TWI510276B - 一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化方法 - Google Patents

一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI510276B
TWI510276B TW101117321A TW101117321A TWI510276B TW I510276 B TWI510276 B TW I510276B TW 101117321 A TW101117321 A TW 101117321A TW 101117321 A TW101117321 A TW 101117321A TW I510276 B TWI510276 B TW I510276B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
column
solvent
compound
difference
solubility parameter
Prior art date
Application number
TW101117321A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201249520A (en
Original Assignee
Univ Nat Central
Scinopharm Taiwan Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Nat Central, Scinopharm Taiwan Ltd filed Critical Univ Nat Central
Publication of TW201249520A publication Critical patent/TW201249520A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI510276B publication Critical patent/TWI510276B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析 純化胜肽程序之最佳化方法
本申請案主張自2011年5月20日所申請之美國臨時專利申請號61/488,387、以及自2012年2月17日所申請之美國臨時專利申請號61/600,004之優先權。此二件美國臨時專利申請案之全部內容係併入本文參考。
本申請係關於一種經由層析技術自混合物辨識、定量或純化化合物之方法，特別是關於胜肽化合物的膠體式層析純化。
高效能液相層析法(HPLC)係廣泛地應用於分析各種不同的化學物質。大多數的純化流程係依理解溶質與溶劑的物化性質而定。目前已研究出數種方式，例如Snyder氏有名的P氏規模及來自Eckert的MOSCED規模。然而，大多數的模型僅對某些化學品的子集有效。分子反應的複雜度導致更複雜的模型，例如線性溶合作用能量關係式(LSER)及定量結構滯留關係式(QSRRs)。儘管如此，這些方式未能預料胜肽的滯留，特別是序列混洗胜肽集(sequence shuffled peptide sets)，胜肽鏡像異構物及非鏡像異構物。
因此，有了將層析純化改善之需求。
本發明之一態樣係為一種透過負載管柱吸附劑之層析管柱自混合物辨識、定量或純化化合物之方法。此方法包含：施加混合物至層析管柱； 以沖提溶劑組成物沖提混合物；以及收集化合物；其中至少一管柱吸附劑及沖提溶劑組成物係基於化合物、管柱吸附劑、沖提溶劑的溶解度參數及化合物的結構能之一做選擇。
根據本發明之一實施例，至少一管柱吸附劑及沖提溶劑組成物係基於下列步驟做選擇：a)辨識由化合物及雜質所組成之關鍵分子配對；b)1.若介於關鍵分子配對之間的差異為實質的，b.1.a)選擇至少一管柱吸附劑及沖提溶劑組成物，致使R△ 係實質地遠離1，其中R△ 係定義如下：
其中，(△δ)2 API-L 為化合物(API)與樹脂(L)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 API-S 為API與沖提溶劑(S)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 I-L 為雜質(I)及樹脂之間總溶解度參數差值的平方；以及(△δ)2 I-S 為雜質(I及沖提溶劑之間總溶解度參數差值的平方；b.1.b)分離化合物；b.1.c)若一基線分離未在步驟b.1.b)達成，持續選擇至少一管柱吸附劑及沖提溶劑組成物，致使R△ 大於1.05或小於0.95；2.若介於關鍵分子配對的結構差異為非實質的，b.2.a)選擇沖提溶劑組成物，致使關鍵分子配對之間的溶液結構能量差大於0.2 kcal/mole； b.2.b)分離化合物；以及b.3.c)若基線分離未在步驟b.2.b)達成，則持續選擇沖提溶劑組成物，致使關鍵分子配對之間的溶液結構能量差大於0.2 kcal/mole。
純化的化合物可為胜肽。
管柱吸附劑可為樹脂。
如一較佳實施例，管柱吸附劑係基於溶解度參數中的分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )做選擇。
根據另一較佳實施例，沖提溶劑組成物係選自調整溶解度中的參數分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )。
結構能可由分子動力模擬獲得。
層析管柱較佳為逆向層析管柱。
可執行如上所討論的步驟b.1.a)及b.1.b)，致使R△ 大於2或小於0.7，更佳為大於5或小於0.5。
可執行如上所討論的步驟b.2.a)及b.2.c)，致使關鍵分子配對之間的溶液結構能量差大於20 kcal/mole，更佳大於40 kcal/mole。
特徵化本發明的各種不同新穎特徵係特別地於後附的申請專利範圍中指出，且成為本發明揭示的一部分。為了更易理解本發明，其操作上的優點及具體目的透過其應用所達成，參考文獻應具備有繪示及敘述本發明較佳實施例的記述性內容。
定義
後述之定義係用於與本發明某些實施例相關的某些元件。這些定義可同樣地於本文中延伸。
如本文所使用，術語「溶解度參數」指的是用以預測 是否一材料將溶解於另一材料且形成溶液之指數。
如本文所使用，術語「溶解度參數之分散度(δd )」指的是來自分子之間分散力的能量。
如本文所使用，術語「溶解度參數之極性(δp )」指的是來自分子之間之分子間偶極作用力的能量。
如本文所使用，術語「溶解度參數之氫鍵(δh )」指的是來自分子之間氫鍵的能量。
如本文所使用，術語「分子動力(MD)模擬」指的是原子及分子的物理移動的電腦模擬。內隱溶劑(implicit solvent)分子動力模擬指的是未加入任何溶劑(例如：水分子及ACN分子等)的模擬系統。
如本文所使用，術語「沖提溶劑」指的是於移動相的溶劑。
如本文所使用，術語「固體相」指的是於管柱中的吸附劑，例如：膠體或樹脂。
如本文所使用，術語「層析」指的是廣泛地用於分析各種不同的化學物質。其為用於分離混合物的一套實驗室技術的集合名詞。混合物溶於稱為「移動相」的流體中，該「移動相」攜帶著混合物通過填充的樹脂(固定相)。混合物的各種不同成分於管柱中以不同的速度行進，故導致它們分離。此分離係基於移動相與固定相之間的差式分配(differential partitioning)而定。化合物之分配係數的微小差異導致於固定相的差式滯留(differential retention)，因此改變此分離。
如本文所使用，術語「滯留係數」敘述管柱內分析物的遷移率，其以下列方程式所定義：
其中t R 及t 0 係分別表示在RPC管柱中胜肽以及非滯留分子(non-retained molecule)的滯留時間。
如本文所使用，術語「基線分離」指的是多重成分的分離，例如具有彼此不重疊的成分波峰的二元或三元成分。
如本文所使用，R△ 係以下列所定義：
其中，(△δ)2 API-L 為化合物(API)與樹脂(L)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 API-S 為API與沖提溶劑(S)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 I-L 為雜質(I)及樹脂之間總溶解度參數差值的平方；以及(△δ)2 I-S 為I及沖提溶劑之間總溶解度參數差值的平方。
該領域具備通常知識者將可逐步理解R△ 係顯著地、實質地或自1遠離。舉例來說，R△ 可大於1.05，較佳大於2，且更佳大於5，或小於0.95，較佳小於0.7，且更佳小於0.5。
如本文所使用，術語「溶液結構能」指的是溶質於其所溶解的溶劑中的總結構能。此能量為鍵結、角度、二面角、氫鍵、凡得瓦(VDW)及靜電能量之總和。
如本文所使用，術語「關鍵分子配對」指的是所純化(例如：API)的化合物及具有類似化學結構或物理特性的雜質，例如：疏水性及電荷分佈。關鍵分子配對於相同的層析條件下係大多以相同的沖提時間來沖提(於層析圖譜中的成分波峰為重疊的)。
根據本發明，該領域具備通常知識者將能基於本發明的精神及範圍及任何可獲得的裝置，例如CD光譜，來決定當關鍵分子配對之間的結構差異為實質的。舉例來說，當 關鍵分子配對(例如：API及雜質)之間從200nm至250nm的差式CD光譜值(△θ)在從0至5000(cm2 mol-1 度)的範圍內時，關鍵分子配對之間的結構差異則視為非實質的。當差式CD光譜值(△θ)超過5000 cm2 mol-1 度時，關鍵分子配對之間的結構差異則視為實質的。
如本文所使用，術語「樣品溶劑」指的是用來溶解樣品的溶劑。
於生物層析分離中，適當地選擇沖提溶劑、樣品溶劑及樹脂以獲得高純度的活性醫藥成分(API)，特別是胜肽藥則是關鍵的。本發明強調重要的條件，即為如何理性地選擇沖提溶劑、樣品溶劑組成物及管柱樹脂，以透過逆相層析(RPC)來最佳化純化過程。API及雜質的滯留行為由疏水性樹脂及沖提溶劑之間的作用差異決定。大多數的研究通常利用疏水性指數以預測API及雜質的滯留。然而，溶解度參數透過劃分成三個能量(也就是極性、分散度及氫鍵)來提供詳細的分子/原子作用。基於這點考量，本發明可精確地選擇溶劑及樹脂，以控制API及雜質的滯留以最佳化適當的分離情況。然而，在API及其非鏡像異構物的分離方面，因為它們具有相同的溶解度參數，所以並無法直接藉由溶解度參數之估算進行分離程序之最佳化。因此，本發明將結構資訊應用於如何解決胜肽非鏡像異構物的層析分離問題，即使是針對鏡像異構物。分子動力(MD)模擬可提供API及其非鏡像異構物的結構資訊。於溶液中胜肽的結構能的順序可用來預測於RPC的滯留順序。本發明證明於溶液中胜肽非鏡像異構物的結構能可充分地預測API及其鏡像異構物於RPC的滯留行為。透過計算胜肽、樹脂、溶劑組成物的溶解度參數及胜肽於沖提溶劑中結構能，本發明提出透過RPC用於API及其雜質的有效分離程序。
本發明提出API及雜質，甚至是非鏡像異構物/鏡像異構物的雜質的最佳化純化方法之流程(第一圖及第二圖)。如第一圖所示，溶質、管柱及溶劑的溶解度之差異被挑選為操作溶質的沖提行為。樹脂及溶劑的溶解度參數亦可透過實驗測定或Hensen表所獲得。以藉由逆相層析而分離的API(成分A)及雜質(成分B)為例，A與B之沖提條件起始於低沖提強度溶劑至高沖提強度溶劑。一開始，△δA-R (δcomponent A -δresin )大於△δA-m (δcomponent A -δmobile phase 0 )且△δB-R (δcomponent B -δresin )大於△δB-m (δcomponent B -δmobile phase 0 )。若溶解度參數△δA-R 等於△δA-m (δcomponent A -δmobile phase 1 )，成分A可由沖提溶劑1沖提。然後，B成分可由增加的沖提溶劑2沖提，且同時溶解度參數△δB-R 等於△δB-m (δcomponent B -δmobile phase 2 )。
如第二圖所示，API的溶解度參數可透過官能基貢獻法(group contribution method)(Hoy軟體或Hensen表)計算或透過實驗測量來決定。管柱的溶解度參數亦可由實驗測定獲得。除此之外，不同的移動相組成物的溶解度參數可透過混合的規則來計算。接著，分析管柱係用於以適合的樹脂及沖提溶劑來預先分離API及雜質，該適合的樹脂及沖提溶劑係基於溶解度參數理論。詳細說來，分離及純化流程可分為三部分。
第一，雜質應特徵化且於預先分離步驟發現關鍵分子配對。API及雜質應透過MS-MS或NMR辨識以確定一些API及雜質。測定API及雜質的CD光譜以獲得結構資訊，該結構資訊於第二圖中為重要的檢驗點，特別是當雜質為包含序列定位異構物、非鏡像異構物及鏡像異構物的異構物。
由於關鍵分子配對之間的結構差異是實質的，相對分離指數(R△)係直接地用於選擇適當的溶劑，其係基於API- 樹脂與API-溶劑之間的溶解度差值與雜質-樹脂與雜質-溶劑之間的溶解度差值的比例。若所選擇的溶劑組成物使R△接近1，溶劑組成物應改變以使R△遠離1，接著使用此溶劑組成物以確認關鍵分子配對是否與基線分離隔開。如果無法實行，則嘗試透過R△遠離1的標準選擇另一溶劑或樹脂。
另一方面，我們為利用分子模擬計算關鍵分子配對的溶液結構能，其用於無實質結構差集的關鍵分子配對。本發明證明了關鍵分子配對的較大溶液結構能差會使關鍵分子配對充分地分離。因此，應選出適當的溶劑組成物以達到API及雜質之間的較大能差。在此，溶劑組成物係透過介電常數來測定。然而，於介電介質中，關鍵分子配對的結構能可輕易地獲得。若介電介質中關鍵分子配對的能差太小，另一介電介質就應改變。此標準係基於相同的沖提強度和不同的介電介質而定。因為若沖提強度改變，沖提行為即可能改變。相同的沖提強度就像55% ACN/H2 O的強度與32%THF的強度相同，但不同的介電常數則導致在介電介質中溶質的結構不同。如上所述，必須透過適當的介電介質來確認是否關鍵分子配對為基線分離。
最終，若最佳狀態可調整成在分析管柱中的關鍵分子配對分離，API可被大規模地純化。基於第二圖，本發明成功地達到於RPC運作中關鍵分子配對之基線分離。
實施例
三個依森泰德(Exenatide)非鏡像異構物係透過11th 、32nd 及39th 絲胺酸殘基設計，係各自地與單一胺基酸外消旋作用成右旋(D-form)。為了理解依森泰德及其非鏡像異構物於RPC中的結構-滯留關係，胜肽的溶液結構資訊係透過 CD光譜決定，且MD模擬及滯留行為係透過具有等位沖提的RP-HPLC來監控。胜肽的溶液結構穩定度係經由計算溶液結構能量的協助而獲得，胜肽的溶液結構穩定度的計算係由內隱溶劑(implicit solvent)MD模擬所協助。基於結構-滯留關係，係檢測透過RPC最佳化分離胜肽非鏡像異構物的合理策略。
實施例1 依森泰德及其非鏡像異構物於水相的CD光譜
依森泰德及其非鏡像異構物於水溶液中的二級結構係透過CD光譜儀監控。第三圖(A)顯示這些胜肽於包含0.1%TFA的0%ACN/H2 O中的光譜。所有的胜肽顯示由α螺旋結構所導致在222nm產生一特性負波峰。由於外消旋作用是在依森泰德的尾端，右旋絲胺酸39所替換的結構幾乎與原生的依森泰德相同。相對地，由於靠近胜肽中央的右旋突變，其破壞螺旋性之故，胜肽右旋絲胺酸11及右旋絲胺酸32的螺旋性係低於依森泰德的螺旋性。另一方面，依森泰德胜肽及其非鏡像異構物於包含0.1%TFA的36%ACN/H2 O溶液中的CD光譜顯示於第三圖(B)。於36%ACN/H2 O溶液中，所有胜肽的螺旋結構幾乎全部不摺疊，且可觀察到所有右旋非鏡像異構物的結構差異。
實施例2 依森泰德及其非鏡像異構物於RP-HPLC的滯留行為
依森泰德及其非鏡像異構物於RPC管柱中的滯留行為係於25℃下利用包含0.1%TFA的36%ACN/H2 O的等位沖提來檢測。如第四圖所示，這些胜肽的滯留順序為右旋絲胺酸32>依森泰德之右旋絲胺酸39，且右旋絲胺酸11滯留 性較差。明顯地，依森泰德及右旋絲胺酸39在此層析運作條件下形成關鍵分子配對。事實上，根據以殘基為基準(residue-based)的疏水性級別，這些胜肽非鏡像異構物具有相同的疏水性，但滯留因子是不同的。除此之外，係研究樣品溶劑於關鍵分子配對的滯留行為所造成的效應。依森泰德及右旋絲胺酸39係溶解於含有0.1%TFA的0%ACN/H2 O中，且這些胜肽的滯留行為於C18管柱中係由36%ACN/H2 O進行等位沖提。層析圖譜於第五圖顯示。此結果顯示當樣品溶劑由36%ACN/H2 O改變為0%ACN/H2 O時，依森泰德及右旋絲胺酸39的波峰係稍微地分離。於此案例中，介於胜肽及疏水性配位體之間的吸附係視為平衡狀態。若樣品溶劑與沖提溶劑不同，介於胜肽及疏水性樹脂之間的起始關聯性則受影響。因此，樣品溶劑效應似乎會影響胜肽的滯留行為，且促進依森泰德及右旋絲胺酸39的關鍵分子配對分離。
實施例3 依森泰德及其非鏡像異構物於水溶液中的MD模擬
進行內隱溶劑MD模擬以決定溶液結構及溶液結構能。各模型系統係以1ns執行。根據均方根偏差2 Å以內，於36%ACN/H2 O的所有胜肽結構係視為至少0.2ns內達平衡。於運作RPC的條件，溶劑通常含有0.1%TFA以消除溶質與疏水性樹脂之間的靜電力。所有的胜肽係由帶電的胺基酸所構成，係於各模擬系統質子化。因此，依森泰德的溶液結構可與NMR所解的結構不同。第六圖(A)及(B)顯示依森泰德及其非鏡像異構物在1ns分別於0及36%ACN/H2 O的快照。如我們所預期，依森泰德的模擬結構於0%ACN/H2 O係與NMR所解的結構不同。且依森泰德的螺旋結構係於36%ACN/H2 O溶液中明顯地被破壞。此係與CD光譜一致。以右旋所替代的胜肽而言，亦觀察到類似的結果，其為結構形變係伴隨著ACN於溶液中濃度的增加而發生。再者，計算依森泰德及其非鏡像異構物之溶液結構能。透過與滯留因子(第四圖)的比較，可發現的是最具滯留性的右旋絲胺酸32胜肽，在36%ACN/H2 O胜肽的模擬系統中擁有最高溶液結構能。此外，這些胜肽非鏡像異構物之滯留順序係與溶液結構能的順序相同。此外，亦進行二胜肽非鏡像異構物中的滯留性較差之胜肽(LALA-R-ELEELN,R=L-Arg)及滯留性較佳之胜肽(LALA-r-ELEELN,r=D-Arg)的MD模擬。沖提溶劑之組成分係基於自Winter et al.(Journal of Separation Science ,2009 ,32,1111)的層析圖。右旋精胺酸及左旋精胺酸胜肽的溶液結構能係分別為138.99及135.75 kcal/mol。能量計算亦與滯留行為的預測吻合。因此，胜肽非鏡像異構物的溶液結構能確實可應用於滯留行為之預測。
再者，係發現依森泰德及右旋絲胺酸39可透過樣品溶劑改變自36%至0%ACN/H2 O而輕微地分離。於是，依森泰德及右旋絲胺酸39的MD模擬於0%ACN/H2 O係進行以計算溶液結構能。結果顯示依森泰德及右旋絲胺酸39的溶液結構能係分別為415.75及412.91 kcal/mol。比較使用0%ACN/H2 O為樣品溶劑的依森泰德及右旋絲胺酸39的滯留行為，發現依森泰德於0%ACN/H2 O樣品溶劑具有較大的溶液結構能，其導致較長的滯留時間。相對地，具有較低溶液結構能的右旋絲胺酸39滯留性較差。另一方面，這些胜肽於0%ACN/H2 O的溶液結構能差係大於這些胜肽於36%ACN/H2 O的溶液結構能差，此導致些微的分離。有趣的是，在36%ACN/H2 O樣品溶劑中依森泰德的溶液結構能係大於在0%ACN/H2 O樣品溶劑中依森泰德的溶液結構能，右旋絲胺酸39胜肽的行為亦是如此。此係發現在36%ACN/H2 O樣品溶劑中此二胜肽的滯留時間大於在0%ACN/H2 O樣品溶劑中此二胜肽的滯留時間。基於我們提出的結構-滯留關係，這些結果係對應於在RPC中的滯留行為。因此，則推論出調整樣品溶劑，其貢獻以擴大溶液結構變化的差異，會促進非鏡像異構物分離。同時，其可應用於沖提溶劑變化。再者，於0%及36%ACN/H2 O樣品溶劑中的溶液結構能差太小以致於無法達到基線分離。因此，更進一步的方式係透過調整沖提溶劑之組成物來進行。
實施例4 透過調整沖提溶劑達到關鍵分子配對分離
依森泰德及右旋絲胺酸39的關鍵分子配對係由模擬預測及層析圖譜兩者所觀察。即使改變樣品溶劑，關鍵分子配對仍然存在。因此，我們嘗試改變沖提溶劑以調整此關 鍵分子配對的溶液結構差異。在我們選出適合的溶劑以分離關鍵分子配對之前，我們透過利用介電常數55.75進行MD模擬計算出溶液結構能，該介電常數55.75係對應於大約55%ACN/H2 O溶液及32%THF/H2 O混合溶液。然而，此關鍵分子配對於55%ACN/H2 O溶液之間的溶液結構能差為2.98kcal/mol，其大於在0%ACN/H2 O的溶液結構能差。不幸地，關鍵分子配對透過55%ACN/H2 O沖提時並不會滯留。因此，我們打算尋找介電常數等於55%ACN/H2 O的其他溶劑，但沖提強度係低於55%ACN/H2 O。溶劑組成物之一係為32%THF/H2 O。於32%THF/H2 O中依森泰德的CD光譜係與於55%ACN/H2 O中依森泰德的CD光譜相同，右旋絲胺酸39胜肽的CD光譜亦是如此。因此，我們假設32%THF/H2 O中依森泰德的結構能與55%ACN/H2 O中依森泰德的結構能相同。類似地，32%THF/H2 O中右旋絲胺酸39的結構能量係與55%ACN/H2 O中右旋絲胺酸39的結構能量相同。於我們的案例中，結構的穩定性係與溶劑的介電常數有關，且並不強烈地受到溶劑種類影響。第八圖顯示依森泰德及右旋絲胺酸39的層析圖譜；結果顯示此關鍵分子配對可在32%THF/H2 O混合溶液下充分地分離。結果，依森泰德及右旋絲胺酸39於RPC的基線分離係透過調整沖提溶劑而成功地達成。
實施例5 用於胜肽非鏡像異構物分離的結構穩定性-滯留關係
由不適合的純化條件所產生的關鍵分子配對分離在胜肽藥物的製造是值得注意的。RPC係依據其單純的運作及較高的解析度廣泛地應用於生物分離。所提出的合理策略透過層析分離胜肽鏡像異構物對於醫藥產業是重要且必須 的。於臨床應用，胜肽藥物的純度需求係高如99.5%或更高。為了達到此需求，於分析及甚至是製備規模獲得最佳的層析條件是必須的。
第七圖顯示胜肽非鏡像異構物的結構彈性及滯留行為之間的關係。從MD模擬分析及滯留因子測量來看，具有較高溶液結構能的胜肽非鏡像異構物會展示較大的滯留因子。相對地，具有較低溶液結構能的胜肽非鏡像異構物會展示較小的滯留因子。因此，可建議的是溶液結構的穩定性在滯留行為方面是關鍵性的。如先前文獻所敘述，由於不利的焓(enthalpy)損失，具有堅固結構(小的溶液結構能)的胜肽無法在疏水性樹脂上容易地變形。相對地，相較於堅固結構的胜肽，具有小的結構穩定性的彈性胜肽(大的溶液結構能)，會較有利於在疏水性表面上吸附(The Journal of Physical chemistry.B ,2010 ,114,11620)。胜肽結構彈性的角色於本發明的胜肽鏡像異構物滯留預測證明與先前文獻的定位性胜肽異構物滯留預測一致：較有彈性的胜肽較能滯留於C18樹脂中。再者，溶液結構能差亦有助於RPC進行關鍵分子配對分離。調整樣品溶劑或具有較大溶液結構能差之沖提溶劑會導致關鍵分子配對之基線分離。
實施例6 關鍵分子配對分離最佳化
基於結構穩定性-滯留關係的檢測，其首先應於不同水溶液中透過MD模擬溶液結構穩定性，獲得關鍵分子配對的溶液結構穩定性差異。接著，基於溶液結構穩定性差異選擇適合的樣品溶劑及沖提溶劑。進行依森泰德及右旋絲胺酸39於0、36及55%ACN/H2 O溶液的內隱MD模擬，以獲得此關鍵分子配對的溶液結構穩定性差異。關鍵分子配 對的溶液結構能差於55%ACN/H2 O係大於關鍵分子配對的溶液結構能差於0%ACN/H2 O，接下來係大於36%ACN/H2 O。這暗示了可利用55%ACN/H2 O為適合的樣品溶劑用於關鍵分子配對分離。然而，樣品溶劑的溶劑強度實際上太強以致於胜肽無法輕易地滯留於RPC。選擇另一適合的0%ACN/H2 O樣品溶劑可使關鍵分子配對的輕微波峰分離，但關鍵分子配對仍然存在。於是，沖提溶劑係更進一步地調整。由模擬的結果來看，自溶液結構穩定性來看，55%及0%ACN/H2 O溶液可為沖提溶劑的合適候選者；然而，關鍵分子配對透過此二沖提溶劑可能是無法滯留的且無法沖提的。因此，必須改變沖提溶劑以達到關鍵分子配對的基線分離。MD模擬利用溶劑作用力(solvation force)領域以獲得於水溶液中的平衡結構。發明人假設在具有相同介電介質的不同溶劑組成物中的胜肽結構可幾乎相等。55%ACN/H2 O的介電介質係大約相當於32%THF/H2 O溶液，因此，32%THF/H2 O溶液作為沖提液及樣品溶劑用以關鍵分子配對分離。此最佳化程序促進關鍵分子配對、依森泰德及右旋絲胺酸39的基線分離。結果，結構穩定性-滯留關係實際上於RP-HPLC的胜肽分離提供了重要的含義，特別是對於異構物的雜質。
第一圖提供透過HPLC較佳純化胜肽的新策略。
第二圖提供活性醫藥成分(API)及雜質的純化過程。
第三圖提供依森泰德(Exenatide)及其非鏡像異構物於水溶液的圓二色性光譜。(A)0% ACN/H2 O及(B)36% ACN/H2 O。
第四圖提供於36% ACN/H2 O的溶液結構能量(E conf. )及依森泰德與其非鏡像異構物於RPC中的滯留係數(lnk’)。
第五圖提供依森泰德及其非鏡像異構物於RP-HPLC的層析圖譜。胜肽於25℃以包含0.1%TFA的36% ACN/H2 O沖提，流速為1mL/min。(A)樣品溶劑係與沖提溶劑相同；(B)樣品溶劑為含有0.1%TFA的0% ACN/H2 O。
第六圖提供在1 ns透過內隱溶劑MD模擬依森泰德及其非鏡像異構物之快照。顯示胜肽之溶液結構於(A)0% ACN/H2 O及(B)36% ACN/H2 O。具有右旋取代反應的絲胺酸殘基以棒狀鍵結為代表，且該胜肽以絲帶為代表。
第七圖提供結構彈性與胜肽鏡像異構物的滯留行為之間連同溶劑調整的關係。這些胜肽於沖提溶劑A中與具有細微的溶液結構能差共同沖提，且於沖提溶劑B中展示具有大的溶液結構能差的基線分離。
第八圖提供關鍵分子配對分離的層析圖譜，其透過含有1%TFA的32%THF/H2 O等位地(isocratically)沖提。
<110> 台灣神隆股份有限公司
<120> 一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化 方法
<130> 101117321
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白質
<400> 1
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白質
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白質
<400> 3
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白質
<400> 4

Claims (18)

  1. 一種透過負載一管柱吸附劑之一層析管柱自一混合物辨識、定量或純化一化合物之方法，包含：施加該混合物至該層析管柱；以一沖提溶劑組成物沖提該混合物；以及收集該化合物；其中至少一該管柱吸附劑及沖提溶劑組成物係基於該化合物、管柱吸附劑、沖提溶劑的溶解度參數及該化合物的結構能之一做選擇。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該化合物為一胜肽。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該管柱吸附劑為一樹脂。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該管柱吸附劑係基於溶解度參數中的分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )做選擇。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該沖提溶劑組成物係選自調整溶解度參數中的分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該結構能係由分子動力模擬獲得。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該層析管柱為逆向層析管柱。
  8. 一種透過負載一管柱吸附劑之一層析管柱從一混合物辨識、定量或純化一化合物之方法，，包含：施加該混合物至該層析管柱；以一沖提溶劑組成物沖提該混合物；以及收集該化合物； 其中至少一該管柱吸附劑及沖提溶劑組成物係基於下列步驟做選擇：a)辨識由該化合物及一雜質所組成之一關鍵分子配對；b)1.若介於該關鍵分子配對之間的結構差異為實質的，b.1.a)選擇至少一該管柱吸附劑及沖提溶劑組成物，致使R△ 係實質地遠離1，其中R△ 係定義如下： 其中，(△δ)2 API-L 為化合物(API)與樹脂(L)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 API-S 為API與沖提溶劑(S)之間總溶解度參數差值的平方；(△δ)2 I-L 為雜質(I)及樹脂之間總溶解度參數差值的平方；以及(△δ)2 I-S 為雜質(I)及沖提溶劑(S)之間總溶解度參數差值的平方；b.1.b)分離該化合物；b.1.c)若一基線分離未在步驟b.1.b)達成，持續選擇至少一該管柱吸附劑及沖提溶劑組成物，致使R△ 大於1.05或小於0.95；2.若介於該關鍵分子配對的結構差異為非實質的，b.2.a)選擇該沖提溶劑組成物，致使該關鍵分子配對之間的溶液結構能差大於0.2 kcal/mole；b.2.b)分離該化合物；以及b.3.c)若一基線分離未在步驟b.2.b)達成，則持續選擇該沖提溶劑組成物，致使該關鍵分子配對之間的溶液結構能差大於0.2 kcal/mole。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該管柱吸附劑係基於溶解度參數中的分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )做選擇。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該沖提溶劑組成物係選自調整溶解度參數中的分散度(δd )、極性(δp )及氫鍵(δh )。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該結構能係由分子動力模擬獲得。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該層析管柱為逆向層析管柱。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該管柱吸附劑為樹脂。
  14. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該化合物為一胜肽。
  15. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中執行步驟b.1.a及b.1.c，致使R△ 大於2或小於0.7。
  16. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中執行步驟b.1.a及b.1.c，致使R△ 大於5或小於0.5。
  17. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中執行步驟b.2.a及b.2.c，致使該關鍵分子配對之間的該溶液結構能差大於20 kcal/mole。
  18. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中執行步驟b.2.a)及b.2.c)，致使該關鍵分子配對之間的該溶液結構能差大於40 kcal/mole。
TW101117321A 2011-05-20 2012-05-16 一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化方法 TWI510276B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161488387P 2011-05-20 2011-05-20
US201261600004P 2012-02-17 2012-02-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201249520A TW201249520A (en) 2012-12-16
TWI510276B true TWI510276B (zh) 2015-12-01

Family

ID=47175409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101117321A TWI510276B (zh) 2011-05-20 2012-05-16 一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8933196B2 (zh)
TW (1) TWI510276B (zh)
WO (1) WO2012161654A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX365465B (es) 2013-03-21 2019-06-04 Sanofi Aventis Deutschland Sintesis de productos peptidicos que contienen imida ciclica.
HUE034308T2 (en) 2013-03-21 2018-02-28 Sanofi Aventis Deutschland Preparation of hydantoin-containing peptide products

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB625820A (en) * 1945-06-23 1949-07-05 Merck & Co Inc Purification of antibiatic substances
JPH01207257A (ja) * 1988-02-15 1989-08-21 Nippon Oil & Fats Co Ltd α−リノレン酸の分離法
US20060150716A1 (en) * 2004-12-15 2006-07-13 Seiko Epson Corporation Analyzing method for coloring material composition

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5076909A (en) 1988-05-14 1991-12-31 Exxon Research And Engineering Company Method for refining or upgrading hydrocarbons with analysis
JPH03227996A (ja) 1990-02-01 1991-10-08 Kao Corp アルキルグリコシドの製造方法
JP2000005598A (ja) 1998-06-25 2000-01-11 Hitachi Chem Co Ltd 疎水性吸着剤の製造法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB625820A (en) * 1945-06-23 1949-07-05 Merck & Co Inc Purification of antibiatic substances
JPH01207257A (ja) * 1988-02-15 1989-08-21 Nippon Oil & Fats Co Ltd α−リノレン酸の分離法
US20060150716A1 (en) * 2004-12-15 2006-07-13 Seiko Epson Corporation Analyzing method for coloring material composition

Also Published As

Publication number Publication date
US20120296068A1 (en) 2012-11-22
WO2012161654A1 (en) 2012-11-29
TW201249520A (en) 2012-12-16
US8933196B2 (en) 2015-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Valeja et al. Three dimensional liquid chromatography coupling ion exchange chromatography/hydrophobic interaction chromatography/reverse phase chromatography for effective protein separation in top-down proteomics
Posewitz et al. Immobilized gallium (III) affinity chromatography of phosphopeptides
Wu et al. Study on the matrix effect in the determination of selected pharmaceutical residues in seawater by solid-phase extraction and ultra-high-performance liquid chromatography–electrospray ionization low-energy collision-induced dissociation tandem mass spectrometry
Lavén et al. Serial mixed-mode cation-and anion-exchange solid-phase extraction for separation of basic, neutral and acidic pharmaceuticals in wastewater and analysis by high-performance liquid chromatography–quadrupole time-of-flight mass spectrometry
Wang et al. A highly selective dispersive liquid–liquid microextraction approach based on the unique fluorous affinity for the extraction and detection of per-and polyfluoroalkyl substances coupled with high performance liquid chromatography tandem–mass spectrometry
Josefsson et al. Sample preparation on polymeric solid phase extraction sorbents for liquid chromatographic-tandem mass spectrometric analysis of human whole blood—A study on a number of beta-agonists and beta-antagonists
Nemoto et al. High-throughput determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma by HILIC-MS/MS
Alshishani et al. Ion-pair vortex assisted liquid-liquid microextraction with back extraction coupled with high performance liquid chromatography-UV for the determination of metformin in plasma
Inoue et al. An approach to on-line electrospray mass spectrometric detection of polypeptide antibiotics of enramycin for high-speed counter-current chromatographic separation
Ilisz et al. Enantioseparation of β2-amino acids on cinchona alkaloid-based zwitterionic chiral stationary phases. Structural and temperature effects
US20110219858A1 (en) Composition for use as a peptide retention standard and a method of predicting peptide hydrophobicity in liquid chromatography
Ishikawa et al. Improved method for isolation and purification of underivatized amino acids for radiocarbon analysis
TWI510276B (zh) 一種藉由溶解度參數與溶液結構能之計算於管柱層析純化胜肽程序之最佳化方法
Haidar Ahmad et al. Introducing multifactorial peak crossover in analytical and preparative chromatography via computer-assisted modeling
JP2022510407A (ja) 多重反応同位体分子種反応モニタリングによる、サンプル内検量線を用いた分析方法
Gao et al. Evaluation of volatile ion-pair reagents for the liquid chromatography–mass spectrometry analysis of polar compounds and its application to the determination of methadone in human plasma
Long et al. Selective separation and purification of highly polar basic compounds using a silica-based strong cation exchange stationary phase
Accioni et al. Exploring polar hydrophobicity in organized media for extracting oligopeptides: application to the extraction of opiorphin in human saliva
CN106770849B (zh) 一种测定度骨化醇及其所含杂质的检测方法
WO2021075478A1 (ja) Ｆｍｏｃ骨格を有する保護基で保護されたアミノ基含有化合物の定量法
Carda-Broch et al. Use of a three-factor interpretive optimisation strategy in the development of an isocratic chromatographic procedure for the screening of diuretics in urine samples using micellar mobile phases
Liu et al. Derivatization reagent-assisted enantioseparation of 3-hydroxyaspartate with two chiral centers in rat cerebrospinal fluid by capillary electrophoresis-mass spectrometry
Birdsall et al. Reducing metal-ion mediated adsorption of acidic peptides in RPLC-based assays using hybrid silica chromatographic surfaces
Zhang et al. Separation of chiral primary amino compounds by forming a sandwiched complex in reversed-phase high performance liquid chromatography
Mant et al. An improved approach to hydrophilic interaction chromatography of peptides: Salt gradients in the presence of high isocratic acetonitrile concentrations