 불소 원자로 치환된 기를 의미하고, 바람직하게는 C1-C8 플루오로알킬, C1-C6 플루오로알킬, C1-C4 플루오로알킬, C1-C2 플루오로알킬 등을 들 수 있다. 플루오로알킬로서 구체적으로는, 트라이플루오로메틸, 2,2,2-트라이플루오로에틸, 펜타플루오로에틸, 2,2,3,3-테트라플루오로프로필, 헵타플루오로프로필, 트라이플루오로메톡시, 2,2,2-트라이플루오로에톡시, 펜타플루오로에톡시, 2,2,3,3-테트라플루오로프로폭시, 헵타플루오로프로폭시, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「사이클로알킬」이란, 포화 또는 부분적으로 포화된 환상의 1가의 지방족 탄화수소기를 의미하고, 단환, 바이사이클로환, 스파이로환을 포함한다. 바람직하게는 C3-C8 사이클로알킬을 들 수 있다. 사이클로알킬은, 부분적으로 불포화여도 된다. 사이클로알킬로서는 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「사이클로알킬알킬」이란, 상기 정의 「알킬」 중의 임의의 수소 원자를, 상기 정의 「사이클로알킬」로 치환한 기를 의미한다. 사이클로알킬알킬로서는, 바람직하게는 C3-C8 사이클로알킬C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬C1-C4 알킬 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로필메틸, 사이클로프로필에틸, 사이클로뷰틸메틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아릴」이란, 1가의 방향족 탄화수소환을 의미하고, 바람직하게는 C6-C10 아릴을 들 수 있다. 아릴로서는 구체적으로는, 예를 들어, 페닐, 나프틸(예를 들어, 1-나프틸, 2-나프틸) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「헤테로아릴」이란, 환을 구성하는 원자 중(본 명세서에 있어서 「환내」라고도 한다.)에 바람직하게는 1∼4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족성의 환의 1가의 기를 의미하고, 부분적으로 포화되어 있어도 된다. 환은 단환, 또는 2개의 축합환(예를 들어, 벤젠 또는 단환 헤테로아릴과 축합된 2환식 헤테로아릴)이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 바람직하게는 5∼10이다(5∼10원환 헤테로아릴). 헤테로아릴로서는 구체적으로는, 예를 들어, 퓨릴, 싸이엔일, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 싸이아졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피리다진일, 피라진일, 벤조퓨란일, 벤조싸이엔일, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아르알킬(아릴알킬)」이란, 아릴과 알킬을 모두 포함하는 기이며, 예를 들어, 상기 알킬의 적어도 1개의 수소 원자가 아릴로 치환된 기를 의미하고, 바람직하게는, 「C6-C10 아릴C1-C6 알킬」을 들 수 있다. 예를 들어, 벤질, 페네틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알켄일」이란, 적어도 1개의 이중 결합(2개의 인접 sp2 탄소 원자)을 갖는 1가의 기이다. 이중 결합 및 치환분(존재하는 경우)의 배치에 의해, 이중 결합의 기하학적 형태는, 엔트게겐(E) 또는 주잠멘(Z), 시스 또는 트랜스 배치를 취할 수 있다. 알켄일로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 것을 들 수 있고, 내부 올레핀을 포함하는 직쇄 등을 포함한다. 바람직하게는 C2-C10 알켄일, 더 바람직하게는 C2-C6 알켄일을 들 수 있다. 이와 같은 알켄일은, 구체적으로는, 예를 들어, 바이닐, 알릴, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일(시스, 트랜스를 포함한다), 3-뷰텐일, 펜텐일, 헥센일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알킨일」이란, 적어도 1개의 삼중 결합(2개의 인접 SP 탄소 원자)을 갖는, 1가의 기이다. 직쇄상 또는 분지쇄상의 알킨일을 들 수 있고, 내부 알킬렌을 포함한다. 바람직하게는 C2-C10 알킨일, 더 바람직하게는 C2-C6 알킨일을 들 수 있다. 알킨일로서는 구체적으로는, 예를 들어, 에틴일, 1-프로핀일, 프로파르길, 3-뷰틴일, 펜틴일, 헥신일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알콕시」는, 상기 정의의 「알킬」이 결합한 옥시기인 것을 의미하고, 예를 들어, 탄소 원자수 1∼20(C1-C20)의 알콕시를 들 수 있다. 알콕시로서, 구체적으로는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 1-프로폭시, 2-프로폭시, n-뷰톡시, i-뷰톡시, sec-뷰톡시, tert-뷰톡시, (3,7,11,15-테트라메틸헥사데실)옥시 등을 들 수 있다.
할로젠으로서는, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「설포」는, -SO3H로 표시되는 기이다.
본 명세서에 있어서의 「트라이메틸실릴」은 -Si(CH3)3 또는 TMS로 표시되는 기이다.
어느 태양에 있어서, 제 1 용액에는 함량을 산출하고 싶은 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(제 1 Fmoc 화합물)을 포함하는 조생성물, 용매, 염기가 포함된다. 제 1 용액에는 내표준 물질이 포함되어 있어도 된다. 제 1 용액에서는, Fmoc 골격을 갖는 보호기를 탈보호하는 반응이 일어난다. 고상법에 의해 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 펩티드를 합성하는 경우, 탈보호 공정에 앞서, 고상 합성용 수지에 담지된 펩티드 화합물을 수지로부터 절출하여, 상기 펩티드를 얻는 공정을 본 발명의 방법에 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 제 1 용액을 「시료 용액」이라고 하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 탈보호 반응 전의 시료 용액을 “미반응” 시료 용액이라고 하는 경우가 있고, 이 용어와 함께 이용하는 경우, “시료 용액”이란 용어는 탈보호 반응 후의 용액을 의미하는 경우가 있다. 제 1 용액에 있어서 탈보호 반응은, 정량적으로 진행되는 것이 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 제 2 용액에는, 표품으로서 이용되는 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(제 2 Fmoc 화합물), 용매, 및 염기가 포함된다. 제 2 용액에는 내표준 물질이 포함되어 있어도 된다. 제 2 Fmoc 화합물은, 그 정확한 함량을 파악할 수 있는 것이면 한정되지 않고, 예를 들어, 순도 및/또는 함량이 100% 혹은 100%에 가까운 것이 이용된다. 제 2 Fmoc 화합물로서 구체적으로는, 수많은 벤더로부터 판매되고 있는, 아미노기가 Fmoc기로 보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 제 1 용액과 같이, 제 2 용액에서도, Fmoc 골격을 갖는 보호기를 탈보호하는 반응이 일어난다. 본 명세서에서는, 제 2 용액을 「표준 용액」이라고 하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 탈보호 반응 전의 표준 용액을 “미반응” 표준 용액이라고 하는 경우가 있고, 이 용어와 함께 이용하는 경우, “표준 용액”이란 용어는 탈보호 반응 후의 용액을 의미하는 경우가 있다. 제 2 용액에 있어서 탈보호 반응은, 정량적으로 진행되는 것이 바람직하다.
제 1 용액, 및/또는 제 2 용액에는, 분석 시료 및 표품으로서 이용하는 제 2 Fmoc 화합물이 용해되는 임의의 용매를 이용할 수 있고, 예를 들어, 아세토나이트릴, DMF, DMA, NMP, DMSO 등의 비양성자성 극성 용매를 바람직하게 이용할 수 있다. 제 1 용액 및/또는 제 2 용액에 이용하는 용매는, 동일해도 상이해도 되지만, 동일한 용매를 이용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 「제거」 및 「탈보호」란, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 제1급 아미노기 및/또는 제2급 아미노기를 해당 보호기에 의해 보호되어 있지 않은 상태로 하는 것을 말한다.
어느 태양에 있어서, Fmoc 골격을 갖는 보호기는, 고상 반응에 의해서도, 액상 반응에 의해서도 제거할 수 있고, 액상 반응이 바람직하다. 또한, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물은, 고상에 담지되어 있어도, 고상에 담지되어 있지 않아도 되고, 고상에 담지되어 있지 않은 것이 바람직하다.
어느 태양에 있어서, Fmoc 골격을 갖는 보호기는, 염기 존재하, 0℃∼용매 비점 부근의 온도에서, 바람직하게는 0℃∼80℃의 온도에서, 더 바람직하게는 0∼50℃의 온도에서, 반응 혼합물을 1분∼5일간 교반 및/또는 정치하는 것에 의해 제거할 수 있다. 본 반응에는, 제거 반응에 관여하지 않는 내표준 물질을 가해도 되고, 가하지 않아도 된다.
어느 태양에 있어서, Fmoc 골격을 갖는 보호기의 제거에는, 보호기를 제거할 수 있는 임의의 염기를 이용할 수 있다. 이와 같은 염기로서는, 유기 염기 또는 무기 염기를 들 수 있고, 유기 염기가 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 유기 염기로서는, 1,8-다이아자바이사이클로〔5.4.0〕-7-운데센(DBU), 2,3,6,7-테트라하이드로-1H,5H-9-아자벤조[ij]퀴놀리진, 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥테인(DABCO), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]-5-노넨, 7-메틸-1,5,7-트리아자바이사이클로[4.4.0]데카-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 1,8-비스(테트라메틸구아니디노)나프탈렌, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 1-메틸피리딘, N,N＇-다이메틸피페라진, N-메틸모폴린, N-에틸모폴린, p-다이메틸아미노피리딘 등의 3급 아민을 포함하는 염기를 들 수 있고, 이들에 더하여 그 밖에, 피리딘, 모폴린, 다이사이클로헥실아민, p-다이메틸아미노피리딘, 다이아이소프로필에틸아민, 피리딘, 피페라진, 테트라뷰틸암모늄 플루오라이드 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 중에서는, 3급 아민을 1개 또는 복수 포함하고, 1급 및 2급 아민을 포함하지 않는 유기 염기가 바람직하고, 1,8-다이아자바이사이클로〔5.4.0〕-7-운데센(DBU)이 보다 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 본 발명에서는, Fmoc 골격을 갖는 보호기를 완전히 제거할 수 있는 임의의 등량의 염기를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 용액 중 0.1∼20v/v%, 바람직하게는 1∼10v/v%, 더 바람직하게는 1∼4v/v%의 염기를 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「다이벤조풀벤 또는 그의 유도체」란, Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거했을 때에 생성되는, 하기 식(2):
Figure pct00010
(식 중, R1∼R10은, 식(1)로 표시되는 Fmoc 골격을 갖는 보호기의 R1∼R10과 각각 동의이다.)로 표시되는 화합물을 의미한다. R1∼R10이 모두 수소인 하기 식(3):
Figure pct00011
으로 표시되는 화합물이 「다이벤조풀벤」이다.
어느 태양에 있어서, 본 발명에서는, 제 1 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량과 제 2 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 대비하는 것에 의해, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)을 산출할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 제 1 용액 중 및/또는 제 2 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체는, 크로마토그래프법에 의해 제 1 용액 중 및/또는 제 2 용액 중의 다른 성분으로부터 분리할 수 있고, 동법에 의해 그 함량을 정량할 수 있다.
크로마토그래프법은, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물, 아미노기 함유 화합물(탈보호체), 다이벤조풀벤(DBF) 또는 그의 유도체, 및 내표준 물질을 분리할 수 있는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 크로마토그래프법으로서는, 예를 들어, 액체 크로마토그래프법, 초임계 유체 크로마토그래프법, 가스 크로마토그래피법, 박층 크로마토그래프법, 친수성 상호작용 크로마토그래프법(HILIC), 이온 교환 크로마토그래프법(IEX), 사이즈 배제 크로마토그래프법(SEC) 등의 크로마토그래프법, 전기 영동법, 이온 이동도 분광법(예, 이온 유동성) 등을 들 수 있고, 액체 크로마토그래프법, 가스 크로마토그래피법, 전기 영동법, 또는 이온 이동도 분광법이 바람직하다. 또한, 액체 크로마토그래프법으로서는, 고속 액체 크로마토그래프법(HPLC), 초고속고분리 액체 크로마토그래프법(UPLC)이 바람직하다. 이들 방법은, 공지일 수 있다.
순상 액체 크로마토그래프법은, 예를 들어, 실리카, 알루미나 등의 고정상, 및 헥세인, 아세트산 에틸, 염화 메틸렌, 아이소프로필 알코올, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란 및 이들의 혼합 용매 등의 이동상을 이용하여, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다.
역상 액체 크로마토그래프법은, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 역상 액체 크로마토그래프의 고정상으로서는, 예를 들어, 소수성 화합물로 수식된 충전제, 구체적으로는, 예를 들어 소수성 화합물로 수식된 실리카 겔을 이용할 수 있다. 역상 액체 크로마토그래프법의 이동상으로서는, 예를 들어, 유기 용매, 수용액 및 이들의 혼합 용매를 이용할 수 있다. 유기 용매로서는, 예를 들어, 아세토나이트릴, 메탄올, 에탄올, 아이소프로필 알코올 등을 들 수 있다. 유기 용매에는, 폼산, 트라이플루오로아세트산, 아세트산 등의 산이 포함되어 있어도 된다. 수용액으로서는, 예를 들어, 물, 폼산 수용액, 폼산 암모늄 수용액, 트라이플루오로아세트산 수용액, 아세트산 수용액, 아세트산 암모늄 수용액, 중탄산 암모늄 수용액, 암모니아수, 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 알킬설폰산 나트륨 및 그의 염이나, 테트라알킬암모늄 또는 트라이알킬아민 및 그의 염 등의 이온 페어 시약을 용매에 추가해도 된다. 이것에 의해 피크 분리가 나쁜 경우, 분석 컬럼의 분리능을 향상시킬 수 있다. 액체 크로마토그래프법에 있어서, 이동상을 혼합 용매로 하는 경우, 혼합비를 단계적으로 변화시켜도 되고, 연속적으로 변화시켜도 된다. 액체 크로마토그래프법의 온도 조건, 이동상 유량은, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체, 내표준 물질의 성질 등에 응해 따라서 적절히 설정될 수 있다.
Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물, 다이벤조풀벤(DBF) 또는 그의 유도체, 및 내표준 물질의 동정 및 정량에는, 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로서는, 예를 들어, 자외 가시광 흡수 검출기, 다이오드 어레이 검출기(PDA), 형광 검출기, 시차 굴절률 검출기, 증발 광산란 검출기, 하전화 입자 검출기(CAD), 질량 분석계 등을 이용하는 방법을 들 수 있다. 고감도 또한 고선택적 검출의 관점에서, 자외 가시광 흡수 검출기를 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법을 포함하는 분리 정량 방법은, 액체 크로마토그래피(LC)와 자외 가시광 흡수 검출기를 조합한 LC-UV, LC-PDA 등을 이용하여 행하는 것이 보다 바람직하다.
제 1 용액(시료 용액) 또는 제 2 용액(표준 용액) 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체는, 그 피크 면적을 상기 크로마토그래프법에 의해 측정하여, 정량할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 내표준(내부 표준)에 기초하여, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율을 보정할 수 있다. 즉, 제 1 용액(시료 용액), 및 제 2 용액(표준 용액)의, 크로마토그래프로의 주입량을 보정하기 위한 내표준으로서, 내표준 물질을 이들 용액에 포함시키는 것에 의해, 제 1 및 제 2 Fmoc 화합물을 보다 정확하게 정량할 수 있다. 내표준에 기초하는 보정은, 예를 들어, 제 1 용액(시료 용액) 및/또는 제 2 용액(표준 용액)의 조제 시에 내표준 물질을 가하여 정치하고, 보호기의 제거 후에 생성되는 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 정량 결과(실측치)에 내표준 물질의 함량을 가미하는 것에 의해 실시된다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, 제 1 용액 중에 포함되는 내표준 물질(제 1 내표준 물질이라고 하는 경우가 있다)의 함량과, 제 2 용액 중에 포함되는 내표준 물질(제 2 내표준 물질이라고 하는 경우가 있다)의 함량을 대비하는 것에 의해, 함유율을 보정할 수 있다. 내표준 물질을 가하는 타이밍은, 제 1 용액(시료 용액) 및/또는 제 2 용액(표준 용액)의 조제 시로 한정되지 않고, 보호기의 제거 후여도 된다.
내표준 물질은, 크로마토그래프법에 의해 다이벤조풀벤(DBF) 또는 그의 유도체와 분리할 수 있으면, 임의의 물질을 이용할 수 있다. 이와 같은 내표준 물질로서는, 예를 들어, 시판의 것을 이용할 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 안트라센, 페난트렌, 나프탈렌, 벤젠, 톨루엔, 트라이페닐렌, 나프타센 등을 들 수 있고, 이들 중에서는 안트라센이 바람직하다.
제 1 용액(시료 용액) 또는 제 2 용액(표준 용액) 중의 내표준 물질의 함량은, 그 피크 면적을 크로마토그래프법에 의해 측정하는 것에 의해, 정량할 수 있다. 내표준 물질의 피크 면적은, 다이벤조풀벤(DBF) 또는 그의 유도체의 피크 면적과 동일한 측정 조건하에서 측정하는 것이 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)은,
1) 제 1 용액(시료 용액)과 제 2 용액(표준 용액)의, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적(AT 및 AS)과,
2) 제 1 용액(시료 용액) 중의, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 조생성물의 농도(CT) 및 제 2 용액(표준 용액) 중의 제 2 Fmoc 화합물의 농도(Cs)를 이용하여, 이하의 계산식으로부터 산출할 수 있다.
Figure pct00012
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이다.)
구체적으로는, CT는, 조생성물의 칭량치와 제 1 Fmoc 화합물의 분자량에 기초하여 산출할 수 있다.
또한, 제 1 Fmoc 화합물이 고상법에 의해 합성된 Fmoc-펩티드인 경우에는, 고상 합성용 수지에 담지된 Fmoc 펩티드 화합물을 제 1 Fmoc 화합물이라고 간주하여, CT를 구할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 고상 합성용 수지에 담지된 Fmoc 펩티드 화합물의 칭량치, 및 Fmoc 펩티드의 분자량에 기초하여 CT를 산출할 수 있다.
또한, 어느 태양에 있어서, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)은, 내표준 물질에 의한 보정을 행하는 경우에는, 제 1 용액(시료 용액) 및 제 2 용액(표준 용액)의, 내표준 물질의 피크 면적(IST 및 ISS)을 추가로 이용하여, 이하의 계산식으로부터 산출할 수 있다.
Figure pct00013
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
ISS는, 제 2 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
IST는, 제 1 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이다.)
어느 태양에 있어서, 조생성물의 Fmoc 순도에 의해, 상기 함유율을 보정할 수 있다. 여기에서 「Fmoc 순도」란, 조생성물에 포함되는 모든 종류의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물의 함량의 합계에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함량의 비율(%)이다. 본 보정을 실시하는 것에 의해, 조생성물(분석 시료) 중의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물 이외의, Fmoc 골격을 갖는 보호기를 갖는 화합물(불순물)에 의한, 오차를 해소하여, 함유율을 보다 정확하게 산출할 수 있다.
구체적으로는, Fmoc 순도는, (i) 제 1 Fmoc 화합물의 피크 면적과, (ii) 조생성물 중의 제 1 Fmoc 화합물 이외의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물(다른 Fmoc 화합물, 혹은 Fmoc 관련 불순물이라고 하는 경우가 있다)의 각 피크 면적에 기초하여 산출할 수 있다. 조생성물 중에 Fmoc 관련 불순물이 복수 존재하는 경우에는, 검출 가능한 모든 Fmoc 관련 불순물의 피크 면적을 Fmoc 순도의 산출에 이용하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 예를 들어, Fmoc 순도는,
(i) 크로마토그래프법으로 제 1 Fmoc 화합물 및 Fmoc 관련 불순물에 대응하는 피크를 동정하는 것
(ii) 제 1 Fmoc 화합물 및 Fmoc 관련 불순물의 피크 면적을 구하고 그 값을 합산하는 것, 및
(iii) 제 1 Fmoc 화합물의 피크 면적을, (ii)에서 구한 합산치로 나누는 것에 의해 구할 수 있다.
Fmoc 관련 불순물의 피크인지 여부는, 크로마토그래프 분석의 UV 크로마토그램(254nm)으로부터 Fmoc 골격을 갖는 보호기의 유무를 판단함으로써 동정할 수 있다.
고상법에 의해 제 1 Fmoc 화합물(예를 들어, Fmoc 펩티드)을 제조하는 경우에는, 고상 합성용 수지로부터의 제 1 Fmoc 화합물의 절출에 이용한 용액(절출 용액)을 이용하여, 제 1 Fmoc 화합물 및 Fmoc 관련 불순물의 피크 면적을 구하는 것을 통해서, Fmoc 순도를 구해도 된다.
다이벤조풀벤 또는 그의 유도체나 내표준 물질의 정량과 동일한 측정 조건에서 제 1 Fmoc 화합물 및 Fmoc 관련 불순물의 피크 면적을 측정하는 것을 통해서, Fmoc 순도를 구함으로써, 오차가 적은, 정확한 함유율의 산출이 가능해진다. 어느 태양에 있어서, 순도를 구하는 데 이용하는 측정 기기 및 측정 조건과, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 정량에 이용하는 측정 기기 및 측정 조건을 동일하게 함으로써, 보다 오차가 적은, 정확한 함유율의 산출이 가능해진다.
Fmoc 순도에 의한 보정을 행하는 경우, 함유율은, 예를 들어 이하의 계산식에 의해 구할 수 있다.
(내표준 물질에 의한 보정이 없는 경우)
Figure pct00014
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
PS는, Fmoc 순도이다.)
(내표준 물질에 의한 보정이 있는 경우)
Figure pct00015
(식 중,
Cs는, 제 2 Fmoc 화합물의 몰농도이고,
CT는, 조생성물이 제 1 Fmoc 화합물만으로 이루어진다고 가정했을 경우의 해당 조생성물의 몰농도이고,
ISS는, 제 2 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
IST는, 제 1 용액의 내표준 물질의 피크 면적이고,
AS는, 제 2 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
AT는, 제 1 용액의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적이고,
PS는, Fmoc 순도이다.)
어느 태양에 있어서, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 분해를 막기 위해서, 산을 이용할 수 있다. 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 분해 억제(안정화)는, 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체와 산을 접촉시키는 것에 의해 달성된다. 산으로서는, 바람직하게는 유기산, 무기산을 들 수 있고, 유기산, 무기산 및 이들의 조합이 이용된다.
산을 가하는 경우, 산은 Fmoc 골격을 갖는 보호기의 제거 후에 분석 시료(예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 용액)에 가할 수 있다. 다이벤조풀벤의 분해를 막기 위해서, 제거 후 신속히 산을 가하는 것이 바람직하다. 산의 양은, 표준 용액 혹은 시료 용액이 중성보다 산성에 치우쳐 있으면, 임의의 양을 이용할 수 있고, 예를 들어, 보호기의 제거를 위해서 가한 염기와 동일하거나, 그보다 많은 등량의 산을 가함으로써 이것을 달성할 수 있다. 산은 그대로 분석 시료에 가해도 되고, 유기 용매 등에 용해시키고 나서 분석 시료에 가해도 된다.
유기산으로서는, 시트르산, 옥살산, 말레산, 황산수소 테트라메틸암모늄, 폼산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 모노플루오로아세트산, 다이플루오로아세트산, 트라이클로로아세트산, 모노클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 또는 이들의 조합이 이용되고, 시트르산이 바람직하게 이용된다.
무기산으로서는, 인산, 붕산, 염산, 질산, 황산, 브로민화 수소산, 포스폰산, 또는 이들의 조합이 이용되고, 인산이 바람직하게 이용된다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 탈보호 후의 아미노기 함유 화합물을 정량하는 것에 의해, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물을 정량하는 방법에 관한 것이다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물로부터 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 제거하고, 그것에 의해 생성된 아미노기 함유 화합물을 정량하는 방법에 관한 것이다.
어느 태양에 있어서, 상기 방법은, 크로마토그래프법에 의해 다른 성분으로부터 아미노기 함유 화합물을 분리하고, 그 피크 면적을 측정함으로써, 그 함량을 정량할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 아미노기 함유 화합물의 크로마토그래프법에 의한 분리에는, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물, 다이벤조풀벤(DBF) 또는 그의 유도체 및 아미노기 함유 화합물을 분리할 수 있는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 크로마토그래프법으로서, 예를 들어, 액체 크로마토그래프법, 초임계 유체 크로마토그래프법, 가스 크로마토그래피법, 박층 크로마토그래프법, 친수성 상호작용 크로마토그래프법(HILIC), 이온 교환 크로마토그래프법(IEX), 사이즈 배제 크로마토그래프법(SEC) 등의 크로마토그래프법, 전기 영동법, 이온 이동도 분광법(예, 이온 유동성)를 들 수 있고, 친수성 상호작용 크로마토그래프법(HILIC)이 바람직하다. 이들 방법은, 공지일 수 있다.
아미노기 함유 화합물의 동정 및 정량 수법에는, 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로서는, 예를 들어, 자외 가시광 흡수 검출기, 다이오드 어레이 검출기, 형광 검출기, 시차 굴절률 검출기, 증발 광산란 검출기, 하전화 입자 검출기(CAD), 질량 분석계 등을 이용하는 방법을 들 수 있고, 자외 가시광 가시광 파장에 흡수를 가지지 않아도 검출할 수 있는 하전화 입자 검출기(CAD) 및/또는 질량 분석계를 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법을 포함하는 분리 정량 방법은, 친수성 상호작용 크로마토그래프법(HILIC)과 하전화 입자 검출기(CAD)를 조합한 HILIC-CAD 등을 이용하여 행하는 것이 보다 바람직하다.
제 1 용액(시료 용액) 또는 제 2 용액(표준 용액)의 아미노기 함유 화합물의 함량은, 상기 크로마토그래프법에 의해 얻어진 아미노기 함유 화합물의 피크 면적을 측정하는 것에 의해, 정량할 수 있다.
한편, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 원용할 수 있다.
실시예
이하에, 실시예로 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명의 내용은 반드시 이하의 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에 기재하는 정량에 있어서, 이하의 Fmoc-아미노산을 이용했다.
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-cLeu-OH, Fmoc-NMe-Gly-OH, Fmoc-NMe-Ala-OH, Fmoc-NMe-Leu-OH, Fmoc-NMe-Val-OH, Fmoc-NMe-Cha-OH, Fmoc-Aze-OH. 이들은 와타나베 화학공업 등의 원재료 메이커로부터 구입했다. 특별히 언급하지 않으면, 동일한 Fmoc-아미노산이어도 원재료 메이커의 차이나 로트 차이도 포함된다.
실시예 1 (Fmoc-아미노산의 DBF에 의한 정량-1)
표준 용액의 조제
Fmoc-Gly-OH(약 10mg)를 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하여, 아세토나이트릴(20mL)에 용해시켜 조제한 Fmoc-Gly-OH 용액(500ug/mL의 농도로 Fmoc-Gly-OH를 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(250ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하고, Fmoc-Gly-OH를 100ug/mL의 농도로, 안트라센을 50ug/mL의 농도로, DBU를 4v/v%의 농도로 각각 포함하는 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 표준 용액」이라고 하고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「표준 용액」이라고 하는 경우가 있다. 한편, 표준 용액의 조제에 이용한 Fmoc-Gly-OH(순도 99.8%, 수분 함량 0.10% 미만)는 와타나베 화학공업으로부터 구입했다.
시료 용액의 조제
정량 대상의 Fmoc-아미노산을 포함하는 조 Fmoc-아미노산(약 10mg)을 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 아세토나이트릴(20mL)에 용해시켜 조제한 조 Fmoc-아미노산 용액(500ug/mL의 농도로 조 Fmoc-아미노산을 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(250ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, 조 Fmoc-아미노산을 100ug/mL의 농도로, 안트라센을 50ug/mL의 농도로, DBU를 4v/v%의 농도로 각각 포함하는, 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 시료 용액」이라고 하는 경우가 있고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「시료 용액」이라고 하는 경우가 있다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-TUV
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(2.1 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.3mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 1에 나타낸다
Figure pct00016
표준 용액의 크로마토그램을 도 1에, 각 시료 용액의 크로마토그램을 도 2∼도 7에 나타낸다.
또한, 이하의 수식을 이용하여 Fmoc-Gly-OH에 대한 각 Fmoc-아미노산의 함유율(w/w%)을 산출할 수 있다. 그 결과를 표 2(안트라센에 의한 주입량의 보정 없음)와 표 3(안트라센에 의한 주입량의 보정 있음)에 나타낸다.
산출식(안트라센에 의한 주입량의 보정이 없는 경우)
Figure pct00017
Cs: 미반응 표준 용액 중의 Fmoc-Gly-OH의 농도 (umol/L)
CT: 각 미반응 시료 용액 중의 각 조 Fmoc-아미노산의 농도 (umol/L)
AS: 표준 용액의 DBF 피크 면적
AT: 각 시료 용액의 DBF 피크 면적
산출식(안트라센에 의한 주입량의 보정이 있는 경우)
Figure pct00018
Cs: 미반응 표준 용액 중의 Fmoc-Gly-OH의 농도 (umol/L)
CT: 각 미반응 시료 용액 중의 각 조 Fmoc-아미노산의 농도 (umol/L)
ISS: 표준 용액의 안트라센 피크 면적
IST: 각 시료 용액의 안트라센 피크 면적
AS: 표준 용액의 DBF 피크 면적
AT: 각 시료 용액의 DBF 피크 면적
Figure pct00019
Figure pct00020
상기의 결과, Fmoc-Ile-OH나 Fmoc-NMe-Leu-OH와 같이, 함유율이 거의 100%인 Fmoc-아미노산이 있는 한편, 함유율이 100%에 미치지 않는 Fmoc-아미노산도 있음을 알 수 있었다. 함유율이 100%에 미치지 않는 Fmoc-아미노산은, 수분이나 무기염, 잔류 용매 등 UV로는 검출할 수 없는 불순물이 포함되어 있는 것으로 생각된다. 또한, 내부 표준 물질의 피크 면적으로 보정함으로써, 표준 용액과 각 시료 용액의 주입량에 차이가 생겼을 때에도 정량적으로 산출 가능하다.
실시예 2 (Fmoc-아미노산의 DBF에 의한 정량-2)
표준 용액의 조제
Fmoc-Gly-OH(약 10mg)를 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 아세토나이트릴(10mL)에 용해시켜 조제한 Fmoc-Gly-OH 용액(1mg/mL의 농도로 Fmoc-Gly-OH를 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(500ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, Fmoc-Gly-OH를 100ug/mL의 농도로, 안트라센을 50ug/mL의 농도로, DBU를 4v/v%의 농도로 각각 포함하는 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 표준 용액」이라고 하는 경우가 있고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「표준 용액」이라고 하는 경우가 있다. 한편, 표준 용액의 조제에 이용한 Fmoc-Gly-OH는 와타나베 화학공업(순도 99.8%, 수분 함량 0.10%미만)으로부터 구입했다.
시료 용액의 조제
정량 대상의 Fmoc-아미노산을 포함하는 조 Fmoc-아미노산(약 10mg)을 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 아세토나이트릴(10mL)에 용해시켜 조제한 조 Fmoc-아미노산 용액(1mg/mL의 농도로 조 Fmoc-아미노산을 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(500ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, 조 Fmoc-아미노산을 100ug/mL의 농도로, 안트라센을 50ug/mL의 농도로, DBU를 4v/v%의 농도로 각각 포함하는, 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 시료 용액」이라고 하는 경우가 있고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「시료 용액」이라고 하는 경우가 있다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-TUV
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(3.0 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.6mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 4에 나타낸다
Figure pct00021
표준 용액의 크로마토그램을 도 8에, 각 시료 용액의 크로마토그램을 도 9∼도 11에 나타낸다.
또한, 실시예 1에 기재된 수식을 이용하여 Fmoc-Gly-OH에 대한 각 Fmoc-아미노산의 함유율(w/w%)을 산출할 수 있다. 그 결과를 표 5(안트라센에 의한 주입량의 보정 없음)와 표 6(안트라센에 의한 주입량의 보정 있음)에 나타낸다.
Figure pct00022
Figure pct00023
상기의 결과, 상기 3종의 Fmoc-아미노산의 함유율은 거의 100%였다. 또한, 안트라센에 의한 주입량의 보정의 유무에 의해, 함유율은 대부분 변함 없었으므로, 본 실시예에 있어서는 표준 용액과 각 시료 용액의 주입량에 차는 없었음이 추측된다.
실시예 3(Fmoc-아미노산의 순도로 보정한 함량 분석)
시료 용액의 조제
1mg/mL 조 Fmoc-아미노산 용액을 희석하여 시료 용액(100ug/mL의 농도로 조 Fmoc-아미노산을 포함하는 아세토나이트릴 용액)으로 했다. 한편, 시료 용액에 이용한 각종의 조 Fmoc-아미노산은, 와타나베 화학공업으로부터 구입했다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-TUV
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(3.0 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.6mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 7에 나타낸다
Figure pct00024
도 12∼도 20에 나타내는 바와 같이, 실시예 2의 크로마토그램과의 비교로부터, DBU 처리에 의해 소실된 Fmoc-아미노산의 피크를 확인할 수 있다. 본 피크는 Fmoc기를 갖는 화합물 유래의 피크로서 생각되고, 이들의 피크만을 적분하여 산출한 각 Fmoc-아미노산의 순도를 표 8에 나타낸다. 이들의 순도와 안트라센에 의한 주입량으로 보정하여, 함유율을 산출할 수 있다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
산출식
Figure pct00025
DBF assaysample: 순도에 의한 보정 전의 각 Fmoc-아미노산의 함유율
PS: Fmoc기를 갖는 화합물 중의 각 Fmoc-아미노산 순도
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 4 (DBF의 안정성의 검토)
시료 용액의 조제
Fmoc-Gly-OH를 표 10에 나타내는 각 용매에 용해하여, 시료 용액(100ug/mL의 농도로 Fmoc-Gly-OH를 포함한다)을 조제했다. 또한, 시료 용액을 10℃에서 보관하여 분석을 실시했다.
Figure pct00028
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-PDA
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(2.1 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.3mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 11에 나타낸다
Figure pct00029
초일의 시료 용액 중의, 및 1일, 2일, 5일의 각 기간 보관한 후의 시료 용액 중의 DBF와 그 분해물의 각 피크 면적의 비율을 표 12에 나타낸다. 또한, 초일의 시료 용액 중, 및 5일간 보관한 후의 시료 용액 중의 DBF의 피크 면적을 비교(5일간 보관/초일)한 결과를 표 13에 나타낸다. 이로부터, 시트르산으로 처리함으로써 DBF의 분해를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
Figure pct00030
주) DBF-Pip는 이하의 구조이다.
Figure pct00031
주) DBF 분해물은 이하의 구조이다.
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 5 (정량 NMR과의 비교)
본 발명에 의한 정량법(DBF assay)의 타당성을 평가하기 위해, 다양한 조 Fmoc-아미노산에 대해, DBU로 처리하여 생긴 DBF를, 실시예 1 또는 2와 마찬가지로 정량하여(내표준 물질에 의한 보정 없음, 및 순도에 의한 보정 있음), 상기 조 Fmoc-아미노산의 정량 NMR에 의한 정량치와 비교했다. 한편, 표준 용액의 조제에 이용하는 표품의 아미노산으로서, Fmoc-Ile-OH(정량 NMR로 함유율 99.18%)를 이용했다. 도 21과 표 14에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 의한 정량치와 정량 NMR에 의한 정량치의 사이에는 상관계수 0.95라고 하는 양호한 양의 상관 관계가 인정되어, 본 발명의 타당성이 뒷받침되었다.
분석 장치 및 시약은 이하와 같다.
(분석 장치)
NMR: JEOL 500MHz Royal HFX Probe
시약: Fmoc-아미노산
Solvent: DMSO-d6
Standard: 3,5-bis(trifluoromethyl)-benzoic acid (99.96%±0.06%, 정량 NMR용 시약)
Figure pct00034
qNMR과의 상관으로부터, 본 정량법이 qNMR과 마찬가지로, 유효한 정량법임이 나타났다.
실시예 6 (Fmoc-아미노산의 DBU 처리 후의 아미노산 정량)
DBU로 Fmoc-아미노산을 탈보호했을 때에, DBF와 아미노산이 생긴다. 실시예 1∼4에서는 DBF를 정량하고 있지만, 본 실시예에서는 아미노산을 정량했다. DBU로 Fmoc-NMe-Gly-OH를 탈보호하여 생긴 H-NMe-Gly-OH의 피크 면적과, 내표준 물질로서 H-NMe-Gly-OH를 이용한 아미노산 표준 용액의 피크 면적을 비교한 결과, 탈보호에 의해 생긴 H-NMeGly-OH를 97.2%의 수율로 얻었다(도 22∼24). 이것에 의해, DBU 첨가에 의한 탈보호 반응은 정량적으로 진행되고 있음이 뒷받침되었다.
한편, 본 실시예에서는, 친수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC)로 측정을 실시하고 있고, 소수성이 높은 화합물(예를 들어 DBF)의 피크가 빠른 용출 위치에, 친수성이 높은 화합물(예를 들어 아미노산)의 피크가 느린 용출 위치에 나오고 있다. 또한, H-NMe-Gly-OH는 자외 가시광 파장에 흡수를 거의 갖지 않기 때문에, CAD로 검출하고 있다.
아미노산 표준 용액의 조제
H-NMeGly-OH(N-메틸글리신)를 100ug/mL의 농도로 포함하는 용액을 조제했다. H-NMe-Gly-OH(순도 99.7%(비수법))는 도쿄 화성공업으로부터 구입했다.
시료 용액의 조제
Fmoc-NMeGly-OH에 2% DBU 용액(2v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액)을 첨가 후, CH3CN/H2O(4:1)로 희석하여, 시료 용액(Fmoc-아미노산을 300ug/mL의 농도로 포함하는 용액)을 조제했다. Fmoc-MeGly-OH는 원재료 메이커로부터 구입했다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: 1200 series (Agilent)
· 자외 가시광 흡수 검출기: Agilemt 1200 MWD
· 펌프: Agilent 1200 Binary pump-1, -2
· 오토샘플러: Agilent 1200 Auto sampler
(분석 조건)
컬럼: Imtakt Intrada Amino Acid(3 x 100mm, 3um)
이동상 A: 0.1% 폼산 / 아세토나이트릴
이동상 B: 100 mM 폼산 암모늄 / 물
유속: 1.0mL/min
컬럼 온도: 35℃
샘플 주입량: 2 uL
검출기: Charged Aerosol Detector (CAD) (Corona ULTRA)
그래디언트 조건: 표 15에 나타낸다
Figure pct00035
본 조건과는 별도로 역그래디언트 설정을 실시하여, 검출기에는 항상 A:B=50:50으로 도입되도록 했다.
역그래디언트 조건: 표 16에 나타낸다
Figure pct00036
실시예 7 (Fmoc-펩티드의 DBF에 의한 정량)
표준 용액의 조제
Fmoc-Gly-OH(약 10mg)를 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 아세토나이트릴(20mL)에 용해시켜 조제한 Fmoc-Gly-OH 용액(500ug/mL의 농도로 Fmoc-Gly-OH를 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(250ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, Fmoc-Gly-OH를 50ug/mL의 농도로, 안트라센을 25ug/mL의 농도로, DBU를 2v/v%의 농도로 각각 포함하는 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 표준 용액」이라고 하고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「표준 용액」이라고 하는 경우가 있다. 한편, 표준 용액의 조제에 이용한 Fmoc-Gly-OH(순도 98.6%)는 도쿄 화성공업으로부터 구입했다.
시료 용액의 조제-1
정량 대상의 조 Fmoc-Phe-Phe-OH(약 10mg)를 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 아세토나이트릴(20mL)에 용해시켜 조제한 조 Fmoc-Phe-Phe-OH 용액(500ug/mL의 농도로 Fmoc-Phe-Phe-OH를 포함하는 아세토나이트릴 용액)에, 내부 표준 용액(250ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, 조 Fmoc-Phe-Phe-OH를 50ug/mL의 농도로, 안트라센을 25ug/mL의 농도로, DBU를 2v/v%의 농도로 각각 포함하는, 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 용액의 조제에 이용한 조 Fmoc-Phe-Phe-OH(순도 99.8%)는 와타나베 화학공업사로부터 구입했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 시료 용액」이라고 하는 경우가 있고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「시료 용액」이라고 하는 경우가 있다.
시료 용액의 조제-2(고상 반응으로 합성하여 수지에 담지된 조 Fmoc-펩티드 화합물)
정량 대상의, 고상 반응으로 합성하여 수지에 담지된 조 Fmoc-펩티드 화합물(이하, 간단히 「수지에 담지된 조 Fmoc-펩티드 화합물」이라고 하는 경우가 있다)(약 30mg)을 일본 약국방에 따라 정밀하게 칭량하고, 다이클로로메테인(3mL)을 가하고 15분 이상 정치하여, 팽윤시켰다. 한편, 본 실시예 및 실시예 8에서는, 고상 합성용 수지로서 CTC 수지를 이용했다. 다이클로로메테인을 배출한 후, 수지를 다이클로로메테인(3mL)으로 2번 세정했다. 수지에 TFA 용액(1v/v%의 농도로 TFA를 포함하는 다이클로로메테인 용액)을 0.6mL 가하고 실온에서 진탕하여, 수지로부터의 조 Fmoc-펩티드의 절출을 행했다. 이것에, 내부 표준 용액(250ug/mL의 농도로 안트라센을 포함하는 아세토나이트릴 용액), DBU 용액(10v/v%의 농도로 DBU를 포함하는 아세토나이트릴 용액), 및 아세토나이트릴을 첨가하여, 수지에 담지된 조 Fmoc-펩티드 화합물로서 조 Fmoc-펩티드를 1mg/mL의 농도로, 안트라센을 25ug/mL의 농도로, DBU를 2v/v%의 농도로 각각 포함하는, 조 Fmoc-펩티드를 포함하는 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 그 다음에, 해당 용액을 볼텍스로 교반한 후, 실온에서 10분 이상 정치하여 Fmoc기를 탈보호했다. HPLC로 취득한 UV 크로마토그램에 의해 탈보호 반응이 정량적으로 진행된 것을 확인했다. 본 실시예에 있어서, 탈보호 반응 개시 전의 상기 용액을 「미반응 시료 용액」이라고 하는 경우가 있고, 탈보호 반응 후의 상기 용액을 간단히 「시료 용액」이라고 하는 경우가 있다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-TUV
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(2.1 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.3mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 17에 나타낸다
Figure pct00037
표준 용액의 크로마토그램을 도 25에, 각 시료 용액의 크로마토그램을 도 26∼도 29에 나타낸다.
또한, 이하의 수식을 이용하여 Fmoc-Gly-OH에 대한 각 Fmoc-펩티드의 함유율(w/w%)을 산출할 수 있다. 그 결과를 표 18(안트라센에 의한 주입량의 보정 없음)과 표 19(안트라센에 의한 주입량의 보정 있음)에 나타낸다. 한편, 시료 용액에 포함되는 Fmoc-펩티드의 분자량은, 말단에 카복실기를 갖는 카복실산체로서 산출하고 있다.
산출식(안트라센에 의한 주입량의 보정이 없는 경우)
Figure pct00038
Cs: 미반응 표준 용액 중의 Fmoc-Gly-OH의 농도 (umol/L)
CT: 각 미반응 시료 용액 중의 각 조 Fmoc-펩티드의 농도 (umol/L)
AS: 표준 용액의 DBF 피크 면적
AT: 각 시료 용액의 DBF 피크 면적
산출식(안트라센에 의한 주입량의 보정이 있는 경우)
Figure pct00039
Cs: 미반응 표준 용액 중의 Fmoc-Gly-OH의 농도 (umol/L)
CT: 각 미반응 시료 용액 중의 각 조 Fmoc-펩티드의 농도 (umol/L)
ISS: 표준 용액의 안트라센 피크 면적
IST: 각 시료 용액의 안트라센 피크 면적
AS: 표준 용액의 DBF 피크 면적
AT: 각 시료 용액의 DBF 피크 면적
Figure pct00040
Figure pct00041
실시예 8(Fmoc-펩티드의 순도로 보정한 함량 분석)
시료 용액의 조제-1
500ug/mL의 조 Fmoc-Phe-Phe-OH 용액을 희석하여 시료 용액(50ug/mL의 농도로 조 Fmoc-Phe-Phe-OH를 포함하는 아세토나이트릴 용액)으로 했다.
시료 용액의 조제-2
실시예 7의 「시료 용액의 조제-2」와 마찬가지로, 수지에 담지된 조 Fmoc-펩티드 화합물로서 조 Fmoc-펩티드를 1mg/mL의 농도로 포함하도록 절출 용액을 아세토나이트릴로 희석하여, 시료 용액으로 했다.
분석 장치 및 분석 조건은 이하와 같다.
(분석 장치)
HPLC 시스템: H-class (Waters)
· 자외 가시광 흡수 검출기: ACQ-TUV
· 펌프: ACQ-QSM
· 오토샘플러: ACQ-FTN
(분석 조건)
컬럼: 오사카 소다 CAPCELL CORE ADME(2.1 x 150mm, 2.7um)
이동상 A: 0.05% TFA / 물
이동상 B: 0.05% TFA / 아세토나이트릴
유속: 0.3mL/min
컬럼 온도: 40℃
샘플 주입량: 2 uL
측정 파장: 254nm
그래디언트 조건: 표 20에 나타낸다
Figure pct00042
각 시료 용액에 대해 총 Fmoc 화합물에 대한 조 Fmoc-펩티드의 순도를 각각 산출했다. 그 결과를 표 21에 나타낸다. 산출한 순도와 안트라센에 의한 보정을 행하여, Fmoc-펩티드의 함유율을 산출했다. 그 결과를 표 22에 나타낸다. 측정한 샘플의 보관 중에 메틸에스터체가 생긴 샘플에 관해서는, 메틸에스터체도 목적으로 하는 Fmoc-펩티드라고 하여 순도를 산출했다.
산출식
Figure pct00043
DBF assaysample: 순도에 의한 보정 전의 각 Fmoc-펩티드의 함유율
PS: Fmoc기를 갖는 화합물 중의 각 Fmoc-펩티드 순도
Figure pct00044
Figure pct00045
상기의 결과, 본 발명에 의한 정량법은, Fmoc-펩티드의 함량 분석, 및 고상 반응으로 합성하여 수지에 담지된 Fmoc-펩티드 화합물로부터의 Fmoc-펩티드의 함량 분석에도 이용 가능함이 나타났다.
본 발명은, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 신규한 정량 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의해, 분석 시료 중에 포함되는 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물의 함량을, 고정밀도로 간편하게 정량하는 것이 가능해진다.

Claims (14)

  1. 조생성물 중에 포함되는, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 아미노기 함유 화합물(이하, 제 1 Fmoc 화합물이라고 한다)의 함량을 정량하는 방법으로서,
    용액(이하, 제 1 용액이라고 한다) 중, 제 1 Fmoc 화합물로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    용액(이하, 제 2 용액이라고 한다) 중, 표품으로서 이용하는 Fmoc 골격을 갖는 보호기를 갖는 아미노기 함유 화합물(이하, 제 2 Fmoc 화합물이라고 한다)로부터 보호기를 염기로 탈보호하고, 그것에 의해 생성된 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는 것을 추가로 포함하고,
    제 1 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량과 제 2 용액 중의 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 대비하는 것에 의해, 제 2 Fmoc 화합물에 대한, 제 1 Fmoc 화합물의 함유율(중량%)을 산출하는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    제 1 용액 및 제 2 용액에 있어서, 탈보호 반응이 정량적으로 진행되는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 피크 면적을 측정하는 것에 의해, 다이벤조풀벤 또는 그의 유도체의 함량을 정량하는, 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조생성물의 Fmoc 순도에 의해, 함유율을 보정하는 것을 추가로 포함하고,
    여기에서 「Fmoc 순도」란, 조생성물에 포함되는 모든 종류의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물의 함량의 합계에 대한 제 1 Fmoc 화합물의 함량의 비율인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    (i) 제 1 Fmoc 화합물의 피크 면적과 (ii) 조생성물 중의 제 1 Fmoc 화합물 이외의 Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된 화합물의 각 피크 면적에 기초하여, Fmoc 순도를 산출하는, 방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내표준 물질에 의해, 함유율을 보정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제 1 용액 중에 포함되는 내표준 물질(이하, 제 1 내표준 물질이라고 한다)의 함량과, 제 2 용액 중에 포함되는 내표준 물질(이하, 제 2 내표준 물질이라고 한다)의 함량을 대비하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제 1 내표준 물질의 피크 면적과 제 2 내표준 물질의 피크 면적을 측정하는 것에 의해, 제 1 및 제 2 내표준 물질의 함량을 각각 정량하는, 방법.
  10. 제 4 항, 제 6 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 피크 면적을 크로마토그래프법에 의해 측정하는, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    각 피크 면적을 동일한 측정 조건에서 측정하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fmoc 골격을 갖는 보호기가 하기 식(1):
    Figure pct00046

    (식 중,
    R1∼R8은, 독립적으로, 수소, C1-C8 알킬, C1-C8 플루오로알킬, 할로젠, 설포, 및 트라이메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    R9∼R10은, 독립적으로, 수소, 또는 메틸이다.)
    로 표시되는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 Fmoc 화합물 및/또는 제 2 Fmoc 화합물이, Fmoc 골격을 갖는 보호기로 보호된, 아미노산, 펩티드, 또는 저분자 유기 화합물인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기가 유기 염기인, 방법.
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