JP6967246B2 - エピトープタグ、並びにタグ付けされたポリペプチドの検出、捕捉及び/又は精製のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物医学研究、生化学及び細胞生物学の分野に関する。新規なエピトープが提示され、これは、タグを含む目的のポリペプチドの迅速かつ効果的な特徴付け、精製、及びイン・ビボ局在における使用のためのタグとして使用することができる。このタグはエピトープ特異的抗体によって特異的に認識され、抗体-タグ相互作用を可能にする。
ポストゲノム時代において、プロテオミクスの分野は劇的に成長した。分析からハイコンテントイメージング(high-content imaging)にわたる多数の用途のために、親和性ベースのアッセイが不可欠である。親和性ベースのアッセイは、受容体とリガンドとの間、例えば抗体と抗原との間のタンパク質-タンパク質-相互作用(PPI)の検出に依存している。抗原-抗体-相互作用のモニタリングの場合、アッセイは、免疫親和性アッセイとも呼ばれる。免疫親和性アッセイは、目的のポリペプチドの同一性、量、及び/又は局在を試験するための選択方法である。しかしながら、適切な抗体が利用できない場合がある。免疫親和性ベースのアッセイのこの欠点は、「エピトープタグ付け」と呼ばれる方法によって克服することができ、当該方法では、タンパク質はエピトープ、すなわち抗原タンパク質の結合部分でタグ付けされる。
本明細書及び特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるものとする多数の用語が参照されることになる:
本発明は、配列番号1によって定義されるエピトープペプチド配列に関する。
X4は、K又は置換とすることができ;
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ;
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、並びに
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ;
ここで、単離されたエピトープペプチドが、少なくとも9個のアミノ酸を含む場合、配列番号3により定義されたアミノ酸配列(RKAAVSHW)を含まない。
X1は、P又はAとすることができ;
X2は、D又はDの保存的置換とすることができ;
X4は、K又は置換とすることができ;
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ;
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ;
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ;並びに
X11及びX12は、Q又はQの保存的置換とすることができ;
ここで、単離されたエピトープペプチドが、配列番号3により定義されたアミノ酸配列(RKAAVSHW)を含まない。
エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体、これは本実施形態では、検出可能部分を含む必要はない;
少なくとも1つの二次結合パートナー、これは、エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体、タグ付けされたタンパク質、又は両方によって構築された複合体に結合することができる。二次結合パートナーは、検出可能部分を含むことができ、及び/又は固定化可能であり得る。
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
− 本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクト;
− 本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体;
− 任意により検出可能部分;並びに
− 本発明の捕捉及び/又は検出方法に必要な緩衝液及び試薬。
− 本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクト;
− 本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体;
− 任意により固体支持体;並びに
− 本発明の捕捉及び精製方法に必要な緩衝液及び試薬。
本発明の好ましい実施形態を以下の実施例で概説するが、実施例は本発明の範囲又は趣旨を限定するものとして解釈されるべきではない。
一価のBC2-Nbを固体マトリックスに共有結合することによって、BC2ナノトラップを生成した。これは、先に記載されたGFPナノトラップに類似した非常に効率的なプルダウン試薬として役立ち[4]、GFPナノトラップは細胞溶解物からGFPタグ付けされた複合体を精製するために広く使用されるようになる[5]。BC2ナノトラップの優れた結合特性は、例えば結合反応においてカオトロピック剤(最大4 Mの尿素又は1.5 MのGdmCl)又は変性界面活性剤(2% SDS)を用いる高度競合結合条件を適用する、プロテオーム解析に好ましい[6]。結合したタンパク質が変性条件下でのみ放出されるGFPナノトラップとは対照的に、BC2ナノトラップ-結合タンパク質は、単に少量のBC2-ペプチド(0.1〜1 mM)を用いるペプチド競合によって、機能的立体配座で溶出することができる。位置クローニングは、N又はC末端に配置されたBC2-タグが、BC2ナノトラップによって等しく十分に認識されることを明らかにした。N末端にタグ付けされたGFPのために、非結合画分における追加のバンドを観察した。これは、BC2-タグが細胞溶解時にタンパク質分解的に除去されたかもしれないことを示し、この現象は哺乳動物発現系における他のエピトープタグについて既に記載されている[7]。
記載されたNbsのほとんどが立体配座エピトープを有するので、観察された高親和性結合の根底にある分子機構を、BC2-Nb単独(1.8 Åの分解能)及びBC2Tとの複合体(1.0 Å)での高分解能結晶構造を解くことによって調査した。以後、結果の提示及び考察を容易にするために、BC2Tアミノ酸を1文字コードで、及びBC2-Nbアミノ酸を3文字コードで参照することにする。アミノ酸位置は、配列番号4に定義されたように、12個のアミノ酸からなるエピトープタグにおけるアミノ酸残基の位置を参照している(PDRKAAVSHWQQ)。
高親和性結合及び反応速度論は観察された構造的特徴によって説明することができるが、複合体形成の特異性は他になければならない。BC2T残基のサブセットのみがNbとの特異的な側鎖媒介性接触に関与しているので、位置走査ペプチドライブラリーを用いた結合のためのこれら個々のアミノ酸の寄与を調べた。合計で、ペプチドの1つの単一位置に20個全てのタンパク質構成(proteinogenic)アミノ酸を示す12個の異なるBC2Tライブラリーを、免疫沈降実験に使用した。BC2Tライブラリーを、液体クロマトグラフィー、次いで固定化されたBC2-Nb、BC2-NbR106S又はBC2-NbR106Eによる免疫沈降の前後に質量分析に供した。プルダウン後の非結合画分に残っているペプチドを決定することによって、非結合ペプチドの組成及びこれに対応する不変アミノ酸位置(以下の表4)をマッピングした。具体的には、BC2-Nb又はその突然変異体の上清、及び非BC2T関連対照Nb(GFP-特異的Nb)の上清におけるペプチドの比較分析によって、沈降したペプチドを同定した。GFP-Nbとの直接的な比較は、標識された標準を必要とせずに、ペプチド捕捉の定量的な程度の決定を可能にした。したがって、ペプチドがBC2-Nbによって捕捉されなかった場合、図2に与えられた比は1であるか又は1に近い。より多くのペプチドが捕捉されるほど、値は0に近づく。イソロイシン(I)とロイシン(L)ペプチドバージョンとは、これらペプチドが同重体であるために、区別することができなかった。しかしながら、I/Lを含む2つのペプチドバージョンは分割され、従って2つの値が結果として与えられる。
BC2-Nbの独自のリガンド結合様式に基づいて、BC2Tベースの親和性システムを開発することを目的とした。精製BC2-Nbをセファロースビーズに共有結合させ、「BC2ナノトラップ」と呼ばれる親和性マトリックスを生成した。まず、粗溶解物から直接BC2Tタグ付けされたタンパク質を沈殿させるBC2ナノトラップの能力を試験した。それゆえ、C末端にタグ付けされたGFP(GFPBC2T)又はwtGFP(対照)のいずれかを発現する大腸菌細胞の可溶性タンパク質画分をBC2ナノトラップとインキュベートし、インプット、非結合及び結合画分を、SDS-PAGE次いでクーマシー染色及びイムノブロッティングによって分析した(図3a)。得られたデータは、BC2ナノトラップが定量的にGFPBC2Tを沈殿させることを示している。次に、BC2T精製を、様々な非変性界面活性剤(NP-40、Triton X100、CHAPS又はTween 20、0.1〜1% w/v)の存在下又は増加する塩濃度(0〜500 mM NaCl、2 - 50 mM KCl、2〜20 mM MgCl2)で行った。これら試薬のいずれも結合効率に影響を及ぼさないようであった(データは示さず)。さらに、抗原結合を、結合緩衝液中のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又はカオトロピック剤(GdmCl;尿素)の濃度を上昇させることによって変性条件下で試験した。BC2ナノトラップが、2% SDS、4 Mの尿素又は最大で1.5 MのGdmClの存在下でその抗原を効率的に沈殿させることが観察された(図3b)。これは、BC2ナノトラップが厳しい条件下で機能的に活性なままであることを示している。
多数のナノボディが、細胞表面に位置する疾患関連抗原の分子イメージングについて記載されている[12-14]。今までのところ、細胞イメージングのためにナノボディを使用した研究はほとんどない[15]。それゆえ、蛍光標識されたBC2-Nb(有機色素AlexaFluor488又はATTO647と結合された(BC2-NbAF488;BC2-NbATTO647))がBC2タグ付けされた細胞タンパク質を可視化するのに適しているかを試験した。関連する細胞標的構造を生成するために、以前に記載された融合コンストラクトmCherry-VIMBC2T又はGFP-PCNABC2Tをヒト細胞で発現した(図4 a)。ビメンチンの蛍光コンストラクトは、細胞中間径フィラメントネットワークに組み込まれ、一過性細胞発現時に細胞質内でビメンチン繊維を可視化する一方で[16]、GFP-PCNAはDNA複製部位で見出され、細胞周期のS期中に核内で特徴的なスポット状の構造を形成する[17]。適用された融合タンパク質の特徴的なパターンは、色素標識BC2-Nbsによる免疫細胞化学を用いた共局在研究の実施を可能にする。
実施例3で概説したように、配列番号4の1、2、4、5、7、9、11及び12位のBC2T残基は置換することができることが実証された。これは、ペプチドの1つの単一位置に20個のタンパク質構成アミノ酸を全て表示する位置走査ペプチドライブラリーを用いて示された。
合理的な設計アプローチを用いて、BC2Tの変形を、BC2-Nbに対するBC2タグの親和性をさらに改善することを目的として開発した。この目的のために、配列番号4の1、4、5、11及び12位のBC2T残基を、図1及び表4における構造的及び生化学的データ、並びに分子モデリングに基づいて置換した。
発現プラスミド
C末端BC2タグ付きGFP(GFPBC2T)の細菌発現のために、pEGFP-C1(Clontech)を鋳型として使用した。GFPBC2Tをコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、オリゴヌクレオチドプライマーGFPBC2T_for(5´-GCA CCA TGG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G-3´;配列番号15)及びGFPBC2T_rev(5‘-GAC GTC GAC TTA CTG CTG CCA GTG ACT AAC A-3´;配列番号16)を用いて増幅した。PCR断片を、pTRC2A(Life Technologies)のNcoI/SalI制限部位にクローニングした。N末端His6-タグを有するC末端BC2タグ付きGFP(His6-GFPBC2T)の発現のために、GFPBC2Tをコードする配列を、PCRによって、オリゴヌクレオチドプライマーHis6-GFPBC2T_for(5´-CAG GGA TCC GAG TGA GCA AGG GC -3´;配列番号17)及びHis6-GFPBC2T_rev(5´-CAG GGT ACC TTA CTG CTG CCA GTG ACT AA -3´;配列番号18)を用いて増幅した。PCR断片をpRSET B(Invitrogen)のBamHI/KpnI制限部位にクローニングし、N末端His6-タグを付加する。
BC2ナノボディの発現及び精製を、先に記載されたように実施した[11]。wtGFP又はその修飾されたバージョンの発現及び精製を、先に記載されたように実施した[19]。全てのタンパク質の精製は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析に基づいて、少なくとも95%であると評価された。タンパク質濃度を分光学的に決定した。
複合体形成のために、2 mg/mlのBC2-Nb溶液を混合し、10 mM Tris/HCl pH 7.4、100 mMのNaCl緩衝液中の3倍モル過剰のペプチドと、1時間室温でインキュベートした。過剰のペプチドをサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 increase、GE Healthcare)によって除去した。複合体形成を液体クロマトグラフィー質量分析によって、Phenomenex Kinetex(2.6 u C18 100 Å)カラムを備えたShimadzu LCMS 2020を用いて確認した。複合体を13.7 mg/mlに濃縮し、結晶化実験に使用した。
ハンギングドロップ蒸気拡散を用いて、3.2 mg/mlのタンパク質溶液と結晶化緩衝液(0.1 M MES/イミダゾールpH 6.7、12.5% [v/v] 2-メチル-2,4-ペンタジオール(MPD)、7.5% [w/v] PEG 1000、7.5% [w/v] PEG 3350、3 mM アルコール混合物)とを、1:1比で20℃で混合することによって、リガンド非結合BC2-Nbを結晶化した。ハンギングドロップ蒸気拡散を用いて、13.7 mg/mlの複合体溶液と、結晶化緩衝液(0.1 M MES/イミダゾールpH 6.5、12.5% [v/v] 2-メチル-2,4-ペンタジオール(MPD)、12.5% [w/v] PEG 1000、12.5% [w/v] PEG 3350、4 mM アミノ酸混合物)とを、1:1比で20℃で混合して、BC2-Nb/BC2T複合体を結晶化した。いずれの場合にも、結晶を凍結保護のための30% [v/v] MPDを含有する結晶化溶液に移し、30秒間のインキュベーション後に液体窒素でフラッシュ冷却(flash cooled)した。BC2-Nbからの1つのデータセット、及び異なる位置におけるBC2-Nb/BC2T複合体の同じ結晶からの4つのデータセットを、Helmholtz-Zentrum Berlin(HZB)のBESSY IIのビームラインMX 14.2で0.918409 Åのビーム波長で収集した。
構造の重ね合わせ及びRMSD値の計算を、構造比較を用いて行った。結晶構造の画像をPyMol(http://www.pymol.org)で作成した。
BC2T及び由来する突然変異体の結合特異性を調べるために、配列PDRKAAVSHWQQ(配列番号4)の各アミノ酸位置についてのペプチドライブラリーを、N-末端又はC-末端にそれぞれ位置するアセチル基及びアミド基を用いて合成した(Intavis)。アガロースビーズ上に固定化された2 μlのBC2-Nbと単一位置ライブラリーの60 pmolのペプチドをインキュベートして、沈降研究を行った。インキュベーションを、300 μlのPBS/0.01% CHAPS中で1時間、HulaMixer(Life Technologies)上で行った。遠心分離ステップに続いて、10 μlの上清をLC-MS手順で分析した。ペプチドを、C18 PepMap100 μ-Precolumn(300 μm x 5 mm;粒径:5 μm;孔径:100 Å - Thermo Scientific)及びC18分析カラム(Acclaim Rapid Separation LC(RSLC)Column:150 mm x 5 mm;粒径:2.2 μm;孔径:100 Å - Thermo Scientific)から成る、UltiMate3000 RSLCnano System(Thermo Scientific)を用いて分離した。段階勾配を、8%で開始し、20分後に30%で終わる溶離剤B(80%アセトニトリル、20% H2O、0.1%ギ酸)に適用した。Q Exactive Plus質量分析計(Thermo Scientific)によって検出されたFULL-MS法を用いてペプチドを分析した。最大注入時間として、AGC targetを3E6に設定しながら、100 msを選択した。解像度を70.000に設定した。最大半量(Half-maximal)シグナル領域を参照して、アガロースビーズ上に固定化されたGFP-特異的ナノボディを用いて沈降アプローチを制御した。全ての実験は三連で行った。
10% FCS、2 mMのL-グルタミン及びPen Strep(全てGibco, Life Technologiesから)で補充したDMEM(高グルコース、ピルビン酸)中で、HEK293T及びHeLa細胞を培養した。細胞を、37℃で加湿チャンバー内5% CO2雰囲気で培養し、継代のためにトリプシン処理した。P100皿に一過性トランスフェクションのためのDNA/PEI複合体を生成するために、24 μgのDNAと、750 μlのOpti-MEM(Gibco、Life Technologies)で予め希釈した108 μlのポリエチレンイミン(PEI、Sigma Aldrich)とを混合し、10分間室温でインキュベートした。96-ウェルプレートでの細胞のトランスフェクションのために、200 ngのDNA及び1.5 μlのPEIを使用した。
1 L培養物に由来するGFP又はGFPBC2Tを発現する大腸菌細胞のペレットを、0.1 mg/mlのリゾチーム、5 μg/mlのDNaseI、50 μg/mlのPMSF及び1xのプロテアーゼインヒビターミックスB(Serva)を含有する500 μlのPBS中で、90分間4℃でホモジナイズし、超音波処理に続く(10 x 10 秒パルス)。遠心分離ステップ(10分、18.000 x g、4℃)後、可溶性タンパク質画分を新しいカップに移し、製造業者のプロトコルに従ってCoomassie Plus(Thermo Fisher Scientific)を用いて各溶解物のタンパク質濃度を決定した。
GFPBC2Tに対するBC2ナノボディ及びその示された突然変異体の親和性測定を、表面プラズモン共鳴分光法を用いてBiacore 3000 instrument(GE-Healthcare)で行った。GFPBC2Tを、500 RUの応答レベルにCM5センサーチップ(GE Healthcare)のデキストラン繊維上に共有結合した。1つのフローセルを、バックグラウンドを決定するためにタンパク質の非存在下で活性化及びブロックし、別のフローセルを非特異的結合に対する対照としてタグ付けされていないGFPでロードした。動態測定のために、BC2-Nb、BC2-NbR106S又はBC2-NbR106Eのいずれかの7.8125 nM〜250 nMの範囲の6つの濃度を注入した。各測定を二連で行った。ランニング/希釈緩衝液として、10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%界面活性剤Tweenを使用した。測定は25℃で行った。BC2-Nbの会合のために50 μl/分の流速を15秒間、及び解離のために50 μl/分の流速を600秒間適用した。30 μl/分の流速での23 μlの再生溶液の注入によって、再生を誘導した。再生溶液として、10 mMのグリシン-HCl pH 2.0を使用した。ソフトウェアBia evaluation 4.1、及び物質移動を伴う1:1 ラングミュア結合モデルを用いて、データを評価した。
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を標準的な手順に従って行った。タンパク質試料を、2x SDS-試料緩衝液(60 mM Tris/HCl、pH 6.8;2%(w/v)SDS;5%(v/v)2-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.02% ブロモフェノールブルー)中で煮沸した。イムノブロッティングのために、タンパク質をニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories)に転写した。
イムノブロッティングのために、以下の一次抗体を使用した:抗GFPクローン3H9(ChromoTek)、抗PCNAクローン16D10(ChromoTek)、抗VimentinクローンV9(Sigma Aldrich)、抗GAPDH(abcam)、抗β-カテニンクローン14(BD-Biosciences)。検出のために、蛍光色素分子標識された種特異的二次抗体(Alexa-647、ヤギ-抗-ウサギ、ヤギ-抗-ラット;ヤギ-抗-マウスLife Technologies)を使用した。Typhoon-Trioレーザースキャナ(GE Healthcare)でブロットをスキャンした。
eGFP、eGFPBC2T又はBC2TeGFP、eGFP-PCNA、eGFP-PCNABC2T、mCherry-Vimentin、mCherry-VimentinBC2Tを一過性に発現するHEK293T細胞を、洗浄して、リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)中で回収し、液体窒素中で瞬間凍結(snap-frozen)して、−20℃で保存した。細胞ペレットを、200 μlの溶解緩衝液(10 mM Tris/Cl pH 7.5、150 mM NaCl、0.5% NP40、1 μg DNaseI、2 mM MgCl2、2 mM PMSF、1x プロテアーゼインヒビターミックスM(Serva)中で、40分間氷上で繰り返しピペッティングすることによって、ホモジナイズした。遠心分離ステップ(10分、18.000 x g)後、各溶解物のタンパク質濃度を、製造業者のプロトコルに従ってPierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて決定し、タンパク質溶液を、希釈緩衝液(10 mM Tris/Cl pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM PMSF)を用いて1 mg/mlの濃度に調整した。上清の2%をSDS-含有試料緩衝液に添加した(インプットと称する)。100 μlの上清につき50 μlのBC2ナノトラップ(スラリー)を添加し、回転ローター(end-over-end rotor)で4℃で1時間のインキュベーションに続く。遠心分離ステップ(2分、2500 x g)後に、前もって除去した上清を新しいカップに移した。2%をSDS-含有試料緩衝液に添加した(非結合と称する)。4回の洗浄ステップ後、50 μlのSDS-試料緩衝液中でビーズを煮沸することによって、又は指示された溶出緩衝液とのインキュベーションによって、BC2ナノトラップ 結合タンパク質を溶出した。試料をSDS-PAGE、次いでイムノブロッティングによって分析した。イムノブロットを示された抗体でプローブした。
各条件について、50 μlのビーズ-スラリーを、大腸菌溶解物からの可溶性タンパク質の100 μl(c=1 mg/ml)、及び界面活性剤又はカオトロピック剤のいずれかを含有する溶液の150 μlと混合し、以下に示されるような最終濃度をもたらした。カオトロピック剤として、尿素(0 M、1 M、2 M、4 M)及び塩化グアニジニウム(0 M、0.375 M、0.75 M、1.5 M、3 M)を使用し、界面活性剤として、SDS(0%、0.1%、0.5%、1%、2%)を使用した。回転ローター上で1時間4℃でのインキュベーション、及び遠心分離ステップ(2分、2500 x g、4℃)後に、上清を捨て、残りのビーズをPBSで2回洗浄した後、50 μl 2 x試料緩衝液中で煮沸した。各ビーズ結合(B)画分の10%を、SDS-PAGE及び抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
溶出実験のために、BC2ナノトラップ(スラリー)の40 μlを、GFPBC2Tを発現する大腸菌細胞に由来する400 μlの可溶性タンパク質抽出物(c=1mg/ml)と、1時間4℃で、回転ローター上でインキュベートした。遠心分離ステップ(2500 x g、4℃、2分)後、上清を捨て、ビーズを、2回目の洗浄ステップの後のカップの交換を含めて、4回氷冷PBS中で洗浄した。その後、ビーズをペレット化し、示された溶出条件の80 μlと15分間室温でインキュベートした。以下の溶出条件を試験した:ペプチド溶出:0.2 M Tris/Cl pH 7.4、150 mM NaClに溶解した、0 mM、0.01 mM、0.1 mM又は1 mMのBC2-ペプチド;酸性溶出:pH 1、pH 2又はpH 3に調整した0.2 Mのグリシン-HCl;アルカリ性溶出:0 mM、1 mM、10 mM又は100 mMのNaOH;チオシアン酸ナトリウムによる溶出:0 M、1 M、2 M、又は3 MのNaSCN。溶出液を収集し、1 x SDS含有試料緩衝液中で煮沸し、残りのビーズをPBSで2回洗浄した後、40 μl 2 x 試料緩衝液中で煮沸した。各溶出(放出、R)及びビーズ結合(結合、B)画分の10%を、SDS-PAGE及び抗GFP 抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
精製したBC2 ナノボディ(1 mg)を、NHS-活性化蛍光色素Alexa488(Life technologies)又はAtto647(Atto-Tec)を用いて、製造業者のガイドラインに従って標識した。カップリング後、PD-10 Desalting Columns(GE Healthcare)で分離することによって未結合色素を除去した。イムノブロット分析のために、BC2-NbAF488の5 μgを、4 mlの3%BSA(TBSで希釈)、0.05% Tween20で希釈し、ウェスタンブロットを1時間室温でインキュベートした。
蛍光アッセイを、96ウェルマイクロプレート(Nunc)をTyphoon Trio(GE Healthcare Life Sciences)、励起:488 nm、発光フィルター設定:520 nm BP 40でスキャンすることによって行った。
BC2T及び改善された変形pTag1及びpTag2に対するBC2-Nbの親和性測定を、BLItzシステム装置(forteBIO)を用いるバイオレイヤー干渉法を用いて行った。BC2T及びその変形のビオチン化ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサー(forteBIO)に固定化した。こうして用意したセンサを、ベースラインシグナルを決定するためにBLItz緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、0.1%(m/v)BSA、0,02%(v/v)Tween20)に120秒間、会合を決定するためにBLItz緩衝液(5〜50 nMの濃度)中のBC2-Nbの溶液に120秒間、そして解離を決定するためにBLItz緩衝液に600秒間、浸漬した。振とう速度は1200 rpmであった。参照として、各ペプチドをまた、上記プロトコルに従ってBLItz緩衝液のみとインキュベートした。対照実験では、ストレプトアビジンバイオセンサーを、事前のペプチド固定化なしにBC2-Nbとインキュベートした。(3回繰り返して)10mMのグリシンpH 2.0及びBLItz緩衝液に順次浸漬することによって、センサを再生した。生データを、ソフトウェアBLItz Pro(forteBio)及び1:1結合モデルを用いて分析した。
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Claims (28)
X 1 は、P又はAとすることができ、
X 2 は、D又はDの保存的置換とすることができ;
X4は、K又はKの保存的置換、あるいはセリンとすることができ;
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ;
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ、
X 11 及びX 12 は、Q又はQの保存的置換とすることができ、
ここで、前記単離されたエピトープペプチドが、配列番号3により定義されたアミノ酸配列(RKAAVSHW)を含まない、単離されたエピトープペプチド。
配列番号33により定義されたアミノ酸配列(PDRVRAVSHWSS)を有するか、又は
配列番号34により定義されたアミノ酸配列(ADRVRAVSHWSS)を有する、
単離されたエピトープペプチド。
a)エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドを、試料に、請求項10に記載された宿主細胞に、又は請求項10に記載された宿主細胞の細胞溶解物に投与し、ここで、前記親和性リガンドは検出可能部分を含み;
b)前記検出可能部分を検出することによって、エピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在、細胞内局在及び/又は量を決定すること、
を含む、方法。
a)エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドを、試料に、請求項10に記載された宿主細胞に、又は請求項10に記載された宿主細胞の細胞溶解物に投与し;
b)ステップa)の親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築された複合体に結合することができる少なくとも二次結合パートナーを投与し、ここで、前記二次結合パートナーは、検出可能部分及び/又は固定化された部分若しくは固定化可能部分を含み;
c)前記検出可能部分を検出することによって、エピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在、細胞内局在及び/又は量を決定すること、
を含む、方法。
エピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在及び/又は量の決定がウェスタンブロットによって行われる、請求項12又は13に記載の方法。
a)コンストラクト又は目的のポリペプチドを含む試料を、エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドと接触させ、ここで、結合の前又は後に、前記親和性リガンドが固体支持体に付着され;
b)ステップa)の固体支持体を洗浄して、未結合及び非特異的結合成分を除去すること、
を含む、方法。
a)コンストラクト又は目的のポリペプチドを含む試料を、エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドと接触させ;
b)ステップa)の後に得られた試料を、ステップa)の親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築された複合体に結合することができる二次結合パートナーと接触させ、ここで、結合前又は後の前記二次結合パートナーが固体支持体に付着され;
c)ステップb)の固体支持体を洗浄して、未結合及び非特異的結合成分を除去すること、
を含む、方法。
前記コンストラクト又は目的のポリペプチドを溶出させること、
をさらに含む、請求項15又は16に記載の方法。
a)請求項5に記載された核酸、あるいは請求項6から9のいずれか一項に記載された核酸発現コンストラクト;
b)請求項1又は2に記載されたエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンド;
c)請求項12から20のいずれか一項に記載された方法に必要な緩衝液及び試薬、
を含む、キット。
a)請求項5に記載された核酸、あるいは請求項6から9のいずれか一項に記載された核酸発現コンストラクト;
b)請求項1又は2に記載されたエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンド;
c)請求項12から20のいずれか一項に記載された方法に必要な緩衝液及び試薬、
を含む、キット。
以下:
d)親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築される複合体に特異的な二次結合パートナーであって、固体支持体に付着され又は固定化可能である、二次結合パートナー;
e)請求項1又は2に記載された単離されたエピトープペプチド;
f)固体支持体であって、以下、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン、合成ポリマー及びコポリマー、ラテックス、シリカ、アガロース、金属、ガラス、及び炭素、を含む群から選択される、固体支持体、
の1つ又は複数をさらに含む、請求項25に記載のキット。
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