CN108291229A - 用于检测、捕获和/或纯化标记的多肽的表位标记和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型表位，其可以被用作用于快速和有效表征、纯化和亚细胞定位感兴趣的多肽的方法的标记，该感兴趣的多肽包括该标记。标记被表位特异性抗体特异性地识别，其可以被用于检测、捕获、定量和/或纯化使用本发明的表位标记的感兴趣的多肽。

Description

用于检测、捕获和/或纯化标记的多肽的表位标记和方法
技术领域
本发明涉及生物医学研究、生物化学和细胞生物学领域。呈现了可以被用作标记的新型表位，该标记用于快速和有效表征、纯化和体内定位包括该标记的感兴趣的多肽。标记由表位特异性抗体特异性地识别，其允许抗体-标记相互作用。
背景技术
在后基因组学时代，蛋白质组学领域已经显著地发展。对于质谱分析至高内涵成像范围内的大批应用，基于亲和力的分析是不可或缺的。基于亲和力的分析依赖于受体和配体比如抗体和抗原之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的检测。在监测抗原-抗体相互作用的情况下，分析也被称为免疫亲和分析。免疫亲和分析是用于测试感兴趣多肽的同一性、数量和/或位置的选择方法。然而，存在其中没有合适的抗体可利用的情况。基于免疫亲和力的分析的缺点可以通过称为“标记表位(epitope tagging，附加表位)”的方法克服，其中使用表位——即抗原蛋白的结合部分——标记蛋白质。
标记表位是借助遗传工程将已知的表位融合至重组蛋白的技术。通过选择对其抗体可利用的表位，该技术允许检测对其没有抗体可利用的蛋白质。自二十世纪八十年代末以来，标记表位已经成为标准的分子遗传学方法，用于使得能够快速和有效表征、纯化和体内定位克隆基因的蛋白质产物。
在蛋白质组学的早期，第一批可商购的标记最初被设计用于蛋白质纯化。这些早期标记的实例是FLAG、6×HIS和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统。6×HIS标记依赖于金属亲和力和GST系统依赖于GST对谷胱甘肽的亲和力。FLAG是商业使用的第一批表位标记(epitope tag，附加表位)中的一种。
后来，荧光蛋白报道分子比如绿色荧光蛋白(GFP)的发现使得在不需要第二试剂的情况下细胞内检测蛋白质是可能的。在此情况下，使用GFP的全长蛋白质序列标记感兴趣的蛋白质，致使标记的感兴趣的蛋白质发荧光。
然而，包括全长蛋白质比如GST麦芽糖-结合蛋白(MBP)或GFP的标记的问题在于它们有时在空间上干扰亚细胞蛋白质定位或折叠，其可能危害或废除待分析的蛋白质的天然功能。
因此，已经研发了众多基于小肽的表位标记，比如c-myc、V5、HA、CBP或FLAG。这样的标记具有合成起源(FLAG)或源自病毒(HA、V5)或内源性哺乳动物(c-myc、CBP)蛋白质。它们的特征在于8-26个氨基酸残基的大小并且通过经典的IgG(多克隆或单克隆)检测。源自内源性蛋白质的标记的一个问题是如下事实：标记特异性抗体通常也结合至内源性蛋白质。如果标记和抗体之间的相互作用不是特异性的，则分析可能给出假阳性。由于作为抗体的结合配偶体的标记的蛋白质和内源性蛋白质之间的竞争，分析将是低效的。
虽然使用标记特异性抗体，许多免疫亲和捕获系统是可利用的，但是仍然存在严峻的问题，这是由于低亲和结合、非特异性相互作用、批次间差异或抗体在共价偶联至固体表面之后降低的功能。
另外，已知的免疫亲和检测和/或捕获系统的具体问题是它们依赖由脊椎动物免疫系统进化的常规抗体来检测标记表位的蛋白质。
因而，本发明的目标是提供免疫亲和检测和/或捕获系统，其特征在于高亲和力、特异性和再现性。
而且，本发明的目标是提供表位标记，其可以与表位特异性抗体特异性地、可靠地、再现性地和以高亲和力地相互作用。本发明的进一步的目标是提供基于免疫亲和力的分析的必要组分，该分析适合可靠地、特异性地和高效地检测感兴趣的多肽，其可以例如被用于细胞成像或直接抗原检测。
本发明的进一步的目标是提供基于免疫亲和力的分析的必要组分，该分析适合可靠地、特异性地和高效地纯化感兴趣的多肽。
另外，本发明的目标是提供用于捕获和/或检测的系统，具体地可以被用于不同类型的分析、用于通过微观和生物化学研究的组合分析等的系统。
进一步的目标是提供用于重组蛋白的稳健的纯化方法，其允许使用非变性或变性条件。
附图说明
参照下列附图进一步说明本发明。
图1显示了BC2-纳米抗体(BC2-Nb)和BC2-Nb/BC2T复合体的结构分析。
(a)显示了BC2-Nb/BC2T骨架相互作用。BC2-肽(BC2T)(粉色)折叠为β-链，其是由互补决定区3(CDR3，蓝色)与框架区2和3(灰色)形成的β-折叠结构的一部分。显示了13个骨架-骨架氢键(黑色虚线)，其中一个由水介导(红色球体)。CDR3贡献了这些相互作用中的八个并且框架区贡献了这些相互作用中的五个。CDR1(淡黄色)和CDR2(黄色)不参与结合。
(b)显示了所谓的“头锁(headlock)”相互作用。CDR3(蓝色)的Arg106和FR2中的Glu44之间电荷介导的相互作用稳定BC2-Nb/BC2T复合体。这些氨基酸侧链越过(reachover)肽(粉色)，形成将肽锁入其结合位点的盐桥。
(c)显示了特异性BC2-Nb/BC2T相互作用。除骨架相互作用之外，由侧链介导的少量相互作用生成对BC2T肽序列的特异性。BC2T残基W10参与和Cys50的CH-π相互作用(虚线)。水分子(红色球体)被肽氨基酸S8(粉色)、Tyr109、两个羰基和一个氨基结合。也显示了Arg106(CDR3)和Glu44(FR2)的侧链之间电荷介导的相互作用，该侧链越过肽。
图2显示了介导BC2T结合特异性的残基的鉴定。
使用固定化在琼脂糖上的BC2-Nb(黑色条)、BC2-NbR106S(淡灰色)和BC2-NbR106E(深灰色)培育BC2T位置序列变体文库(n＝3)。在沉淀后，上清液经受液相色谱法，接着是质谱分析。具体地，通过计算由如下产生的信号比鉴定沉淀的序列变体：在BC2-Nb的上清液或指示的突变体和非BC2T相关对照Nb(GFP特异性Nb)的上清液中的肽。显示了(a)BC2TR3X、(b)BC2TA6X、(c)BC2TS8X和(d)BC2TW10X的序列变体文库的结果(完整结果参见表1)。改变的位置在BC2T序列中被指示为X。根据氨基酸侧链的物理化学性质：非极性、极性和带电的，对氨基酸进行分组。在文库合成中使用γ-氨基丁酸代替半胱氨酸。显示了三个独立实验的平均值和标准差(s.d.；误差线)。
图3显示了使用BC2纳米陷阱(nanotrap)一步纯化BC2标记的蛋白质。
(a)对于免疫沉淀，使用固定化在琼脂糖上的BC2-Nb(BC2纳米陷阱)培育表达具有C-端BC2标记(GFPBC2T)的GFP或单独地GFP的细菌溶胞产物的可溶性蛋白质级分。输入物(input)(I)、未结合的(NB)和结合的级分(B)通过SDS-PAGE进行分离并且通过考马斯蓝(顶部)或通过免疫印迹分析(底部)可视化。
(b)BC2纳米陷阱在严苛条件下高效地结合其表位。源自细菌提取物的GFPBC2T在增加浓度的SDS(0-2％)、尿素(0-4M)或盐酸胍(0-3M)下培育并且如(a)中描述地沉淀。显示了在指示条件下的输入物(I)和结合的级分。
(c)BC2标记的蛋白质使用碱性pH或肽洗脱高效地释放。结合至BC2纳米陷阱的GFPBC2T经受使用硫氰酸钠(NaSCN，1-3M)的洗脱、酸性洗脱(0.2M甘氨酸pH 1-2.5)、碱性洗脱(pH 10-12)或肽洗脱(0-1mM)。释放的(R)和结合的(B)级分的等分试样通过使用抗-GFP抗体的免疫印迹进行分析。
(d)BC2纳米陷阱结合来自人细胞溶胞产物的BC2标记的蛋白质，与BC2标记位于N-端还是C-端无关。对于免疫沉淀BC2标记的蛋白质，如(a)中描述的，使用BC2纳米陷阱培育表达BC2TeGFP、eGFPBC2T或单独地eGFP的HEK293T细胞的可溶性蛋白质级分。输入物(I)、未结合的(NB)和结合的级分(B)通过SDS-PAGE进行分离并且通过考马斯蓝染色(顶部)或通过免疫印迹分析(底部)可视化。
图4显示了使用荧光标示的BC2纳米抗体的免疫细胞化学实验的结果。
(a)显示了用于共定位研究的BC2标记的融合蛋白和荧光标示的BC2-Nb的示意图。BC2T序列被遗传融合至mCherry-波形蛋白(mCherry-VIMBC2T)和eGFP-PCNA(eGFP-PCNABC2T)的C-端。
(b)分别使用甲醇或PFA固定异位表达mCherry-VIMBC2T或eGFP-PCNABC2T的海拉细胞，接着使用指示的荧光标示的BC2-Nb和DAPI进行染色。比例尺25μm。
图5显示了未配位的BC2-Nb和相应的BC2-Nb/BC2T复合体的结构。
(a)显示了未配位的BC2-Nb结构的带状图。标注了形成两个二硫键的四个半胱氨酸残基。以橙色突出CDR3，其贡献与配位的结构中的肽的接触，和在结合之后经受氨基酸翻转。
(b)显示了未配位的和配位的BC2-Nb结构的叠加。两种结构的比较揭示了两个氨基酸的180度翻转。在BC2-Nb结构中，Arg106与Glu108的羰基相互作用，并且Tyr107参与和Arg45的阳离子π-相互作用(橙色带状踪迹)。Arg106的β-碳朝向Nb取向和Tyr107远离Nb。在肽结合的复合结构中，这是反过来的(蓝色带状踪迹)。Arg106参与“头锁”结合，并且Tyr107与Arg104的羰基形成氢键。
图6显示了BC2-肽与BC2-Nb的相互作用的示意图。
BC2-肽被显示具有粉色的侧链。其乙酰化的N-端在顶部并且酰胺化的C-端在底部。在内的所有极性相互作用以黑色虚线表示，其中对于骨架，来自BC2-Nb的它们的相互作用配偶体为绿色，并且对于侧链相互作用，为黄色。水分子以蓝色显示。在内的相关疏水相互作用以灰色虚线表示。
图7显示了头锁-基序的突变导致BC2纳米抗体的增加的解离速率(off-rate)。对于基于表面等离子体共振波谱学(SPR)的亲和力测量，具有C-端BC2-标记的GFP(GFPBC2T)(a-c)或单独地GFP(d)被固定化在CM5-芯片上。通过注入8nM-250nM范围内的六种浓度的BC2-Nb(a)、BC2-NbR106S(b)或BC2-NbR106E(c)进行动力学测量。获得的数据集使用具有质量转移的1:1朗缪尔结合模型进行评估。作为对照，仅测试BC2-Nb结合至GFP(d)。表3中概述了获得的按照解离常数(KD)表达的亲和力，以及针对BC2-Nb和相应的突变体测定的缔合(kon)和解离速率常数(koff)。
图8显示了可以在天然条件下洗脱由BC2纳米陷阱捕获的蛋白质。
源自细菌溶胞产物的GFPBC2T被BC2纳米陷阱结合并且经受使用如图3c中描述的缓冲条件的洗脱。使用激光扫描仪可视化和定量释放的GFPBC2T的荧光信号强度。上图显示了洗脱的GFPBC2T与完全溶胞产物比较的荧光强度。下图：针对不同洗脱条件获得的GFP-荧光的定量。从未处理的溶胞产物获得的GFP-荧光被设定为1。显示了三个独立实验的平均值和s.d.(误差线)(R1-R3)。
图9显示BC2-Nb对免疫沉淀和检测BC2标记的蛋白质是功能性的。
(a)对于免疫沉淀，使用BC2纳米陷阱培育表达eGFP-PCNA(对照)或BC2标记的eGFP-PCNA(eGFP-PCNABC2T)(左图)或mCherry-波形蛋白(mCherry-VIM，对照)或BC2标记的mCherry-VIM(mCherry-VIMBC2T)的HEK293T细胞的可溶性蛋白质级分。输入物(I)、未结合的(NB)和结合的级分(B)通过SDS-PAGE进行分离并且通过使用抗-PCNA或抗-波形蛋白抗体的免疫印迹分析可视化(上图)。作为加样对照，使用抗-GAPDH抗体探测印迹(下图)。
(b)对于使用荧光标示的BC2-Nb(BC2-NbAF488)的蛋白质印迹检测，指示量的输入物级分(如(a)中显示的)经受SDS-PAGE和免疫印迹。使用BC2-Nb488探测蛋白质印迹，接着使用抗-PCNA(左图)或抗-波形蛋白(右图)抗体进行检测。作为加样对照，使用抗-GAPDH抗体(下图)探测印迹。
(c)显示与过表达的BC2标记的蛋白质比较，BC2纳米陷阱仅沉淀少量的内源性β-联蛋白。如图3d的(a)中描述的样品经受使用抗-β-联蛋白抗体的免疫印迹分析。箭头指示β-联蛋白特异性信号。
图10显示了通过免疫细胞化学使用荧光标示的BC2纳米抗体获得的结果。
(a)显示了mCherry-波形蛋白BC2T与BC2-NbAF488的共聚焦成像。使用甲醇固定异位表达mCherry-VIMBC2T的海拉细胞，接着使用荧光标示的BC2-Nb和DAPI进行染色。图4b中上图的左下角中显示了细胞的最大投影图像(7个平面的z-叠层)。比例尺10μm。
(b)显示了BC2-NbAF488和BC2-NbATTO647的特异性。分别使用甲醇或PFA固定异位表达未标记的mCherry-VIM或eGFP-PCNA的海拉细胞，并且使用指示的荧光标示的BC2-Nb和DAPI进行染色。比例尺25μm。
图11显示了本发明的BC2标记的变体。原始的BC2T序列(PDRKAAVSHWQQ；SEQ IDNO:4)在所有位置的50％中修饰，产生序列PVRSAALSQWSS(BC2T突变体；SEQ ID NO:5)。
标记的原始和修饰版本二者C-端融合至GFP。不具有BC2标记的GFP被用作阴性对照。在大肠杆菌中表达蛋白质。制备溶胞产物并且使用固定化在琼脂糖上的BC2纳米抗体免疫沉淀100μg总溶胞产物。通过SDS-PAGE接着考马斯染色(上图)或使用抗-GFP抗体的免疫印迹(下图)分析输入物(I)、未结合的(NB)和结合的(B)级分。
图12显示了BC2标记的长度变异。原始的BC2T序列(PDRKAAVSHWQQ；SEQ ID NO:4)被缩短，产生序列PDRKAAVSHW(BC2T-10；SEQ ID NO:14)和RKAAVSHW(BC2T-8；SEQ ID NO:3)。缩短和原始版本的标记C-端融合至GFP(GFP-BC2T-10；GFP-BC2T-8，GFP-BC2T)。作为阴性对照，使用不具有BC2标记的GFP。在大肠杆菌中表达蛋白质。制备溶胞产物并且使用固定化在琼脂糖珠上的BC2纳米抗体免疫沉淀100μg总溶胞产物。通过SDS-PAGE接着使用抗-GFP抗体的蛋白质印迹分析输入物(I)、未结合的(NB)和结合的(B)级分。结果显示作为C-端标记的BC2T-10序列(PDRKAAVSHW；SEQ ID NO:14)或BC2T-8序列(RKAAVSHW)通过表位特异性BC2纳米抗体与原始BC2T的12个氨基酸(PDRKAAVSHWQQ)一样被高效地识别。
图13显示了与野生型BC2标记相比具有改进的结合亲和力的BC2标记的两种变异。基于生物层干涉量度法(biolayer interferometry)(BLI)的亲和力测量被用于评估与原始的BC2T序列(c:BC2T SEQ ID NO:4)比较，原始的BC2T序列的两种改进的变异(a:PDRVRAVSHWSS，pTag1 SEQ ID NO:33；b:ADRVRAVSHWSS，pTag2 SEQ ID NO:34)。BC2T和其改进的变异被合成为如下肽——其具有通过乙二醇连接体附连的N-端生物素并且固定化在链霉亲和素生物传感器上。结合动力学通过使用4-5种浓度的BC2-Nb(5-50nM)培育固定化的肽进行分析，并且使用1:1结合模型进行评估。表5中概述了获得的解离常数(KD)、缔合(kon)和解离速率常数(koff)。
图14显示了BC2标记的两种改进的变异进行蛋白质纯化和免疫沉淀的应用。
(a)蛋白质纯化：使用N-端或C-端标记有原始BC2标记BC2T(SEQ ID NO:4)或其改进的变异(pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34)的蛋白质mCherry培育BC2纳米陷阱。随后，使用100μM的浓度下的相应的游离肽洗脱结合的蛋白质。使用SDS-PAGE和考马斯染色分析输入物(I)、未结合的蛋白质(NB)、通过肽洗脱释放的蛋白质(R)和在洗脱后仍结合的蛋白质(B)的级分。
(b)免疫沉淀：BC2纳米陷阱被用于沉淀N-端融合有来自人细胞系HEK293T、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)昆虫细胞系High5和酿酒酵母(yeast Saccharomyces cerevisiae)的溶胞产物的BC2标记变异pTag1 SEQ ID NO:33的蛋白质mCherry。使用SDS-PAGE和考马斯染色分析输入物(I)和结合的蛋白质(B)的级分。
定义
在本说明书和权利要求中，将提及大量术语，它们应当被定义为具有下列含义：
术语“表位肽”或“表位标记”应当指的是被用作标记的本发明的肽序列；两个术语可互换地使用。本发明的表位肽是包括至少如权利要求1中限定的SEQ ID NO:1的8个氨基酸序列的任何肽，其中，当分离的表位肽包括至少9个氨基酸时，其不包括如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)。表位肽或表位标记可以是分离的序列或可以是序列的一部分。
术语“多肽”指的是任何类型的多肽或蛋白质并且包括任何氨基酸序列，其中氨基酸经由肽键连接，比如至少10个氨基酸长度的氨基酸序列，条件是表位标记和多肽的构建体不是β-联蛋白。术语多肽非常一般性地用于本申请并且也应当包括肽，比如寡肽。术语多肽和蛋白质可互换地使用。
术语“感兴趣的多肽”或“感兴趣的蛋白质”应当指的是具有某一功能或性质的任何类型的多肽或蛋白质，比如生理学活性分子，并且包括具有期望性质或功能的所有结构变体和序列变体。具体而言，该术语应当涵盖任何类型的肽和蛋白质以及融合蛋白。两个术语可互换地使用。
术语“融合蛋白”或“融合多肽”应当指的是通过接合两个或更多个多肽或至少一个多肽和至少一个肽或至少一个多肽和至少一个寡肽形成的蛋白质或多肽。例如，“融合蛋白”可以指的是包括融合有表位肽的氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列的多肽。融合蛋白或融合多肽可以包括一个或多于一个多肽和一个或多于一个表位肽。而且，融合肽可以经由桥或连接体序列接合。表位肽优选地融合至蛋白质的氨基酸序列的N-或C-末端——直接地或经由连接体分子。
连接体是任何单元，其连接分子的两个部分，比如两个核酸，两个肽或蛋白质，标记和感兴趣的蛋白质，或核苷酸、肽或蛋白质和运载体。可以使用出于此用途已知的任何单元，只要其不干扰分子的功能。当连接的成员是核酸时，连接体可以由核苷酸组成，例如3至150个核苷酸，或当两个部分中的至少一个是肽或蛋白质，或另一种桥联分子时，连接体可以是一个氨基酸或具有2至50个氨基酸的氨基酸序列。
本发明的表位肽的变体是肽，其包括在位置1、4、6和8上具有SEQ ID NO:3的氨基酸1、4、6和8的至少8个氨基酸，而其余氨基酸可以是SEQ ID NO:3的氨基酸并且那些中的至少一个是在大小、极性和/或电荷方面类似于SEQ ID NO:3的“原始”氨基酸的另一种氨基酸。换句话说，如本说明书中使用的术语“变体”指的是衍生自或对应于SEQ ID NO:3的序列，其中氨基酸的至少12.5％和高至25、或37.5、或50％通过置换如保守置换被替换。例如，赖氨酸也可以被丝氨酸置换，而不改变肽的功能。本发明的变体可以是如上面限定的表位肽，其中SEQ ID NO:3的序列的8个氨基酸中的4个可以被置换，而基本上不改变肽的功能。包括3个保守置换的具有8个氨基酸残基的本发明的表位肽的变体——其产生37.5％保守置换的变体——已经显示在实施例中是活性的。
位于C-末端或N-末端处的本发明的表位标记意思是没有其它衍生自感兴趣的多肽的序列的氨基酸残基在N-末端处的表位标记的序列之前或在C-末端处的表位标记的序列之后。然而，不衍生自感兴趣的多肽的原始序列的序列，比如进一步的标记或连接体序列，可以在本发明的C-或N-端标记之后或之前。
当在本申请中使用时，术语“纯化”应当指的是感兴趣的化学或生物化学实体的任何类型自材料比如生物化学材料的物理分离。实例是自生物化学物质如组织或肉汤纯化多肽。纯化的实体也可以被称为分离物。蛋白质或多肽纯化可以包括意欲从样品分离或富集一种或几种蛋白质的一个步骤或一系列步骤。纯化对感兴趣的蛋白质的功能、结构和相互作用的表征是至关重要的。纯化可以包括将蛋白质与样品的非蛋白质部分分离或将期望的蛋白质与其它蛋白质分离。纯化的结果可以是分离的蛋白质或样品，其中多肽被富集。在本申请中，术语“纯化”涵盖任何类型的分离并且涵盖分开以及富集。
术语“样品”指的是被用于任何类型的测定或纯化方法的样本或数量。样品包括感兴趣的标记和/或蛋白质，其可以是液体或固体。在本发明的背景下，样品通常可以是包括感兴趣的蛋白质的复杂混合物，比如细胞、组织或细胞溶胞产物。样品也可以是通过包括细胞的液体离心获得的上清液，其中细胞能够将感兴趣的蛋白质分泌入液体。样品也可以是任何类型的体液的样本，如血液、尿、液剂(liquor)、汗、泪等。
术语“第二结合配偶体”指的是如下化合物：其可以特异性地或非特异性地结合至标记的多肽、表位特异性亲和配体比如抗体或通过二者形成为第一结合配偶体的复合体，直接地或经由多肽或亲和配体比如抗体处提供的单元。结合对的一个实例是表位特异性抗体和Fc特异性抗体的恒定部分。结合对的另一个实例是在标记的多肽或表位特异性抗体和链霉亲和素上存在的生物素部分。作为第二结合配偶体的进一步的实例是针对复合体的抗体。第二结合配偶体可以被用于分离复合体和/或用于检测复合体。出于此目的，第二结合配偶体可以携带可固定化的基团、可检测的基团等。
发明内容
本发明涉及在SEQ ID NO:1中限定的表位肽序列。
令人惊讶地发现包括至少SEQ ID NO:3的八个氨基酸(RKAAVSHW)或其变体的肽序列作为表位标记是有用的。此氨基酸序列对特异性结合是足够的，因为其抗体对表位的亲和力足够高以确保与标记的特异性和可靠的相互作用。另外，已经发现基于本发明的表位肽的捕获和/或检测系统具有非常期望的性质。例如，已经显示标记表位的蛋白质以～1.4nM的KD被表位特异性抗体结合，其转化为与现有技术中可利用的系统比如FLAG、HA、c-myc或纳米抗体衍生的EPEA-系统比较～10-100倍更高的亲和力。本发明的表位肽是极通用的；其可以被用作C-端或N-端标记并且显示在温和或严苛条件下与相应抗体的强结合。可以使用一个或多个标记，其可以是相同的或不同的，只要标记中的至少一个是本发明的表位标记，并且其可以位于多肽的不同末端上或其可以串联式或以任何其它顺序排列。具体而言，本发明的检测和/或捕获系统通常由于其独特的结合特性显示强的亲和力和结合效率。
而且，令人惊讶地发现仅SEQ ID NO:3的四个氨基酸(参照SEQ ID NO:3中的氨基酸残基，位置1处的R、位置4处的A、位置6处的S和位置8处的W)对标记特异性抗体的特异性结合是必需的，并且其余位置可以被置换，比如被在大小、极性和/或电荷方面类似于“原始”氨基酸的另一种氨基酸置换，并且优选地被保守置换，而不显著地消极影响结合特异性和亲和力。已经发现表位标记——其在高至50％的如SEQ ID NO:4中限定的多肽中包括的氨基酸处包括置换，优选地保守置换——仍然确保标记特异性抗体与标记的蛋白质的高效的和可靠的相互作用。也已经发现在一个末端或两个末端上具有另外的氨基酸的肽提供与肽特异性抗体的高效的和可靠的相互作用。作为实例，具有氨基酸序列PVRSAALSQWSS(SEQID NO:5)的修饰的标记或表位肽被用于高效地纯化标记的GFP蛋白质(参见图11)。修饰的标记或表位肽的进一步的实例具有如由SEQ ID NO:33限定的氨基酸序列(PDRVRAVSHWSS)，或如由SEQ ID NO:34限定的氨基酸序列(ADRVRAVSHWSS)。
已经发现本发明的表位标记可以进一步包括侧接中央标记序列的氨基酸。虽然可以使用长度多于25个氨基酸的标记序列，但是有利的是提供小标记以最小化标记对融合有标记的多肽或蛋白质的亚细胞定位、折叠或功能的干扰；因而，包括标记的本发明的表位肽不应当包括多于25个氨基酸。
因此，本发明的表位肽或标记具有8至25个氨基酸，优选地由8至25个氨基酸构成，其中氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1中限定的序列(RX4X5AX7SX9W)，
其中X4可以是K或置换；
其中X5可以是A或R，或A或R的保守置换；
其中X7可以是V或V的保守置换，并且
其中X9可以是H或H的保守置换；
其中，当分离的表位肽包括至少9个氨基酸时，其不包括如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)。
在优选的实施方式中，X4可以是K或丝氨酸的保守置换。
在优选的实施方式中，本发明的表位肽具有12至25个氨基酸，优选地由12至25个氨基酸构成，其中氨基酸序列包括如SEQ ID NO:32中限定的序列(X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12)，
其中X1可以是P或A；
其中X2可以是D或D的保守置换；
其中X4可以是K或置换；
其中X5可以是A或R，或A或R的保守置换；
其中X7可以是V或V的保守置换；
其中X9可以是H或H的保守置换；并且
其中X11和X12可以是Q或Q的保守置换；
其中分离的表位肽不包括如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)。
在优选的实施方式中，X4可以是K或丝氨酸的保守置换。
“保守置换”指的是一个氨基酸被另一个氨基酸置换，其中替换导致沉默变更。这意思是本发明的表位肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被类似极性的充当功能等价物的另一个氨基酸置换。序列内氨基酸的置换可以选自该氨基酸所属种类的其它成员(即保守置换)。例如，一个极性氨基酸可以被另一个极性氨基酸置换，一个带正电荷的或带负电荷的氨基酸可以分别地被另一个带正电荷的或带负电荷的氨基酸置换，等等。例如，氨基酸的种类是非极性(疏水)氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。
以分离形式提供本发明的表位肽，其意思是不包括在动物体或人体内。表位肽可以被提供为分离的肽或其可以以缀合的、连接的、结合的或连结的形式使用，如以融合蛋白，其中至少一个表位被融合至多肽，具体而言，感兴趣的蛋白质或多肽；或以构建体，其包括本发明的至少一个表位和多肽，任选地通过连接体、间隔区或其它连结构件连接或连结。连接体、间隔区或其它连结构件可以是本领域已知的任何序列。其可以例如是提供切割位点的序列或可以恰好是间隔区，即调节表位和多肽之间的距离的构件，或贡献期望功能的连结构件。
令人惊讶地发现此表位肽可以被高效地和可靠地被用作表位标记，其可以与标记特异性抗体特异性地和高效地相互作用。
“标记表位”是如下技术：其中已知的表位被融合至多肽，比如重组蛋白，例如借助遗传工程。表位标记可以与特异于此表位标记的抗体组合使用，用于检测多肽比如感兴趣的蛋白质。为了作为表位标记是有用的，肽应当提供用于选择性结合特异性抗体的区，标记区应当对结合是可利用的，即使该标记被连接至多肽或与多肽融合，并且非特异性结合应当尽可能地避免。表位标记和相应抗体之间的结合应当是强的、可靠的和选择性的。通过选择表位标记和相应抗体的适合的组合，该技术使得可能检测对其没有抗体可利用的蛋白质。这对表征新发现的蛋白质和低免疫原性的蛋白质是尤其有用的。本发明提供了包括表位和抗体对的系统，其可以被用于大量实验应用，比如蛋白质印迹分析、免疫沉淀、免疫(组织)化学、免疫荧光研究、蛋白质-蛋白质相互作用研究、ELISA和亲和纯化。
尽管衍生自内源性蛋白质β-联蛋白，但是已经令人惊讶地发现与本发明的标记融合的蛋白质使用标记特异性抗体被特异性地和可靠地检测到，而不显著影响抗体与内源性蛋白质的任何相互作用。不受此理论束缚，预期这是由于内源性β-联蛋白是形成所谓的粘着连接的蛋白质复合体的一部分，并且因而不可利用于与标记特异性抗体的高效相互作用。另外，已经发现与标记特异性抗体BC2-Nb对内源性β-联蛋白的亲和力(3.7nM)相比，BC2-Nb具有对表位标记的增加的亲和力(1.4nM)，这表明抗体与标记的多肽的结合优于(favor to)抗体与内源性β-联蛋白的结合。
可以使用标记特异性抗体特异性地和可靠地检测多肽，比如感兴趣的多肽或蛋白质，其已经融合有本发明的表位标记或与本发明的表位标记连接或连结，例如，如下面详细描述的。标记的多肽也可以通过基于免疫亲和力的捕获分析特异性地、高效地和可靠地纯化。
本发明的进一步的方面是由多肽和在该多肽的N-末端或C-末端处的如上面描述的至少一个表位肽构成的构建体。术语“由多肽和至少一个表位肽构成的构建体”指的是非天然存在的多肽，其也可以被称为“融合蛋白”。在构建体中包括的多肽可以包括至少感兴趣的蛋白质和任选地连接序列；其也可以包括进一步的功能序列和/或进一步的标记。构建体可以具有本发明的一个或多个表位标记。如果构建体包括多于一个标记，则那些可以被串联式排列，可以是连续的，可以被间隔开，或可以位于相对端。此外，构建体可以包括进一步的标记，其可以位于任何有用的位置处。
本发明的进一步的方面涉及编码本发明的表位肽的核酸。核酸可以是RNA、DNA、PNA、或LNA。
本发明的核酸构建体包括编码本发明的至少一个表位肽的核酸序列。这些核酸构建体可以具有原核或真核起源，比如具有细菌、哺乳动物、酵母、真菌、线虫、鱼、鸟、病毒、或昆虫起源。任选地，本发明的核酸构建体也包括待标记的多肽比如感兴趣的蛋白质的核酸序列。编码本发明的表位肽的核酸序列可以在编码待标记的多肽的核酸序列的下游和/或上游，产生C-端和/或N-端标记的多肽。已经令人惊讶地发现本发明的表位肽可以在C-端以及N-端使用。这分别允许表位肽或编码其的核酸的非常通用的用途。本发明的构建体可以包括编码一个表位肽或表位肽的多个拷贝比如两个或三个拷贝的核酸。多于一个拷贝可以邻近端标记或标记可以分别位于N-和C-端。
本发明的构建体也可以是核酸表达构建体，并且包括编码表位标记的至少一种核酸和编码待标记的多肽的至少一种核酸，其中二者可以直接地彼此邻近被定位，或可以被适合长度比如大约3-150个核碱基的连接体序列分离。也可以包括其它功能序列。例如，连接体可以包括核酸内切酶的识别位点或编码蛋白酶的识别位点的核酸序列。蛋白酶的实例是TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶或PreScission蛋白酶。
本发明的核酸构建体或核酸表达构建体可以进一步包括核酸序列，其编码进一步的标记，比如HIS-标记。
本发明的核酸构建体或核酸表达构建体可以包括核酸序列，其编码多于一种标记，例如串联标记。串联标记是两个标记按顺序的组合。串联标记可以包括本发明的表位标记的至少两个拷贝，或本发明的至少一个表位标记和至少一个其它标记。构建体也可以包括大量相同或不同的标记，如果适当的话。
本发明的进一步的方面涉及包括本发明的核酸或核酸表达构建体的宿主细胞。“宿主细胞”是包括编码本发明的表位标记的核酸序列的细胞。宿主细胞可以是稳定的转染子或其可以瞬时转染有包括编码表位标记的核酸序列的核酸构建体。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。例如，宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物、植物、真菌、线虫、鱼或鸟细胞。细胞可以是原代细胞或细胞系。宿主细胞可以是单独的单细胞，或可以是为组织的一部分的细胞。
本发明的进一步的方面涉及用于将本发明的核酸或核酸表达构建体引入宿主细胞的方法。引入导致编码本发明的至少一种表位标记的核酸连接至宿主细胞中编码至少感兴趣的多肽的核酸。因此，宿主细胞包括编码本发明的至少一种表位标记的核酸，并且将在表达之后包括本发明的表位标记。
用于将核酸引入宿主的方法可以是本领域已知的出于此目的的任何方法，具体而言，该方法可以选自CRISPR/Cas基因组编辑，使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶的基因组编辑方法，使用试剂比如阴离子脂质、磷酸钙或DADE-葡聚糖的基于试剂的方法，转导，转染和基于仪器的方法比如电穿孔、显微注射和激光转染(laserfection)。
本发明的进一步的方面涉及本发明的表位肽作为N-端或C-端表位标记的用途。包括编码本发明的表位标记的核酸的宿主细胞将表达多肽，比如感兴趣的多肽/蛋白质，其与表位标记连接或融合至表位标记。取决于核酸表达构建体的序列和/或引入编码表位标记的核酸的方法，引入宿主将导致N-端或C-端标记的多肽。与内部标记比较，C-端或N-端标记是优选的，因为端标记将更容易接近进行与标记特异性抗体的相互作用。然而，本发明的表位肽也可以被用作内部标记，条件是感兴趣的标记的蛋白质展现如下构象：其中内部标记可接近与结合配偶体相互作用。例如，感兴趣的蛋白质可以展现环结构，其中内部标记是形成环结构的序列的一部分。在此情况下，内部标记将可接近与结合配偶体相互作用。
根据本申请，术语“亲和配体”指的是如下分子：其能够以非常高的亲和力结合至对其特异的部分或针对其产生的抗体。实例包括生物素(配体)-链霉亲和素(部分)、地高辛(配体)-抗-DIG-抗体和进一步的标记特异性抗体。根据本发明的“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体(具体地多克隆单特异性抗体(即具有不同可变区的抗体，然而其均识别本发明的特异性表位标记))、嵌合抗体、以及上面列出类型的抗体的片段或变体。本文中的术语“抗体”还包括遗传操纵的抗体，并且在优选实施方式中，术语“抗体”指的是比如在骆驼科如骆驼或美洲驼中发现的重链抗体。这些抗体的结合元件由单个多肽结构域即重链多肽的可变区(VHH)构成。这些抗体天然缺乏轻链，其中重链可变结构域形成完整的抗原结合位点。相比之下，常规抗体具有包括两种多肽结构域(重链(VH)和轻链(VL)的可变区)的结合元件。就易于生产和在溶液中的性状而言，不依赖与轻链可变结构域的相互作用以便维持结构和功能完整性使得这些VHH结构域与其它小分子片段相比具有大量优势。具体而言，VHH片段是优选类型的用于免疫亲和纯化的分子，这是由于它们的不寻常的稳定性和它们在完全变性后的高效再折叠的能力，完全变性在抗原的洗脱期间频繁地发生。VHH抗体也被称为单结构域抗体或单链抗体。VHH抗体的片段也被称为“纳米抗体”。抗体的片段是本领域熟知的，并且具有表位结合活性的任何片段可以在系统中被用作“抗体”或用于本发明的相互作用。
在本发明的意义中的术语“抗体”通常指的是全长抗体和上面提及的抗体的抗体片段以及如下面限定的变体。不包含全长抗体的所有结构域或区的抗体是本发明的意义内的抗体的片段。因而，术语“抗体”应当涵盖任何类型的抗体，其片段和变体，以及抗体、片段和/或变体的混合物。
可以使用任何抗体，其具有对本发明的表位肽的亲和力和特异于本发明的表位肽并且提供高抗体亲抗源性或亲和力。其可以是常规抗体或重链抗体，或常规抗体或骆驼科抗体的片段，其也可以是抗体、片段和/或变体的混合物。优选的抗体或抗体片段衍生自重链抗体，比如骆驼科抗体，和骆驼科抗体片段，其被称为纳米抗体或Nb。
所有上文提及的抗体可以以结合或可溶形式存在并且可以包括可检测的部分，或“标签”(例如荧光标记物、放射性同位素、胶体金标记物、偶联的酶等)，和/或可以携带用于固定化在固相上的肽、基团或连接体。术语“结合”指的是膜结合抗体和固定化至固体支持体或运载体材料的抗体二者。在抗体的背景下，术语“可溶的”指的是不结合至膜或固体支持体的抗体，如技术人员很好理解的。
本发明的进一步的实施方式是构建体，其由多肽和如上面和权利要求中限定的在其N-末端或C-末端处的至少一个表位肽构成。多肽可以是如上面概述的任何多肽，并且可以例如至少包括感兴趣的蛋白质和任选地进一步的功能序列，例如进一步的标记。构建体可以包括一个或多个表位标记，如上面说明的。
此构建体或标记的多肽可以通过测量标记特异性亲和配体——比如标记特异性抗体，其可以包括可检测的部分和/或可以结合或可结合至固体支持体——与标记的多肽的相互作用被捕获和/或检测。感兴趣的构建体或标记的多肽可以使用标记特异性亲和配体比如标记特异性抗体捕获用于纯化或富集，并且标记的多肽任选地可以然后通过已知的手段检测和/或定量，比如第二检测配体，其优选地包括可检测的部分，比如荧光标签，并且与感兴趣的多肽相互作用，或任选地，与标记特异性亲和配体比如标记特异性抗体相互作用。
对于检测，标记的多肽和/或标记特异性亲和配体，比如特异性抗体可以包括可检测的部分或允许引入可检测的部分的部分或产生一些种类信号的部分。可检测的部分和用于检测和/或定量部分/信号的方法是本领域熟知的。也可能富集感兴趣的多肽并且稍后分析标记的多肽的结合配偶体、量和其它感兴趣的性质。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明涉及用于检测和/或捕获的方法，例如用于通过捕获纯化多肽的方法，和/或用于检测多肽的方法，其通过捕获和/或测量可检测的信号，或通过在获得的组成中富集多肽并且分析该多肽。
本发明的检测方法适合测定包括本发明的表位肽或表位标记的多肽的存在、亚细胞定位和/或量，并且优选地是体外方法。
待检测、定位和/或定量的标记的多肽或蛋白质可以在宿主细胞中的其细胞内位置处被检测，例如在细胞核中、在细胞膜或另一种细胞隔室中。待检测和/或待定量的标记的多肽或蛋白质也可以在包括标记的多肽或蛋白质的溶液例如从宿主细胞或包括宿主细胞的组织获得的细胞溶胞产物中被检测。
在检测方法的第一步骤中，亲和配体比如特异性地结合本发明的表位肽的抗体被施用至包括标记的多肽或蛋白质的样品。该样品可以是宿主细胞、组织、包括宿主细胞的细胞溶胞产物的溶液或包括标记的多肽的任何其它样品，比如上清液，如在包括宿主细胞的液体离心后获得的，其中宿主细胞能够将感兴趣的多肽分泌入液体或另一种样本比如体液。
此施用步骤在允许亲和配体比如抗体和其表位标记的特异性相互作用的条件下实施。这样的条件对于本领域技术人员是熟知的。洗涤步骤通常在将抗体施用至其抗原之后，并且技术人员知道如何和何时应用所述洗涤步骤。
在一个实施方式中，通过检测亲和配体比如抗体和其表位标记的相互作用检测、定量和/或定位标记的多肽或蛋白质。可以如本领域已知的进行检测。在一个实施方式中，两个相互作用配偶体中的至少一个，通常是表位标记特异性亲和配体，比如抗体，包括可检测的部分。
在施用至样品比如宿主细胞或包括细胞溶胞产物的溶液或细胞上清液之后，亲和配体比如抗体将与标记的蛋白质特异性地相互作用。此相互作用可以通过测量或观察从可检测的部分获得的报道分子信号来检测、监测和定量。例如，如果可检测的部分是荧光标签，则可以在激发之后检测和观察荧光。
在另一个实施方式中，通过使用如下实施检测方法：
表位特异性亲和配体，比如抗体，其在此实施方式中不需要包括可检测的部分；
至少一个第二结合配偶体，其可以结合至表位特异性亲和配体比如抗体，标记的蛋白质，或结合至由二者构建的复合体。第二结合配偶体可以包括可检测的部分和/或可以是可固定化的。
在第一步骤中，表位特异性亲和配体比如抗体被施用至样品比如宿主细胞或包括宿主细胞溶胞产物的溶液，如上面公开的。在第二步骤中，第二结合配偶体可以被施用至样品比如宿主细胞或包括宿主细胞溶胞产物的溶液，其包括结合至表位特异性亲和配体比如抗体的标记的多肽或蛋白质。
可以通过测量或观察从在第二结合配偶体中包括的可检测的部分获得的报道分子信号检测或测定标记的多肽或蛋白质的存在、量和/或定位。
使用两种类型的结合配偶体的两步检测方法的优势在于标记特异性相互作用与实际检测步骤分离。这使得标记特异性亲和配体比如抗体保持不变，因为其不需要包括可检测的部分。与包括可检测的部分的标记特异性亲和配体比如抗体比较，这可以增强其特异性或亲和力，因为可检测的部分可能影响标记和其亲和配体比如其抗体的相互作用。因而，也可以增强检测方法的可靠性和效率。另外，使用标记特异性亲和配体，比如抗体，简单地作为捕获亲和配体，比如捕获抗体并且不作为捕获和检测亲和抗体，比如捕获和检测抗体，允许捕获和检测步骤的分离，如果仅标记的蛋白质或多肽的存在和量将要被测定。因此，使用标记特异性亲和配体比如标记特异性抗体的第一步骤可以在分离或富集步骤之后，得到捕获的感兴趣的标记的蛋白质或多肽。分离或纯化步骤将在本申请的下文进一步讨论。检测步骤然后可以在分离的和/或富集的标记的蛋白质上实施，导致获得的定量的增强的可靠性和更容易操作检测步骤。
用于定性检测表位标记/抗体相互作用的合适的生物物理或生物分子检测方法包括本领域已知的任何合适的方法。这样的方法非限制性地包括用于定性或定量分析应用的方法，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT分析、蛋白质印迹或免疫分析。这样的方法包括例如光学、放射性或层析方法，优选地当使用任何上面的标签、标记物或连接体时，更优选地荧光检测方法、放射性检测方法。
考马斯蓝染色、银染色或其它蛋白质染色方法，电子显微方法，用于通过免疫组织化学或通过直接或间接免疫荧光染色组织切片的方法等。这样的方法可以使用抗体应用或可以包括使用进一步的工具，例如使用第二结合配偶体，具体地结合至标记的多肽、抗体或复合体的一部分。
取决于使用的抗体的大小，也可以测定感兴趣的标记的多肽或蛋白质的亚细胞定位。例如，如果检测抗体足够小，则可以可视化和监测不同的亚细胞结构，比如中间丝状网络或复制机器的必要部分。
在本发明的此方面，检测抗体优选地是纳米抗体，因为纳米抗体可以与在亚细胞定位处的蛋白质比如深深嵌入染色质中的结构相互作用，这是由于它们与常规抗体比较减小的大小。由于不存在可变轻链，与在常规抗体中存在的六个CDR比较，纳米抗体仅具备三个高变环(互补决定区，CDR)。三个CDR侧接4个框架区(FR)。为了弥补CDR的失去，在它们的CDR结构和抗原结合模式方面，Nb展现区别特征。为了提供的足够大的抗原-相互作用表面[1]，大多数纳米抗体展现大幅度延长的CDR3环[2]。在一些情况下，这些长的环的增加的柔性通过使用另外的二硫键将它们紧固至Nb核心来抵消[3]。
典型的纳米抗体因而可以示意性地展示为包括下列区的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
特别优选的抗体是BC2纳米抗体(BC2-Nb)，其显示了良好的性质，如非常高的亲和力、强结合和通用性。BC2-Nb包括骆驼科的重链抗体的可变区，其由框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4组成，如由下列氨基酸序列(122aa)限定的：
QVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCTASGFTLDHYDIGWFRQAPGKEREGVSCINNSDDDTYYADSVKGRFTIFMDNAKDTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAEARGCKRGRYEYDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:6；黑体表示CDR)
表1：限定BC2-Nb的氨基酸序列的区：
已经发现CDR3主要负责本发明的表位肽的强结合。BC2-Nb的氨基酸序列的另一个重要部分是存在于FR2中的半胱氨酸(在SEQ ID NO:6的位置50处)。此半胱氨酸与CDR3的半胱氨酸形成二硫桥并且因而负责CDR3的正确折叠。因此，任何纳米抗体适合作为表位标记/纳米抗体相互作用的一个配偶体，该纳米抗体包括BC2的CDR3序列作为CDR3，并且在框架区2中包括半胱氨酸，其能够与CDR3的半胱氨酸形成二硫桥。在优选的实施方式中，在FR2中的半胱氨酸和CDR3中的半胱氨酸之间存在大约45至55，例如大约50或51个氨基酸残基。在BC2-Nb的情况下，FR2的半胱氨酸在位置50处，并且CD3中的半胱氨酸在位置102中(位置标记指示如上面显示的SEQ ID NO:6中的位置)。因此，存在在框架区2中的半胱氨酸和CDR3中的半胱氨酸之间定位的51个氨基酸残基。
纳米抗体BC2-Nb或包括至少BC2-Nb的CDR3和FR2中的半胱氨酸的其功能变体在所有公开的纯化和/或检测方法和/或在本申请中公开的用途中也是优选的与本发明的表位标记的相互作用配偶体，因为已经显示其是感兴趣的标记表位的多肽的非常可靠的和高效的结合配偶体。BC2-Nb和其功能变体也是本申请中公开的试剂盒的优选组分。本发明的一个优选的实施方式也是BC2-Nb或其功能变体用于检测、定量、测定包括本发明的表位标记的多肽的亚细胞定位，或纯化包括本发明的表位标记的多肽的用途。
BC2-Nb的功能变体是具有对本发明的表位标记具有亲和力的任何抗体或片段，该亲和力与BC2-Nb相比为至少80％、更优选地至少90％或至少95％或甚至99％或更多。变体和BC2-Nb的亲和力可以如本领域已知的测量并且结果可以如技术人员已知的和通过熟知的分析进行比较，例如通过表面等离子体共振(SPR)，或通过其它蛋白质-蛋白质相互作用监测分析。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及纯化方法，或捕获和纯化方法。纯化方法可以被用于分析型、半制备型和制备型方法。
因而，本发明的进一步的方面涉及纯化多肽的方法，比如包括本发明的至少一种表位标记的感兴趣的蛋白质。
在此方面，方法包括使包括标记的多肽的样品例如溶液与能够特异性地结合至本发明的表位标记的亲和配体比如抗体接触的捕获步骤。特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体优选地是抗体，并且最优选地是纳米抗体BC2-Nb或如上面限定的其变体。
待与标记特异性抗体接触的样品可以是包括标记的多肽的任何类型的样品并且可以被加工以分离多肽。优选地，样品是溶液，例如宿主细胞的溶胞产物或体液，包括标记的多肽，或上清液，比如通过离心包括含有构建体或标记的多肽的宿主细胞的液体可获得的上清液，其中宿主细胞能够将标记的多肽分泌或以其它方式运输入液体。
在本发明的方法中用于纯化多肽例如感兴趣的蛋白质的抗体、片段或变体可以在溶液中使用或被固定化。为了固定化针对本发明的表位标记的亲和配体比如抗体或其片段或变体，亲和配体比如抗体，片段或变体，或其混合物可以结合至样品运载体、固体支持体或基质。此固定化步骤可以在将亲和配体比如抗体结合至表位标记之前或之后发生。用于固定化亲和配体比如抗体和其部分的方法对技术人员是熟知的，并且可以使用允许固定化而不损害结合性质的任何方法。
如果能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体不被固定化至固体支持体，则方法任选地可以包括用于分离复合体的进一步的步骤，例如通过使用复合体的结合配偶体，比如第二抗体，其特异于例如该复合体或(在表位特异性抗体是IgG抗体的情况下)抗体的恒定部分。第二结合配偶体可以在溶液中或可以被固定化或可固定化至固体支持体。
在本发明的背景下，术语“固体支持体”或“基质”应当指的是可以被用于固定化亲和配体比如抗体或其部分的任何类型的运载体材料，并且其可以指的是微粒(例如珠或颗粒，通常在提取柱中使用)或片材形式(例如膜或过滤器、玻璃或塑料载玻片、微量滴定分析板、测深尺(dipstick)、毛细管填充设备等)的材料，其可以是平的、起褶的或中空纤维或管。合适的和熟知的基质并非穷尽性地是二氧化硅(多孔无定形二氧化硅)、琼脂糖或聚丙烯酰胺支持体或大孔聚合物。实例包括葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、纤维素、藻酸钙、可控多孔玻璃、铝、钛和多孔陶瓷、合成聚合物和共聚物、乳胶、二氧化硅、琼脂糖、金属、玻璃和碳。可选地，固体表面可以包括质量依赖性传感器例如表面等离子体共振检测器的一部分。便利地，提供了包括多个单独亲和配体比如抗体或抗体片段的阵列，该抗体或抗体片段能够特异性地结合已经结合或固定化至固体表面的本发明的表位标记。一旦使溶液与固定化的亲和配体比如抗体或抗体片段接触，此阵列可以被用于捕获在溶液中包括的标记的多肽。
在捕获步骤之后的进一步的步骤中，包括结合至标记的多肽的固定化的标记特异性亲和配体的固体支持体任选地被洗涤以去除未结合的和非特异性地结合的成分。可以以此形式使用配体和多肽的固定化的复合体。
任选地，在进一步的步骤中，标记的多肽可以被洗脱以获得分离的多肽，比如感兴趣的蛋白质。结合至固定化的抗体的标记的蛋白质的洗脱可以通过本领域已知的方法实现。例如，标记的蛋白质可以通过与本发明的分离的表位肽的竞争性洗脱来洗脱。此分离的表位肽然后将与标记的多肽竞争结合固定化的标记特异性抗体。如果以过剩的浓度添加分离的多肽，则结合的反应平衡将被转向至固定化的抗体与分离的表位标记的结合。这导致标记的多肽的释放。然后可以任选地添加用于进一步纯化释放的多肽的另外的步骤，比如技术人员熟知的方法步骤。
标记的多肽也可以保持固定化至固体支持体，比如珠，并且在下游应用比如质谱法中被进一步处理，而没有洗脱步骤。
在另一个优选的实施方式中，标记的蛋白质，例如包括具有切割位点的连接体的标记的多肽，可以使用适当的方式例如蛋白酶切割，以去除标记，从而由固定化的抗体释放多肽，并且可以以其天然形式获得多肽。对于此实施方式，编码多肽的核酸序列应当不仅包括编码表位标记的序列，而且包括编码具有可断裂位点的连接体的序列，例如由蛋白酶识别的切割位点。通过酶促切割的释放步骤可以替换洗脱步骤或在洗脱步骤之后。
本发明也包括试剂盒，其包括对实施本发明的方法必需的组分。
在一个实施方式中，提供了用于捕获和/或检测标记的多肽的试剂盒。
适合实施本发明的捕获和/或检测方法的本发明的试剂盒包括下列组分：
-编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体；
-亲和配体，比如抗体，其能够特异性地结合至本发明的表位肽；
-任选地可检测的部分；和
-缓冲液和试剂，其对本发明的捕获和/或检测方法是必需的。
编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体被引入宿主细胞，如上面描述的和如技术人员已知的。在这方面，试剂盒也可以包括缓冲液和试剂，其对将编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体引入宿主细胞是必需的。
能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体优选地是抗体，并且最优选地是纳米抗体BC2-Nb或其变体，如上面限定的。
能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体可以包括至少一种可检测的部分。试剂盒也可以包括至少一种第二结合配偶体，其可以结合至在复合体或其组分中的一种比如抗生物素蛋白或链霉亲和素上提供的单元，如果复合体或其组分中的一种是生物素化的，或用于捕获复合体的第二和第三抗体由标记的多肽和亲和配体比如抗体构建，则这些进一步的抗体例如特异于多肽或表位特异性亲和配体比如抗体的其它部分，或特异于在多肽上提供的单元，亲和配体比如抗体或复合体，比如能够特异性地结合至本发明的表位肽的初级亲和配体或抗体的恒定部分。进一步的抗体也可以包括可检测的部分。
如本申请中限定的，亲和配体比如抗体对检测、捕获和/或纯化包括本发明的表位肽的多肽是特别有用的。因此，本发明的一方面是如本文限定的表位特异性亲和配体比如抗体，具体而言，纳米抗体用于检测、捕获和/或纯化包括本发明的表位肽的多肽的用途。
试剂盒可以进一步包括固体支持体，其包括特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体，本发明的表位肽固定化或附连至固体支持体。
可检测的部分可以是如上面限定的任何可检测的部分。优选地，可检测的部分是荧光标签。
在进一步的实施方式中，提供了用于捕获和纯化标记的多肽的试剂盒。
用于纯化标记的多肽的试剂盒包括下列组分。
-编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体；
-亲和配体，比如抗体，其能够特异性地结合至本发明的表位肽；
-任选地固体支持体；和
-缓冲液和试剂，其对本发明的捕获和纯化方法是必需的。
编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体将被引入宿主细胞，如上面描述的和如技术人员已知的。在这方面，试剂盒也可以包括缓冲液和试剂，其对将编码本发明的表位肽的核酸或核酸表达构建体引入宿主细胞是必需的。
能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体优选地是如上面限定的纳米抗体BC2-Nb或其变体。
能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体可以在溶液中或固定化或附连至固体支持体。试剂盒也可以包括如上面概述的进一步的结合配偶体。进一步的结合配偶体也可以包括可检测的部分。
固体支持体可以是如上面限定的任何固体支持体，并且技术人员可以选择将亲和配体比如抗体固定化或附连至固体支持体的适合方式。
试剂盒也可以包括试剂，其适合从能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体释放捕获的标记的多肽。因而，试剂盒可以例如包括本发明的分离的表位肽。其也可以包括酶，其能够通过从多肽切割标记而从能够特异性地结合至本发明的表位肽的亲和配体比如抗体释放捕获的标记的多肽。例如，酶可以是蛋白酶比如TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶或PreScission蛋白酶。
实施例
在下列实施例中概述本发明的优选的实施方式，其不应当被解释为限制本发明的范围或精神。
实施例1：综述
通过将单价BC2-Nb共价偶联至固体基质，生成BC2纳米陷阱。这充当类似于前面描述的GFP纳米陷阱[4]的高效拉下(pulldown)试剂，该GFP纳米陷阱被广泛地用于从细胞溶胞产物纯化GFP标记的复合体[5]。BC2纳米陷阱的优异结合特性有利于蛋白质组学分析，其在结合反应中应用例如高竞争性结合条件，其使用离液剂(高至4M尿素或1.5M GdmCl)或变性洗涤剂(2％SDS)[6]。与GFP纳米陷阱(其中结合的蛋白质仅在变性条件下被释放)形成对比，BC2纳米陷阱结合的蛋白质可以仅使用低量的BC2-肽(0.1-1mM)通过肽竞争以功能构象洗脱。定位克隆揭示了N-或C-端定位的BC2-标记同样很好地被BC2纳米陷阱识别。对于N-端标记的GFP，在未结合的级分中观察到额外的带。这指示BC2-标记可能在细胞溶解之后被蛋白水解去除，一种已经针对哺乳动物表达系统中的其它表位标记进行描述的现象[7]。
此研究中描述的基于BC2的捕获和检测系统是当前可利用的表位标记系统的有吸引力的替代选择。本发明的申请人已经显示了BC2-Nb以～1.4nM的KD结合BC2-标记表位的蛋白质，并且因此显示与可利用的FLAG、HA、c-myc或纳米抗体衍生的EPEA系统比较～10-100倍更高的亲和力[8-10]。
最近，生成针对β-联蛋白的纳米抗体，其识别β-联蛋白的氨基酸序列内的不同表位。这些抗体被用于监测细胞内的内源性β-联蛋白[11]。这些Nb中的一种，其被称为BC2-Nb，识别与β-联蛋白的aa 16-27对应的短的线性表位。
在此，提供了BC2-Nb和其与肽表位的相互作用的详细结构和生物化学分析，该表位肽在下文被称为BC2-标记(BC2T)。数据揭示了由延伸的CDR3和BC2-Nb的框架介导的不寻常的结合机制，其被称为“头锁结合”。基于BC2-Nb的高亲和结合性质，研发和表征了新型BC2-标记纯化和检测系统。显示固定化的BC2-Nb从细菌和哺乳动物细胞提取物以天然折叠状态高效地捕获和纯化BC2标记的蛋白质。通过共定位分析，第一次显示了使用荧光标示的纳米抗体的肽标记的细胞蛋白质的检测。此通用的捕获和检测系统现在使得包括此小的、惰性的肽-标记的大量各种蛋白质的生物化学和显微分析的独特组合成为可能。
生成以非常高的亲和力(KD～1.4nM)结合短的线性肽的纳米抗体。BC2-Nb/BC2-肽复合体的结构分析揭示了不寻常的结合模式，其中BC2肽形成另外的反平行p-链，其插入由CDR3和框架区形成的β-折叠结构。众多骨架氢键提供亲和力，并且CDR3的Arg106和FR2的Glu44之间的盐桥以头锁样方式包围(embrace)结合的肽。与在蛋白质数据库(PDB)中可利用的所有纳米抗体复合体的比较显示这样的结合模式先前没有在任何81种已知的结晶化复合体中观察到。头锁突变的BC2-Nb的亲和力测量显示了～10倍降低的结合亲和力和更高的解离速率。这些数据清楚地表明头锁的主要功能在于将已经结合的肽紧固至纳米抗体。
使用位置扫描肽文库的表位分析揭示了四种特异性决定残基的小组，其中最关键的是W10。相比之下，其它残基对结合特异性没有贡献，这主要是由于它们不参与接触。依赖于许多骨架相互作用以生成亲和力和仅四种氨基酸侧链的特异性致使BC2T/BC2-Nb系统是尤其通用的。BC2T残基的大多数可以被替换而不牺牲结合效率，并且这使得直接修改标记用于个别应用，包括电荷修饰、添加色氨酸残基以便增加280nm下的吸光度、或引入蛋白酶切割位点或甚至出于标示目的引入不寻常的氨基酸。
最终，研究显示BC2-Nb提供新的细胞成像的机会。从根本上说，纳米抗体可以容易地通过使用全范围的可利用的有机染料进行定点标示来修饰并且被用于细胞结构的直接成像而不需要用于检测的第二抗体。最近，证明了使用光敏定位显微术(PALM)-相容性有机染料比如AlexaFluor 647(AF647)标示的GFP-和RFP-特异性抗体在高分辨率显微镜中高效地可视化荧光融合蛋白。仍然存在对于如下纳米抗体的持续需求：其识别较小的表位以最小化源自大标记比如GFP-或RFP的空间位阻或潜在的连接错误。在此研究中，第一次证明荧光标示的肽特异性纳米抗体可以被用于可视化不同的亚细胞结构，比如中间丝状网络或复制机器的必要部分。基于这些发现，发明人提出BC2介导的检测系统提供了与当前可利用的途径比较独特的优势。首先，由于其小尺寸(12aa，1.4kDa)，BC2-标记不干扰异位表达的蛋白质的亚细胞定位或折叠。第二，小纳米抗体(2×4nm)的使用直接地将检测信号与相应的抗原关联。第三，BC2纳米抗体可以容易地被修饰，例如使用适合的高分辨率相容性染料的定点标示。总之，BC2标记的构建体的纳米抗体介导的标示现在将最小表位标记与有机染料的高光子产率和最小连接错误组合。
实施例2：表位结合的结构基础
由于描述的Nb中的大多数具有构象表位，因此观察到的高亲和结合潜在的分子机制通过解析单独的BC2-Nb(在的分辨率下)和与BC2T复合的高分辨率晶体结构来调查。从此往后，BC2T氨基酸将以一字母代码提及并且BC2-Nb氨基酸以三字母代码提及，以便于促进结果的展示和讨论。氨基酸位置指的是氨基酸残基在由12个氨基酸(如SEQ IDNO:4中限定的(PDRKAAVSHWQQ))构成的表位标记中的位置。
BC2-Nb采取典型的免疫球蛋白折叠，其由形成两个β-折叠的九条β-链构成，这两个β-折叠通过环并且通过Cys22和Cys96之间的保守的二硫键连接(图5a)。类似于其它纳米抗体结构，BC2-Nb的特征在于格外长的CDR3，其包含14个氨基酸并且通过Cys102(位于CDR3中)和Cys50(位于框架区2(FR2)中)之间形成的另外的二硫键稳定化(图5a)。BC2T结合至细长构象的BC2-Nb，插入CDR3与BC2-Nb的FR2和FR3之间的沟。肽被整合入BC2-Nb结构，形成β-折叠中的链(图1a)。这导致大数目的骨架氢键，其将肽锚固至相邻的第二结构元件。显著地，CDR1和CDR2都不参与和BC2T的相互作用(图1a，下面的表2)。
表2
未结合的和结合的BC2-Nb结构是类似的，并且可以叠加与原子位置的小的整体均方根偏差(RMSD)(Phenix结构_比较)。CDR3环具体而言具有类似的定向，除翻转几乎180度的两个氨基酸(Arg106和Tyr107)之外(图5b)。在未配位的BC2-Nb中，Arg106的β-碳朝向Nb的核心结构取向，同时Arg106侧链与Glu108的骨架羰基和与Tyr109的π-电子体系相互作用。Tyr107的β-碳远离Nb指向并且芳香族环参与与Arg45的阳离子-π相互作用。在复合体中，残基Arg106和Tyr107被翻转，因为它们的β-碳和其侧链面向相反方向。Arg106现在参与与位于FR2中的Glu44的侧链的电荷介导的相互作用(图1b)。这种不寻常的相互作用——其被本发明人称为“头锁”，越过结合的肽并且将其牢固地锁定在合适的位置。几种直接的和水介导的相互作用将肽紧固在其结合位点(图1c)。然而，仅小子集的BC2T残基参与这些接触：R3与Asp110形成盐桥，S8参与和Lys103的羰基的氢键并且还连同Tyr109一起复合水分子，并且W10被埋在疏水口袋中，在该疏水口袋中其形成与Cys50的CH-π相互作用和与Cys102的羰基的氢键二者(图6显示了所有相互作用的完整概述)。
调查点突变对BC2-Nb的结合性质的影响。首先，通过使用丙氨酸替换Cys50和使用丝氨酸替换Cys102(BC2-NbC50A_C102S)去除连接CDR3和FR2的另外的二硫键。使用修饰的GFP——其包含BC2T作为C-端肽标记(GFPBC2T)——的结合研究揭示了此突变导致结合的完全失去(数据未显示)。此结果的最可能的解释是维持CDR3的结构需要二硫桥，其贡献与BC2T的大部分接触。然后，分析“头锁”基序对结合的贡献。Arg106被替换为丝氨酸(BC2-NbR106S)或谷氨酸(BC2-NbR106E)，并且使用GFPBC2T构建体进行表面等离子体共振(SPR)测量。两种突变体蛋白得到～11nM的KD值，其与BC2-Nb(KD：1.4nM)比较低大约10倍(下面的表3，图7)。有趣的是wt和突变体蛋白显示了类似的结合速率(on-rate)，而在两种突变体中观察到显著更高的解离速率(表3)。总之，亲和力的适度改变与结构分析一致。延伸的肽的十三种骨架相互作用清楚地有助于相互作用的高亲和力。“头锁”最可能帮助确保结合的肽，如通过wt蛋白的较低的解离速率指示的。
表3
Nb Rmax[RU] KD[nM] Kon[M-1s-1] Koff[s-1] x2
BC2-Nb 170±0.34 1.4±0.06 4.6±0.04×105 6.4±0.27×10-4 3.5
BC2-NbR106E 160±0.48 12.0±0.15 2.8±0.01×105 3.4±0.04×10-3 3.8
BC2-NbR106S 160±0.43 9.7±0.13 3.3±0.03×105 3.2±0.03×10-3 3.1
实施例3：使用合成位置扫描肽文库的详细表位分析
虽然高亲和结合和动力学可以通过观察到的结构特征解释，但是复合体形成的特异性必须在别处展现。由于仅BC2T残基的子集参与和Nb的特异性、侧链介导的接触，因此使用位置扫描肽文库检查这些单独的氨基酸对结合的贡献。总计，在免疫沉淀实验中使用在肽的一个单一位置中展示所有20种蛋白原氨基酸的12种不同的BC2T文库。在使用固定化的BC2-Nb、BC2-NbR106S或BC2-NbR106E的免疫沉淀之前和之后，BC2T文库经受液相色谱法接着是质谱分析。通过测定在拉下后在未结合的级分中保留的肽，绘制(map)未结合的肽的组成和相应地，可变氨基酸位置(表4，下面)。具体地，通过在BC2-Nb的上清液或其突变体中和在非BC2T相关的对照Nb(GFP特异性Nb)的上清液中的肽的比较分析鉴定沉淀的肽。与GFP-Nb的直接比较使得可能在不需要标示的标准物的情况下测定肽捕获的定量程度。因而，如果BC2-Nb没有捕获肽，则图2中给出的比率将是一或接近一。越多肽被捕获，值越接近0。由于这些肽是同原子量异位序的(isobaric)，因此不可能区分异亮氨酸(I)和亮氨酸(L)肽形式。然而，包含I/L的两种肽形式可以被分辨并且因而给出两个值作为结果。
分析显示在SEQ ID NO:4的位置1、2、4、5、7、9、11和12处的BC2T残基可以被替换，而不影响表位结合性质(表4，下面)。这些结果与结构一致，其显示所有八种残基的侧链背对Nb。然而，R3、A6、S8和W10BC2T文库的上清液的分析揭示了在这些位置处纳米抗体与其它氨基酸的极小的交叉反应性(图2a-d)。值得注意地，来自R3BC2T文库的结合肽(BC2TR3X)具有含有碱性性质的残基，即K3或H3，或包括较小侧链的残基，即T3或V3(图2a)。这个观察与晶体结构一致，因为R3和Asp110之间的盐桥也可能由H3或K3形成。BC2TA6X文库的分析揭示了BC2-Nb对位置6处的小氨基酸的偏好，因为半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸和丝氨酸交换(permutant)从文库有效地拉下。在此位置处包含甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽以较小的量拉下(图2b)。这些结果与晶体结构一致，其中A6侧链指向BC2-Nb的小疏水口袋。较大的氨基酸(即亮氨酸、异亮氨酸)的结合将需要构象重排，并且甘氨酸将引入额外的柔性。针对BC2TS8X-文库观察到类似的作用。丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和缬氨酸可以替换S8，同时以较小程度捕获其它残基(图2c)。S8的羟基与纳米抗体的Lys103的羰基形成氢键。半胱氨酸和苏氨酸可以参与稍类似的生产性相互作用，同时至少可以容纳(accommodate)缬氨酸。位置10处的色氨酸在我们的肽扫描研究中好像是不变的特异性-决定氨基酸，因为W10交换均不被BC2-Nb捕获(图2d)。这与结构分析是极一致的，其显示W10侧链插入纳米抗体上深的疏水口袋。
突变体BC2-NbR106S和BC2-NbR106E的表位扫描结果与BC2-Nb几乎相同，有一个明显的例外。BC2TA6X文库的分析揭示了与BC2-Nb形成对比，突变的Nb也以小程度沉淀BC2T变体，其在位置6处携带赖氨酸或精氨酸(图2d)。这个观察表明形成头锁的Arg45突变为Ser或Glu导致稍低的肽特异性。总之，鉴定了在BC2T中具有受限或没有氨基酸可变性的四个位置。结果与结构一致，其显示R3、S8和W10的侧链直接参与BC2-Nb相互作用，同时A6的交换在空间上可能不利并且可能阻止头锁结合的形成。总之，此分析确认小子集的侧链相互作用帮助确定BC2-Nb对BC2T序列的特异性。
实施例4：基于BC2T的捕获系统的生成
基于BC2-Nb的不寻常的配体结合模式，目标是研发基于BC2T的亲和系统。纯化的BC2-Nb被共价偶联至琼脂糖珠并且生成被称为“BC2纳米陷阱”的亲和基质。首先，测试BC2纳米陷阱从粗溶胞产物直接沉淀BC2T标记的蛋白质的能力。因此，使用BC2纳米陷阱培育表达C-端标记的GFP(GFPBC2T)或wtGFP(对照)的大肠杆菌的可溶性蛋白质级分，并且通过SDS-PAGE接着是考马斯蓝染色和免疫印迹分析输入物、未结合的和结合的级分(图3a)。获得的数据显示BC2纳米陷阱定量地沉淀GFPBC2T。然后，BC2T纯化在多种非变性洗涤剂(NP-40，Triton X100，CHAPS或Tween 20，0.1-1％w/v)或增加的盐浓度(0-500mM NaCl，2-50mMKCl，2-20mM MgCl2)的存在下进行。这些试剂对于结合效率似乎都没有影响(数据未显示)。另外，在变性条件下通过在结合缓冲液中提升十二烷基磺酸钠(SDS)或离液剂(GdmCl；尿素)的浓度来测试抗原结合。观察到BC2纳米陷阱在2％SDS、4M尿素或高至1.5M GdmCl的存在下高效地沉淀其抗原(图3b)。这指示BC2纳米陷阱在严苛条件下保持功能上活性。
虽然在一些情况下，这样的严苛结合和洗脱条件对获得高度纯的蛋白质可能是有利的，但是大部分结合的蛋白质可能被变性并且不维持生物学活性。因此，使用MgCl2(0.5M-4M)、硫氰酸钠(NaSCN，1-3M)或pH介导的释放(酸性；pH 1-2.5，或碱性；pH 10-12)测试更温和的洗脱条件。也通过添加增加浓度的BC2肽(PDRKAAVSHWQQ，0.01-1mM)的竞争性洗脱测试结合的GFPBC2T的放出。使用MgCl2的培育不洗脱GFPBC2T(数据未显示)，而使用高浓度的NaSCN或酸性洗脱(pH 1.5)的处理导致结合的蛋白质的30％-40％的释放(图3c，上图)。相比之下，使用较高pH(pH 11和12)的碱性洗脱揭示了40-80％的更高效的释放。值得注意地，当在分别添加0.1mM和1mM BC2肽后在洗脱级分中检测～60％和～80％的GFPBC2T时，竞争性洗脱是高效的(图3c，下图)。而且，使用NaSCN或酸性pH的处理之后显著地影响GFP的荧光，而碱性pH或肽洗脱获得完全荧光GFP(图8)。这些结果显示BC2肽可以高效地取代以其天然折叠状态的BC2结合的蛋白质。
进一步分析BC2-捕获系统进行衍生自人细胞的重组蛋白的一步纯化。具体地，调查BC2-标记的端位置是否对结合具有影响。为此，在人胚肾(HEK)293T细胞中使用未标记的eGFP作为阴性对照表达在N-端(BC2TeGFP)或C-端(eGFPBC2T)上包括BC2-标记的修饰的GFP。在转染后两天，生成可溶性蛋白质级分并且使用BC2纳米陷阱使其经受免疫沉淀。通过SDS-PAGE接着是考马斯蓝染色和免疫印迹分析输入物、未结合的和结合的级分(图3d)。结果显示N-和C-端BC2标记的GFP构建体二者通过BC2纳米陷阱高效地沉淀，而在阴性对照中没有检测到GFP。在BC2TeGFP的未结合的级分中出现了稍小的GFP片段。由于此带在结合泳道中没有出现，因此假设其出现是由于在细胞溶解程序期间N-端BC2-标记的蛋白酶介导的去除。
接着，测试BC2纳米陷阱是否可以沉淀中间丝或核复制机器的BC2标记的细胞组分。BC2T遗传融合至mCherry-波形蛋白(mCherry-VIMBC2T)或eGFP-PCNA(eGFP-PCNABC2T)并且两种构建体在HEK293T细胞中表达。作为对照，使用不具有BC2-标记的相应构建体。使用BC2纳米陷阱培育可溶的蛋白质提取物，和通过使用抗-波形蛋白或抗-PCNA抗体的免疫印迹分析完整的溶胞产物(输入物)、未结合的和结合的级分。结果显示使用BC2纳米陷阱高效地沉淀mCherry-VIMBC2T和eGFP-PCNABC2T二者，同时在未标记的蛋白质的结合的级分中没有可检测的信号(图9a)。下一个问题是BC2-Nb是否也可以在免疫印迹中检测到BC2标记的蛋白质。因此，荧光标示的BC2-Nb通过将纯化的纳米抗体化学偶联至有机染料AlexaFluor488(BC2-NbAF488)来生成，并且其被用于探测如下免疫印迹：其具有表达eGFP-PCNA、eGFP-PCNABC2T、mCherry-VIM或mCherry-VIMBC2T的细胞的可溶性蛋白质级分。结果显示BC2-NbAF488高度特异于BC2标记的蛋白质，而没有检测到未标记的蛋白质(图9b)。最终，询问BC2-Nb是否也在BC2标记的蛋白质的存在下识别内源性β-联蛋白。虽然在使用BC2-NbAF488的蛋白质印迹中没有检测到β-联蛋白的信号(图9b)，但是与过表达的BC2标记的蛋白质比较，较小量的β-联蛋白在使用BC2纳米陷阱的沉淀后在结合的级分中被发现(图9c)。
总之，结果显示BC2T/BC2-Nb亲和系统使得能够在天然(即非变性)和变性条件二者下从不同的表达系统稳健地和便利地一步纯化BC2标记的重组蛋白。与在免疫印迹检测中观察到的功能组合，系统覆盖用于大范围的生物化学分析的全范围的BC2标记的蛋白质的捕获和检测。
实施例5：使用荧光标示的BC2-Nb的免疫细胞化学
已经描述了众多纳米抗体用于在细胞表面上定位的疾病相关抗原的分子成像[12-14]。迄今为止存在非常少的将纳米抗体用于细胞成像的研究[15]。因此，测试荧光标示的BC2-Nb(偶联至有机染料AlexaFluor488或ATTO647(BC2-NbAF488；BC2-NbATTO647))是否适合可视化BC2标记的细胞蛋白。为了生成相关的细胞靶结构，将先前描述的融合构建体mCherry-VIMBC2T或GFP-PCNABC2T在人细胞中表达(图4a)。将波形蛋白的荧光构建体并入细胞中间丝网络并且在瞬时细胞表达之后在细胞质中可视化波形蛋白纤维[16]，而在DNA复制的位点处发现GFP-PCNA，在细胞周期的S期期间在核中形成特征点状结构[17]。应用的融合蛋白的特征模式允许进行使用使用染料-标示的BC2-Nb的免疫细胞化学的共定位研究。
通过使用BC2-NbAF488染色表达mCherry-VIMBC2T的海拉细胞，观察到在红色通道中显示(图4b，图10a)的沿着细胞质波形蛋白结构的绿色纳米抗体信号的强共定位。相应地，BC2-NbATTO647揭示了在S期期间在复制焦点处与GFP-PCNABC2T的清楚的共定位。GFP-PCNABC2T和BC2-NbATTO647二者的信号在核中排他性地发现，证明了BC2-Nb的结合特异性。在表达缺少BC2-标记的mCherry-VIM或GFP-PCNA构建体的细胞中没有检测到纳米抗体信号(图10b)。这些数据证明荧光标示的BC2-Nb特异性地结合至异位表达的BC2T融合蛋白并且可以因此被应用于免疫细胞化学中的直接抗原检测。
实施例6：分析在BC2标记内的多种突变或截短对BC2-Nb在拉下试验中的结合效率的影响
如实施例3中概述的，证明在SEQ ID NO:4的位置1、2、4、5、7、9、11和12处的BC2T残基可以被替换。这通过使用在肽的一个单一位置中展现所有20种蛋白原氨基酸的位置扫描肽文库显示。
为了更详细地研究BC2T内氨基酸残基的多重交换对结合性能的影响，通过同时交换六个氨基酸残基生成BC2T的突变形式。因此，位置2处的Asp(D)替换为Val(V)；位置4处的Lys(K)替换为Ser(S)；位置7处的Val(V)替换为Leu(L)；位置9处的His(H)替换为Gln(Q)；位置11处的Gln(Q)替换为Ser(S)和位置12处的Gln(Q)替换为Ser(S)。通过这样，改变了最初被鉴定为BC2T序列(SEQ ID NO:5)的总计50％的氨基酸残基。所得到的氨基酸序列被称为BC2Tmut。为了测试这些氨基酸残基的同时交换是否影响包括突变的BC2-标记(BC2mut)的蛋白质的拉下效率，BC2Tmut被遗传融合至GFP(GFPBC2Tmut)。对于拉下分析，使用BC2纳米陷阱培育表达wtGFP(对照)、C-端BC2标记的GFP(GFPBC2T)或GFPBC2Tmut的大肠杆菌细胞的可溶性蛋白质级分，并且通过SDS-PAGE接着是考马斯染色和免疫印迹分析输入物、未结合的和结合的级分(参见图11)。获得的数据显示BC2纳米陷阱定量地沉淀GFPBC2T以及GFPBC2Tmut。由此可以推断指示位置处的氨基酸残基的多重交换不影响突变的BC2T与BC2纳米陷阱的相互作用和结合能力。
然后，分析BC2T的N-或C-端截短是否影响与BC2-Nb的结合性质。因此，生成两种构建体。在第一种构建体(称为BC2T-10)中，缺失在BC2T的C-端处定位的最后两个Gln(Q)残基，产生序列PDRKAAVSHW。对于第二种构建体，另外缺失在BC2T(BC2T-8；RKAAVSHW)的N-端上定位的前两个氨基酸残基Pro(P)和Asp(D)。对于结合研究，BC2T-10和BC2T-8被遗传融合至GFP(GFPBC2T-10；GFPBC2T-8)。对于拉下分析，使用BC2纳米陷阱培育表达wtGFP(对照)、C-端BC2标记的GFP(GFPBC2T)、GFPBC2T-10或GFPBC2T-8的大肠杆菌细胞的可溶性蛋白质级分，并且通过SDS-PAGE接着是使用抗-GFP抗体的免疫印迹分析输入物、未结合的和结合的级分(参见图12)。获得的数据显示BC2纳米陷阱以比得上使用原始BC2T(GFPBC2T)标记的GFP的方式沉淀GFPBC2T-10以及GFPBC2T-8。这证明在N-或C-端处缺失侧接BC2T的两个氨基酸残基不影响截短的BC2T与BC2纳米陷阱的相互作用和结合能力。
实施例7：研发改进的BC2T变异
使用合理的设计途径，研发BC2T的变异，其旨在进一步改进BC2标记与BC2-Nb的亲和力。为此，基于在图1和表4中报告的结构和生物化学数据以及分子建模置换在SEQ IDNO:4的位置1、4、5、11和12处的BC2T残基。
设计称为pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34的BC2T的两种变异，其被发现与原始的BC2T序列相比展现与BC2-Nb更高的亲和力(表5，图13)。使用生物层干涉量度法，对于BC2-Nb与pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34之间的相互作用，解离常数KD被分别测定为0.7nM和1.9nM。相比之下，对于原始的BC2T(SEQ ID NO:4)，与BC2-Nb的相互作用的KD是2.6nM(如使用生物层干涉量度法测定的)。具体而言，对pTag1 SEQ ID NO:33的解离速率常数koff与对原始的BC2T的解离速率常数koff相比慢7倍(表5)，解释了BC2-Nb对pTag1 SEQ ID NO:34的不寻常高的亲和力。
BC2T的这些改进的变异在蛋白质纯化和免疫沉淀中的应用被验证(图14)。蛋白质mCherry在N-端或C-端处与BC2T变异pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34(以及原始的BC2T SEQ ID NO:4，用于比较)融合并且使用BC2纳米陷阱培育(图14a)。随后，以100μM的浓度使用相应的肽洗脱捕获的融合蛋白。输入物、未结合的蛋白质、洗脱的蛋白质和在洗脱后仍结合至BC2纳米陷阱的蛋白质的级分的SDS-PAGE分析(图14a)显示改进的BC2标记能够捕获融合蛋白，而与标记的定位无关。而且，使用游离肽洗脱捕获的蛋白质，即在天然的非变性条件下。因而，改进的BC2T变异可以被应用于与这样的BC2T变异融合的感兴趣的蛋白质的一步蛋白质纯化。与原始的BC2T比较，改进的BC2T变异对BC2-NB的较高的亲和力导致更高效地捕获标记的蛋白质，其中高至100％蛋白质结合(图14a)。
可以使用BC2纳米陷阱从一系列生物体沉淀融合至改进的BC2T变异的感兴趣的蛋白质。如图14b中显示的，pTag1 SEQ ID NO:33与蛋白质mCherry的N-端融合允许使用BC2纳米陷阱从人细胞系HEK293T、粉纹夜蛾昆虫细胞系High5和酿酒酵母的溶胞产物高度特异性地回收此融合蛋白。此实验(图14b)使用本领域常见的细胞系，其例证BC2纳米陷阱连同使用BC2T变异pTag1 SEQ ID NO:33的蛋白质标记对从重组表达的相关系统进行蛋白质纯化和沉淀的适用性。
表5：与野生型BC2T比较，两种改进的BC2T变异的结合动力学
表格说明：使用生物层干涉量度法分析BC2-Nb与BC2T(SEQ ID NO:4)和其两种改进的变异(pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34)的结合(原始数据参见图13)。列出了1:1结合模型的解离常数(KD)、缔合(kon)和解离(koff)速率常数以及拟合质量的标记物(χ2，R2)。对原始的BC2T报告的常数不同于在表1中列出的那些，因为使用不同的方法分析动力学。
总之，理性的设计途径能够研发改进的BC2T变异，其特征在于由BC2-Nb的较高亲和力。这些改进的变异可以被融合至感兴趣的蛋白质的N-端或C-端，并且允许从各种生物体高效地纯化这样的融合蛋白。而且，与原始的BC2T相同，这些改进的BC2T标记可以使用天然的非变性条件由BC2陷阱洗脱。
实施例8：材料和方法
表达质粒
对于C-端BC2标记的GFP(GFPBC2T)的细菌表达，pEGFP-C1(Clontech)被用作模板。通过聚合酶链反应(PCR)使用寡核苷酸引物GFPBC2T_for(5′-GCA CCA TGG ATG GTG AGCAAG GGC GAG G-3′；SEQ ID NO:15)和GFPBC2T_rev(5‘-GAC GTC GAC TTA CTG CTG CCA GTGACT AAC A-3′；SEQ ID NO:16)扩增编码GFPBC2T的序列。将PCR片段克隆入pTRC2A(LifeTechnologies)的NcoI/SalI限制性位点。对于具有N-端His6-标记(His6-GFPBC2T)的C-端BC2标记的GFP的表达，通过PCR使用寡核苷酸引物His6-GFPBC2T_for(5′-CAG GGA TCC GAG TGAGCA AGG GC-3′；SEQ ID NO:17)和His6-GFPBC2T_rev(5′-CAG GGT ACC TTA CTG CTG CCAGTG ACT AA-3′；SEQ ID NO:18)扩增编码GFPBC2T的序列。将PCR片段克隆入添加N-端His6-标记的pRSET B(Invitrogen)的BamHI/KpnI限制性位点。
为了生成包括50％修饰的BC2标记的GFP融合构建体，pEGFP-C1(Clontech)被用作模板。通过聚合酶链反应(PCR)使用寡核苷酸引物GFPBC2Tmut_for(5'-GGA TCC GAT GGT GAGCAA GGG CGA G-3'；SEQ ID NO:19)和GFPBC2Tmut_rev(5‘-GGT ACC TTA GCT GCT CCA CTGGCT CAG CGC CGC GCT CCG GAC CGG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC-3'；SEQ ID NO:20)扩增编码GFPBC2Tmut的序列。将PCR片段克隆入先前生成的GFPBC2T表达构建体的BamHI/KpnI限制性位点。
为了生成编码具有N-端His6-标记和C-端缩短形式的BC2T(BC2T-10或BC2T-8)的GFP的细菌表达载体，通过PCR使用pEGFP-C1(Clontech)作为模板扩增编码GFPBC2T-10或GFPBC2T-8的序列。对于PCR，使用下列寡核苷酸引物：His6-GFPBC2T-10_for：(5′-ccccGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′；SEQ ID NO:21)和His6-GFPBC2T-10_rev(5′-ccccGGTACCTTACCAATGTGACACCGCTGCTTTGCGGTCAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′；SEQ IDNO:22)或His6-GFPBC2T-8_for(5′-ccccGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′；SEQ ID NO:23)和His6-GFPBC2T-8_rev(5′-ccccGGTACCTTACCAGTGGGAAACGGCTGCTTTACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3′；SEQ ID NO:24)。
对于C-端BC2标记的GFP的哺乳动物表达，pEGFP-C1被用作模板。通过PCR使用寡核苷酸引物eGFPBC2T_for(5′-AAG CTA GCG CTA CCG GTC GCC ACC ATG-3′；SEQ ID NO:25)和eGFPBC2T_rev(5′-AAG GTA CCT TAT TGC TGC CAG TGA CTA ACA GCC GCT TTT CTG TCTGGC TTG TAC AGC TCG TC-3′；SEQ ID NO:26)扩增编码哺乳动物eGFPBC2T构建体的序列。将PCR片段克隆入pEGFP-C1载体的NheI/KpnI位点。
对于N-端BC2标记的GFP(BC2TGFP)的哺乳动物表达，合成分别具备NheI和BglII限制性位点的编码BC2-标记(5′-GCT AGC ATG CCC GAT CGT AAG GCT GCG GTC TCT CAT TGGCAA CAG AGA TCT-3′；SEQ ID NO:27)的核苷酸序列(MWG)。随后，将标记克隆入pEGFP-N1(Clontech)的NheI/BglII位点。获得的质粒使用XhoI和NheI消化，使用Klenow酶(Roche)平端化(blunt)并且再连接，得到期望的构建体。
对于mCherry-波形蛋白BC2T的哺乳动物表达，mCherry-波形蛋白构建体[18]被用作模板。通过PCR使用寡核苷酸引物mCherry-波形蛋白BC2T_for(5′-AAA AGC TTA GGT GGAGGA GGT TCT TCC ACC AGG TCC GTG TC-3′；SEQ ID NO:28)和mCherry-波形蛋白BC2T_rev(5′-AAG GTA CCC TAT TGC TGC CAG TGA CTA ACA GCC GCT TTT CTG TCT GGT TCA AGGTCA TCG TG-3′；SEQ ID NO:29)扩增编码mCherry-波形蛋白BC2T的核苷酸序列。将PCR片段克隆入mCherry-波形蛋白载体的HindIII/KpnI位点。
对于GFP-PCNABC2T的哺乳动物表达，GFP-PCNA[17]被用作模板。通过PCR使用寡核苷酸引物GFP-PCNABC2T_for(5′-GTA TGG CTT CGT GGG GAT CCC CG-3′；SEQ ID NO:30)和GFP-PCNABC2T_rev(5′-GGG GTC TAG ACT AAA GGT ACC CTA TTG CTG CCA GTG ACT AACAGC CGC TTT TCT GTC TGG AGA TCC TTC TTC ATC CTC-3′；SEQ ID NO:31)扩增编码GFP-PCNABC2T的序列。将PCR片段克隆入GFP-PCNA载体的BamHI/XbaI限制性位点。
为了生成编码具有N-端His6-标记和C-端BC2T或其变异的mCherry的细菌表达载体，编码BC2T(SEQ ID NO:4)以及变异pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34的序列被合成为寡核苷酸，退火并且克隆入质粒载体pRSET-B_mCherry(ThermoFisherScientific)的BrsGI和HindIII限制性位点。为此，使用下列寡核苷酸：mCherry_BC2T_fw(5’-GTA CAG TGG TCC GGA TCG CAA AGC GGC GGT GAG CCA TTG GCA GCA GTA AA-3’；SEQID NO:35)和mCherry_BC2T_rv(5’-AGC TTT TAC TGC TGC CAA TGG CTC ACC GCC GCT TTGCGA TCC GGA CCA CT-3’；SEQ ID NO:36)；mCherry_SEQ33_fw(5’-GTA CAG TGG TCC GGATCG CGT GCG CGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CTA AA-3’；SEQ ID NO:37)和mCherry_SEQ33_rv(5’-AGC TTT TAG CTG CTC CAA TGG CTC ACC GCG CGC ACG CGA TCC GGA CCACT-3’；SEQ ID NO:38)；mCherry_SEQ34_fw(5’-GTA CAGT GGT GCG GAT CGC GTG CGC GCGGTG AGC CAT TGG AGC AGC TAA A-3’；SEQ ID NO:39)和mCherry_SEQ34_rv(5’-AGC TTTTAG CTG CTC CAA TGG CTC ACC GCG CGC ACG CGA TCC GCA CCA CT-3’；SEQ ID NO:40)。
为了生成编码具有C-端His6-标记和N-端BC2T或其变异的mCherry的细菌表达载体，编码BC2T(SEQ ID NO:4)以及变异pTag1 SEQ ID NO:33和pTag2 SEQ ID NO:34的序列被合成为寡核苷酸，退火并且克隆入编码C-端His6-标记的修饰的质粒载体pRSET-B_mCherry(ThermoFisher Scientific)的变异的NdeI和BamHI限制性位点。为此，使用下列寡核苷酸：mCherry_BC2T_fw2(5’-TAT G CC GGA TCG CAA AGC GGC GGT GAG CCA TTG GCAGCA GGG CTC G-3’；SEQ ID NO:41)和mCherry_BC2T_rv2(5’-GAT CCG AGC CCT GCT GCCAAT GGC TCA CCG CCG CTT TGC GAT CCG GCA-3’；SEQ ID NO:42)；mCherry_SEQ33_fw2(5’-TAT GCC GGA TCG CGT GCG CGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CGG CTC G-3’；SEQ IDNO:43)和mCherry_SEQ33_rv2(5’-GAT CCG AGC CGC TGC TCC AAT GGC TCA CCG CGC GCACGC GAT CCG GCA-3’；SEQ ID NO:44)；mCherry_SEQ34_fw2(5’-TAT GGC GGA TCG CGT GCGCGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CGG CTC G-3’；SEQ ID NO:45)和mCherry_SEQ34_rv2(5-GAT CCG AGC CGC TGC TCC AAT GGC TCA CCG CGC GCA CGC GAT CCG CCA-3’；SEQ ID NO:46)。
蛋白质产生和纯化
如先前描述的进行BC2纳米抗体的表达和纯化[11]。如先前描述的进行wtGFP或其修饰形式的表达和纯化。基于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，所有蛋白质的纯度被评价为至少95％。光谱学测定蛋白质浓度。
复合体形成
对于复合体形成，混合2mg/ml下的BC2-Nb溶液，并且使用三倍摩尔过量的肽在10mM Tris/HCl pH 7.4，100mM NaCl缓冲液中在室温下培育1h。经由尺寸排阻色谱法(Superdex 200 increase，GE Healthcare)去除过量的肽。通过使用具有PhenomenexKinetex(2.6u C18)柱的Shimadzu LCMS 2020的液相色谱法-质谱法确认复合体形成。复合体被浓缩至13.7mg/ml并且用于结晶实验。
结晶化
通过将3.2mg/ml蛋白质溶液与结晶缓冲液(0.1M MES/咪唑pH 6.7，12.5％[v/v]2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，7.5％[w/v]PEG 1000，7.5％[w/v]PEG 3350，3mM醇混合物)以1:1比率在20℃下混合，使用悬滴气相扩散(hanging drop vapor diffusion)结晶化未配位的BC2-Nb。通过将13.7mg/ml复合溶液与结晶缓冲液(0.1M MES/咪唑pH 6.5，12.5％[v/v]2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，12.5％[w/v]PEG 1000，12.5％[w/v]PEG 3350，4mM氨基酸混合物)以1:1比率在20℃下混合，使用悬滴气相扩散结晶化BC2-Nb/BC2T复合体。在两种情况下，将晶体转移入包含30％[v/v]MPD的结晶溶液用于冷冻保护，并且在培育之后在液氮中迅速冷却30s。使用的束波长在BESSY II的光束线MX 14.2下在Helmholtz-Zentrum Berlin(HZB)处收集在不同位置处来自BC2-Nb的一个数据集和来自BC2-Nb/BC2T复合体的相同晶体的四个数据集。
减少X射线数据并且在BC2-Nb/BC2T复合体的情况下，使用XDS程序包合并[20]。在仅包含核心区的纳米抗体(PDB ID:2X1O)的CHAINSAW[22,23]修饰的模型的情况下，通过使用PHASER[21]进行分子替换获得BC2-Nb数据的初始相。然后，在分子替换中使用未配位的BC2-Nb结构作为搜索模型解析BC2-Nb/BC2T复合体的结构。使用PHENIX.refine[24]、REFMAC5[25]和COOT[26]细化两种结构。使用MOLPROBITY[27]验证两种结构。Ramachandran图显示了有利区中的100％(BC2-Nb)、98.1％(BC2-Nb/BC2T复合体)，和允许区中的100％。
结构可视化和分析
使用Phenix结构_比较实施结构的叠加和RMSD值的计算。使用PyMol(http://www.pymol.org)制备晶体结构的图像。
使用合成位置扫描肽文库对结合特异性进行质谱分析
为了调查BC2T和衍生的突变体的结合特异性，使用分别在N-端或C-端处定位的乙酰基和酰胺基团(Intavis)合成序列PDRKAAVSHWQQ(SEQ ID NO:4)的每个氨基酸位置的肽文库。使用固定化在琼脂糖珠上的2μl BC2-Nb培育单一位置文库的60pmol肽，实施沉淀研究。在HulaMixer(Life Technologies)上在300μl PBS/0.01％CHAPS中进行培育1h。在离心步骤之后，在LC-MS程序中分析10μl上清液。使用UltiMate3000 RSLCnano系统(ThermoScientific)分离肽，该系统由C18 PepMap100μ-前置柱(300μm×5mm；颗粒大小：5μm；孔大小：-Thermo Scientific)和C18分析柱(Acclaim快速分离LC(RSLC)柱：150mm×5mm；颗粒大小：2.2μm；孔大小：-Thermo Scientific)组成。以8％开始应用步骤梯度并且在20min后在30％洗脱液B(80％乙腈，20％H2O，0.1％甲酸)处终止。使用通过Q ExactivePlus质谱仪(Thermo Scientific)检测的FULL-MS-策略分析肽。随着选择最大注射时间100ms，同时设定AGC目标为3E6。分辨率设定为70.000。参考一半-最大信号区域以使用固定化在琼脂糖珠上的GFP-特异性纳米抗体控制沉淀途径。一式三份进行所有实验。
细胞培养和转染
在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和Pen Strep(都来自Gibco,LifeTechnologies)的DMEM(高浓度葡萄糖，丙酮酸)中培育HEK293T和海拉细胞。在具有5％CO2气氛的加湿室中在37℃下培育细胞并且胰蛋白酶化进行传代。为了在P100盘中生成DNA/PEI复合体用于瞬时转染，将24μg DNA与使用750μl Opti-MEM(Gibco,Life Technologies)预稀释的108μl聚乙烯亚胺(PEI，Sigma Aldrich)混合并且在RT下培育10min。对于在96孔板中转染细胞，使用200ng的DNA和1.5μl的PEI。
从细菌细胞生成可溶性蛋白质级分
将源自1L培养物的表达GFP或GFPBC2T的大肠杆菌细胞的沉淀物在4℃下在包含0.1mg/ml溶菌酶、5μg/ml DnaseI、50μg/ml PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物B(Serva)的500μl PBS中均匀化90min，接着超声处理(10×10秒脉冲)。在离心步骤后(18.000×g，4℃下10min)，将可溶性蛋白质级分转移入新的杯并且根据制造商的方案(Thermo FisherScientific)使用Coomassie Plus测定每种溶胞产物的蛋白质浓度。
表面等离子体共振
使用表面等离子体共振波谱法以Biacore 3000仪器(GE-Healthcare)进行BC2纳米抗体和其指示的突变体对GFPBC2T的亲和力测量。将GFPBC2T共价偶联在CM5传感器芯片(GEHealthcare)的葡聚糖纤维上，达到500RU的响应水平。一个流动池(flow cell)在不存在蛋白质的情况下被活化和封闭以测定背景，另一个针对非特异性结合装载未标记的GFP作为对照。对于动力学测量，注入7.8125nM至250nM的范围内的六种浓度的BC2-Nb、BC2-NbR106S或BC2-NbR106E。一式二份进行每种测量。作为运行/稀释缓冲液，使用10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.5％表面活性剂吐温。在25℃下进行测量。对于BC2-Nb的缔合，应用50μl/min的流速持续15s，并且对于解离，应用50μl/min的流速持续600s。通过以30μl/min的流速注入23μl再生溶液诱导再生。作为再生溶液，使用10mM甘氨酸-HCl pH 2.0。使用软件Bia评估4.1和具有质量转移的1:1朗缪尔结合模型评价数据。
SDS-PAGE和免疫印迹
根据标准程序进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在2×SDS-样品缓冲液(60mM Tris/HCl，pH 6.8；2％(w/v)SDS；5％(v/v)2-巯基乙醇，10％(v/v)甘油，0.02％溴酚蓝)中煮沸蛋白质样品。对于免疫印迹，将蛋白质转移在硝酸纤维素膜上(Bio-RadLaboratories)。
抗体
对于免疫印迹，使用下列第一抗体：抗-GFP克隆3H9(ChromoTek)、抗-PCNA克隆16D10(ChromoTek)、抗-波形蛋白克隆V9(Sigma Aldrich)、抗-GAPDH(abcam)、抗-β-联蛋白克隆14(BD-Biosciences)。对于检测，使用荧光团标示的物种特异性第二抗体(Alexa-647，山羊-抗-兔，山羊-抗-大鼠；山羊-抗-小鼠Life Technologies)。在Typhoon-Trio激光扫描仪(GE Healthcare)上扫描印迹。
BC2标记的蛋白质的免疫沉淀
瞬时表达eGFP、eGFPBC2T或BC2TeGFP、eGFP-PCNA、eGFP-PCNABC2T、mCherry-波形蛋白、mCherry-波形蛋白BC2T的HEK293T细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤和收获，在液氮中速冻并且在-20℃下储存。通过在冰上重复吸移40min在200μl溶解缓冲液(10mM Tris/Cl pH7.5，150mM NaCl，0.5％NP40，1μg DNaseI，2mM MgCl2，2mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂混合物M(Serva))中均匀化细胞沉淀物。在离心步骤(在18.000×g下10min)后，根据制造商的方案使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)测定每种溶胞产物的蛋白质浓度，并且使用稀释缓冲液(10mM Tris/Cl pH 7.5，150mM NaCl，2mM PMSF)将蛋白质溶液调节至1mg/ml的浓度。将2％的上清液添加至含有SDS的样品缓冲液(其被称为输入物)。添加50μl BC2纳米陷阱(浆液)/100μl上清液，接着在4℃下在颠倒旋转器(end-over-end rotor)上培育1h。在离心步骤(2min，2500×g)后，将预清除的上清液转移至新的杯。将2％添加至含有SDS的样品缓冲液(其被称为未结合的)。在四个洗涤步骤后，通过在50μlSDS-样品缓冲液中煮沸珠或通过使用指示的洗脱缓冲液培育来洗脱BC2纳米陷阱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE接着免疫印迹分析样品。使用指示的抗体探测免疫印迹。
严苛条件下的免疫沉淀
对于每种条件，50μl珠-浆液与来自大肠杆菌溶胞产物(c＝1mg/ml)的100μl可溶性蛋白质级分和包含清洁剂或离液剂的150μl溶液混合，导致如下面所指示的最终浓度。使用尿素(0M、1M、2M、4M)和盐酸胍(0M、0.375M、0.75M、1.5M、3M)作为离液剂并且使用SDS(0％、0.1％、0.5％、1％、2％)作为清洁剂。在4℃下在颠倒旋转器上培育一小时和离心步骤(2min，2500×g，4℃)后，丢弃上清液并且在50μl 2×样品缓冲液中煮沸前在PBS中洗涤两次其余的珠。使用抗-GFP抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析10％的每种珠结合的(B)级分。
结合的BC2标记的蛋白质的洗脱
对于洗脱实验，使用源自表达GFPBC2T的大肠杆菌细胞的400μl可溶性蛋白质提取物(c＝1mg/ml)在4℃下在颠倒旋转器上培育40μl的BC2纳米陷阱(浆液)持续1h。在离心步骤(2500×g，4℃，2min)后，丢弃上清液并且在第二洗涤步骤后在冰冷PBS中洗涤珠四次，包括杯改变。随后，使珠沉淀并且使用80μl指示的洗脱条件在RT下培育15min。下列洗脱条件已经被测试：肽洗脱：溶解在0.2M Tris/Cl pH 7.4，150mM NaCl中的0mM、0.01mM、0.1mM或1mM BC2-肽；酸性洗脱：调节至pH 1、pH 2或pH 3的0.2M甘氨酸-HCl；碱性洗脱：0mM、1mM、10mM或100mM NaOH；使用硫氰酸钠的洗脱：0M、1M、2M或3M NaSCN。收集洗脱物并且在包含样品缓冲液的1×SDS中煮沸，并且在40μl 2×样品缓冲液中煮沸前在PBS中洗涤两次其余的珠。使用抗-GFP抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析10％的每种洗脱(释放，R)和珠结合的(结合的，B)级分。
使用荧光标示的纳米抗体的免疫荧光染色
根据制造商的指导，使用NHS-活化的荧光染料Alexa488(Life technologies)或Atto647(Atto-Tec)标示纯化的BC2纳米抗体(1mg)。在偶联后，通过在PD-10DesaltingColumns(GE Healthcare)上的分离去除未结合的染料。对于免疫印迹分析，5μg的BC2-NbAF488在TBS，0.05％吐温20中稀释的4ml 3％BSA中稀释，并且在RT下培育蛋白质印迹持续1h。
对于免疫细胞化学，使用编码C-端BC2标记的波形蛋白或PCNA的质粒转染5-10×103个贴壁的海拉细胞/μClear 96孔板(Greiner)的孔。在24h后，使用PBS洗涤细胞一次并且使用PBS中的4％w/v多聚甲醛(PFA)在RT下固定15min或使用甲醇在-20℃下固定15min。在去除固定剂和使用PBS洗涤两次后，封闭细胞并且使用PBS中的3％w/v BSA和0.1％v/vTriton X-100在RT下透性化1h。随后，以10-15μg/ml的最终浓度添加标示的BC2纳米抗体和具有1μg/ml的最终浓度的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma Aldrich)，在4℃下培育过夜。通过使用PBS和H2O中的6％v/v 5M NaCl的混合物洗涤3次去除未结合的纳米抗体和DAPI。使用Image Xpress micro XL系统获得图4b和图10b的图像。图10a的共聚焦图像使用ImageXpress Micro Confocal获得。
荧光光谱法
通过在Typhoon Trio(GE Healthcare Life Sciences)上扫描96孔微孔板(Nunc)进行荧光分析，激发：488nm，发射滤光片设定：520nm BP 40。
生物层干涉量度法
使用生物层干涉量度法使用BLItz系统仪器(fortéBIO)进行BC2-Nb对BC2T和改进的变异pTag1和pTag2的亲和力测量。BC2T和其变异的生物素化的肽被固定化在链霉亲和素生物传感器(fortéBIO)上。将装载的传感器相继地浸渍入BLItz缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，0.1％(m/v)BSA，0.02％(v/v)吐温20)持续120s以测定基线信号，在BLItz缓冲液中的BC2-Nb的溶液(5-50nM的浓度)中持续120s以测定缔合和在BLItz缓冲液中持续600s以测定解离。振动速率是1200rpm。作为参比，仅根据上面的方案也使用BLItz缓冲液培育每种肽。在对照实验中，使用BC2-Nb培育链霉亲和素生物传感器而没有在先的肽固定化。通过连续的浸渍入10mM甘氨酸pH 2.0和BLItz缓冲液(重复三次)再生传感器。使用软件BLItz Pro(fortéBio)和1:1结合模型分析原始数据。
参考文献
1 De Genst,E.et al.Molecular basis for the preferential cleftrecognition by dromedary heavy-chain antibodies.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 103,4586-4591,doi:10.1073/pnas.0505379103(2006).
2 Muyldermans,S.Single domain camel antibodies:current status.Journalof biotechnology 74,277-302(2001).
3 Govaert,J.et al.Dual beneficial effect of interloop disulfide bondfor single domain antibody fragments.The Journal of biological chemistry 287,1970-1979,doi:10.1074/jbc.M111.242818(2012).
4 Rothbauer,U.et al.A versatile nanotrap for biochemical andfunctional studies with fluorescent fusion proteins.Molecular&cellularproteomics:MCP 7,282-289,doi:10.1074/mcp.M700342-MCP200(2008).
5 Muyldermans,S.Nanobodies:natural single-domain antibodies.Annu RevBiochem 82,775-797,doi:10.1146/annurev-biochem-063011-092449(2013).
6 Lee,S.Y.et al.Ube3a,the E3 ubiquitin ligase causing Angelmansyndrome and linked to autism,regulates protein homeostasis through theproteasomal shuttle Rpn10.Cellular and molecular life sciences:CMLS 71,2747-2758,doi:10.1007/s00018-013-1526-7(2014).
7 Schembri,L.et al.The HA tag is cleaved and loses immunoreactivityduring apoptosis.Nature methods 4,107-108,doi:10.1038/nmeth0207-107(2007).
8 Wegner,G.J.,Lee,H.J.&Corn,R.M.Characterization and optimization ofpeptide arrays for the study of epitope-antibody interactions using surfaceplasmon resonance imaging.Analytical chemistry 74,5161-5168(2002).
9 Hilpert,K.et al.Anti-c-myc antibody 9E10:epitope key positions andvariability characterized using peptide spot synthesis on cellulose.ProteinEng 14,803-806(2001).
10 De Genst,E.J.et al.Structure and properties of a complex of alpha-synuclein and a single-domain camelid antibody.Journal of molecular biology402,326-343,doi:10.1016/j.jmb.2010.07.001(2010).
11 Traenkle,B.et al.Monitoring interactions and dynamics ofendogenous beta-catenin with intracellular nanobodies in livingcells.Molecular&cellular proteomics:MCP,doi:10.1074/mcp.M114.044016(2015).
12 Huang,L.et al.SPECT imaging with 99mTc-labeled EGFR-specificnanobody for in vivo monitoring of EGFR expression.Molecular imaging andbiology:MIB:the official publication of the Academy of Molecular Imaging 10,167-175,doi:10.1007/s11307-008-0133-8(2008).
13 Vaneycken,I.et al.Preclinical screening of anti-HER2 nanobodiesfor molecular imaging of breast cancer.FASEB journal:official publication ofthe Federation of American Societies for Experimental Biology 25,2433-2446,doi:10.1096/fj.10-180331(2011).
14 Broisat,A.et al.Nanobodies targeting mouse/human VCAM1 for thenuclear imaging of atherosclerotic lesions.Circulation research 110,927-937,doi:10.1161/CIRCRESAHA.112.265140(2012).
15 Ries,J.,Kaplan,C.,Platonova,E.,Eghlidi,H.&Ewers,H.A simple,versatile method for GFP-based super-resolution microscopy viananobodies.Nature methods 9,582-584,doi:10.1038/nmeth.1991(2012).
16 Yoon,M.,Moir,R.D.,Prahlad,V.&Goldman,R.D.Motile properties ofvimentin intermediate filament networks in living cells.The Journal of cellbiology 143,147-157(1998).
17 Leonhardt,H.et al.Dynamics of DNA replication factories in livingcells.The Journal of cell biology 149,271-280(2000).
18 Maier,J.,Traenkle,B.&Rothbauer,U.Real-time analysis of epithelial-mesenchymal transition using fluorescent single-domain antibodies.Scientificreports 5,13402,doi:10.1038/srep13402(2015).
19 Kirchhofer,A.et al.Modulation of protein properties in livingcells using nanobodies.Nature structural&molecular biology 17,133-138,doi:10.1038/nsmb.1727(2010).
20 Kabsch,W.Xds.Acta crystallographica.Section D,Biologicalcrystallography 66,125-132,doi:10.1107/S0907444909047337(2010).
21 McCoy,A.J.et al.Phaser crystallographic software.Journal ofapplied crystallography 40,658-674,doi:10.1107/S0021889807021206(2007).
22 Winn,M.D.et al.Overview of the CCP4 suite and currentdevelopments.Acta crystallographica.Section D,Biological crystallography 67,235-242,doi:10.1107/S0907444910045749(2011).
23 Stein,N.CHAINSAW:a program for mutating pdb files used astemplates in molecular replacement.Journal of applied crystallography 41,641-643,doi:Doi 10.1107/S0021889808006985(2008).
24 Adams,P.D.et al.PHENIX:a comprehensive Python-based system formacromolecular structure solution.Acta crystallographica.Section D,Biologicalcrystallography 66,213-221,doi:10.1107/S0907444909052925(2010).
25 Murshudov,G.N.,Vagin,A.A.&Dodson,E.J.Refinement of macromolecularstructures by the maximum-likelihood method.Acta crystallographica.Section D,Biological crystallography 53,240-255,doi:10.1107/S0907444996012255(1997).
26 Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-building tools for moleculargraphics.Acta crystallographica.Section D,Biological crystallography 60,2126-2132,doi:10.1107/S0907444904019158(2004).
27 Chen,V.B.et al.MolProbity:all-atom structure validation formacromolecular crystallography.Acta crystallographica.Section D,Biologicalcrystallography 66,12-21,doi:10.1107/S0907444909042073(2010).
序列表
<110> 科尔莫泰克公司
图宾根大学NMI自然科学和医学研究院
<120> 用于检测、捕获和/或纯化标记的多肽的表位标记和方法
<130> CHR161101PCT
<150> EP15194838.7
<151> 2015-11-16
<160> 46
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> K或置换
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> A或R，或A或R的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> V或V的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> H或H的保守置换
<400> 1
Arg Xaa Xaa Ala Xaa Ser Xaa Trp
1 5
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> D或D的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> K或置换
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> A或R，A或R的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> V或V的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> H或H的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Q或Q的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Q或Q的保守置换
<400> 2
Pro Xaa Arg Xaa Xaa Ala Xaa Ser Xaa Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽 8 aa
<400> 3
Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<400> 4
Pro Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<400> 5
Pro Val Arg Ser Ala Ala Leu Ser Gln Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Asn Asn Ser Asp Asp Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Met Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Ala Arg Gly Cys Lys Arg Gly Arg Tyr Glu Tyr Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的框架区1
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的CDR1
<400> 8
Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr Asp
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的框架区2
<400> 9
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的CDR2
<400> 10
Ile Asn Asn Ser Asp Asp Asp Thr Tyr
1 5
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的框架区3
<400> 11
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Met Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Glu
35
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的CDR3
<400> 12
Ala Arg Gly Cys Lys Arg Gly Arg Tyr Glu Tyr Asp Phe Trp
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2-Nb的框架区4
<400> 13
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽 10 aa
<400> 14
Pro Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp
1 5 10
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP(BC2T)正向引物
<400> 15
gcaccatgga tggtgagcaa gggcgagg 28
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP(BC2T)反向引物
<400> 16
gacgtcgact tactgctgcc agtgactaac a 31
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T)正向引物
<400> 17
cagggatccg agtgagcaag ggc 23
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T)反向引物
<400> 18
cagggtacct tactgctgcc agtgactaa 29
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP BC2Tmut正向引物
<400> 19
ggatccgatg gtgagcaagg gcgag 25
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP(BC2Tmut)反向引物
<400> 20
ggtaccttag ctgctccact ggctcagcgc cgcgctccgg accggcttgt acagctcgtc 60
catgc 65
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T-10)正向引物
<400> 21
ccccggatcc gatggtgagc aagggcgagg 30
<210> 22
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T-10)反向引物
<400> 22
ccccggtacc ttaccaatgt gacaccgctg ctttgcggtc aggcttgtac agctcgtcca 60
tgcc 64
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T-8)正向引物
<400> 23
ccccggatcc gatggtgagc aagggcgagg 30
<210> 24
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His6-GFP(BC2T-8)反向引物
<400> 24
ccccggtacc ttaccagtgg gaaacggctg ctttacgctt gtacagctcg tccatg 56
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP(BC2T)正向引物
<400> 25
aagctagcgc taccggtcgc caccatg 27
<210> 26
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP(BC2T)反向引物
<400> 26
aaggtacctt attgctgcca gtgactaaca gccgcttttc tgtctggctt gtacagctcg 60
tc 62
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NheI - BC2T - BgIII
<400> 27
gctagcatgc ccgatcgtaa ggctgcggtc tctcattggc aacagagatc t 51
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry-波形蛋白(BC2T)正向引物
<400> 28
aaaagcttag gtggaggagg ttcttccacc aggtccgtgt c 41
<210> 29
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry-波形蛋白(BC2T)反向引物
<400> 29
aaggtaccct attgctgcca gtgactaaca gccgcttttc tgtctggttc aaggtcatcg 60
tg 62
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP-PCNA(BC2T)正向引物
<400> 30
gtatggcttc gtggggatcc ccg 23
<210> 31
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP-PCNA(BC2T)反向引物
<400> 31
ggggtctaga ctaaaggtac cctattgctg ccagtgacta acagccgctt ttctgtctgg 60
agatccttct tcatcctc 78
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> P或A
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> D或D的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> K或置换
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> A或R，或A或R的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> V或V的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> H或H的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Q或Q的保守置换
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Q或Q的保守置换
<400> 32
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Ala Xaa Ser Xaa Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<400> 33
Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽
<400> 34
Ala Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_BC2T_fw
<400> 35
gtacagtggt ccggatcgca aagcggcggt gagccattgg cagcagtaaa 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_BC2T_rv
<400> 36
agcttttact gctgccaatg gctcaccgcc gctttgcgat ccggaccact 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ33_fw
<400> 37
gtacagtggt ccggatcgcg tgcgcgcggt gagccattgg agcagctaaa 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ33_rv
<400> 38
agcttttagc tgctccaatg gctcaccgcg cgcacgcgat ccggaccact 50
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ34_fw
<400> 39
gtacagtggt gcggatcgcg tgcgcgcggt gagccattgg agcagctaaa 50
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ34_rv
<400> 40
agcttttagc tgctccaatg gctcaccgcg cgcacgcgat ccgcaccact 50
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_BC2T_fw2
<400> 41
tatgccggat cgcaaagcgg cggtgagcca ttggcagcag ggctcg 46
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_BC2T_rv2
<400> 42
gatccgagcc ctgctgccaa tggctcaccg ccgctttgcg atccggca 48
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ33_fw2
<400> 43
tatgccggat cgcgtgcgcg cggtgagcca ttggagcagc ggctcg 46
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ33_rv2
<400> 44
gatccgagcc gctgctccaa tggctcaccg cgcgcacgcg atccggca 48
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ34_fw2
<400> 45
tatggcggat cgcgtgcgcg cggtgagcca ttggagcagc ggctcg 46
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry_SEQ34_rv2
<400> 46
gatccgagcc gctgctccaa tggctcaccg cgcgcacgcg atccgcca 48

Claims (19)

1.具有8至25个氨基酸的分离的表位肽，其中氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1中限定的序列(RX4X5AX7SX9W)，
其中X4可以是K或置换；
其中X5可以是A或R，或A或R的保守置换；
其中X7可以是V或V的保守置换，并且
其中X9可以是H或H的保守置换，
其中，当所述分离的表位肽包括至少9个氨基酸时，其不包括如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)。
2.权利要求1所述的分离的表位肽，其具有12至25个氨基酸，其中所述氨基酸序列包括如由SEQ ID NO:32限定的序列(X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12)，
其中X1可以是P或A，
其中X2可以是D或D的保守置换；
其中X11和X12可以是Q或Q的保守置换。
3.权利要求1所述的分离的表位肽，其具有如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)；或
具有如由SEQ ID NO:5限定的氨基酸序列(PVRSAALSQWSS)，或
具有如由SEQ ID NO:33限定的氨基酸序列(PDRVRAVSHWSS)，或
具有如由SEQ ID NO:34限定的氨基酸序列(ADRVRAVSHWSS)。
4.表位肽作为N-端或C-端表位标记的用途，其中所述表位肽具有8至25个氨基酸，并且其中氨基酸序列包括如由SEQ ID NO:1限定的序列(RX4X5AX7SX9W)，
其中X4可以是K或置换；
其中X5可以是A或R，或A或R的保守置换；
其中X7可以是V或V的保守置换，并且
其中X9可以是H或H的保守置换。
5.由多肽和在其N-末端或C-末端处的至少一个表位肽构成的构建体，其中所述表位肽具有8至25个氨基酸，并且其中氨基酸序列包括如由SEQ ID NO:1限定的序列RX4X5AX7SX9W)，
其中X4可以是K或置换；
其中X5可以是A或R，或A或R的保守置换；
其中X7可以是V或V的保守置换，并且
其中X9可以是H或H的保守置换。
6.权利要求4所述的用途或权利要求5所述的构建体，其中所述表位肽具有12至25个氨基酸，其中所述氨基酸序列包括如由SEQ ID NO:32限定的序列(X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12)，
其中X1可以是P或A；
其中X2可以是D或D的保守置换；
其中X11和X12可以是Q或Q的保守置换；或
其中所述表位肽具有如由SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列(RKAAVSHW)；或如由SEQ IDNO:5限定的氨基酸序列(PVRSAALSQWSS)，或如由SEQ ID NO:33限定的氨基酸序列(PDRVRAVSHWSS)，或如由SEQ ID NO:34限定的氨基酸序列(ADRVRAVSHWSS)。
7.编码如权利要求1至6中任一项中限定的分离的表位肽的核酸；其中任选地所述核酸是RNA、DNA、PNA或LNA。
8.核酸表达构建体，其包括权利要求7所述的至少一种核酸，和任选地编码感兴趣的多肽的核酸和/或至少一个连接体。
9.权利要求8所述的核酸表达构建体，进一步包括连接体，其中所述连接体任选地包括编码切割位点或被邻近权利要求7所述的核酸定位的酶识别的位点的核酸序列，其中任选地所述切割位点被蛋白酶识别。
10.宿主细胞，其包括如权利要求7中限定的核酸，或如权利要求8或9中任一项中限定的核酸表达构建体；其中任选地所述宿主细胞选自原核细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞、真菌细胞、线虫细胞、鸟细胞、鱼细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
11.用于将如权利要求7中限定的核酸，或如权利要求8或9中任一项中限定的核酸表达构建体引入宿主细胞的方法，其中所述核酸被融合至所述宿主细胞中编码感兴趣的多肽的核酸，所述方法选自CRISPR/Cas基因组编辑，使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶的基因组编辑方法，使用试剂比如阴离子脂质、磷酸钙或DADE-葡聚糖的基于试剂的方法，转导，转染和基于仪器的方法比如电穿孔、显微注射和激光转染。
12.测定包括如权利要求1至6中任一项中限定的表位肽的感兴趣的多肽的存在、亚细胞定位和/或量的体外方法，其包括下列步骤：
a)将能够特异性地结合所述表位肽的亲和配体施用至样品，如权利要求10中限定的宿主细胞，或如权利要求10中限定的宿主细胞的细胞溶胞产物，其中任选地所述亲和配体包括可检测的部分；
b)任选地施用能够结合步骤a)的所述亲和配体、标记的多肽或二者构建的复合体的至少第二结合配偶体，其中所述第二结合配偶体包括可检测的部分和/或固定化的或可固定的部分；
c)通过检测所述可检测的部分来测定包括所述表位肽的所述感兴趣的多肽的存在、亚细胞定位和/或量。
13.权利要求12所述的方法，其中所述可检测的部分是荧光标签，其中通过测量荧光水平实施测定；或其中通过蛋白质印迹实施包括所述表位肽的所述感兴趣的多肽的存在和/或量的测定。
14.纯化如权利要求5中限定的构建体或包括如权利要求1至6中任一项中限定的表位肽的感兴趣的多肽的方法，其中所述方法包括如下的步骤
a)使包括所述构建体或所述感兴趣的多肽的样品与能够特异性地结合至所述表位肽的亲和配体接触，其中任选地在结合之前或之后，所述亲和配体被附连至固体支持体；
b)任选地使在步骤a)后获得的所述样品与能够结合步骤a)的所述亲和配体、标记的多肽或二者构建的复合体的第二结合配偶体接触，其中在结合之前或之后，所述第二结合配偶体被附连至固体支持体；
c)洗涤步骤a)或b)的所述固体支持体以去除未结合的和未特异性结合的成分；和任选地
d)洗脱所述构建体或所述感兴趣的多肽。
15.权利要求14所述的方法，其中步骤a)的所述样品是包括如权利要求8或9中限定的核酸构建体的如权利要求10中限定的宿主细胞的溶胞产物，其中所述方法进一步包括在权利要求14所述的步骤d)之后或替换其的步骤e)，其中通过使用蛋白酶切割从所述感兴趣的多肽去除所述表位肽。
16.权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述亲和配体是抗体，其中所述抗体是纳米抗体，优选地BC2-Nb，其中所述纳米抗体包括包含框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4的氨基酸序列，其中CDR3具有如SEQ ID NO:12中限定的氨基酸序列，并且其中半胱氨酸存在于所述框架区2中，能够与存在于CDR3中的半胱氨酸形成二硫桥。
17.用于捕获和/或检测多肽的试剂盒，其包括
a)如权利要求7中限定的核酸，或如权利要求8或9中任一项中限定的核酸表达构建体；
b)特异性地结合至如权利要求1至6中任一项中限定的表位肽的亲和配体，其中所述亲和配体任选地包括可检测的部分，其中任选地所述可检测的部分是荧光标签；其中任选地所述亲和配体是如权利要求16中限定的亲和配体；
c)任选地，特异于所述亲和配体、标记的多肽或二者构建的复合体的第二结合配偶体，其中所述第二结合配偶体包括可检测的部分和/或固定化的或可固定的部分；和
d)对如权利要求12至16中任一项中限定的方法必需的缓冲液和试剂。
18.用于捕获和/或纯化多肽的试剂盒，其包括
a)如权利要求7中限定的核酸，或如权利要求8或9中任一项中限定的核酸表达构建体；
b)特异性地结合至如权利要求1至6中任一项中限定的表位肽的亲和配体，其中任选地所述亲和配体被附连至固体支持体；
c)任选地特异于所述亲和配体、标记的多肽或二者构建的复合体的第二结合配偶体，其中所述第二结合配偶体被附连至固体支持体或是可固定的；和
d)任选地，如权利要求1至6中任一项中限定的分离的表位肽；
e)任选地，固体支持体，其中任选地所述固体支持体选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、纤维素、葡聚糖、合成聚合物和共聚物、乳胶、二氧化硅、琼脂糖、金属、玻璃和碳；和
f)对如权利要求12至16中任一项中限定的方法必需的缓冲液和试剂。
19.包括含有框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4的氨基酸序列的纳米抗体用于检测、捕获和/或纯化包括如权利要求1至6中任一项中限定的至少一种表位的多肽的用途，其中CDR3具有如SEQ ID NO:12中限定的氨基酸序列，并且其中半胱氨酸存在于所述框架区2中，能够与存在于CDR3中的半胱氨酸形成二硫桥。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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EP4141447A4 (en) * 2020-04-24 2023-10-25 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. DETECTION METHOD, DETECTION DEVICE AND DIELECTRIC PARTICLES
WO2023222580A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 Byondis B.V. Novel masked antibodies

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130115635A1 (en) * 2010-05-25 2013-05-09 Els Pardon Epitope tag for affinity-based applications
CN104812773A (zh) * 2012-07-20 2015-07-29 庆熙大学校产学协力团 表位标记用抗体、杂交瘤细胞株以及其用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2427257C (en) 2000-11-01 2014-01-21 The Government Of The United States Of America Expression vectors able to elicit improved immune response and methods of using same
WO2006010106A2 (en) 2004-07-09 2006-01-26 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Dna-based vaccination of retroviral-infected individuals undergoing treatment
EP3168306A1 (en) 2015-11-16 2017-05-17 ChromoTek GmbH Epitope tag and method for detection and/or purification of tagged polypeptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130115635A1 (en) * 2010-05-25 2013-05-09 Els Pardon Epitope tag for affinity-based applications
CN104812773A (zh) * 2012-07-20 2015-07-29 庆熙大学校产学协力团 表位标记用抗体、杂交瘤细胞株以及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BJOERN TRAENKLE等: "Monitoring Interactions and Dynamics of Endogenous Beta-catenin With Intracellular Nanobodies in Living Cells", 《MOLECULAR&CELLULAR PROTEOMICS》 *
WU，J.等: "Assessment of recombinant porcine follicle stimulating hormone receptor using a novel polyclonal ectodomain antibody", 《ENDOCRINE RESEARCH》 *

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