CN112981543B

CN112981543B - 一种具有阿尔法螺旋结构的拟抗体筛选库、其构建方法及应用

Info

Publication number: CN112981543B
Application number: CN202110230903.9A
Authority: CN
Inventors: 李永琦
Original assignee: Beijing Chuangzhi Intelligent Health Technology Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Chuangzhi Intelligent Health Technology Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN112981543A

Abstract

本发明涉及蛋白质类药物筛选系统，具体涉及一种具有阿尔法螺旋结构的拟抗体筛选库、其构建方法及应用。本发明提供用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。还提供一种RNA库，是由所述DNA库经转录反应获得。还提供一种拟抗体筛选库，是由所述RNA库经体外无细胞表达获得的RNA‑拟抗体库，或者由所述RNA‑拟抗体库经反转录获得的cDNA‑拟抗体库。还提供一种筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，该方法使用本发明的拟抗体筛选库进行筛选，可得到高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。

Description

一种具有阿尔法螺旋结构的拟抗体筛选库、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及蛋白质类药物筛选系统，具体涉及一种具有阿尔法螺旋结构的拟抗体筛选库、其构建方法及应用。

背景技术

拟抗体是一种功能与抗体类似，但结构与之没有任何关系的有机化合物，它可以与抗原特异结合，通常它是人造的肽或者蛋白质。以阿尔法螺旋结构为基础构型的拟抗体(英文文献中被命名为affibody)是一类经蛋白质工程设计合成的结合蛋白。此类型拟抗体的设计来源于金黄色葡萄球菌的A蛋白的与免疫球蛋白结合的结构域，由不含半胱氨酸的氨基酸折叠而成，含有三个阿尔法螺旋结构，大小约6.5千道尔顿(Tashiro,M.,Tejero,R.,Zimmerman,D.E.,Celda,B.,Nilsson,B.,&Montelione,G.T.(1997).High-resolutionsolution NMR structure of the Z domain of staphlococcal protein A.Journal ofMolecular Biology.)。既往研究表明，以该螺旋结构为主体的拟抗体在和靶蛋白结合时，拥有高特异性和高结合力(Frejd,F.,Kim,KT.Affibody molecules as engineeredprotein drugs.(2017).Exp Mol Med 49,e306.)。和当前广泛应用于医药领域的抗体相比，此类拟抗体拥有诸多抗体所没有的优点。比如，此类拟抗体分子远远小于抗体，更容易穿过人体组织和细胞；且此类拟抗体结构中不含有类似抗体的二硫键和糖基化结构，使得它拥有比抗体更好的热稳定性。拟抗体已成为一类可以替代抗体的用于科研、诊断、治疗等生物医药领域的蛋白质分子。

发明内容

为满足上述领域的需求，我们构建了一种可表达具有阿尔法螺旋结构的拟抗体的筛选库，基于核糖体展示技术和RNA展示技术进行拟抗体筛选，经过4至7个筛选循环可获得高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。

本发明提供一种用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。

在本发明的一些实施例中，所述多个DNA分子的5’端还包含T7噬菌体RNA聚合酶启动子序列和核糖体结合位点序列，3’端还包含用于连接嘌呤霉素连接体的链接DNA序列和终止密码子。

在本发明的一些实施例中，所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。

在本发明的一些实施例中，所述DNA库的DNA多样性为20¹³。

本发明还提供一种用于拟抗体筛选的RNA库，其特征在于：是由任一所述的DNA库经转录反应获得。

本发明还提供一种拟抗体筛选库，其特征在于：是由所述RNA库经体外无细胞表达获得的RNA-拟抗体库，或者由所述RNA-拟抗体库经反转录获得的cDNA-拟抗体库。

本发明还提供包含任一所述的DNA库或所述的RNA库或所述的拟抗体筛选库的试剂盒。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包含用于拟抗体筛选的通用试剂；所述通用试剂包括PCR试剂、DNA提取与纯化试剂、体外转录试剂、RNA提取与纯化试剂、体外无细胞表达试剂，和/或反转录试剂。所述PCR试剂包括普通PCR试剂和定量PCR试剂。PCR使用的聚合酶优选高保真DNA聚合酶，可保证长链DNA的高准确扩增。

任一所述的DNA库或所述的RNA库或所述的拟抗体筛选库或所述的试剂盒在拟抗体筛选中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种拟抗体筛选库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)合成任一所述的DNA库；

2)以所述DNA库为模板，合成RNA库；

3)将所述RNA库与嘌呤霉素连接体连接，获得嘌呤霉素连接体-RNA库；

4)以所述嘌呤霉素连接体-RNA库为模板进行体外无细胞表达，获得RNA-拟抗体库；

5)以所述RNA-拟抗体库为模板进行反转录，获得拟抗体筛选库。

在本发明的一些实施例中，步骤1)中，通过两步重叠PCR反应合成DNA库；第一步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物；第二步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物；引物中的N为A，T，G，C的等摩尔混合物，K为G，T的等摩尔混合物。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5’端修饰PO₄，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。

本发明还提供一种筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，其特征在于：使用本发明所述的拟抗体筛选库针对靶蛋白质进行拟抗体筛选。

在本发明的一些实施例中，所述方法包括如下步骤：

1)制备和纯化靶蛋白质，将靶蛋白质固定在固相载体上；

2)制备所述的RNA库；

3)将RNA库与嘌呤霉素连接体相连，获得嘌呤霉素连接体-RNA库；

4)以嘌呤霉素连接体-RNA库为模板进行体外无细胞表达，然后解离核糖体复合物，获得RNA-拟抗体库；

5)以RNA-拟抗体库为模板进行反转录，获得cDNA-拟抗体库；

6)将固定有靶蛋白质的固相载体与cDNA-拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cDNA-拟抗体，作为筛选样本；将不含靶蛋白质的固相载体与cDNA-拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cDNA-拟抗体，作为对照样本；

7)向步骤6)得到的样本中加入洗脱液，获得筛选的cDNA；

8)以筛选的cDNA为模板，转录获得RNA库，然后重复步骤3)－7)，进行下一个筛选循环；

9)以步骤5)获得的cDNA-拟抗体库为模板进行定量PCR，得到原始DNA量；以步骤7)获得的cDNA为模板进行定量PCR，得到筛选样本和对照样本的DNA量；按照样本DNA量/原始DNA量计算每个筛选循环中筛选样本和对照样本的DNA回收率；若筛选样本C_T值逐渐小于对照样本C_T值且筛选样本的DNA回收率逐渐增加且越来越大于对照样本的DNA回收率，则表明筛选样本中存在能与靶蛋白质结合的拟抗体，然后通过DNA测序确定筛选得到的拟抗体。

在本发明的一些实施例中，所述固相载体为带有标签的磁珠，并且所述靶蛋白质含有能与所述磁珠相结合的标签。

在本发明的一些实施例中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5’端修饰PO₄，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。

在本发明的一些实施例中，步骤9)中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示的引物进行定量PCR。

本发明还提供一种针对P-糖蛋白的拟抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。该拟抗体是采用本发明的方法筛选得到的。

包含所述的针对P-糖蛋白的拟抗体的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述针对P-糖蛋白的拟抗体的应用也属于本发明的保护范围。

如图1所示，本发明提供的筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，将核糖体展示技术和RNA展示技术结合起来，使用体外无细胞的蛋白质表达系统表达预先设计和合成的蛋白质类药物(拟抗体)的RNA库，表达出的每个拟抗体通过与其对应的RNA上的嘌呤霉素链接体连接，使得每个拟抗体可与表达它的RNA链相连，获得RNA-拟抗体库。然后通过反转录技术，合成每个RNA的cDNA，获得cDNA-拟抗体库。然后，将得到的cDNA-拟抗体库与预先准备好的包裹在磁珠上的靶蛋白质孵育。拟抗体库中如果存在可与靶蛋白质结合的拟抗体，可通过磁珠上的靶蛋白质筛选出来。筛选得到的拟抗体的cDNA可通过PCR扩增、再次转录成RNA、使用体外无细胞蛋白质系统表达获得RNA-拟抗体库并反转录为cDNA-拟抗体库，然后与包裹在磁珠上的靶蛋白质孵育，重复以上筛选过程。经过4至7个循环，逐步得到可高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。最后通过深度测序技术，可检测最终筛选的拟抗体的DNA序列，从而可使用原核细胞大规模生产筛选出的拟抗体，进行功能验证。该筛选系统不依赖于细胞及动物体，可高效筛选与靶蛋白质结合的蛋白质类分子，为蛋白质类药物研发提供了新的方法。

本发明的拟抗体筛选库的多样性可达20¹³种。通过使用本发明的筛选系统，可得到与靶蛋白高效结合的蛋白质类药物(拟抗体)。拟抗体通过与靶蛋白质结合，可潜在抑制靶蛋白与其他蛋白结合，或通过改变靶蛋白的构型，从而抑制靶蛋白质功能。该系统可用于针对病毒类蛋白、癌症相关蛋白和免疫类疾病相关蛋白的筛选，获得的蛋白质类药物可用于科研及开发新的诊断工具和治疗药物。

附图说明

图1.筛选针对靶蛋白质的拟抗体的流程示意图。其中：(1)制备好的用于表达拟抗体的RNA库；(2)RNA库与嘌呤霉素连接体相连；(3)体外无细胞表达拟抗体；(4)反转录生成cDNA；(5)使用覆盖在磁珠上的靶蛋白筛选拟抗体库中能与之结合的拟抗体；(6)获取能与靶蛋白结合的拟抗体的cDNA库，用于再次转录生成RNA库，然后进行进一步筛选。一般筛选需要4-7个循环。

图2.合成的DNA库的电泳检测结果。

图3.合成的RNA库的电泳检测结果。

图4.以P-糖蛋白为例，包裹磁珠的蛋白质量的检测结果。其中：S＝上清液，B＝磁珠；12.5pmol，25pmol，37.5pmol表示用于包裹每微升(40μg)His-标签磁珠的蛋白量。

图5.嘌呤霉素连接体与RNA库的连接产物的电泳检测结果。其中：1的条带为RNA库；2为嘌呤霉素连接体与RNA库的连接产物，其中上层条带为连接嘌呤霉素连接体后的RNA库的条带，下层条带为未连接嘌呤霉素连接体的RNA库的条带。

图6.第一个筛选循环中各样本的定量PCR扩增曲线。

图7.第二个筛选循环中各样本的定量PCR扩增曲线。

图8.第三个筛选循环中各样本的定量PCR扩增曲线。

图9.第四个筛选循环中各样本的定量PCR扩增曲线。

图6-9中，C：步骤C得到的反转录后DNA；D：脱盐后样本的DNA；E：步骤E预清除后的DNA；P：阳性筛选得到的拟抗体的DNA；N：阴性对照的DNA；Blank：空白对照，即洗脱液所含的DNA。

图10.每个筛选循环中的阳性筛选样本的DNA回收率(阳性回收率)与阴性对照样本的DNA回收率(阴性回收率)。

图11.使用Pymol软件展示的P-糖蛋白的拟抗体的3D结构示意图。

图12.使用美国波士顿大学CLusPro平台模拟的P-糖蛋白与其拟抗体的结合示意图。其中：A为整体示意图，B为A中矩形框部分的放大图。

图13.使用欧洲生物信息所LIGPLOT平台展示的P-糖蛋白与拟抗体的结合位点。其中，虚线相连的拟抗体和P-糖蛋白的氨基酸位点是参与结合的部位。

图14.使用ForteBio Blitz生物分子相互作用仪检测P-糖蛋白与拟抗体的结合力。其中：Run1，Run2，Run 3，Run 4，Run 5为样品编号，分别代表1000nM,500nM,125nM,250nM,62.5nM的P-糖蛋白与拟抗体的结合。

图15.拟抗体筛选库的DNA结构。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1.拟抗体的DNA库的构建

1.序列设计

我们使用已报道的金黄色葡萄球菌的A蛋白的与免疫球蛋白结合的Z结构域的核苷酸序列作为骨架序列，根据骨架序列的结构设计了13个NNK(N＝A/T/G/C；K＝G/T)随机突变位点，获得了SEQ ID NO:1所示的拟抗体DNA序列，该序列具有20¹³(约8*10¹⁶)的DNA多样性。

以下为金黄色葡萄球菌的A蛋白的氨基酸序列(来源：NCBI Reference Sequence:WP_194381935.1)：

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDETQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLDEAKKLNESQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLKEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYDILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQ QNAFYKTLHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNKKSGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAERRREL。(SEQ ID NO:12)

拟抗体DNA序列如下：

ATGGTAGATAACAAATTCAACAAAGAANNKNNKNNKGCGNNKNNKGAGATCNNKNNKTTACCTAACTTAAACNNKNNKCAANNKNNKGCCTTCATCNNKAGTTTANNKGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAA。(SEQ ID NO:1)

为进行蛋白质类药物筛选，我们在拟抗体DNA序列的5’端添加T7噬菌体RNA聚合酶启动子(5′TAATACGACTCACTATAG 3′)(SEQ ID NO:17)和核糖体结合位点(5’TAGGAG 3’)，3’端添加链接DNA(GGGTCTGGGTCTGGGTCT)(SEQ ID NO:18)和终止密码子，形成如图15所示的拟抗体筛选库的DNA结构。所述DNA结构中，T7 Promoter：T7噬菌体RNA聚合酶启动子；RBS：Ribosome-binding site，核糖体结合位点；链接DNA：3个重复的甘氨酸和丝氨酸序列，设计用于通过共价键连接嘌呤霉素连接体，用于基于核糖体展示技术和RNA展示技术的蛋白质类药物筛选系统。

修饰后的核苷酸序列为：

TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCCATGGTAGATAACAAATTCAACAAAGAANNKNNKNNKGCGNNKNNKGAGATCNNKNNKTTACCTAACTTAAACNNKNNKCAANNKNNKGCCTTCATCNNKAGTTTANNKGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGGGTCTGGGTCTGGGTCTTAGGACGGGGGGCGGAAA。(SEQ ID NO:2)

翻译后所得拟抗体的氨基酸序列为：

MVDNKFNKEXXXAXXEIXXLPNLNXXQXXAFIXSLXDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGS。(SEQ ID NO:3)

其中X为突变位点，下划线所示肽段为三段阿尔法螺旋结构的氨基酸序列。

2.DNA合成

使用重叠延伸聚合酶链式反应，通过两步PCR合成完整拟抗体的DNA链。下列PCR扩增使用New England Biolabs公司生产的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(货号M0530S)。

2.1第一步延伸PCR

引物DNA序列(5’-3’)：

Library-F129(具有13个NNK随机突变位点，引物合成时，N为A，T，G和C的等摩尔混合物，K为G和T的等摩尔混合物)：

GTAGATAACAAATTCAACAAAGAANNKNNKNNKGCGNNKNNKGAGATCNNKNNKTTACCTAACTTAAACNNKNNKCAANNKNNKGCCTTCATCNNKAGTTTANNKGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAAC；(SEQ ID NO:4)

Library-R105：

TTTCCGCCCCCCGTCCTAAGACCCAGACCCAGACCCTTTTGGTGCTTGAGCATCATTTAGCTTTTTAGCTTCTGCTAAAAGGTTAGCGCTTTGGCTTGGGTCATC。(SEQ ID NO:5)

PCR结束后，取2μl产物于3％琼脂凝胶电泳检测产物DNA的大小。产物是大小为210碱基长度的DNA片段，无杂带。产物DNA多样性：1.5*10¹⁴，产物里每种DNA有1条链。

2.2第二步延伸PCR

引物DNA序列(5’-3’)：

Library-T7-F73：

TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCCATGGTAGATAACAAATTCAACAAAGAA；(SEQ ID NO:6)

Library-R36：

TTTCCGCCCCCCGTCCTAAGACCCAGACCCAGACCC。(SEQ ID NO:7)

PCR结束后，取2μl产物于3％琼脂凝胶电泳检测产物DNA的大小。结果如图2所示，终产物是大小为259碱基长度的DNA片段，无杂带。产物DNA多样性：1.5*10¹⁴，产物里每种DNA有5条链。

3.终产物DNA库的提取及纯化

为了最大程度提取出含不同序列的DNA库，按照如下方法进行终产物DNA的提取与纯化：

1)加同等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，10mM Tris饱和溶液，pH8.0，1mM EDTA(Sigma-Aldrich公司，货号P3803)。*使用1.7mL的eppendorf管，*确保使用溶剂的下层液。

2)剧烈震荡混匀至少10秒。

3)离心3分钟，转速13000rpm。

4)分离取出上层液(含所提取DNA)，丢弃下层液(有机层)。

5)取出的上层液中加同等体积的氯仿–异戊醇混合物(24:1，Sigma-Aldrich公司，货号25666)。

6)再次剧烈震荡混匀至少10秒。

7)离心3分钟，转速13000rpm。

8)再次分离取出上层液(含所提取DNA)，丢弃下层液(有机层)。

9)取出的上层液中加入1/10体积的3M NaCl，加入2.2倍体积的100％乙醇，混匀，放置于冰上至少10分钟。

10)离心15分钟，转速13000rpm。

11)丢弃上清液(可见DNA沉淀于管底部)。

12)用0.5倍体积(原PCR体积)的70％乙醇洗两次沉淀物。

13)离心3分钟，转速13000rpm。

14)丢弃上清液，室温下干燥沉淀的DNA。然后将DNA溶解于16μL的Milli Q水中，用于下一步转录(如果沉淀物少，可溶解于8μL的Milli Q水中)。

实施例2.拟抗体的RNA库的合成

1.体外转录

以实施例1步骤3(终产物DNA库的提取及纯化)纯化的DNA库为模板，使用HiScribeT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs公司，货号E2050S)进行体外转录，产生RNA库。

1)设置以下转录反应(反应体积可根据需要而改变)：

2)放置于37℃恒温器中至少8-10小时(推荐过夜)。

3)加入Milli Q水(60μL)使总体积达到100μL(2×)，加入4μL的DNase1(2×)。室温下放置15分钟。加入等体积(104μL)的含有0.6M NaCl和10mM EDTA的混合溶液。加入0.8倍体积(166.4μL)的异丙醇，放置于-20℃冰箱30分钟。

4)离心15分钟，转速13000rpm。

5)使用100μL的70％乙醇清洗，然后再次离心3分钟，丢弃上清液。清洗两次。

6)室温下干燥沉淀的RNA，注意避免放置于室温下过久。将沉淀的RNA充分溶解于至少10μL的Milli Q水中，得到RNA溶液。

2.RNA库的纯化和提取

向步骤1获得的RNA溶液中加入等体积(10μL)的2×RNA loading Dye，98℃加热2分钟。使用8％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳提取和纯化RNA库。

1)准备8％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液使用1×TBE(TRIS硼酸盐–EDTA缓冲液)。注意使用宽的Teflon梳子。

8％的变性聚丙烯酰胺凝胶(13cm×13cm×1mm)制作方法如下:

18mL的含有8.8％丙烯酰胺和6.7M尿素的溶液

2mL 5×TBE(1mL 10×TBE+1mL MilliQ水)

15μL TEMED

200μL 10％APS*

*加入10％APS(过硫酸铵)后快速将溶液加入到准备好的胶板中，插入宽的Teflon梳子。

2)使用25mA电流进行凝胶电泳，直到溴酚蓝条带到达胶板底部(建议加样前预先使用25mA电流电泳15分钟)。

3)把胶放置在保鲜膜上，然后放置于含有荧光剂的薄层硅胶色谱板(TLC)上，使用手提式UV紫外灯365nm长波显影。

4)若见两条条带，下层条带为完整RNA库产物，上层条带为不完全转录产物。用记号笔圈出下层条带，然后关闭紫外灯，用一次性刀片切下圈出的凝胶。如图3所示，可见两个RNA条带，需回收下层条带。

5)把凝胶放入1.7ml或10ml的离心管中，充分碾压成末状。

6)加入1mL的0.3M NaCl，4℃下旋转混合1小时，然后15200×g离心10min。

7)使用1mL或1.5mL的注射器，吸入离心后的上清液，然后于注射器前端连接孔径小于等于0.45μm的过滤器(Merck Milipore Millex-LCR针头式过滤器，亲水性PTFE，0.45um，直径：13mm)。通过过滤器将注射器内的液体缓慢注射入一个新的离心管中。

8)重复步骤6)和7)共3遍，将所有过滤后的上清液放入一个离心管内。加入两倍体积的100％乙醇，置于冰上10分钟。

9)15200×g离心15分钟，可见沉淀的RNA，弃上清液，用100μL的70％乙醇清洗两遍，再次离心后弃上清液。

10)将沉淀的RNA溶解于少量(5.5μL)的Milli Q水中，使用Nano drop分光光度计测量RNA浓度(取样本0.5μl+Milli Q 4.5μl)，最后稀释RNA为10μM。使用如下公式1计算出摩尔浓度后，使用如下公式2计算出稀释所需要的水的体积。公式1中，X为样本浓度，#为259(拟抗体的RNA长度)。公式2中，目的浓度为10μM，浓度为公式1计算的摩尔浓度，液量为RNA样本体积。

实施例3.基于核糖体展示技术和RNA展示技术的拟抗体筛选

1.准备靶蛋白质

本实验以P-糖蛋白(又名ABCB1)为例，将其作为靶蛋白质进行拟抗体筛选。P-糖蛋白的氨基酸序列如下(序列来源：Protein Data Bank:ID:6A6M)：

ASGPESAYTTGVTARRIFALAWSSSATMIVIGFIASILEGATLPAFAIVFGRMFAVFTKSKSQIEGETWKYSVGFVGIGVFEFIVAGSRTALFGIASERLARDLRVAAFSNLVEQDVTYFDRRKAGELGGKLNNDVQVIQYSFSKLGAVLFNLAQCVVGIIVAFIFAPALTGVLIALSPLVVLAGAAQMIEMSGNTKRSSEAYASAGSVAAEVFSNIRTTKAFEAERYETQRYGSKLDPLYRLGRRRYISDGLFFGLSMLVIFCVYALALWWGGQLIARGSLNLGNLLAAFFSAILGFMGVGQAAQVWPDVTRGLGAGGELFAMIDRVPQYRRPDPGAEVVTQPLVLKQGIVFENVHFRYPTRMNVEVLRGISLTIPNGKTVAIVGGSGAGKSTIIQLLMRFYDIEPQGGGLLLFDGTPAWNYDFHALRSQIGLVSQEPVLFSGTIRDNILYGKRDATDEEVIQALREANAYSFVMALPDGLDTEVGERGLALSGGQKQRIAIARAILKHPTLLCLDESTSALDAESEALVQEALDRMMASDGVTSVVIAHRLSTVARADLILVMQDGVVVEQGNHSELMALGPSGFYYQLVEKQLASGDMSAAGSENLYFQ。(SEQ ID NO:13)

筛选前需获取纯化的靶蛋白质。靶蛋白质需具有能和蛋白磁珠相结合的标签。本实验于靶蛋白C端重组连接含有6个组氨酸的组氨酸标签(6×Polyhistidine-tag)，相应地，在筛选过程中使用NTA磁珠。P-糖蛋白可委托生物公司制备，制备方法和步骤参考GrosP,Beaudet L,Urbatsch IL.Yeast as an expression system for the study of P-glycoprotein and other ABC transporters.Acta Physiol Scand Suppl.1998Aug；643:219-25.。

筛选前需要确定充分包裹磁珠的靶蛋白质的量。以下使用Thermo fisher公司生产的NTA磁珠(Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown，货号10103D)为例，分别使用12.5pmol，25pmol，37.5pmol量的P-糖蛋白与磁珠包裹，然后通过SDS凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察在不同靶蛋白质量下，包裹在磁珠上的蛋白质的量和剩余未包裹的蛋白质的量。

具体流程：分别将12.5pmol，25pmol，37.5pmol的靶蛋白质与1μL(40μg)的NTA磁珠混合，放置于4℃下旋转30分钟。然后用吸铁石固定磁珠，将上清液转移入新的离心管内，并于上清液中加入SDS上样缓冲液。用储存靶蛋白质的缓冲液(含有20mM Tris-HCl(pH 7.0)，150mM Nacl的PBS溶液)洗磁珠三遍，丢弃缓冲液，于NTA磁珠也加入SDS上样缓冲液。95℃加热2分钟变性。SDS凝胶电泳，然后使用考马斯亮蓝染色。结果如图4所示，随着所用蛋白质摩尔数量增加，上清液(S)的蛋白质条带逐渐加深。且12.5pmol时，上清液中已出现靶蛋白质条带，说明磁珠已被蛋白质完全包裹。说明加入12.5pmol时，蛋白质已可充分包裹磁珠。即，12.5pmol的P-糖蛋白是充分包裹40μg磁珠所需要的量。

2.筛选针对靶蛋白质的拟抗体

A.嘌呤霉素连接体与拟抗体的RNA库的连接

本实验所使用的嘌呤霉素连接体如下：

5'-[PHO]CTCCCGCCCCCCGTCC-(C18)(C18)(C18)(C18)(C18)(C18)-CC-嘌呤霉素-3′，

其中，[PHO]代表PO4。寡核苷酸(CTCCCGCCCCCCGTCCCC)(SEQ ID NO:8)的5’端修饰PO4，3’端修饰嘌呤霉素。在所述寡核苷酸第16个碱基和第17个碱基之间并入6个Spacer 18(六乙二醇)，寡核苷酸通过HPLC纯化。

嘌呤霉素连接体的功能和机制：嘌呤霉素连接体5’端的磷酸基团在T4 RNA连接酶的作用下可与位于RNA链3’端的-OH基团连接。嘌呤霉素连接体3’端可在无细胞蛋白质翻译结束后，进入核糖体A受位，通过共价键与翻译出的蛋白质C端结合。使用嘌呤霉素连接体可使每个RNA与它所表达的拟抗体相连。

1.合成嘌呤霉素连接体，建立嘌呤霉素连接体与实施例2制备的拟抗体的RNA库的连接反应(可按需求调整反应体积)：

室温条件下放置2-4小时反应。注：连接体系中使用的PNK为T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase，New England Biolabs，货号M0201S)，目的是充分使嘌呤霉素连接体的5’端磷酸化。所使用的10×T4 RNA连接酶缓冲液和200U/μL T4 RNA连接酶从Thermo fisher公司定制。

2.加同等体积(20μl)的苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，10mM Tris饱和溶液，pH8.0，1mM EDTA(Sigma-Aldrich公司，货号P3803)。剧烈震荡混匀至少10秒后，离心15200×g，3分钟，将上层(水层)液体转移至新的离心管中。

3.加入和离心管内同等体积(小于等于20μl)的氯仿–异戊醇混合物(24:1，Sigma-Aldrich公司，货号25666)。剧烈震荡混匀至少10秒后，离心15200×g，3分钟，再次将上层(水层)液体转移至新的离心管中。

4.加入1/10体积的3M NaCl，2.2倍体积的100％乙醇，0.2μl的glycogen(UltraPure Glycogen，Thermo fisher公司，货号10814010)。放置于-20℃冰箱30分钟。离心15200×g，15分钟，可见RNA沉淀于管底部。丢弃上清液，用50μL 70％乙醇洗两次，离心丢弃上清液，室温下干燥RNA沉淀。

5.溶解RNA于3μL水中。注意：100％提取会得到10μM mRNA-嘌呤霉素连接体，但是实际提取率会因操作精准度而异，会低于100％。由于最终提取到的RNA液体中含有ATP，故使用分光光度仪无法准确测出浓度。

为了检测嘌呤霉素连接体的连接效率和最终RNA的回收情况，须使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。分别于未连接嘌呤霉素连接体的浓度为10μM的RNA库和溶解于3μL水中的RNA-嘌呤霉素连接体样本中取1μL样本，加入1μL的2×RNA loading Dye，98℃加热2分钟变性。使用浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，缓冲液使用1×TBE(TRIS硼酸盐–EDTA缓冲液)。8％的聚丙烯酰胺凝胶(13cm×13cm×1mm)制备如下：18mL的含有8.8％丙烯酰胺及6.7M尿素的溶液，2mL 5×TBE(1mL 10×TBE+1mL MilliQ水)，15μL TEMED，200μL 10％APS(过硫酸铵)。混合后迅速倒入胶板中。加入样本后，使用25mA电流进行凝胶电泳，直到溴酚蓝条带到达胶板底部(建议加样前预先使用25mA电流电泳15分钟)。电泳结束后切除多余的凝胶，使用1×TBE摇动清洗样本10分钟。丢弃清洗液，使用溴化乙锭染RNA 10分钟。回收溴化乙锭以备下次使用。用MilliQ水摇晃清洗10分钟。使用紫外光分析暗箱检测样本。

结果如图5所示，1的条带为实施例2制备的拟抗体的RNA库；2为嘌呤霉素连接体与RNA库的连接产物，两个条带中，上层条带为连接嘌呤霉素连接体后的RNA库的条带，下层条带为未连接嘌呤霉素连接体的RNA库的条带，连接率大约为50％。

B.体外无细胞表达拟抗体

所需的体外无细胞表达系统来源于已报道的PURE大肠杆菌的蛋白质表达系统，包含除释放因子RF1外的蛋白质翻译所需的所有成分(参考Shimizu Y,Kanamori T,UedaT.Protein synthesis by pure translation systems.Methods.2005Jul；36(3):299-304.doi:10.1016/j.ymeth.2005.04.006)。具体构建如下：50mM HEPES-KOH(pH 7.6)；12mM醋酸镁；100mM醋酸钾；2mM亚精胺；20mM磷酸肌酸；2mM DTT；2mM ATP；2mM GTP；1mM CTP；1mMUTP；0.1mM 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid；0.5mM 20种氨基酸；1.5mg/ml大肠杆菌总tRNA；0.73μM AlaRS；0.03μM ArgRS；0.38μM AsnRS；0.13μM AspRS；0.02μMCysRS；0.06μM GlnRS；0.23μM GluRS；0.02μM GlyRS；0.02μM HisRS；0.04μMIleRS；0.04μMLeuRS；0.11μM LysRS；0.03μM MetRS；0.68μM PheRS；0.16μM ProRS；0.04μM SerRS；0.09μMThrRS；0.03μM TrpRS；0.02μM TyrRS；0.02μM ValRS；0.6μM MTF；0.26μM EF-G；10μM EF-Tu；10μM EF-Ts；2.7μM IF1；0.4μM IF2；1.5μM IF3；0.5μM RRF；0.1μM T7 RNA聚合酶；4μg/ml肌酸激酶；3μg/ml肌激酶；0.1μM焦磷酸酶；0.1μM核苷二磷酸激酶；1.2μM核糖体。

目前，商用的能满足该条件并且证实有效的无细胞表达系统有两种。一种是美国New England Biolabs公司生产的PURExpress体外蛋白质表达试剂盒(货号E6850s)，另一种是日本Gene frontier公司生产的PUREfrex2.0体外蛋白质表达试剂盒(货号PF201-0.25-EX)。

使用PURExpress Delta RF123 Kit(New England Biolabs，货号E6850s)体外表达拟抗体的反应如下。反应体系的设置可按需要进行改变，一般建议第一个筛选循环使用10×反应体系，第二个筛选循环后使用2×反应体系。

37℃恒温反应30分钟。然后加入表达体系的1/5体积的100mM EDTA(pH＝8.0)，37℃恒温30分钟，目的是解离核糖体复合物，获得RNA-拟抗体库。如下：

C.反转录合成cDNA-拟抗体库

使用反转录试剂盒M-MLV RT RNase(H-)PointMutant(Promega M3682)，按照试剂盒说明书的方法合成与拟抗体相连接的RNA的cDNA。反应体系的设置可按需要进行改变，一般建议第一个筛选循环使用10×反应体系，第二个筛选循环后使用2×反应体系。

将上面的反转录混合物加入上述步骤B(体外无细胞表达拟抗体)获得的RNA-拟抗体库中，如下：

42℃恒温反应1小时。

反转录引物：

Library-R36：TTTCCGCCCCCCGTCCTAAGACCCAGACCCAGACCC。(SEQ ID NO:9)

1小时后，留取0.5μL样本加入499.5μL水，置于冰上，用于实时定量PCR反应。在剩余49.5μL样本中加入50.5μL靶蛋白质缓冲液(储存靶蛋白质的缓冲液，即含有20mMTris-HCl(pH 7.0)，150mM Nacl的PBS溶液)。

D.脱盐

1.准备一个～0.7mL的脱盐柱。脱盐柱用于去除样本内会增加拟抗体非特异结合的物质，比如镁离子和EDTA。

2.脱盐柱制作方法如下：准备一个1mL的一次性注射器和一个15mL的离心管。取出注射器的活塞，在针筒内放入一小片kimwipe或lenswipe低尘土擦拭纸，用活塞将擦拭纸推入针筒底部，目的为了下一步在针筒内加入葡萄糖凝胶。提前把G-25葡萄糖凝胶浸泡于靶蛋白质缓冲液内，充分浸泡至少4小时(推荐前一天准备，常温浸泡过夜后4℃保存)。向针筒内加入准备好的G-25葡萄糖凝胶，按步骤3离心后使得针筒内的凝胶的量达到针筒0.7mL刻度线。

3.把准备好的针筒放入15mL的离心管，转速800×g(不是rpm)离心1分钟。然后向针筒内加入300μL的靶蛋白质缓冲液并再次离心，时间至少3分钟。把离心后的针筒放入一个新的离心管内。(注意，此时如果再次离心，针筒内不应有液体流入到离心管内。)

4.把经过步骤C反转录后的样本加入脱盐柱，转速800×g离心3分钟，样本经过脱盐柱流入离心管内。此时离心管内得到样本体积应与加入脱盐柱前的样本体积相同。

留取0.5μL样本加入499.5μL水，置于冰上，用于实时定量PCR反应。向剩余样本内加入等体积的2×封闭液(含有0.2％牛血清白蛋白BSA的靶蛋白质缓冲液)。

E.预清除

预清除需6-12次，预清除的目的是移除拟抗体库内可与磁珠非特异性结合的拟抗体。预清除前，需准备能与靶蛋白特异结合的磁珠，每次预清除可使用2至5微升磁珠。若需预清除6次，则准备6个1.7毫升的离心管，加入靶蛋白质缓冲液(每微升磁珠需使用至少50微升缓冲液清洗)和磁珠。用移液枪吹打磁珠，然后用磁铁固定磁珠后，移除缓冲液。如此方法清洗2至3次。注意：操作时应迅速，不能将磁珠干燥。

把步骤D得到的样本加入2至5μL清洗好的磁珠中，于4℃旋转10分钟，然后用吸铁石把磁珠固定在离心管内壁，将样本移至新的磁珠，按此步骤预清除6-12次。预清除完成后，将样本放入新的1.7毫升的离心管内。留取0.5μL样本加入499.5μL水，置于冰上，用于实时定量PCR反应。

F.蛋白质固定

充分固定并包裹磁珠所需要的靶蛋白质的量因靶蛋白质的不同而改变。使用至少2倍的所需量充分包裹磁珠。如何确定所需蛋白质的量可参见前文。

磁珠的使用量因磁珠的不同和拟抗体的分子数量不同而改变。以NTA磁珠(Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown，Thermo fisher公司，货号10103D)为例，每微升磁珠含有磁珠40μg。推荐第一循环筛选使用4-5μL磁珠，之后每个循环使用1-2μL磁珠。注意：大量的磁珠会增加拟抗体与磁珠的非特异性结合，不推荐使用过量磁珠。

操作：使用靶蛋白质缓冲液清洗所需磁珠2-3次，移除缓冲液，加入靶蛋白质，4℃下旋转30分钟。用100μL蛋白质缓冲液清洗3次包裹有靶蛋白质的磁珠，最后一次清洗前，将磁珠移至新的离心管内。

G.筛选

将完成步骤E的样本分为等体积的两份，一半与步骤F准备的包裹了靶蛋白质的磁珠相混合(阳性筛选样本)，另一半与未包裹靶蛋白质的磁珠混合(阴性对照样本)，4℃条件下混合30分钟。使用100μL靶蛋白质缓冲液充分清洗磁珠3-5次(使用移液枪吹打清洗，若磁珠易与移液枪枪头沾粘，则用手指轻弹离心管清洗磁珠)。最后一次清洗前，将磁珠移至新的离心管内。清洗完成后，移除缓冲液，加入50μL的洗脱液(洗脱液的配制见步骤H)。

H.获取拟抗体的cDNA

配制洗脱液如下，建议使用New England Biolabs公司生产的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号M0530S)。使用量：阳性筛选样本和阴性对照样本各50μL，额外准备50μL用于稀释在步骤I的定量PCR中使用的标准DNA以及空白对照。

洗脱液：

阳性筛选样本和阴性对照样本分别加入50μL的洗脱液后，置于98℃加热5分钟。然后迅速将含有cDNA的洗脱液移入新的离心管，放置于冰上。

cDNA-F46(5’-3’)：

TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCC；(SEQ ID NO:10)

cDNA-R24(5’-3’)：

TTTCCGCCCCCCGTCCTAAGACCC。(SEQ ID NO:11)

I.定量PCR

使用定量PCR检测的样本为：步骤C，D，E稀释于500μL水中的DNA，步骤H得到的阳性筛选样本和阴性对照样本的DNA(不需要稀释)，5个等比例稀释的标准DNA，以及1个空白对照的DNA(洗脱液)。

使用定量PCR的目的：a)获取一个循环内每一步骤拟抗体DNA扩增所需的C_T值及DNA数量，比较区别和变化，用于优化筛选；b)比较阳性筛选样本与阴性对照样本C_T值的区别；c)通过确定阳性筛选样本与阴性对照样本的cDNA量，计算每个循环阳性筛选样本和阴性对照样本中DNA的量和筛选前(预清除后的样本)的DNA的量的比值(回收率)；d)使用洗脱液作为空白对照，检测样本中是否存在污染DNA，若空白对照的C_T值小于26，说明所有样本中可能存在污染DNA，需找出DNA污染来源，并重新进行相应循环的筛选。

操作方法：提前准备标准DNA用于定量PCR。标准DNA的准备方法：使用浓度为10μM的拟抗体的RNA库，反转录可得浓度为10μM的DNA，使用步骤H制备的洗脱液，分别稀释为如下浓度：1nM，100pM，10pM，1pM，100fM。

使用SYBR Green定量试剂盒(Thermo fisher，货号A25780)准备定量PCR如下：

定量PCR时间及温度设置如下：95℃/10分钟；95℃/20秒，55℃/20秒，72℃/1分钟，40个循环。(可以不需要溶解曲线)

J.PCR扩增筛选样本的cDNA，准备下一循环

使用New England Biolabs公司生产的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(货号M0530S)进行PCR扩增：

温度及时间设定如下：98℃/5minutes；n个循环：98℃/20秒，55℃/20秒，72℃/1分钟；72℃/5min。其中，循环数量(n)是定量PCR得到的阳性筛选样本的CT值。

PCR结束后取2μL样本，使用3％琼脂凝胶电泳检测扩增出的拟抗体的DNA，所见DNA条带大小与设计的拟抗体DNA大小一致为正常。若所见DNA条带大小与设计的拟抗体DNA条带大小不一致，或者出现杂带，说明筛选过程中有DNA污染或异常扩增。

然后，按照如下方法进行终产物DNA的提取与纯化：

1)加同等体积的苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，10mM Tris饱和溶液，pH8.0，1mMEDTA(Sigma-Aldrich公司，货号P3803)。*使用1.7mL的eppendorf管，*确保使用溶剂的下层液。

2)剧烈震荡混匀至少10秒。

3)离心3分钟，转速13000rpm。

4)分离取出上层液(含所提取DNA)，丢弃下层液(有机层)。

6)再次剧烈震荡混匀至少10秒。

7)离心3分钟，转速13000rpm。

8)再次分离取出上层液(含所提取DNA)，丢弃下层液(有机层)。

10)离心15分钟，转速13000rpm。

11)丢弃上清液(可见DNA沉淀于管底部)。

12)用100μL的70％乙醇洗两次沉淀物。

13)离心3分钟，转速13000rpm。

14)丢弃上清液，室温下干燥沉淀的DNA。然后将DNA溶解于10μL的Milli Q水中。

K.转录

1)以步骤J获得的DNA为模板，使用HiScribe T7 Quick High Yield RNASynthesis Kit(New England Biolabs公司生产，货号E2050S)进行转录。设置转录体系为7.5μl的反应(反应体积可按需要调整)。

2)放置于37℃恒温器或PCR过夜。

3)加入Milli Q水使总体积达到50μL，加入2μL的DNase 1。室温下放置15分钟。加入等体积(52μL)的含有0.6M NaCl和10mM EDTA的混合溶液。加入0.8倍体积(83.2μL)的异丙醇，放置于-20℃冰箱30分钟。

4)离心15分钟，转速13000rpm。

6)室温下干燥沉淀的RNA，注意避免放置于室温下过久。将沉淀的RNA充分溶解于至少10μL的Milli Q水中。

接下来，重复上述A-I的筛选过程。

结果分析：

经过4-7个循环后，若阳性筛选样本的C_T值逐渐小于阴性对照样本的C_T值，且每个循环阳性筛选样本的DNA回收率逐渐增加且越来越大于阴性对照样本的DNA回收率，则表明与靶蛋白质结合的拟抗体数量增加，阳性筛选样本中存在能与靶蛋白质结合的拟抗体的DNA。此时，可通过第二代DNA测序，确定筛选得到的拟抗体的DNA序列。

图6-9为采用本发明制备的拟抗体库针对P-糖蛋白进行拟抗体筛选的定量PCR结果。该筛选共4个循环。图6-9中，C：步骤C得到的反转录后的DNA；D：脱盐后样本的DNA；E：步骤E预清除后的DNA；P：阳性筛选得到的拟抗体的DNA；N：阴性对照的DNA；Blank：空白对照，即洗脱液所含的DNA。表1-4为每个循环各个样本的C_T值和DNA量。

表1.第一循环中各个样本的C_T值和DNA量

样本名	Cт值	DNA量
			反转录(C)	12.75654793	9414356
脱盐(D)	15.91512871	1528355.5
			预清除(E)	17.34741211	670176.75
阳性筛选(P)	23.24604607	24473.89258
			阴性对照(N)	21.28567886	65457.8125
空白对照(Blank)	34.58578873	32.88714218

表2.第二循环中各个样本的C_T值和DNA量

表3.第三循环中各个样本的C_T值和DNA量

样本名	Cт值	DNA量
			反转录(C)	9.944783211	45808040
脱盐(D)	13.28336811	5362149.5
			预清除(E)	14.50905418	2439619
阳性筛选(P)	17.75522804	333044
			阴性对照(N)	19.7874527	82116.65625
空白对照(Blank)	27.91888428	442.0045166

表4.第四循环中各个样本的C_T值和DNA量

样本名	Cт值	DNA量
			反转录(C)	9.769544601	105355696
脱盐(D)	12.97455502	17839740
			预清除(E)	14.0046339	10081038
阳性筛选(P)	14.96417904	5983734.5
			阴性对照(N)	20.56784248	265523.1563
空白对照(Blank)	34.92451096	93.16288757

确定阳性筛选样本与阴性对照样本的cDNA量后，计算每个循环中阳性筛选样本和阴性对照样本中DNA的量占筛选前(预清除后的样本)的DNA的量的比值，即为回收率，若每个循环的拟抗体阳性回收率逐渐增加，且阴性对照的回收率未显著增加，则说明能与靶蛋白结合的拟抗体被筛选出。注意：计算回收率时，先根据溶液体积使用筛选样本或对照样本中定量PCR检测到的DNA量计算原样本含有的DNA量，除以预清除后样本的DNA总量，即可得到回收率。

图10和表5示出了本次筛选每个循环的阳性筛选样本的DNA回收率(阳性回收率)与阴性对照样本的DNA回收率(阴性回收率)。可以看出，阳性回收率在第四个循环迅速增加，预示有拟抗体被成功筛选。通过DNA测序，获得被筛选的拟抗体的核酸序列。拟抗体序列可通过使用PURE系统或原核细胞系统表达并进行进一步验证。

表5

	第一循环	第二循环	第三循环	第四循环
					阳性回收率	0.006086427	0.015624329	0.02275246	0.098927222
阴性回收率	0.016278744	0.007716229	0.005609937	0.004389812

3.筛选出的拟抗体的效果验证

经过4个循环筛选，使用第二代测序技术检测筛选所得的cDNA序列。获得了氨基酸序列如下的拟抗体：

MVDNKFNKEWLSAYSEIVTLPNLNAWQHAAFIWSLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGS。(SEQ ID NO:14)

编码该拟抗体的DNA序列为：

ATGGTAGATAACAAATTCAACAAAGAATGGCTGAGCGCGTACAGCGAGATCGTGACCTTACCTAACTTAAACGCGTGGCAACACGCGGCCTTCATCTGGAGTTTATTCGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGGGTCTGGGTCTGGGTCT。(SEQ ID NO:15)

使用分子三维结构显示软件Pymol展示该拟抗体的3D结构，如图11所示。

使用美国波士顿大学CLusPro平台检测及模拟P-糖蛋白(Protein Data Bank:ID:6A6M)与该拟抗体的结合，如图12所示。图12A为拟抗体与P-糖蛋白结合的整体示意图，矩形框显示该拟抗体与P-糖蛋白的结合位置；图12B为图12A的矩形框部分的放大图，可以看出该拟抗体结合于图示P-糖蛋白的口袋结构中。

使用欧洲生物信息所LIGPLOT平台展示结合位点，如图13所示，虚线相连的拟抗体和P-糖蛋白的氨基酸位点是参与结合的部位。

对筛选到的拟抗体(SEQ ID NO:14)进行表达，方法和步骤如下：

(1)拟抗体的C端GSGSGS序列可不用表达，可替换为蛋白质标签。本研究中将Strep标签连接于拟抗体的C端。Strep标签的氨基酸序列为：WSHPQFEK(SEQ ID NO:19)，DNA序列为tggagccatccgcagtttgaaaaa(SEQ ID NO:20)。合成用于表达该拟抗体的DNA，其核苷酸序列如下：

TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCCATGGTAGATAACAAATTCAACAAAGAATGGCTGAGCGCGTACAGCGAGATCGTGACCTTACCTAACTTAAACGCGTGGCAACACGCGGCCTTCATCTGGAGTTTATTCGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAATGGAGCCATCCGCAGTTTGAAAAATAGGACGGGGGGCGGAAA。(SEQ ID NO:16)

(2)按照实施例2中记载的体外转录的方法，使用HiScribe T7 Quick High YieldRNA Synthesis Kit(New England Biolabs公司，货号E2050S)对步骤(1)获得的DNA进行体外转录，获得RNA。然后按照实施例3中记载的体外无细胞表达拟抗体的方法，使用PURExpress Delta RF123 Kit(New England Biolabs，货号E6850s)体外表达拟抗体。随后，使用streptavidin磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，Thermo fisher公司生产，货号11205D)提取表达体系中的拟抗体，PBS缓冲液清洗后，使用5-10mM脱硫生物素(IBA公司生产，货号2-1000-001)分离磁珠上的拟抗体，使用Amicon滤器(Amicon Ultra-0.5Centrifugal Filters，Merck公司生产，货号：UFC5003)过滤清洗拟抗体。使用紫外光分光光度计检测获得的拟抗体的浓度，或通过SDS凝胶电泳和考马斯亮蓝(CBB)染色对拟抗体进行定性和定量。

然后使用ForteBio Blitz生物分子相互作用仪检测上述拟抗体与P-糖蛋白的结合力。使用10μM拟抗体覆盖streptavidin探针(Fortebio，货号18-5019)，分别使用1000nM,500nM,250nM,125nM,62.5nM的P-糖蛋白结合拟抗体，然后使用蛋白质缓冲液(含有浓度为20mM Tris-HCl(pH 7.0)，150mM Nacl的PBS溶液)解离结合。获得结合曲线后，设置GlobalFitting模式分析拟抗体结合力。如图14和表6所示，Run1，Run2，Run 3，Run 4，Run 5为样品编号，分别代表1000nM,500nM,125nM,250nM,62.5nM的P-糖蛋白与拟抗体的结合。结果显示，P-糖蛋白与拟抗体的结合KD(nM)为77.73nM，k_a(1/Ms)为9.26e4，k_d(1/s)为7.20e-3。KD数值越小，说明结合力越强，77.73nM表明拟抗体与P-糖蛋白有较强的结合力。

表6

样品编号

KD(M)

ka(1/Ms)

ka误差

kd(1/s)

kd误差

Rmax

Rmax误差

R平衡

X^2

R^2

Run 1

7.7729711E-8

9.2620805E4

2.5866449E3

7.1993884E-3

1.9557853E-4

6.6459103

0.062766433

6.1665835

217.71046

0.97186428

Run 2

7.7729711E-8

9.2620805E4

2.5866449E3

7.1993884E-3

1.9557853E-4

5.5839931

0.10433658

4.8327038

217.71046

0.97186428

Run 3

7.7729711E-8

9.2620805E4

2.5866449E3

7.1993884E-3

1.9557853E-4

5.4606607

0.27248964

3.3669588

217.71046

0.97186428

Run 4

7.7729711E-8

9.2620805E4

2.5866449E3

7.1993884E-3

1.9557853E-4

10.417921

0.49697165

7.9470371

217.71046

0.97186428

Run 5

7.7729711E-8

9.2620805E4

2.5866449E3

7.1993884E-3

1.9557853E-4

4.4830192

0.35094942

1.9980695

217.71046

0.97186428

序列表

<110> 北京创智智能健康技术研究院有限公司

<120> 一种具有阿尔法螺旋结构的拟抗体筛选库、其构建方法及应用

<130> P200913-CZZ

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<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtagata acaaattcaa caaagaannk nnknnkgcgn nknnkgagat cnnknnktta 60

cctaacttaa acnnknnkca annknnkgcc ttcatcnnka gtttannkga tgacccaagc 120

caaagcgcta accttttagc agaagctaaa aagctaaatg atgctcaagc accaaaa 177

<210> 2

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg ttgaacttta agtaggagat atatccatgg tagataacaa 60

attcaacaaa gaannknnkn nkgcgnnknn kgagatcnnk nnkttaccta acttaaacnn 120

knnkcaannk nnkgccttca tcnnkagttt annkgatgac ccaagccaaa gcgctaacct 180

tttagcagaa gctaaaaagc taaatgatgc tcaagcacca aaagggtctg ggtctgggtc 240

ttaggacggg gggcggaaa 259

<210> 3

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Glu

1 5 10 15

Ile Xaa Xaa Leu Pro Asn Leu Asn Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ala Phe Ile

20 25 30

Xaa Ser Leu Xaa Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu

35 40 45

Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser

65

<210> 4

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtagataaca aattcaacaa agaannknnk nnkgcgnnkn nkgagatcnn knnkttacct 60

aacttaaacn nknnkcaann knnkgccttc atcnnkagtt tannkgatga cccaagccaa 120

agcgctaac 129

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttccgcccc ccgtcctaag acccagaccc agaccctttt ggtgcttgag catcatttag 60

ctttttagct tctgctaaaa ggttagcgct ttggcttggg tcatc 105

<210> 6

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg ttgaacttta agtaggagat atatccatgg tagataacaa 60

attcaacaaa gaa 73

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttccgcccc ccgtcctaag acccagaccc agaccc 36

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcccgcccc ccgtcccc 18

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttccgcccc ccgtcctaag acccagaccc agaccc 36

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg ttgaacttta agtaggagat atatcc 46

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttccgcccc ccgtcctaag accc 24

<210> 12

<211> 436

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro

20 25 30

Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Thr Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

35 40 45

Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe

50 55 60

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln

85 90 95

Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu

100 105 110

Asn Met Pro Asn Leu Lys Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser

115 120 125

Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys

145 150 155 160

Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Asp Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn

165 170 175

Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser

180 185 190

Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln

195 200 205

Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

210 215 220

Tyr Lys Thr Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

225 230 235 240

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

245 250 255

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn

260 265 270

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

275 280 285

Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

290 295 300

Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

305 310 315 320

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Ser Gly Lys

325 330 335

Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn

340 345 350

Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp

355 360 365

Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val

370 375 380

Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln

385 390 395 400

Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val

405 410 415

Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Glu Arg

420 425 430

Arg Arg Glu Leu

435

<210> 13

<211> 612

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ala Ser Gly Pro Glu Ser Ala Tyr Thr Thr Gly Val Thr Ala Arg Arg

1 5 10 15

Ile Phe Ala Leu Ala Trp Ser Ser Ser Ala Thr Met Ile Val Ile Gly

20 25 30

Phe Ile Ala Ser Ile Leu Glu Gly Ala Thr Leu Pro Ala Phe Ala Ile

35 40 45

Val Phe Gly Arg Met Phe Ala Val Phe Thr Lys Ser Lys Ser Gln Ile

50 55 60

Glu Gly Glu Thr Trp Lys Tyr Ser Val Gly Phe Val Gly Ile Gly Val

65 70 75 80

Phe Glu Phe Ile Val Ala Gly Ser Arg Thr Ala Leu Phe Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Glu Arg Leu Ala Arg Asp Leu Arg Val Ala Ala Phe Ser Asn Leu

100 105 110

Val Glu Gln Asp Val Thr Tyr Phe Asp Arg Arg Lys Ala Gly Glu Leu

115 120 125

Gly Gly Lys Leu Asn Asn Asp Val Gln Val Ile Gln Tyr Ser Phe Ser

130 135 140

Lys Leu Gly Ala Val Leu Phe Asn Leu Ala Gln Cys Val Val Gly Ile

145 150 155 160

Ile Val Ala Phe Ile Phe Ala Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Ile Ala

165 170 175

Leu Ser Pro Leu Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Gln Met Ile Glu Met

180 185 190

Ser Gly Asn Thr Lys Arg Ser Ser Glu Ala Tyr Ala Ser Ala Gly Ser

195 200 205

Val Ala Ala Glu Val Phe Ser Asn Ile Arg Thr Thr Lys Ala Phe Glu

210 215 220

Ala Glu Arg Tyr Glu Thr Gln Arg Tyr Gly Ser Lys Leu Asp Pro Leu

225 230 235 240

Tyr Arg Leu Gly Arg Arg Arg Tyr Ile Ser Asp Gly Leu Phe Phe Gly

245 250 255

Leu Ser Met Leu Val Ile Phe Cys Val Tyr Ala Leu Ala Leu Trp Trp

260 265 270

Gly Gly Gln Leu Ile Ala Arg Gly Ser Leu Asn Leu Gly Asn Leu Leu

275 280 285

Ala Ala Phe Phe Ser Ala Ile Leu Gly Phe Met Gly Val Gly Gln Ala

290 295 300

Ala Gln Val Trp Pro Asp Val Thr Arg Gly Leu Gly Ala Gly Gly Glu

305 310 315 320

Leu Phe Ala Met Ile Asp Arg Val Pro Gln Tyr Arg Arg Pro Asp Pro

325 330 335

Gly Ala Glu Val Val Thr Gln Pro Leu Val Leu Lys Gln Gly Ile Val

340 345 350

Phe Glu Asn Val His Phe Arg Tyr Pro Thr Arg Met Asn Val Glu Val

355 360 365

Leu Arg Gly Ile Ser Leu Thr Ile Pro Asn Gly Lys Thr Val Ala Ile

370 375 380

Val Gly Gly Ser Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Gln Leu Leu Met

385 390 395 400

Arg Phe Tyr Asp Ile Glu Pro Gln Gly Gly Gly Leu Leu Leu Phe Asp

405 410 415

Gly Thr Pro Ala Trp Asn Tyr Asp Phe His Ala Leu Arg Ser Gln Ile

420 425 430

Gly Leu Val Ser Gln Glu Pro Val Leu Phe Ser Gly Thr Ile Arg Asp

435 440 445

Asn Ile Leu Tyr Gly Lys Arg Asp Ala Thr Asp Glu Glu Val Ile Gln

450 455 460

Ala Leu Arg Glu Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Val Met Ala Leu Pro Asp

465 470 475 480

Gly Leu Asp Thr Glu Val Gly Glu Arg Gly Leu Ala Leu Ser Gly Gly

485 490 495

Gln Lys Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala Ile Leu Lys His Pro Thr

500 505 510

Leu Leu Cys Leu Asp Glu Ser Thr Ser Ala Leu Asp Ala Glu Ser Glu

515 520 525

Ala Leu Val Gln Glu Ala Leu Asp Arg Met Met Ala Ser Asp Gly Val

530 535 540

Thr Ser Val Val Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Val Ala Arg Ala Asp

545 550 555 560

Leu Ile Leu Val Met Gln Asp Gly Val Val Val Glu Gln Gly Asn His

565 570 575

Ser Glu Leu Met Ala Leu Gly Pro Ser Gly Phe Tyr Tyr Gln Leu Val

580 585 590

Glu Lys Gln Leu Ala Ser Gly Asp Met Ser Ala Ala Gly Ser Glu Asn

595 600 605

Leu Tyr Phe Gln

610

<210> 14

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Glu

1 5 10 15

Ile Val Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ala Trp Gln His Ala Ala Phe Ile

20 25 30

Trp Ser Leu Phe Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu

35 40 45

Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser

65

<210> 15

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggtagata acaaattcaa caaagaatgg ctgagcgcgt acagcgagat cgtgacctta 60

cctaacttaa acgcgtggca acacgcggcc ttcatctgga gtttattcga tgacccaagc 120

caaagcgcta accttttagc agaagctaaa aagctaaatg atgctcaagc accaaaaggg 180

tctgggtctg ggtct 195

<210> 16

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg ttgaacttta agtaggagat atatccatgg tagataacaa 60

attcaacaaa gaatggctga gcgcgtacag cgagatcgtg accttaccta acttaaacgc 120

gtggcaacac gcggccttca tctggagttt attcgatgac ccaagccaaa gcgctaacct 180

tttagcagaa gctaaaaagc taaatgatgc tcaagcacca aaatggagcc atccgcagtt 240

tgaaaaatag gacggggggc ggaaa 265

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taatacgact cactatag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gggtctgggt ctgggtct 18

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggagccatc cgcagtttga aaaa 24

Claims

1.一种用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。

2.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述多个DNA分子的5’端还包含T7噬菌体RNA聚合酶启动子序列和核糖体结合位点序列，3’端还包含用于连接嘌呤霉素连接体的链接DNA序列和终止密码子。

3.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。

4.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述DNA库的DNA多样性为20¹³。

5.一种用于拟抗体筛选的RNA库，其特征在于：是由权利要求1-4任一所述的DNA库经转录反应获得。

6.一种拟抗体筛选库，其特征在于：是由权利要求5所述的RNA库经体外无细胞表达获得的RNA-拟抗体库，或者由所述RNA-拟抗体库经反转录获得的cDNA-拟抗体库。

7.包含权利要求1-4任一所述的DNA库或权利要求5所述的RNA库或权利要求6所述的拟抗体筛选库的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于拟抗体筛选的通用试剂；所述通用试剂包括PCR试剂、DNA提取与纯化试剂、体外转录试剂、RNA提取与纯化试剂、体外无细胞表达试剂，和/或反转录试剂。

9.一种拟抗体筛选库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)合成权利要求1-4任一所述的DNA库；

2)以所述DNA库为模板，合成RNA库；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，通过两步重叠PCR反应合成DNA库；第一步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的引物；第二步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示的引物；引物中的N为A，T，G，C的等摩尔混合物，K为G，T的等摩尔混合物；

步骤3)中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5’端修饰PO₄，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。

11.一种筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，其特征在于：使用权利要求6所述的拟抗体筛选库针对靶蛋白质进行拟抗体筛选。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)制备和纯化靶蛋白质，将靶蛋白质固定在固相载体上；

2)制备权利要求5所述的RNA库；

5)以RNA-拟抗体库为模板进行反转录，获得cDNA-拟抗体库；

7)向步骤6)得到的样本中加入洗脱液，获得筛选的cDNA；

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述固相载体为带有标签的磁珠，并且所述靶蛋白质含有能与所述磁珠相结合的标签。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5’端修饰PO₄，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤9)中，使用核苷酸序列如SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的引物进行定量PCR。

16.一种针对P-糖蛋白的拟抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

17.包含权利要求16所述的针对P-糖蛋白的拟抗体的试剂或试剂盒。