TW201024731A - Improved methods of RNA display - Google Patents

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TW201024731A
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scfv
mrna
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antibody
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TW098133223A
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Chung-Ming Hsieh
Yuliya A Kutskova
John E Memmott
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Abbott Lab
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201024731 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本揭示案係關於RNA呈現，且特定言之，係關於允許選 擇可溶性及細胞表面抗原之RNA呈現方法。 本申請案主張2008年9月30曰申請之美國臨時申請案第 61/101471號之優先權，該案之内容以引用的方式併入本 文中。 【先前技術】 * 可選擇以高特異性及親和力結合至幾乎任何結構抗原決 定基且通常用作研究工具及FDA批准之治療劑的抗體。因 此，治療性及診斷性單株抗體構成全世界幾十億美元市 場。 使動物免疫以獲得抗體之典型方法較慢且麻煩。因此， 已開發使用合成抗體庫離體選擇所需標靶分子之抗體的方 法。在一些方法中，在生物體（例如噬菌體 '病毒、酵母 參細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞）之表面上呈現抗體或其 片段之庫，且選擇表現所需抗體之生物體。在其他方法 中，在無細胞活體外系統中表現及選擇抗體庫。在一種稱 為RN A呈現之該系統中，將所表現之蛋白質或肽以共價方 式或藉由緊密非共價相互作用連接於其編以形成 RNA/蛋白質融合體分子。RNA/蛋白質融合體中之蛋白質 或肽組份經選擇可結合至所需標靶且蛋白質或肽之身分可 藉由對所連接之編瑪mRNA組份測序來測定。 目前的活體外RNA呈現系統儘管善於表現單一抗體可變 143627.doc 201024731 域，但表現諸如單鏈抗體（scFv)分子之多域抗體的效率 低。此主要歸因於目前活體外表現系統之反應條件及庫中 之全長scFv cDNA在重複PCR擴增中損失之趨勢。 因此，此項技術中需要用於選擇針對所需標靶之^⑺抗 體的改良之活體外呈現方法。 【發明内容】 本發明藉由提供允許自表現庫可靠地表現及選擇scFv分 子之活體外RNA呈現之改良方法來解決上述問題。儘管尤 其適合於表現及選擇scFv分子，但本發明之方法亦適用於 活體外呈現所有類別之蛋白質，包括可溶性與細胞表面抗 原。 因此’本發明具有若干優點，包括（但不限於）提供比先 前所述之方法執行更簡單且耗時更少之改良的活體外RN A 呈現方法。另外’本發明之方法允許增強含有鏈内二硫鍵 之蛋白質（例如scFv抗體分子）之功能性表現。 在一態樣中，本發明提供一種篩檢scFv抗體RNA呈現庫 之方法，該方法包含以下步驟：（a)提供嘌呤黴素 (puromycin)或其類似物交聯scFv mRNA分子，該分子包含 編碼5’ scFv及3’間隔序列之mRNA ’該分子與單股核酸連 接子交聯，該連接子包含3'端之嘌呤黴素或其類似物及5, 端之補骨脂素C6(Psoralen C6) ; (b)在標記存在下，在 GSSG(氧化型麩胱甘肽）/GSH(還原型麩胱甘肽）及PDI(蛋白 質二硫鍵異構酶）存在下，且無二硫蘇糖醇存在下，於形 成經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子的條件 143627.doc 201024731 下’活體外轉譯°票吟黴素交聯SCFv mRNA ; (c)純化經標記 之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子；（d)使經純化、 經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子經受至少一 種抗原之抗原選擇’及（e)使用基於親和力之磁性珠粒回收 經純化、經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子。 在一實施例中，該方法進一步包含（g)在抗原選擇後反 轉錄該scFv mRNA以產生CDNA之步驟。在另一實施例 中，方法進一步包含（h)擴增cDNA之步驟。 在一實施例中’該標記為放射性標記，諸如35s甲硫胺 酸或半胱胺酸。 在一實施例中’該3'間隔序列包含約〇至約2〇〇個胺基 酸’例如約16個胺基酸，且/或該3'間隔子包含親和標籤。 在一實施例中，該連接子從5'到3'包含：補骨脂素C6、 包含序列UAGCGGAUGC之2OMe核糖核苷酸（SEQ ID NO: 20)、6個三乙二醇或PEG-150部分、2個胞苷殘基及嘌呤黴 素。 在一實施例中，scFv mRNA分子藉由UVA與DNA連接子 光交聯。在另一實施例中，scFv mRNA分子包含選自由 T7、SP6及T3組成之群的5’啟動子。在一特定實施例中， scFv mRNA分子包含終草鑲嵌病毒（tobacco mosaic virus)5' 非轉譯區。 在一實施例中，該經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/ 蛋白質分子係藉由募聚去氧胸苷（oligo-dT)層析法來純 化。在另一實施例中，經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/ 143627.doc 201024731 蛋白質分子係使用抗FLAG M2單株抗體瓊脂糖珠粒來純 化。在又一實施例中，經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/ 蛋白質分子係藉由募聚去氧胸苷層析法及抗FLAG M2單株 抗體瓊脂糖珠粒來純化。 在一實施例中，該抗原為生物素標記之肽、蛋白質或半 抗原。在另一實施例中，抗原為與人類免疫球蛋白可結晶 片段（Fc)或與鼠類免疫球蛋白可結晶片段（Fc)的融合蛋 白，或抗原為細胞群體。在一特定實施例中，本發明之抗 體為抗IL-12抗體、抗血球凝集素（抗HA)抗體、鼠類抗體 或人類抗體。 在一實施例中，嘌呤黴素交聯scFv mRNA之活體外轉譯 係在GSSH/GSH存在下執行。 在一實施例中，該方法不包含mRNA加帽步驟。在另一 實施例中，該方法在純化步驟之前不包含活體外反轉錄步 驟。在又一實施例中，在步驟（a)至（g)中之任一步之前、 期間或之後添加核糖核酸酶（RNase)抑制劑。在一實施例 中，該純化步驟包含無二硫蘇糖醇（DTT)存在下反轉錄 mRNA以產生cDNA。 在特定實施例中，藉由約ρΗ=8·0至約pH=10.0之鹼性水 解來溶離cDNA。或者，藉由足以使DNA:RNA雜合物變性 之加熱，藉由約pH=3.0至約pH=6.0之酸或藉由核糖核酸酶 Η消化來溶離cDNA。 在一實施例中，藉由聚合酶鏈反應來擴增cDNA。在一 實施例中，聚合鏈反應係使用熱穩定DNA聚合酶或選自由 143627.doc 201024731
PlatinumHiFi及KOD組成之群的DNA聚合酶。 在另一實施例中，該等珠粒係選自由以下組成之群：抗 生蛋白鏈菌素-M280、中性鏈親和素-M280、SA-M270、 _ NA-M270、SA_MyOne、NA-MyOne、SA-壤脂糖及 NA-瓊 脂糠。 本發明之其他特徵及優點由以下實施方式及申請專利範 圍而顯而易見。 ^ 【實施方式】 序列識別號 本說明書中所提及之核苷酸及胺基酸序列已指定以下序 列識別號： SEQ ID NO:l-MAK195 scFv蛋白序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO:2-Y61 scFv短蛋白質序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO:3-Y61 scFv長蛋白質序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO:4-Y61 scFv基因3蛋白質序列之胺基酸序 ❹ 列。 SEQ ID NO:5-D2E7 scFv短蛋白質序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO:6-D2E7 scFv中蛋白質序列之胺基酸序列。 • SEQ ID NO:7-D2E7 scFv長蛋白質序列之胺基酸序列。 - SEQ ID ΝΟ··8-17/9 scFv短蛋白質序列之胺基酸序列。 SEQ ID ΝΟ··9-17/9 scFv長蛋白質序列之胺基酸序列。 SEQ ID N〇:10-MAK195 scFv核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:ll-Y61 scFv短核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:12-Y61 scFv長核苷酸序列之核酸序列。 143627.doc 201024731 SEQ ID NO:13-Y61 scFv基因3PA核苷酸序列之核酸序 列。 SEQ ID NO:14-Y61 scFv基因3核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:15-D2E7 scFv短核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:16-D2E7 scFv中核苷酸序列之核酸序列》 SEQ ID NO:17-D2E7 scFv長核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:18-17/9 scFv短核苷酸序列之核酸序列。 SEQ ID NO:19_17/9 scFv長核苷酸序列之核酸序列。 為了可更易於瞭解本發明’首先定義某些術語。 I.定義 術語「抗體」包括單株抗體（包括全長單株抗體）、多株 抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、嵌合抗體、 CDR移植抗體、人類化抗體、人類抗體、鼠類抗體及其片 段，例如抗體輕鏈（VL)、抗體重鏈（VH)、單鏈抗體 ㈣V) ' F(ab’M段、Fab片段、Fd片段、FV片段及單域抗 體片段（dAb)。 術語「抗體庫」係指多數含有蝙碼抗體或W段之開放 閱讀框架卿）的職細A分子。其亦包括多數由㈣ DNA或RNA分子表現之抗體蛋 子。 白及核酸/抗體融合體分 術語「重鏈可變域」 該核酸之蛋白質產物。 術語「輕鏈可變域」 該核酸之蛋白質產物。 係指編碼抗體重鏈可變區之核酸及 係指編碼抗體輕鏈可變區之核酸及 143627.doc 201024731 決疋基標籤」係指化學上或遺傳上連接於抗 "y測之77子、由該抗體特異性識別的短胺基酸序列， Ύ AG；^籤、ΗΑ標籤、Myc標籤或Τ7標籤。 術語^非抗體序列」係指本發明之抗體庫中所出現之不 為原始抗體序列之一部分的任何核酸或胺基酸序列。該等 序列包括例如抗原決定基標籤。 術 控制序列」係指在特定宿主生物體或活體外表現 系統中表現可操作性連接之編碼序列所需之序列或遺 傳元件。該等序列在此項技術中已熟知。適合於原核生物 之控制序列包括例如啟動子、視情況存在之操縱序列及核 糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苦酸化信 號及增強子。舉例而言，當核酸與另一核酸序列呈功能關 係置放時’其「可操作性連接」。舉例而言，若啟動子或 增強子影響序列轉錄，則其可操作性連接於編碼序列或 若核糖體結合位點定位於有利於轉譯之位置，則其可操作 性連接於編碼序列。一般而言，「可操作性連接」意謂所 連接之DNA序列為鄰接的β然而，增強子不必為鄰接的。 Μ 10 Μ、1 χ 1 ο 8 μ、1 χ 1 ο.9 μ、 1〇‘12 Μ或小於ΐχ10·ΐ2 μ之親和 術語「特異性結合」<「特異性結合至」係指結合分子 能夠以至少1x10 - ΙχΙΟ'10 Μ [χ ίο·11 Μ、 >.,χ - χ ν ΐνΐ^, m, 力結合至標_，及/或能夠α至少兩倍於針對非特異性抗 原之親和力的親和力結合至標乾。 術語「標靶」係指由抗體識別之抗原或抗原決定基。標 靶包括任何肽、蛋白質、醣類、核酸或其他分子，包括可 143627.doc 201024731 產生特異性抗體之小分子。在一實施例中，抗體係針對人 類蛋白質，例如 TNFa、IL-12、IL1 8、IL-la或 IL-Ιβ。 「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之 胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族 已在此項技術中定義。 術語「RNA呈現」或「mRNA呈現」係指活體外技術， 其中所表現之蛋白質或肽以共價方式或藉由緊密非共價相 互作用連接於其編碼mRNA以形成「RNA/蛋白質融合體」 分子。RNA/蛋白質融合體之蛋白質或肽組份經選擇可結 合至所需標靶且蛋白質或肽之身分可藉由對所連接之編碼 mRNA組份測序來測定。該等方法在此項技術中已熟知且 描述於例如以下專利中：美國專利第號；第 6,951，725號；第 7,078，197號；第 7,022,479，6,518,018號； 第 7，125,669 號；第 6,846,655 號；第 6,281,344 號；第 6,207,446 號； 第 6,214,553 號； 第 6,258,558 號； 第 6,261,804 號； 第 6,429,300 號； 第 6,489，116 號； 第 6,436,665 號； 第 6,537,749 號； 第 6,602,685 號； 第 6,623,926 號； 第 6,416,950 號； 第 6,660,473 號； 第 6,312,927號；第 5,922,545號；及第 6,348,315號；該等各 專利以全文引用的方式併入本文中。 術語「單鏈抗體」或「scFv」係指使用重組方法、藉由 合成連接子接合在一起的輕鏈可變區之抗原結合部分及重 鏈可變區之抗原結合部分，該合成連接子使其能夠以單一 蛋白質鏈形式產生，其中VL區與VH區配對形成單價分子 -10· 143627.doc 201024731 (稱為單鏈Fv(ScFv);參見例如咖事乂… 242:423-426，·及細咖事 ⑽“ (1988) P^oc. Natl A〇ad Sci t/U 85:5879-5883)。 術語「功能性部分」係指賦予其所連接之分子其他功能 性的任何生物或化學實體。
術語「選擇」係指使分子與群體中之其他分子實質上分 開。如本文中所使用’「選擇」步驟提供在該選擇步驟後 所需分子相料群冑中之非所需分子至少2倍、較佳3〇 倍、更佳100倍且最佳1000倍之富集。如本文中所指示， 選擇步驟可重複任意次，且在岐方法中可組合不同類型 之選擇步驟。 術語「中止序列」係指引起核糖體減慢或中止其轉譯速 率之核酸序列。 .術δ吾固體載體」係指（不限於）親和複合物可直接或間 接（例如經由其他結合搭配物中間物，諸如其他抗體或蛋 白Α)結合或親和複合物可包埋於其中（例如經由受體或通 道）的任何管柱（或管柱材料）、珠粒、試管、微量滴定皿、 固體顆粒（例如瓊脂糖（agarose或sepharose))、微晶片（例如 石夕、碎-玻璃或金晶片）或膜（例如脂質體或微脂粒之膜）。 術#吾「連接區」係指scFv抗體基因中連接編瑪抗體vh 及VL域之核酸序列的核酸區。連接區與編碼抗體vh及VL 之核酸序列同框以便形成含有VH、VL及連接區之連續開 放閱讀框架。該術語亦指scFv蛋白中連接VH及VL之區 域。 I43627.doc •11 - 201024731 術語「肽受體」係指能夠藉由核糖體肽基轉移酶功能之 催化活性添加至生長蛋白質鏈之c端的任何分子。通常， 該等分子含有⑴核苷酸或核苷酸樣部分（例如嘌呤黴素及 其類似物）、（π)胺基酸或胺基酸樣部分（例如2〇種〇_胺基酸 或L-胺基酸或其任何胺基酸類似物中之任一者）（例如由
Ellman等人，Meth. Enzymol. 202:301，1991所述之 〇_ 甲基 酪胺酸或任何類似物）及（iii)兩者之間的鍵聯（例如3，位置或 次佳2|位置處之酯、醯胺或酮鍵聯）；較佳地，此鍵聯不顯 著干擾天然核糖核苷酸構形之環結構。另外，此術語包涵 (不限於）與蛋白質編碼序列共價鍵結（直接或經由介入核酸 序列而間接鍵結）之肽受體分子，以及藉由一些非共價方 式（例如經由使用結合於蛋白質編碼序列之3,端處或附近且 自身與肽受體分子結合之第二核酸序列之雜合）與蛋白質 編碼序列接合之分子。 II·概述 本發明係關於允許自表現庫可靠地表現及選擇seFv抗體 分子之活體外RNA呈現之改良方法。 RNA呈現方法一般涉及表現蛋白質或肽之庫，其中所表 現之蛋白質或肽以共價方式或藉由緊密非共價相互作用連 接於其編碼mRNA以形成RNA/蛋白質融合體分子。RNA/ 蛋白質融合體之蛋白質或肽組份經選擇可結合至所需標靶 且蛋白質或肽之身分可藉由對所連接之編碼mRNA組份測 序來測定。目前RNA呈現方法對於scFv抗體表現而言並非 最佳，因為在還原條件下執行多個步驟有礙於形成scFv鍵 143627.doc -12· 201024731 内二硫鍵及scFv抗體分子之正確摺疊。另外，目前方法在 選擇方法中使用VH或VL抗體片段。 本發明藉由在有利於scFv鏈内二硫鍵且從而scFv抗體分 子之正確摺疊的溫和還原條件下執行活體外RNA呈現檢定 來解決此技術性問題。使用scFv形式而非單一可變域（例 如單一重鏈可變（VH)域）亦無需鑑別為所選VH域轉化為全 IgG抗體所必需之相容性輕鏈可變（VL)域。因此，儘管特 別適於表現及選擇scFv抗體分子，但本發明之方法亦適用 於活體外RNA呈現所有類別之蛋白質。 本發明之方法亦為執行RNA呈現提供一種更短且更簡單 方案。此係部分藉由在標靶選擇之前避免將RNA-蛋白質 融合體中之mRNA反轉錄為cDNA的耗時步驟來達成。 III.經改良之活體外RNA呈現篩檢方法 在一態樣中，本發明係關於經改良之活體外RNA呈現篩 檢方法。該一般方法如下： 1) 形成RNA/蛋白質融合體 轉錄一或多種活體外抗體DNA表現庫以產生mRNA。任 何活體外抗體表現庫均為合適的（例如VH、VL或scFv 庫），然而，本發明之方法尤其適合於scFv庫。此項技術 認可之任何轉錄方法均為合適的。RNA轉錄後，移除DNA 庫模板。此可使用此項技術認可之任何方法（例如藉由去 氧核糖核酸酶（DNase)I消化）來完成。 移除DNA後，將肽受體連接於庫mRNA之3'端。此可使 用此項技術認可之任何方法來完成。在一實施例中，使用 143627.doc -13- 201024731 包含 5'(補骨脂素 C6) 2'OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (嘌呤黴素）3’（SEQ ID NO: 20)(其中X為三乙二醇或 PEG-150且CC為標準DNA主鏈）之連接子。首先經由互補 鹼基配對使該連接子與庫mRNA之3'端結合。接著藉由補 骨脂素C6分子之UV活化來使連接子與mRNA交聯。 添加肽受體後，接著在活體外系統中轉譯庫mRNA。此 項技術認可之任何活體外轉譯方法均為合適的，例如兔網 狀紅血球溶解物。然而，為允許在scFv分子内形成適當鏈 内二硫鍵，將蛋白質二硫鍵異構酶（PDI)添加至活體外轉 譯反應物中且/或於溫和氧化條件下執行該反應。在一實 施例中，將溫和氧化劑（例如GSSG/GSH，例如100 mM GSSG/10 mM GSH)添加至活體外轉譯反應物中。在另一實 施例中，活體外轉譯反應省去還原劑（例如二硫蘇糖醇 (DTT))。 可將一或多種經標記之胺基酸或其衍生物添加至活體外 轉譯系統中以便將經標記之胺基酸併入所得抗體中。本發 明涵蓋此項技術認可之任何經標記之胺基酸，例如放射性 標記之胺基酸，例如標記35S之曱硫胺酸或半胱胺酸。 在活體外轉譯反應期間，mRNA分子經由融合於3'端之 肽受體（例如嘌呤黴素）共價連接於其蛋白質產物。自活體 外轉譯反應混合物中純化此等RNA/蛋白質融合體分子。 本發明涵蓋此項技術認可之自反應混合物分離RNA/蛋白 質融合體分子之任何方法。在一實施例中，RNA/蛋白質 融合蛋白係藉由使用聚去氧胸苷（P〇lydT)樹脂之層析法來 143627.doc -14- 201024731 分離。在另一實施例中，RNA-抗體融合蛋白係藉由與對 RNA/蛋白質融合蛋白之抗體組份中存在的抗原決定基具 有特異性之抗體結合來分離。該抗原決定基可為在例如N 端、C端處或可變區間連接子中併入RNA-抗體融合蛋白之 抗體組份之胺基酸序列中的胺基酸序列標籤，例如FLAG 或HA標籤。 本發明之RNA/蛋白質融合體涉及使用裸RNA。在一較 佳實施例中，用核糖核酸酶抑制劑試劑（例如核糖核酸酶 OUTTM、酵母tRNA、SUPERaseln™、RNasin®及此項技術 中已知之其他核糖核酸酶抑制劑）處理所有接觸RNA/蛋白 質融合體之試劑。 2)篩檢針對所需標靶之抗體 針對活體外結合至所需標靶篩檢RNA/蛋白質融合體 庫。標靶分子通常結合至固體載體，例如瓊脂糖珠粒。在 一實施例中，標靶分子直接連接於固體受質。在另一實施 例中，首先修飾標乾分子，例如進行生物素標記，接著經 由該修飾使經修飾之標靶分子結合至固體受質，例如抗生 蛋白鏈菌素-M280、中性鏈親和素-M280、SA-M270、NA-M270 ' SA-MyOne ' NA-MyOne ' SA- 月旨 It & ΝΑ- 月旨 糖。在其他實施例中，固體載體進一步包括磁性珠粒，例 如Dynabeads。該等磁性珠粒允許使用磁體自檢定混合物 分離固體載體及任何結合之RNA/抗體融合體。 RNA/蛋白質融合體結合後，洗滌固體載體一或多次以 移除未結合之RNA/蛋白質融合體且接著擴增RNA。在一 143627.doc -15· 201024731 實施例中，擴增與抗體或多數抗體實體上連合之mRNA以 產生更大mRNA。本發明涵蓋此項技術認可之任何RNA複 製方法，例如使用RNA複製酶。在另一實施例中，可將與 抗體或多數抗體實體上連合之mRNA轉錄為cDNA，隨後藉 由PCR擴增。PCR擴增混合物可經歷一或多輪篩檢以富集 最高親和力抗體。 或者或另外，可在擴增核酸組份之前自固體載體溶離 RNA/蛋白質融合體。本發明涵蓋此項技術認可之任何溶 離方法。在一實施例中，使用鹼性條件（例如使用約8.0至 10.0之pH值）溶離RNA/蛋白質融合體。在另一實施例中， 使用酸性條件（例如使用約3.0至6.0之pH值）溶離RNA/蛋白 質融合體。在一實施例中，在擴增核酸組份之前不溶離 RNA/蛋白質融合體，而是將RNA/蛋白質融合體直接添加 至擴增反應混合物中。 或者或另外，核酸之PCR擴增混合物可使用單分子測序 方法來測序以測定每個所選RNA/蛋白質分子之核酸序 列。在一實施例中，PCR擴增可使用高保真校對聚合酶來 完成，例如來自小寶島產嗜熱古菌 之 KOD1 熱穩定 DNA 聚合酶或 Platinum 分 DNA高保真聚合酶（Invitrogen)。 或者或另外，可於使得將突變引入經擴增之DNA中的條 件下擴增核酸序列，由此將多樣性進一步引入所選核酸序 列中。DNA分子之此突變混合物可經受額外數輪篩檢。 IV.庫建構 143627.doc -16- 201024731 本發明之庫可由能夠與標靶結合之任何抗體片段產生。 在一實施例中，產生抗體可變域之庫。此等域可為VH及/ 或VL域。在另一實施例中，產生scFv庫。 . 本發明之庫亦可包括編碼可變區外部區域（例如恆定區 或其片段，或鉸鏈區）的抗體核酸序列。 本發明之核酸庫可包含RNA、DNA或含有RNA與DNA元 件之雜合物。 核酸與肽受體之鍵聯 抗體核酸庫經修飾可含有肽受體部分。此可有利於核酸 表現庫之個別成員共價連接於其同源蛋白質產物。本發明 涵蓋此項技術認可之使肽受體連接於核酸之任何方法，包 括例如美國專利第5,643,768號、美國專利第5,658,754號、 美國專利第7,195,880號及美國專利第6,951,725號中所述之 方法，該等專利之内容以引用的方式併入本文中。 在一態樣中，本發明係關於用於使肽受體連接於核酸庫 φ 之新穎方法及組合物。在一實施例中，可合成包含補骨脂 素C6分子及肽受體分子之連接分子，其中該補骨脂素C6 分子及肽受體分子與核酸序列融合，其中該核酸序列與核 • 酸庫之3'端序列互補。該等連接分子可經由互補鹼基配對 - 與核酸庫純系之Y端結合。補骨脂素C6對紫外（UV)光敏感 且使連接子與核酸庫純系交聯，由此使肽受體共價連接於 核酸庫純系。在另一實施例中，連接分子之核酸部分可含 有經修飾之核苷酸，例如2'甲氧基（2OMe)核糖核苷酸。在 另一實施例中，連接分子進一步包含分隔含有補骨脂素C6 143627.doc -17- 201024731 分子之核酸區與肽受體分子之三乙二醇或PEG-150連接 子。在一實施例中，連接子自5’至3'包含：補骨脂素C6、 包含序列UAGCGGAUGC之2OMe核糖核苷酸（SEQ ID NO: 20)、6個三乙二醇或PEG-150部分、2個胞苷殘基及嘌呤黴 素.。該等連接子可由例如TriLink BioTechnologies, Inc定 製合成。 V. —般篩檢方法 在一態樣中，本發明係關於篩檢本發明之表現庫以鑑別 能夠與所需標靶結合之抗體的方法。本發明涵蓋可基於抗 體結合至標靶分子自表現庫選擇抗體之任何活體外或活體 内篩檢方法。 在一實施例中’本發明之表現庫可使用此項技術認可之 活體外無細胞表型-基因型關聯呈現法來篩檢。該等方法 在此項技術中已熟知且描述於例如以下專利中：美國專利 第 7，195,880 號；第 6,951,725 號；第 7,078，197 號；第 7’022,479 ;第 6,518，G18號；第 7，125,669號；第 6,846,655 號；第 6,281，344號；帛 6,2〇7,446號；第 6,214,553號；第 6,258,558 號；第 6 261 8〇4 冑；帛 6 429 3〇〇 號；第 6’489，116 號，帛 6 436 665 號；帛 Μ”，，號；第 6,602,685 號；帛 6 623 926 號；帛 6 416 95〇 號；第 6’660’473 號；第 6,312,927 號；第 5,922,545 號；及第 6,348,3 15號此等方法涉及以使得蛋白質與其來源之核酸 實體上連合或結合之方式自核酸活體外轉錄蛋白質。藉由 標乾分子選擇所表現之蛋白f，亦選擇編碼該蛋白質之核 143627.doc -18 · 201024731 酸。 為改良scFv蛋白之表現，上文提及之活體外篩檢檢定可 能需要添加或移除某些試劑。在一實施例中，可將蛋白質 二硫鍵異構酶添加至活體外表現系統中以改良功能性scFv 分子之產生。在另一實施例中，可將溫和氧化劑（例如 GSSG/GSH，例如 100 mM GSSG/10 mM GSH)添加至 scFv 蛋白之活體外轉譯反應混合物中以允許在scFv分子之VH 及VL區中形成鏈内二硫鍵。在另一實施例中，可自scFv之 活體外轉譯反應混合物移除還原劑（例如二硫蘇糖醇 (DTT))。 在另一實施例中，可將一或多種經標記之胺基酸或其衍 生物添加至活體外轉譯系統中以便經標記之胺基酸併入所 得抗體中。涵蓋此項技術認可之任何經標記之胺基酸，例 如放射性標記之胺基酸，例如標記35S之曱硫胺酸或半胱 胺酸。 在一個實施例中，本發明之活體外篩選檢定需要在活體 外選擇一種抗體或多數抗體後，可反轉錄與該抗體或多數 抗體實體上相關之mRNA以產生編碼該抗體或多數抗體之 cDNA。涵蓋任何適於反轉錄之方法，例如酶介導之反轉錄， 例如莫洛尼氏鼠類白血病病毒（Moloney murine leukemia virus)反轉錄酶。 本發明所用之篩檢方法可能需要擴增編碼特異性結合至 所欲標靶之抗體的核酸。在一個實施例中，可擴增與一種 抗體或多數抗體實體上相關之mRNA以產生更大mRNA。 143627.doc -19- 201024731 涵蓋此項技術認可之任何RNA複製方法，例如使用RNA複 製酶。在另一實施例中，首先可將與一種抗體或多數抗體 實體上相關之mRNA反轉錄為cDNA，隨後藉由PCR擴增。 在一個實施例中，PCR擴增可使用高保真校對聚合酶例如 小寶島產嗜熱古菌之KOD1熱穩定DNA聚合酶或Platinum Jla分DNA高保真聚合酶（Invitrogen)達成。在另一實施例 中，PCR擴增可在將突變引入經擴增之DNA的條件下執 行，例如易錯（error-prone) PCR。 在另一實施例中，本發明之表現庫可藉由在細胞、病毒 或噬菌體之表面上呈現且使用固定標靶分子之選擇來篩 檢。適合之篩檢方法描述於美國專利第7,063,943號、第 6,699,658 號、第 6,423,538 號、第 6,696,251 號、第 6,300,065 ^ 、第 6,399,763 號、第 6,114,147 號及第 5,866,344號中 ° 本發明所用之篩檢方法可能需要藉由引入可導致所表現 之抗體分子中一或多個胺基酸取代及/或缺失的核酸取代 及/或缺失來將多樣性引入抗體庫中。本發明涵蓋此項技 術認可之任何突變誘發方法，例如隨機突變誘發、「模糊 (walkthrough)」突變誘發及「精確（look through)」突變誘 發。抗體之此突變誘發可使用例如易錯PCR、酵母或細菌 之「突變」株或在整個或部分抗體之從頭合成期間合併隨 機或限定之核酸變異來達成。在一實施例中，可形成一或 多個胺基酸已隨機突變之抗體分子庫。在另一實施例中， 可形成一或多個胺基酸突變為一或多個預定胺基酸之抗體 143627.doc -20- 201024731 分子庫。 本發明所用之f帛檢方法亦可能需要增加標㈣合筛檢檢 定之嚴格度以選擇對標乾之親和力改良之抗體。可考量此 . 項技術認可之任何增加抗體·標_互作用檢定之嚴格度 的方法。在'一實施例中，可神繳 ,,j, τ τ改變一或多種檢定條件（例如 檢定緩衝液之鹽濃度）以降低抗體分子對所需標^親和 力在另實知例中，可縮短允許抗體與所需標乾結合之 %日夺間長度。在另一實施例中’可將競爭性結合步驟添加至 抗體-標把相互作用檢定中。舉例而言，首先可使抗體也 所需固定標乾結合。接著可添加特定濃度之非固定標無， 其用以與固定標乾競爭結合以使得對抗原之親和力最低之 抗體自固定標把溶離’從而富集抗原結合親和力改良之抗 體。檢定條件之嚴格度可進一步藉由增加添加至檢定中之 非固定標靶之濃度來增加。 本發明之篩檢方法亦可能需要多輪選擇以富集—或多種 • Λ有經改良之標乾結合之抗體。在-實施例中，在每一輪 選擇時’可使用此項技術認可之方法將其他胺基酸突變引 入抗體中。在另-實施例中，在每—輪選擇時，可增加與 •户斤需標㈣合之嚴格度以選擇對所需標乾之親和力增加之 抗體。 本發明之篩檢方法可能需要自活體外轉譯系統之組份純 化RNA-抗體融合蛋白。此可使用此項技術認可之任何分 離方法來完成。在一實施例中，RNA_抗體融合蛋白可藉 由使用聚去氧胸芽（polydT)樹腊之層析法來分離。在另— 243627.doc •21- 201024731 實施例中，RNA-抗體融合蛋白可藉由使用對RNA-抗體融 合蛋白之抗體組份中存在的抗原決定基具有特異性之抗體 的層析法來分離。該抗原決定基可為併入RNA-抗體融合 蛋白之抗體組份之胺基酸序列中（例如N端、C端處或可變 區間連接子中）的胺基酸序列標籤，例如FLAG、Myc或HA 標籤。 自本發明之庫選擇抗體可能需要使用固定標靶分子。在 一實施例中，標靶分子直接連接於固體受質，例如瓊脂糖 珠粒。在另一實施例中，首先修飾標靶分子，例如進行生 物素標記，接著經由該修飾使經修飾之標靶分子與固體載 體結合，例如抗生蛋白鏈菌素-M280、中性鏈親和素-M280、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、 S A-瓊脂糖及ΝΑ-瓊脂糖。 本發明之實例 除非另有規定，否則在實例中使用以下材料及方法。 材料及方法 一般而言，除非另有指示，否則使用化學、分子生物 學、重組DNA技術、免疫學（尤其例如免疫球蛋白技術）及 畜牧學之習知技術實施本發明。參見例如Sambrook, Fritsch及 Maniatis，Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ； Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996) ; Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series，169)，McCafferty 編，Irl Pr 143627.doc •22- 201024731 (1996) ; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow等人， C.S.H.L. Press, Pub. (1999) ; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人編，John Wiley & Sons (1992)。 用於scFv之mRNA呈現方案 mRNA呈現可根據圖2中所示之方法來進行。下文更詳細 地描述此方法之特定實施例。此等實施例意欲說明本發明 之方法，且不應視為限制本發明。 1. 設計抗體庫模板 庫DNA構築體可根據此項技術中已知之抗體庫產生方法 來設計。在一實施例中，庫構築體可編碼抗體片段，亦即 抗體輕鏈片段（VL)或抗體重鏈片段（VH)。在一例示性實施 例中，庫構築體可編碼單鏈可變區片段（scFv)。 2. 製備標耙抗原 一般可針對生物素標記抗原選擇mRNA呈現抗體庫。雖 然各標靶之最佳抗原應視不同情況而定，但可使用以下考 量因素作為一般準則。標靶抗原通常經充分表徵，且為相 關或顯性遺傳同型，如依據多形現象（SNP及單倍體）及/或 藥物遺傳學分析所判定。標靶抗原另外可具有合理的生物 活性（與天然抗原相當）、良好溶解性及良好化學及物理特 性，且可以足夠用於庫選擇或篩檢及下游生物檢定之量製 備。
3. 製備庫DNA 庫DNA及其選擇產物可藉由PCR擴增。PCR擴增可使用 143627.doc -23 - 201024731 此項技術中已知之方法來執行。PCR反應物通常含有DNA 模板、反應緩衝液、dNTP、用於擴增之引子、DNA聚合 酶及水。可自母混合物同時配置多個反應管以增加經擴增 之DNA產量。25輪PCR通常產生足夠擴增，但可使用多達 35輪擴增獲得更多產物。 4. 庫DNA純化 若產物尺寸正確（對於scFv為約850 bp，對於VH或VL庫 為約500 bp)且含有極少非特異性產物，則其可直接用於轉 錄反應。或者，可藉由切出正確尺寸之特定條帶而在製備 型瓊脂糖凝膠上純化產物。可在分光光度計上量測DNA濃 度。 5. RNA轉錄 可使用此項技術中已知之標準方法自庫DNA執行RNA轉 錄。可使用大反應體積轉錄足夠DNA模板以對庫總多樣性 進行取樣。在一例示性實施例中，RNA轉錄反應中可使用 庫模板之lxlO13個複本。RNA轉錄通常含有5-10 pg PCR產 物、反應緩衝液、ATP、CTP、GTP、UTP及T7 RNA聚合 酶。RNA轉錄反應可於37°C下進行2小時至隔夜。最初數 輪選擇後可使用較短時間，然而，隔夜培育可使反應之 RNA產量達到最大。RNA轉錄後，可藉由去氧核糖核酸酶 I消化而自反應混合物移除DNA模板。 6. 藉由NAP管柱層析法進行RNA純化 轉錄後，可使用NAP-10管柱分離RNA。可將多達約1 mL之轉錄反應物加載至NAP-10管柱上以進行RNA純化。 143627.doc -24- 201024731 分離之前可使用經DEPC處理之dHsO平衡管柱。可使用約 1.5倍反應體積之經DEPC處理之dH2〇(例如每500 pL轉錄反 應物為750 μί)自管柱溶離RNA。總溶離體積可小於轉錄 反應體積之約150%。或者或另外，可使用ΝΑΡ-25管柱分 離 RNA。 7. RNA品質控制及定量 RNA樣品之尺寸及產量可使用凝膠電泳或者藉由量測所 收集之溶離份中之RNA濃縮物在260 nm下之〇D值（OD26〇) 來分析。舉例而言，可如下計算scFv RNA之莫耳濃度： [RNA]bM)=[RNA](mg/mL)xl06/(8 5 0x3 3 0) =OD260x稀釋因數 x40 (pg/mL)xl000/(850x330) RNA產量（nmol)=[RNA](pM)x體積（μΙ〇/1000。 RNA產量通常於每500 pL轉錄反應物約20 nmol/mL下達到 最大值。 8. RNA與連接子之接合 在3’端含有肽受體分子之DNA連接子可藉由UV交聯而與 各RNA分子之3'端共價接合。可進入核糖體A位點且與新 生多肽鏈之羧基端共價偶合的肽受體最終能夠使mRNA(基 因型）與由此mRNA編碼之蛋白質（表型）共價連合。可使用 具有下式之例示性PEG6/10連接子： 5'(補骨脂素C6) 2OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (嘌呤黴素）3'(SEQ ID NO: 20) 143627.doc -25- 201024731 補骨脂素C6 5’修飾具有光敏性且作用為藉由UV交聯而 在連接子與mRNA之間形成共價鍵。2'0Me(U AGC GGA UGC)(SEQ ID NO: 20)主鏈區經由連接子黏接位點3'黏接 至mRNA上之FLAG序列（參見圖1)。在上述序列中，X表示 「間隔子9」，或者稱為三乙二醇或PEG-150。此間隔子已 優化成可為將嘌呤黴素插入真核核糖體A位點中提供柔 性。CC包含標準DNA主鏈。嘌呤黴素3’修飾插入核糖體A 位點中以在連接子與新生肽之間形成穩定連接。本文所述 之連接子的消光係數可為約147.7 OD26〇/微莫耳。因為此 連接子具有光敏性，所以含有此連接子之溶液應避光保 存。 對於最初數輪庫選擇，可推薦大規模接合反應（約5 nmol 或約3.1 X 1015個經轉錄之RNA分子）以對估計多樣性為約 1012-1013之天然抗體庫總多樣性進行取樣。此RNA量可確 保有足夠模板併入轉譯反應中以產生約1 〇 pmol功能性 mRNA呈現分子。在稍後數輪選擇中，RNA投入量可減少 至每次選擇約0.5 nmol。在一例示性實施例中，RNA接合 反應物可含有以下組份：RNA、水、化學接合缓衝液及 PEG6/嘌呤黴素連接子（1 mM)。在一例示性實施例中，總 反應體積為約1〇〇 pL。在一較佳實施例中，連接子/RNA之 莫耳比可大於約1.5。在一實施例中，反應物中之最終連 接子濃度為約15 μΜ，且反應物中之RNA濃度可在約3-10 μΜ(=0.3 -1 nmol RNA投入量）範圍内。作為參考，850 nt scFv RNA對應於1 mg/mL=3.56 μΜ，且可達到之最大接合 143627.doc -26· 201024731 濃度將為約3 _ 1 6 μΜ(約0.32 nmol)。 黏接反應（使連接子與所轉錄之RNA黏接）可在熱循環器 中執行。在一較佳實施例中，黏接反應可藉由於約85〇c下 培育樣品約30秒，接著於約4°C下使用每秒約0.3°C之溫變 率培育來進行。接著可於約4°C下保持反應。 黏接之連接子/RNA之接合可藉由UV交聯來完成。此可 使用熟習此項技術者已知之任何方法來進行。在一實施例 φ 中，可將反應管置於經冷凍之冷凍包上且直接置於手提式 長波長（約3 65 nm)UV燈下並在黑暗中交聯約15分鐘。典型 接合效率為約50-90%。一般不需要純化。接合產物可儲存 於-80°C下。 9.轉譯反應 在一例示性實施例中’在所有反應及純化後，約〇. 1%之 所投入的RNA可成為mRNA呈現分子。活體外轉譯係使用 沾習此項技術者已知之方法及試劑來進行。在一實施例 • 中 ，使用scFv庫之轉§睪反應係使用約5 nmol RNA模板及約 10 mL網狀紅血球溶解物，反應體積為約15 mL。 為轉澤反應作準備’可製備最終濃度為約1〇〇 mM GSSG/10 mM GSH之GSSG/GSH(氧化型麩胱甘肽/還原型麵 胱甘肽）之溶液。藉由將PDI粉末溶解於dHzO中以達到約i 個單位/微升之濃度來製備PDI。PDI溶液可儲存於_2(Γ(： 下。 143627.doc -27- 201024731
可如下配置例示性轉譯反應物： RNA(100-120 pmol/300 μ!>或500-600 pmol/1.5 ml) X X joL dH20 至 73.7 至370 joL 胺基酸母混合物(Met_) 15 75 μL 100 mM GSSG/10 mM GSH 3.3 16.5 pL PDI(1 υ/μί) 6 30 (〇L [35S]曱硫胺酸 2 10 網狀紅血球溶解物 200 1000 μί 總體積 300 1500 pL 轉譯反應物可於30°C水浴中培育1-2小時，且應立即執 行RNA/蛋白質融合體形成。當轉譯體積超過3 mL時，可 觀察到RNA/蛋白質融合體產量顯著減少；因此，若反應 體積大於3 mL，則可製備轉譯反應之母混合物，且接著分 成較小等分試樣。 10. RNA/蛋白質融合體形成 轉譯反應後，每300 pL轉譯反應混合物可添加約100 kL 2 M KC1及約20 pL 1 M MgCl2，且於室溫下培育約1小 時，或於-20°C下培育隔夜。或者，每1·5 ml轉譯反應混合 物可添加約500 μί 2 M KC1及約100 pL 1 M MgCl2 ’且於 室溫下培育約1小時，或於-20°C下培育隔夜。由此使位於 mRNA模板末端之所中止核糖體穩定且允許位於DNA連接 子末端之嘌呤黴素進入所中止核糖體之A位點，從而使經 143627.doc -28- 201024731 轉譯之scFv蛋白永久地連接於其mRNA模板。若反應物儲 存於-20°C下隔夜，則可縮短室溫培育時間。可藉由每300 pL或1.5 ml轉譯反應物分別添加約50 pL或約250 pL 0.5 Μ EDTA以破壞核糖體來終止反應。反應物可儲存於-20°C 下。可移除5-10 pL等分試樣以稍後用於閃爍計數。 11.藉由寡聚去氧胸苷纖維素進行RNAJ蛋白質融合體純化 包括此步驟以自轉譯/融合反應物純化mRNA呈現分子及 殘餘RNA模板。對於募聚去氧胸苷結合，應估計捕捉所有 參 RNA模板所需之預洗滌之寡聚去氧胸苷纖維素的量。可將 足量寡聚去氧胸苷結合緩衝液添加至融合反應物中以達到 約1 X最終濃度。接著可添加預洗滌之寡聚去氧胸苷纖維 素，且於4°C下旋轉反應物1小時。可視情況於4°C下以約 1500 rpm離心反應物5分鐘，且丟棄上清液。可轉移寡聚 去氧胸苷纖維素珠粒且使用旋轉管柱、以1 X寡聚去氧胸苷 結合緩衝液洗滌約6次，且緩衝液通常藉由以約1000 rpm Φ 旋轉管柱10秒來移除。可丟棄流過液，但可保留最後洗液 以用於閃爍計數。為降低鹽濃度且促進溶離，可將1/10初 始漿液體積之dH20添加至乾燥寡聚去氧胸苷珠粒中，可立 - 即離心10秒且可丟棄流過液。可藉由將dH20添加至珠粒中 且於室溫下培育5分鐘來溶離mRNA呈現分子（及游離RNA 模板）。藉由以約4000 rpm(或高於4000 rpm)旋轉20秒來收 集溶離液。通常重複溶離一次且合併溶離液。可移出5 μΕ 溶離液以用於閃爍計數。視情況亦可使用NanoDrop分光光 度計、依據260 nm之OD值（OD26G)評估募聚去氧胸苷純化 143627.doc -29- 201024731 效率。理論上募聚去氧胸苷珠粒可回收所有殘餘RNA模板 及mRNA呈現分子。將5xFLAG結合緩衝液添加至溶離液 中以達到約1 X最終濃度。若不進行下一個FLAG純化步 驟，則樣品可儲存於-80°C下。 可如下計算募聚去氧胸苷回收率。對約5 pL投入物（來 自融合反應）、約100 μί最後洗液及約5 pL產物（來自募聚 去氧胸苷純化之溶離液）計數。使用最後洗液評估洗滌程 度，且使用其他2項計數自初始RNA模板投入量計算RNA/ 蛋白質融合體回收率。RNA/蛋白質融合體產量 (卩111〇1)=(0?]^1產物><體積產物父5 μΜχ體積落解物)/[CPM投入物X體積 投人物x(產物中甲硫胺酸之量）]。此式假定在網狀紅血球溶 解物中甲硫胺酸濃度為5 μΜ，且計算中所使用之所有體積 均以pL表示。對於最初數輪選擇，mRNA呈現分子之產量 通常為0.5-2%，但在稍後數輪中可增加至10%。舉例而 言，PROfusion庫中之最初數輪甲硫胺酸量可為： •對於 VH-Vk scFv，為約 3 μΜ， •對於 VH-νλ scFv，為約 2至 3 μΜ， • 對於VH，為約2 μΜ， • 對於Vk，為約2 μΜ，且 • 對於νλ，為約1 μΜ。 此等量為平均值且基於生殖系序列，且熟習此項技術者 應瞭解，當針對向特定序列富集庫時，此等量在數輪選擇 後會改變。 12.藉由抗FLAG M2瓊脂糖進行RNA/蛋白質融合體純化 143627.doc -30- 201024731 此步驟設計成自殘餘RNA模板純化mRNA呈現分子。若 藉由抗原解離速率競爭或藉由抗原表現細胞來選擇庫，則 不需要進行此步驟。可估計捕捉所有mRNA呈現分子所需 之預洗蘇之抗FLAG M2瓊脂糖珠粒的量。在一實施例中， 珠粒之結合能力可為每毫升50%漿液約6 nmol融合蛋白。 為在結合及洗滌期間具有足夠珠粒體積用於操作，建議使 用至少約200 μί之預洗滌珠粒。以下所給出之實例係針對 初始300 μΐ^轉譯反應物。 FLAG純化：可使用寬口吸管尖將300 pL預洗滌之抗 FLAG M2瓊脂糖轉移至經募聚去氧胸苷純化之產物中，接 著可於4°C下旋轉1小時。可與抗FLAG M2瓊脂糖一起繼續 培育隔夜。抗FLAG M2瓊脂糖可視情況於4°C下、在離心 機中以約1500 rpm旋轉約1分鐘，且可丟棄上清液。抗 FLAG珠粒可用約500-700 pL lxFLAG結合緩衝液洗滌約5-6次且各洗液可使用旋轉管柱（例如InvitrogenTM微離心機旋 轉管柱）、以約1000 rpm離心10秒（注意InvitrogenTM管柱可 以較高速度旋轉，例如約1 〇,〇〇〇 rpm)。可吾棄流過液。珠 粒可另外以約1000 rpm離心10秒，用700 μι選擇緩衝液（參 見下文）洗滌2次。可保留最後洗液以用於閃爍計數。 mRNA呈現分子可藉由添加約400 μί 1〇〇 pg/mL FLAG肽 (於選擇緩衝液中）且於室溫下培育5分鐘來溶離。溶離液可 藉由以約3000 rpm(或高於3000 rpm，若可能）旋轉20秒來 收集。溶離步驟可藉由添加約400 gL 1〇〇 gg/mL FLAG肽 再重複一次。可合併兩次溶離液且可移出約5 μί以用於閃 143627.doc •31 - 201024731 爍計數。此體積之FLAG肽對於自至多約1 mL之50%漿液 溶離可為足夠的且若使用較少漿液且/或需要較高RNA/蛋 白質融合體濃度，則可分成兩半（200 μΙ〇。為防止RNA在 儲存及抗原選擇期間降解，可將適量之此項技術中已知之 核糖核酸酶抑制劑（亦即1-2 U/pL RNaseOUT及0.02 pg/mL 酵母tRNA)添加至經純化之mRNA呈現庫中。若不進行下 一個抗原選擇步驟，則於-80°C下儲存樣品。 為定量FLAG回收率，用β計數器對約5 pL溶離產物及約 100 pL最後洗液計數。回收率預計可為10-30%或高於 30%，且可根據下式計算： PROfusion分子回e%=(CPM產物X體積產物)/(CPM投入物X體積投入物） 13.藉由生物素標記抗原進行庫選擇 選擇設計成當庫與抗原結合達到平衡時富集特異性結合 至所關注標靶之分子。負向選擇（預清除）可能為自天然 scFv庫移除非特異性及基質結合物所需要的，但若使用由 單一模板形成之庫（例如（但不限於）針對親和力成熟所形成 之庫），則可省去，從而基於單一 scFv模板進行親和力成 熟。選擇方案視標靶形式而改變。以下為用於生物素標記 標靶之例示性選擇方案。此方案經修改可適合其他形式之 標乾抗原，且可視所需產量而定按比例增大或縮小。 A.選擇前之製備
抗生蛋白鏈菌素（SA)磁性珠粒可用於捕捉且通常在使用 之前預阻斷。可將S A珠粒自原裝瓶轉移至1 · 5 mL或2 mL管 中，且用2 mL lxFLAG結合緩衝液洗滌兩次。可於4°C 143627.doc -32- 201024731 下，在轉下用2 mL選擇緩衝液阻斷珠粒（2小時至隔 夜）。重要的是製備對於預清除與選擇捕捉皆足夠之珠 粒。預阻斷之珠粒可儲存於41下。每1〇 pm〇i生物素標記 抗原通常使用約100 μί珠粒’但熟習此項技術者應瞭解， 捕捉珠粒體積應針對反應產量、根據游離生物素之結合能 力（例如650-900皮莫耳/毫克珠粒，其中珠粒濃度通常為1〇 mg/ml)計算。
1.5 mL或2 mL微離心管可用lxFLAG結合緩衝液預阻斷 約1小時至隔夜。所有預清除及選擇步驟均可使用預阻斷 之管。通常各樣品需要4個管：預清除需要2個、珠粒需要 1個及選擇需要1個。
最佳結果可藉由預清除庫而獲得。將FLAG純化之mRNA 呈現庫添加至珠粒（與緩衝液分離）（可使用體積等於捕捉體 積一半的SA珠粒）令。可於3(rc下旋轉珠粒約3〇分鐘。可 使用磁體使預清除之mRNA呈現庫與珠粒分離，且預清除 可再重複_人。可洗滌第二次預清除s A珠粒且如上文所述 進行計數以判定背景是否較高。此亦可时「無抗原」陰 性對照物。 β.庫選擇··結合 對於最初數輪㈣，可將生物㈣記躲（ΗΗ)福)添 :整個預清除庫中，且於机下旋轉!小時。對於稍後 ^擇，當預計抗原結合分子之回收率超過⑼時，可 二青除Ή 2個等分試樣。可將生物素標記抗原添加 固等分試樣中，且另—個等分試樣可用作「無抗原」 143627.doc -33- 201024731
性」且在最初數輪中觀察到顯著回收， 度°當抗原，结合分子之回收率#值齙益古^ 〇
下。 子之回收率超過5%時，可 詳言之’若抗原呈現「黏 L著回收，則應降低抗原濃 c.庫選擇：捕捉 用於阻斷供庫捕捉用之SA珠粒的選擇緩衝液可藉由離 心及磁力分離而移除。可將抗原結合庫轉移至預阻斷之SA 珠粒（與緩衝液分離）中，且接著轉移至結合反應物中，並 於3〇°C下旋轉5至10分鐘。用於捕捉之8八珠粒量應基於能 力及選擇中所用之標靶濃度來計算（參見上文）。當降低標 靶濃度以避免產生SA珠粒結合物時，應降低8八珠粒量， 但通常使用不少於50 pL珠粒。 D.庫選擇：洗滌 可使用磁體收集SA珠粒，且用約1 mL選擇緩衝液洗滌1 分鐘。此步驟可重複約5次（總共約6次）。可在稍後數輪中 增加洗膝時間以將解離速率選擇策略與一些目標結合。可 最後一次用約1 mL適合於反轉錄之1 X緩衝液洗滌珠粒，用 磁體收集’且再懸浮於水（上文所計算之捕捉珠粒體積之 143627.doc -34- 201024731 四分之一）中。 作為另實例可使用〇ynabeadsTM(Invitrogen)，但熟 習此項技術者應瞭解其他珠粒可同樣合適。可藉由離心及 磁力分離使DynabeadsTM與未結合之庫分離。可用i mL管 尖移除上清液（每個庫選擇管使用一個新過濾式管尖以排 除交叉污染）。可用1 mL選擇緩衝液洗滌DynabeadsTM，且 藉由輕緩吸移或藉由顛倒管多次而使其再懸浮。可將該等 ❹ 管放回磁性固持器上以便珠粒分離，同時處理下一個庫。 洗滌所有庫後，可用i mL管尖移除上清液（每個庫選擇管 使用一個新過濾式管尖以排除交叉污染）。重複洗滌5次。
DynabeadsTM可如上文所述用1 mL卜第一股緩衝液 (Superscript II，Invitr〇gen)洗滌兩次。在最後一次洗滌 時，移出庫之1/1 0至獨立管中以便計數以測定庫回收率（若 需要如此）。DynabeadsTM可藉由磁力分離來捕捉且可保留 約1〇〇 μΐ洗滌緩衝液以用於背景計數。可使用如上文所計 馨 算之捕捉珠粒體積之％，使懸浮於水中。 Ε.庫選擇：計數及回收率計算 自第3輪開始，對約10_20%之最後洗液及珠粒計數。不 宜對超過100 μι珠粒計數，因為此可能會中止計數。庫選 擇回收率可根據下式來計算： 選擇回e%=100xCPMa珠粒/CPM總投入物 14.藉由Fc融合蛋白進行平衡庫選擇 在另一實施例中，可對已與抗體Fc域融合之標靶抗原 (例如Fc融合蛋白）執行庫選擇。負向選擇（預清除）可能為 143627.doc -35· 201024731 自天然抗體庫移除非特異性及基質結合物所必需的，但對 於親和力成熟而言可省去。選擇特異性可藉由使標靶抗原 與人類IgGl及小鼠igG2a融合來改良。藉由在庫選擇期間 使Fc融合蛋白中具有不同卩(；域，可使鑑別對Fc區具有特異 性之庫結合物的風險最小。此亦能夠藉由兩種不同磁性珠 粒（蛋白G及抗小鼠igG)吸引庫結合物，從而進一步降低回 收抗蛋白G或抗抗小鼠igG結合物之機率。標乾Fc融合蛋白 亦可經生物素標記’且藉由本文所述之方法或藉由以上第 13節所述之方法來選擇。應注意，蛋白a磁性珠粒由於與 抗體VH域（例如來源於人類VH3家族生殖系序列之VH)之 某些部分的交叉反應性而可能不適合於針對FC融合蛋白標 靶進行選擇。適合於吸引結合抗原之scFv_PROfusion分子 的磁性珠粒包括（但不限於）Dynabeads蛋白G、Dynabeads Pan小鼠IgG及其他可利用之針對人類或小鼠IgG之 Dynabeads M-280。一般而言，蛋白g珠粒能力假定為每 100 pL蛋白A/G磁性珠粒約25 pg人類IgGl (約167 pmol)。 A.選擇前之製備
Dynabeads蛋白G或Dynabeads Pan小鼠IgG(若標靶抗原 為小鼠Fc融合蛋白）可用於捕捉，且通常在使用之前預阻 斷。可計算庫預清除及選擇所需Dynabeads之量。可將 Dynabeads自原裝瓶轉移至1.5 mL或2 mL微離心管中且移 除緩衝液。珠粒可用1 mL選擇緩衝液於4°C阻斷（2小時至 隔夜），或於室溫阻斷1小時。重要的是製備對於預清除與 選擇捕捉均足夠之珠粒。 143627.doc •36· 201024731 1.5 mL或2 mL微離心管可用選擇緩衝液預阻斷〖小時至 隔夜’且所有預清除及庫選擇步驟應使用預阻斷管。 可將FLAG純化之scFv PROfusion庫添加至預阻斷之珠粒 (與緩衝液分離）中，可使用體積等於捕捉體積（如上文所計 算）一半的Dynabead(蛋白G或pan小鼠IgG)，且反應物於 3〇°C旋轉30分鐘。可用磁鐵使預清除之融合庫與珠粒分 離且再重複預清除一次。第二次預清除之Dynabeads可 φ 如上文所述洗務及計數以判定背景是否較高。此亦可用作 「無抗原」陰性對照物。 B‘庫選擇：結合 對於最初數輪選擇，可將生物素化標靶（1〇〇 nM)添加至 整個預清除庫中，且於3(rc旋轉丨小時。對於稍後數輪選 擇，s預期抗原結合分子之回收率超過1 %時，可將預清 除庫分為兩等分（50/5〇至8〇/2〇，視庫計數而定）。可將生 物素化抗原添加至一等分（整體之5〇%至8〇%)中，而另一 鲁等刀"I用作「無抗原」陰性對照物。或者，如上所述，經 洗滌之第二次預清除珠粒亦可視為「無抗原」對照物，除 其將有一次較小「預清除」外。若抗原呈現「黏性」且在 最初數輪中觀察到顯著回收，則可降低抗原濃度。另外， 當抗原結合分子之回收率變得顯著高於背景（無抗原對照 物）時，可在稍後數輪中降低抗原濃度。重要的是注意庫 一抗原之間的化學計量以確保抗原相對於庫pR〇fusi〇n分 子至J/ 5倍莫耳過量，尤其在較低抗原濃度下。 C·庫選擇：捕捉 143627.doc -37· 201024731 用於阻斷供庫捕捉用之Dynabeads的選擇緩衝液可藉由 離心及磁力分離加以移除。可將抗原結合庫轉移至預阻斷 之Dynabeads(與緩衝液分離）中’且接著轉移至結合反應物 中，並於30 C下旋轉20分鐘。用於捕捉之Dynabeads量可 如上文所述基於珠粒能力及選擇中所用之標靶抗原濃度來 計算。為避免吸引珠粒結合物’當標靶抗原濃度降低時， Dynabeads量應降低（但不小於500叫或5〇 μ1)。 D.庫選擇：洗滌 可藉由離心及磁力分離使未結合之庫分 離。可用1 mL管尖移除上清液，且每個庫選擇管可使用一 個新過濾式管尖以排除交叉污染。可使用新吸管尖以約1 mL選擇緩衝液洗滌DynabeadsTM，且可藉由輕緩吸移或藉 由顛倒管多次來使Dynabeads™再懸浮。可將該等管放回 磁性固持器上以便珠粒分離，同時處理下一個庫。洗務所 有庫後，可用1 mL管尖移除上清液（每個庫選擇管使用一 個新過濾式管尖以排除交叉污染）。5次洗滌均可重複此步 驟。DynabeadsTM可如上文所述用1 mL lx第一股緩衝液 (Superscript II，Invitrogen)洗滌兩次。在最後一次洗滌 時’移出庫之1/10至獨立管中以用於計數以測定庫回收率 (若需要如此）。Dynabeads™可藉由磁力分離來捕捉且可保 留約100 μ卜洗滌緩衝液以用於背景計數。可使用如上文所 計算之捕捉珠粒體積之％，使DynabeadsTM再懸浮於水中。 E·庫選擇：計數 可如上文第13節（E)中所述來執行。 143627.doc -38- 201024731 15.藉由抗原競爭進行解離速率庫選擇 、 解離速率選擇與平衡選擇之間的主要差異在於庫首先與 選擇抗原結合，隨後進行FLAG純化。FLAG純化後，可將 _ 該庫與過量競爭抗原或抗體（例如當競爭抗原不可用時）一 起培育，以便競爭劑置換在解離速率競爭期間未與 PROfusion分子結合之任何預結合抗原。該競爭劑與預結 合抗原不同之處在於結合競爭劑之PROfusion分子可能不 會在隨後回收步驟中回收。其可為未修飾抗原或不同形式 之抗原。儘管抗體亦可為競爭劑，但通常其作為競爭劑不 如抗原有效，且其效率隨庫對抗原之親和力增加而降低。 庫之解離速率宜在臨選擇之前測定以鑑別競爭之適當持續 時間。此持續時間可在數小時至數週之範圍内。 A :具有生物素標記抗原或抗原-Fc融合蛋白之預裝載庫 可轉譯PROfusion分子且如上文所述藉由寡聚去氧胸苷 純化。募聚去氧胸苷純化庫可藉由添加5xFLAG結合緩衝 φ 液至lx之最終濃度（僅添加庫體積之25%)來平衡。可添加 抗原（生物素標記抗原或Fc-融合體）至足夠高濃度且於30°C 下旋轉30分鐘以使抗原-抗體結合飽和。PROfusion分子可 • 如上文所述藉由抗FLAG M2瓊脂糖來純化。重要的是注意 . FLAG純化之PROfusion庫應於冰上保持，但不能冷凍。重 要的是如上文所述預阻斷足量之捕捉珠粒。 B :測定競爭劑濃度及庫基線回收率 可計算上述步驟之庫回收量以測定其莫耳濃度。此表示 庫結合抗原之最大量，且可用於計算解離速率競爭所需之 143627.doc •39- 201024731 量（500χ至ΙΟΟΟχ)。 可將10%預阻斷珠粒添加至抗原結合PROfusion庫之10% 等分試樣中且於約4°C下旋轉約20分鐘。珠粒可如上文所 述用1 mL選擇緩衝液洗滌5次。可對珠粒計數以如下測定 在解離速率選擇之前抗原所結合之PROfusion庫之百分 率： 回收％=100x(CPM珠粒/CPM投入物)χ10 C :庫選擇：競爭 可將1000倍莫耳過量之競爭劑（例如未經修飾之抗原或 抗體）添加至FLAG純化之PROfusion庫中且於約30°c下旋 轉預定持續時間，此將施加足以選擇具有較佳解離速率之 純系的選擇壓力。在珠粒捕捉之前，庫於冰上冷卻約1至2 分鐘以降低解離速率。 D :庫選擇：捕捉 用於阻斷供庫捕捉用之Dynabeads的選擇缓衝液可藉由 離心及磁力分離加以移除。可將抗原結合庫轉移至預阻斷 之Dynabeads(與緩衝液分離）中，且於4°C下旋轉約20分 鐘。 E :庫選擇：洗滌 可藉由離心及與庫之磁力分離來收集Dynabeads。可用1 mL管尖移除上清液（如上文所述，每個庫選擇管使用一個 新過濾式管尖以排除交叉污染）。 珠粒可如上文所述用約1 mL lx第一股缓衝液 (Superscript II, Invitrogen)洗滌兩次。在最後一次洗務 143627.doc -40- 201024731 時，移出庫之1 〇%至20°/。至獨立管中以便計數以測定庫回 收率（若需要如此）。〇}^1^563(13可藉由磁力分離來捕捉且可 保留約100 μΐ洗滌緩衝液以用於背景計數。可使珠粒再懸 浮於水（如上文所計算之捕捉珠粒體積之1/4)中。 F :庫選擇：計數及回收率計算 可對最後洗液及珠粒之10-20%計數。宜避免使用超過 100 pL珠粒，因為其可能會中止計數。庫選擇回收率可使 用下式來計算： ϋ #回i)ty〇=100xCPM總珠粒/CPM總投人物 16.庫選擇產物之反轉錄 可用Superscript II反轉錄酶（Invitrogen™)進行反轉錄。 各反應之體積可根據選擇後之珠粒體積而按比例增大。產 物可藉由使用適當引子對之反轉錄（RT)來分析。舉例而 言，「Ck反向引子」或「Ck5-FLAGA20 Rev」引子可用於κ 庫，「CJL反向引子」或「CL5FLAGA20 Rev」引子可用於 • λ庫，且「Lib-GS-Rev」或「VH-GSFLAGA20-Rev」弓| 子 可用於人類PBMC VH庫。 反轉錄引子應至少具有與隨後PCR反向引子相同之5'端 • 序列，以避免自反轉錄反應留下之殘餘引子形成具有不同 . 3'端序列之擴增產物。若RT使用較短「Ck反向引子」、 「CJL反向引子」或「Lib-GS-Rev」引子，則此尤為重 要，因為任何殘餘量之此等引子可參與以下PCR且形成缺 乏poly-A尾之產物。 143627.doc -41 - 201024731 表1:用於擴增庫選擇產物之寡核苷酸引子
Ck反向引子 GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACAG TTCG Ck5-FlagA20 11111 f 111111111 1111 IAAAIAGCGGA1(jCCI rGTCCjTOGTCCaT Rev CCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACA CJL反向引子 GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTGG GCTGACCKAGGACGGT CL5FLAGA20 1111111 i ill 11 1111 111AAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGT Rev CCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTG Lib-GS-Rev CGCTACCTCCGCCGCCAGAC (VH > PBMC) VH- II i i l m i i i l ιΤ 1 1 1 1 1 | IAAATAGCGGATGCTTTGTCATCATCATC GSFLAGA20-Rev TTTATAATCGCTACCTCCGCCGCCAGAC 例示性RT反應條件 對於200 μί最終體積之反應物，可如下配置RT反應物·· 珠粒(水溶液) dH2〇 10 μΜ反向引子 X μ!/至 108 pL 2 μί 10 mM dNTP 1〇 於65°C下培育5分鐘，於冰上冷卻。添加··
5χ第一股緩衝液 0.1 MDTT RNase OUT 40 pL 20 μί 10 μΐ 可於42 C下培育反應物2分鐘，隨後添加1〇 Superscript II反轉錄酶。可將反應物分為1〇〇卟等分試樣 且於42°C下、在偶爾攪動下培育50分鐘。接著在反應後可 於95°C下培育管5分鐘。可分離珠粒且將上清液轉移至新 143627.doc •42- 201024731 管中。通常若樣品來自相同選擇產物，則其可混合。使珠 粒再懸浮於水（RT體積之一半）中。可在反應後於95°C下培 育管5分鐘，且可藉由磁體捕捉珠粒，並可將上清液與先 前轉移之上清液混和。由此提供用於PCR擴增選擇產物之 cDNA模板。 17.針對細胞表面抗原之庫選擇 選擇針對細胞表面抗原與可溶性生物素標記抗原之 PROfusion庫之間的主要區別在於藉由cDNA互補來保護 PROfusion分子中之mRNA部分以防細胞核糠核酸酶降解， 且因此需要在庫選擇之前反轉錄為cDNA ^反轉錄反應可 在FLAG純化之前或之後進行，此視寡聚去氧胸苷純化後 庫之體積而定。重要的是注意還原劑DTT不應包括於反轉 錄中或庫選擇前之任何步驟中，以保持scFv分子之鏈内二 硫鍵。 A :募聚去氧胸苷純化後之庫製備 在一實施例中，可使用適於第一輪選擇之初始1 0 mL轉 譯體積，但應注意以下方法容易調適以用於較小轉譯反 應。 可轉譯PROfusion分子且如上文所述藉由寡聚去氧胸苷 純化。經純化之庫應於體積等於或小於用於轉譯之網狀溶 解物體積的dH20中回收。可如上文所述對投入物、最後洗 液緩衝液及10 μΐ庫計數以測定產量及回收百分率。 B : FLAG結合 可藉由添加1/4庫體積之5xPBS至lxPBS之最終濃度來使 143627.doc -43- 201024731 經寡聚去氧胸苷純化之庫平衡。可估計捕捉所有 PROfusion分子所需之抗FLAG M2瓊脂糖珠粒量（例如估計 珠粒之結合能力為每毫升5 0%漿液約6 nmol融合蛋白）。為 在結合及洗滌期間具有足夠用於操作之珠粒體積，不宜使 用小於約200 μί預洗滌珠粒。可使用寬口吸管尖將抗 FLAG M2瓊脂糖轉移至新管中。可離心珠粒（以1500 rpm 離心1分鐘）且移除緩衝液。可用1 mL PBS洗滌珠粒兩至三 次以移除儲存緩衝液中所存在之任何痕量清潔劑。可以 1 xPBS將經寡聚去氧胸苷純化之庫轉移至經洗滌之抗 FLAG M2瓊脂糖珠粒中，且於4°C下旋轉1小時至隔夜。 C : FLAG洗滌 作為可選步驟，可於4°C下以1500 rpm離心抗FLAG M2 瓊脂糖珠粒1分鐘且丟棄上清液。可使用1 XPBS將珠粒轉 移至Bio-Rad™微型旋轉管柱或Invitrogen™微離心機旋轉 管柱上，且接著可藉由以1000 rpm旋轉10秒來移除缓衝 液。該Invitrogen™管柱可以較高速度旋轉（例如可為 10,000 RPM)。可用500-600 pL lxPBS洗滌珠粒4次且使 PBS旋轉通過管柱。可用500-600 μί lxRT第一股缓衝液 (無DTT)洗滌珠粒2次。可丟棄流過液，但宜保留最後洗液 以用於閃爍計數。 D : FLAG溶離 可藉由添加450 pL(應注意對於較小M2瓊脂糖體積可使 用230 μ!〇之100 gg/mL FLAG肽之第一股緩衝液（無 DDT)(該緩衝液含有1:20稀釋之RNaseOUT)且接著於室溫 143627.doc -44· 201024731 下培育混合物10分鐘來溶離PROfusion分子。可藉由以 3 000 rpm或快於3000 rpm旋轉20秒來收集溶離液。此步驟 可重複一次，且接著可混合來自兩次溶離之庫。 E : FLAG回收率計算 用β計數器對5-10 pL溶離產物及100 μί最後洗液計數。 可如下計算PROfusion分子回收％(注意回收率預計10-30% 或更高）： = (CPM產出物乂胃：^·產出物)/(CPM投人物X胃#投人物) F :反轉錄 可使用上文第16節中所述之引子。 RT反應條件
經純化之PRO fusion庫 445 μί 890 μ：ί 10 μΜ反向引子 5 μί 10 μί 10 mM dNTP 25 μί 5 0 μί Superscript II 25 uL 5 0 uL 總體積 500 μΐ. 1000 pL 可於37°C下、在攪動或不攪動下培育1小時反應物。 可如下使庫平衡以針對細胞表面抗原進行選擇。反轉 錄反應完成後，可將5 M NaCl添加至反應混合物中直至 75 mM(15.3 pLNaCl添加至 1 mL反應物中及7.6 μι NaCl 添加至500 pL反應物中）。若需要增加體積，則可再將 1 xPBS添加至庫中。可在選擇前將以下阻斷試劑添加至 庫中。 143627.doc -45- 201024731 最終濃度 BSA，50 mg/ml 娃魚精子DNA，10 mg/ml 21 μί 1 mg/ml 10·5μί 0.1 mg/ml 天然庫選擇可能需要預清除步驟，但若使用由單一模板 形成之庫（例如針對親和力成熟所形成之庫），則可省去該 步驟。 應藉由>;il式細胞測量術或西方墨點法分析（Western blot analysis)證實用於庫預清除之細胞（抗原天然細胞）在細胞 表面上不具有標乾抗原表現❶舉例而言，此可為用於產生 表現抗原之穩定細胞株的親本細胞，此提示用於預清除之 細胞與用於選擇之細胞之間的唯一已知表面蛋白質差異應 為標靶抗原自身。 應計算預清除庫所需之細胞數目。此為預清除庫所需之 抗原天然細胞之數目且與庫選擇所需之數目相同。細胞數 目（尤)係依據若干數值計算：抗原表現細胞表面上之抗原 複本數（C)、用於選擇之庫尺寸（$=莫耳數X6x 1〇23)及將結 合至標靶抗原之庫分數（尸^其可依據此式大致計算以允 許10倍過量之標靶抗原或預清除力：
X=l〇x^xF/C 舉例而言，假定一種特定抗原之細胞表面複本數目估計 為lx 1〇4，且在10 pm〇l天然抗體庫中，可藉由抗原結合或 背景保留來回收小於0·05%(5χ10-4)之庫。預清除及選擇所 需之細胞數目為 143627.doc -46· 201024731 Χ=1〇χ(1〇χ10'12χ6χ 1023)χ(5χ10'4)/(ΐχΐ〇4)=3χ1〇6 實務上，細胞數目應為5 x 106或5χ 1 〇6以上，以確保離心 後可看見細胞離心塊。 G :預清除庫 細胞密度可藉由血球計或庫爾特計數器（Coulter counter)來計數且可將足夠的細胞轉移至離心管中。細胞 可於4°C下以1500 rpm離心且極輕緩地再懸浮於1 mL冰冷 卻PBS中。可將細胞懸浮液轉移至1 ·7 mL有螺旋蓋之微離 心官中。注意吸移不要劈切細胞。可以15〇〇 rpm離心細胞 且移除PBS。可再重複PBS洗滌步驟一次。應立即將來自 步驟13.3.3之庫添加至輕緩再懸浮之細胞中。接著可將各 管浸入冰水浴中且攪動約60分鐘。可以1500 rpm離心細胞 且將庫轉移至新管細胞中以進行第二次預清除或抗原選 擇。 Η :針對抗原表現細胞之庫選擇 計异抗原選擇所需之之細胞數目。此數目與如上計算之 用於預清除庫之數目相同。細胞數目（幻依據以下若干數 值計算：抗原表現細胞表面上之抗原複本數（C)、用於選 擇之庫尺寸（《S=莫耳數χ6χ1〇23)及將結合至標靶抗原之庫分 數（F)。其可由此式大致計算以允許1〇倍過量之標靶抗原 或預清除力：
X=l〇xSxF/C I :庫選擇 抗原表現細胞密度可藉由企球計或庫爾特計數器來計數 143627.doc -47- 201024731 且可將足夠的抗原表現細胞轉移至離心管中。可於41下 以1500 rpm離心細胞且極輕緩地使細胞再懸浮於1 mL冰冷 卻PBS中。可將細胞懸浮液轉移至17 mL有螺旋蓋之微離 心管中。注意吸移不要剪切細胞。以15 〇〇 rpm離心細胞且 移除PBS並用PBS再重複洗蘇一次。可立即使用經純化及/ 或預清除之庫使細胞輕緩地再懸浮。可將各管浸入冰水浴 中且旋轉2小時。以1500 rpm離心且去棄上清液。可用1 mL PBS洗滌細胞4次’以1500 rpm離心且丟棄上清液。可 使細胞再懸浮於500 pL PBS中。必要時對多達2〇〇/0之細胞 及最後洗液計數。 J :庫產物回收率 可將5 pL核糖核酸酶Η(2 υ/μί)添加至再懸浮之細胞中 且於37。(：下培育20分鐘。此將消化RNA且自細胞表面釋放 cDNA。可以1 500 rpm離心細胞30秒且將上清液轉移至新 管中。現可丟棄細胞。可將5 pL核糖核酸酶A(20 mg/ml)添 加至上清液中且於37°C下培育30分鐘。由此使選擇過程中 可能來自碎裂細胞之任何細胞RNA降解。稍後可藉由透析 移除降解之RNA且由此防止干擾PCR擴增庫。向上清液中 添加等體積之苯酚/CHC13/異戊醇（25:24:1)且渦旋30秒。可 稭由在Phase Lock Gel Heavy 2 ml 管（Eppendorf)中以最大 速度離心5分鐘而使底部有機相與頂部水相分離。可將該 頂部水相轉移至新管中且用苯酚/CHC13/異戊醇（25:24:1)重 複萃取一次並用CHC13重複萃取一次。可將CHC13萃取後 之頂部水相轉移至微型透析套組（Mini Dialysis Kit ; 8 kDa 143627.doc •48- 201024731 分離點，2 mL，GE healthcare)中且於4°C下相對於4公升 dH20透析隔夜。 K:計數及庫選擇回收率計算 自第3輪開始，對約10-20%之最後洗液及細胞計數。 it # 回
18.藉由RT-PCR再擴增庫DNA 可使用自庫捕捉之物質執行反轉錄。此項技術中已知之 試劑及方案適合於執行反轉錄反應。反應體積可根據選擇 後之珠粒體積而按比例增大或縮小。 用於反轉錄之引子可為位於抗體庫之3'端恆定區的任何 合適之反向互補序列且可與隨後PCR擴增中所用之反向引 子相同或位於其3'更遠處。 例示性反轉錄反應物含有來自庫選擇之珠粒（含於水 中）、反向引子及dNTP。於65 °C下培育反應物約5分鐘且於 冰上冷卻。接著通常將第一股合成緩衝液、約0.1 M DTT 及核糖核酸酶抑制劑添加至反應物中。於約42°C下培育反 轉錄反應物2分鐘，隨後添加反轉錄酶。於約42°C下、在 偶爾攪動下培育反應物50分鐘。接著於95°C下培育反應物 5分鐘。接著藉由磁體收集珠粒，且將上清液轉移至新管 中，若其來自相同選擇產物，則混合。使珠粒再懸浮於水 (RT體積之一半）中且於95°C下在管中培育5分鐘。再次使 用磁體收集珠粒，且將上清液與先前轉移之上清液混合。 此含有用於PCR擴增選擇產物之cDNA模板。PCR後，將10 pL PCR產物加載至2%瓊脂糖凝膠上以證實反應成功。 143627.doc -49- 201024731
19,用於庫DNA模板擴增之PCR 對於來自第一及第二輪之選擇產物，可使用8 kDa分離 點、相對於水透析cDNA(來自RT反應物之上清液），且可 使用全部量之cDNA作為PCR模板。對於稍後數輪之選擇 產物，通常可使用10%之cDNA作為PCR模板，且通常不需 要進行透析。第1輪及第2輪產物（使用所有RT產物）可以1 mL PCR體積執行反應，而稍後數輪之產物可按比例縮小 反應體積。100 pL反應物之等分試樣應由母混合物製得。 用於庫DNA模板擴增之例示性PCR反應展示於下表2中。 表2 :用於庫DNA模板擴增之例示性PCR反應 DNA模板 X μί dH20添加至 740 μΐ^ lOxKOD緩衝液 100 μί
MgS04(25 mM) 60 μί
lOmMdNTP 20 pL 5'正向引子(10 μΜ) 30 μί 3'反向引子(10 μΜ) 30 μί
KOD熱啟動DNA聚合酶 20 mL 總體積 1000 pL* 在一例示性實施例中，第1輪及第2輪產物使用1 mL PCR 反應物，且猶後數輪之產出物使用〇.5 mL反應物。100 pL 反應物之等分試樣應由母混合物製得。用於庫DNA模板擴 增之例示性熱循環條件展示於下表4中。 143627.doc -50- 201024731 表3 :用於庫DNA模板擴增之例示性替代PCR反應 cDNA模板 X吣 dH20 添加至790 μΣ l〇x高保真TaqDNA聚合酶緩衝液 100 μι
MgSO4(50 mM) 40 pL
lOmMdNTP 20 pL
5'正向引子(10 μΜ) 20 pL 3’反向引子(10 μΜ) 20 μι
高保真TaqDNA聚合酶 lOpJL 總體積
1000 pL 在一例示性實施例中，第1輪及第2輪產物使用1 mL PCR 反應物，且稍後數輪之產出物使用0.5 mL反應物。100 eL 反應物之等分試樣應由母混合物製得。用於庫DNA模板擴 增之例示性熱循環條件展示於下表4中。 表4 :用於庫DNA模板擴增之另一例示性替代PCR反應 DNA模板 dH20 lOxKOD缓衝液 MgS04(25 mM) 2mMdNTP 5'正向引子(10 μΜ) 3'反向引子(10 μΜ)
XpL
添加至660 jiL
100 pL 60 pL 100 HL 30 |〇L 30 |〇L 143627.doc -51 - 201024731
KOD熱啟動DNA聚合酶 20 |〇L 總體積 1000 μι* 用於庫DNA模板擴增之熱循環條件 95〇C 2分鐘 95〇C 20 秒 Ί 55〇C 10秒卜20個循環*
70°C 15秒 J 70 °C 3 0秒 4°C 一直保持 *應注意：18至20個循環之擴增通常可使用KOD熱啟動 DNA聚合酶，然而，少至13個循環可成功地擴增足量之庫 DNA。在額外擴增循環下，各種尺寸之非特異性產物可變 得更明顯，且產物可能需要凝膠純化。若可能，則宜增加 DNA模板投入量而非擴增循環之數目。 表5 :用於庫DNA模板擴增之熱循環條件 94〇C 2分鐘 丄 94〇C 20 秒 1 55〇C 20秒卜25個循環*
68〇C 1分鐘J 143627.doc -52- 201024731 1 68〇C 5分鐘 丄 4°C 一直保持 *應注意：25個PCR循環通常產生足夠擴增，但其可增加 至多達35個循環以獲得更多產物。在額外擴增循環下，各 種尺寸之非特異性產物可變得更明顯，且產物可能需要凝 # 膠純化。若可能，則宜增加DNA模板投入量而非擴增循環 之數目。 PCR後，藉由例如瓊脂糖凝膠電泳證實PCR產物之尺 寸。若產物為正確尺寸（對於scFv為約850 bp，對於VH或 VL庫為約500 bp)且存在極少非特異性產物，則該等產物 一般可直接或經旋轉管柱（例如Qiagen™ QIAquick PCR純 化套組）純化後用於下一輪轉錄反應中。在一些情況下， PCR產物可能需要凝膠純化。若PCR產物使用凝膠純化， ® 則於製備型瓊脂糖凝膠上分離所有殘餘產物且剪切特異性 條帶以進行凝膠萃取。因為DNA中之殘餘EtBr易於干擾 UV吸光度，所以會誤導凝膠純化DNA之定量。在凝膠萃 取期間更廣泛洗滌步驟可有助於減少此干擾。若可能，則 '應用分光光度計量測DNA濃度，因為在潔淨DNA樣品與具 有殘餘EtBr之DNA之間，UV掃描跡線差異很大。隨後重 複此方案以進行多輪選擇。
A : VH CDR3譜型定型PCR 143627.doc •53· 201024731 可使用譜型定型PCR分析庫或其選擇產物中之VH CDR3 尺寸分布。其為評估庫多樣性以及選擇進程之有用工具。 最初數輪庫選擇產物與選擇前之庫應廣泛多樣且CDR3尺 寸分布接近高斯分布（Gaussian distribution)。 表6 :譜型定型PCR引子
6-FAM- PanVHFR3-Fwd GACACGGCCGTGTATTACTGT PanJH-Rev GCTGAGGAGACGGTGACC
譜型定型PCR配置 cDNA模板 2.0 μί dH20 18.1 μι 5xGoTaq Flexi反應緩衝液 6.0 [〇L 25mMMgCl2 1_8 μίν lOmMdNTP 0.6 ^ 5'正向引子(10 μΜ) 0.6 μΐ^ 3'反向引子(10 μΜ) 0.6 pL GoTaq Flexi DNA聚合酶 0.3 μί 總體積 30.0 pL 此配置中使用Promega GoTaq DNA聚合酶，但其可由其 他來源之熱穩定DNA聚合酶替代。最終Mg2+濃度為1.5 mM。 熱循環程式 94〇C 2分鐘 143627.doc -54- 201024731 94〇C 20 秒 1 55〇C 20秒卜30個循環
72〇C 30 秒 J 丄 72〇C 5分鐘 4°C 一直保持 φ B :譜型定型電泳及分析 PCR後，可將10 pL產物加載至2%瓊脂糖凝膠上以證實 成功反應且可將殘餘產物與標記ROX之DNA尺寸標記一起 提交給測序核心機構以便用測序機器進行譜型定型電泳， DNA產物尺寸一般被低估3 bp，此可能歸因於標記染料之 差異。 經擴增之DNA產物具有以下結構： 5'-FR3 (27 bp)-VH CDR3-FR4 (35 bp)-3' ® VH CDR3尺寸可藉由以下計算式，自如藉由Rox染料尺 寸標記所測定之表觀DNA產物尺寸推算出： 尺寸VHCDR3 = (尺寸表觀DNA產物尺寸- 60)/3 其中60=(62兩 端之構架- I31 A突出+ 3dna楳記低估) 16.例示性試劑及緩衝液組成 1〇Χ化學接合緩衝液
Tris(pH 7) 250 mM
NaCl 1 Μ 143627.doc -55- 201024731 lx 2x 3x 100 200 300 mM 1 2 3 M 0.05 0.1 0.15% lx 5x lx 5x 0.025 0.125% 50 250 mM 150 750 mM 0.025 0.125%
lx 1 mg/mL 0.1 mg/mL 寡聚去氧胸苷結合緩衝液
Tris(pH 8)
NaCl
Triton X-100 FLAG結合緩衝液
基於磷酸鹽之缓衝液 PBS
Triton X-100 基於替代性HEPES之緩衝液
HEPES
NaCl
Triton X-100 選擇緩衝液 基於磷酸鹽之緩衝液
PBS
BSA
鮭魚精子DNA
Triton X-100 0.025% 酵母tRNA(視情況選用，在使用之前添加） 20ng/mL 基於HEPES之替代性緩衝液
HEPES 50 mM
NaCl 150 mM
BSA 1 mg/mL 143627.doc -56 201024731
0.1 mg/mL 0.025% 20 ng/mL 鮭魚精子DNA Triton X-100 酵母tRNA(視情況勒，在使狀前添加) 第一股緩衝液
Tris-HCl(pH 8.3) 250 mM KC1 375 mM MgCl2 15 mM 5〇xFLAG儲備溶液 FLAG 肽 25 mg 選擇緩衝液 5 mL 製備1 mL等分試樣且健存於 -20°C 下。 FLAG溶離溶液 5〇xFLAG儲備溶液 1 mL 選擇緩衝液 49 mL
製備1 mL等分試樣且儲存於 寡聚去氧胸苷織維素製備 量取2.5g寡聚去氧胸苷纖維素置於50 mL管中。 添加25 mL 0.1 N NaOH且混合。 以1500 rpm離心3分鐘，丟棄上清液。 用25 mL lx募聚去氧胸苷結合緩衝液洗滌寡聚去氧胸苷纖維 素。 以1500 rpm離心3分鐘，丟棄上清液。 再重複洗滌3次且量測上清液之pH值。該pH值應與洗蘇缓衝 液相同（約pH 8.5)。 H3627.doc 57- 201024731 藉由添加IX寡聚去氧胸苷結合緩衝液直至25 mL之最終體積 來使募聚去氧胸苷纖維素再懸浮。此可為約50%漿液。於4°C 下儲存預洗滌之纖維素珠粒。 最終濃度= 100 mg/mL=l nmol RNA能力。 抗FLAG M2瓊脂糖製備 將25 mL M2瓊脂糖珠粒轉移至50 mL管中。 在貝克曼離心機（Beckman centrifuge)中以1000 rpm離心珠粒5 分鐘且藉由抽吸移除上清液。 藉由使珠粒再懸浮於等體積之10 mM甘胺酸(pH 3.5)中來洗 務。 在貝克曼離心機中以1000 rpm離心珠粒5分鐘且藉由抽吸移 除上清液。 用一個管柱體積之lxFLAG結合缓衝液再懸浮。 在貝克曼離心機中以1000 ι·ριη離心漿液5分鐘且藉由抽吸移 除上清液。 重複洗滌3次。 用一個管柱體積之lx結合緩衝液（含有1 mg/mL BSA及100 mg/mL鮭魚精子DNA)再懸浮。 於4°C下翻轉1小時或隔夜。 必要時等分為2 mL分離部分且保存於4°C下。 實例1 驗證功能性mRNA-scfv分子 使用四種已知抗體驗證功能性mRNA-scFv分子可得以呈 現且結合其各別抗原：D2E7(人類抗hTNF)、Y61(人類抗 143627.doc -58- 201024731 hIL-12)、17/9(小鼠抗 HA)及 ΜΑΚ195(小鼠抗 hTNF)。使用 下表7中所示之引子，藉由PCR自質體DNA產生MAK-195 scFv ° 表7 :用於建構MAK195 mRNA-scFv構築體之寡核苷酸引子 T7-MAK195VH- Fwd MAK195VhGS-Rev 弓1子_序歹，】______ TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTA CACCATGGAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGG (SEQ ID NO: 22) CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCC TCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC (SEQ ID NO: MAK195VLGS-Fwd MAK195VL-Rev 23) GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGC GGATCGGACATTGTGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 24) GATGGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCC CCGAG (SEQ ID NO: 25) 抗 HA 17/9 scFv(參見 Schulze-Gahmen 等人，（1993) J· Mol· Biol· 234(4): 1098-118)係使用基於自NCBI資料庫下 載之蛋白質序列A3 1790及B31790的以下引子（參見下表 8)、藉由PCR來產生。 表8:用於建構17/9mR]VA-scFV構築餿之募核苷酸引子 ❹ 引子 ^_ ^GACAATTACTATTTACAATTACACCATGGAAGTGCAGCT GGTGGAAAGCGGCGGCGATCTGGTGAAACC (SEQ ID NO: 26) GCTGCTAAAGCTAAAGCCGCTCGCCGCGCAGCTCAGTTTC AGGCTGCCGCCCGGTTTCACCAGATCGCCG (SEQ ID NO: 27) GGCTTTAGCTTTAGCAGCTATGGCATGAGCTGGGTGCGCC AGACCCCGGATAAACGCCTGGAATGGGTGG (SEQ ID NO: 28) GCCTTTCACGCTATCCGGATAATAGGTATAGCCGCCGCCG TTGCTAATGGTCGCCACCCATTCCAGGCGT (SEQ ID NO: 29) CCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGAT AACGCGAAAAACACCCTGTATCTGCAGATG (SEQ ID NO: 30) GTTCGCGGCGCGCGCAATAATACATCGCGCTATCTTCGCT TTTCAGGCTGCTCATCTGCAGATACAGGGT (SEQ ID NO: 31) ATTGCGCGCGCCGCGAACGCTATGATGAAAACGGCTTTG CGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT (SEQ ID NO: 32) CGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGAACCGCCT CCACCCGCGCTCACGGTCACCAGGGTGCCC (SEQ ID NO: 33) T7TMVUTR-17/9 VH-1 Fwd 17/9 VH-2 Rev 17/9 VH-3 Fwd 17/9 VH-4 Rev 17/9 VH-5 Fwd 17/9 VH-6 Rev 17/9 VH-7 Fwd 17/9 VH-8GS Rev -59- 143627.doc 201024731 引子 序列 GS-17/9 VL-1 Fwd AGCGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACCCAGAGC CCGAGCAGCCTGACCGTGACCGCGGGCGAAA (SEQ ID NO: 34) 17/9VL-2Rev TGTTTGCCGCTGTTAAACAGGCTCTGGCTGCTGGTGCAGC TCATGGTCACTTTTTCGCCCGCGGTCACGG (SEQ ID NO: 35) GTTTAACAGCGGCAAACAGAAAAACTATCTGACCTGGTA TCAGCAGAAACCGGGCCAGCCGCCGAAAGTG (SEQ ID NO: 36) 17/9 VL-3 Fwd 17/9 VL-4 Rev CGGTAAAGCGATCCGGCACGCCGCTTTCGCGGGTGCTCG CCCAATAAATCAGCACTTTCGGCGGCTGGCC (SEQ ID NO: 37) TGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATT TTACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGGCGGA (SEQ ID NO: 38) AAAGGTCAGCGGGTTGCTATAATCGTTCTGGCAATAATA CACCGCCAGATCTTCCGCCTGCACGCTGCTA (SEQ ID NO: 39) AGCAACCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAA CTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCT (SEQ ID NO: 40) TTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCG 17/9 VL-5 Fwd 17/9 VL-6 Rev 17/9 VL-7 Fwd 17/9 VL-8 FLAG Rev ATGAAGACAGATGGTGCAGCCACC (SEQ ID NO: 41) 17/9抗體序列係使用寄存編號A31790及B31790、自NCBI資料庫檢索。
活體外轉錄用於此等scFv之DNA構築體且接著藉由兔網 狀紅血球溶解物以mRNA-seFv(蛋白質經由具有嘌呤黴素 修飾之連接子連接於mRNA)形式或以游離scFv(蛋白質不 連接於mRNA)形式轉譯。純化兩種類型之分子且藉由相應 生物素標記抗原進行吸引檢定（Pull_down assay)(參見圖 4)。 ❹ 圖4中之資料顯示功能性m-RNA-scFv(與生物素標記抗 原結合）可被抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒吸引’儘管回收百 分率低於游離scFv ^其他實驗顯示此差異僅僅歸因於繫拾 於scFv之重RNA。核糖核酸酶降解mRNA-scFv分子中之 RNA部分可使藉由抗原達成之scFv回收恢復至與游離scFv 相同之水準（參見圖5)。 實例2 • 60· 143627.doc 201024731 優化mRNA呈現技術以改良轉譯反應 在一較佳實施例中，庫尺寸為lx 1012。選擇需要約20 pmol融合蛋白（例如1·2χ1013)以覆蓋12倍庫尺寸。FLAG純 化後之回收率通常為約30%。因此，寡聚去氧胸苷純化後 需要約60 pmol融合蛋白投入FLAG純化中。在一實施例 中，在寡聚去氧胸苷純化後每100 pmol RNA獲得約1.2 pmol融合蛋白。在此實施例中，獲得60 pmol融合蛋白需 要約5 nmol RNA(其覆蓋3000倍庫尺寸）。應注意此計算不 考量僅約20-30%之融合mRNA呈現分子具有功能性（選擇後 可回收）之觀察結果。 由於mRNA呈現方法之後續步驟需要上述量之融合蛋 白，因此優化轉譯反應可使蛋白質回收率最大。FLAG純 化後，對改變投入轉譯反應中之RNA的初始量進行評估。 藉由量測在轉譯反應期間合併之S35曱硫胺酸的百分率且 藉由計算蛋白質（產物）皮莫耳數對RNA(投入物）皮莫耳數 之比率來評估蛋白質回收率。所測試之RNA之起始投入量 以及所得蛋白質回收率展示於表9中。如此分析所說明， 較低RNA投入量令人驚言牙地產生較高百分數之蛋白質回收 〇 表9 : RNA投入量與蛋白質回收率之間的關係 投入轉譯中之RNA (對於1瓶溶解物） FLAG純化後 所合併之S35 Met % 蛋白質皮莫耳數/RNA皮莫耳數 400 pmol 0.40% 1/400=0.25% 200 pmol 0.67% 1.7/200=0.85% 100 pmol 0.99% 2.5/100=2.5% 50 pmol 0.76% 1.9/50=3.8% 25 pmol 0.73% 1.8/25=7.2% 143627.doc -61 - 201024731 轉譯反應亦使用不同量之游離胺基酸混合物來執行以判 定對蛋白質回收率之影響。所測試之胺基酸混合物之相對 起始量以及所得蛋白質回收率展示於表ίο中。在各種情況 下RNA投入量均為50 pmol。如此分析所說明，增加胺基 酸混合物使得轉譯效率降低。 表10:胺基酸濃度與蛋白質回收率之間的關係 胺基酸混合物 FLAG純化後 所合併之S3s Met % 蛋白質皮莫耳數/RNA皮莫耳數 lx 1.60% 2/50=4% 2χ 0.42% 0.5/50=1% 3χ 0.13% 0.77/50=0.3% 4χ 0.03% 0.04/50=0.07% 亦測試不同量之「冷」（亦即非放射性）曱硫胺酸對轉譯 效率之影響。所測試之不同濃度之冷甲硫胺酸以及所得蛋 白質回收率展示於表11中。在各種情況下RNA投入量均為 50 pmol。如此分析所說明.，增加冷曱硫胺酸之投入量未 引起轉譯效率增加。 表11:冷甲硫胺酸濃度與蛋白質回收率之間的關係 冷甲硫胺酸濃度 FLAG純化後 所合併之S35 Met % 蛋白質皮莫耳數/RNA皮莫耳數 5 μΜ 1.00% 1.31/50=2.6% 17.5 μΜ 0.23% 1.15/50=2.3% 30 μΜ 0.20% 1.52/50=3.0% 42.5 μΜ 0.15% 1.58/50=3.2% 因此，當規劃用於mRNA呈現之轉譯反應時，應考量 RNA投入量及胺基酸濃度。雖然減少各反應中之RNA投入 量可改良蛋白質回收率，但其亦會影響庫尺寸。可適用於 實施本發明之mRNA呈現方法的例示性RNA轉譯反應展示 143627.doc -62- 201024731 於表12中。 表12 :例示性RNA轉譯反應 活體外轉錄之RNA 100 pmol=29-36 \ig 轉譯混合物(包括胺基酸混合物，不包括甲硫胺酸） 15 μΐ &S甲硫胺酸 2μ1 網狀紅血球溶解物 200 μΐ 100 mM GSSG/10 mM GSH 3.3 μΐ PDI(1 υ/μί) 6μ1 H20 至300 μι 反應條件 30°C，60-90分鐘 實例3
為scFv選擇優化mRNA呈現技術-間隔子長度 先前已提出scFv蛋白與mRNA末端之間的長間隔子長度 改良scFv摺疊及功能（參見Hanes等人，（1997) Proc_ Natl. Acad. Sci. USA 94(10):4937-42)。因此，研究scFv與連接 子黏接位點之間的間隔子長度對mRNA-scFv分子功能及產 量之影響（參見圖6)。製造具有短、中及長3'間隔子之三種 不同D2E7 scFv構築體及用於Y61及17/9 scFv之兩種短及長 間隔子構築體（對於D2E7間隔子構築體請參見圖8)。圖7中 所描繪之結果顯示較長間隔子不提供mRNA-scFv分子功能 的可量測優點，如依據抗原結合所評估。此外，較長間隔 子長度顯著降低mRNA-scFv產量（參見圖7)。在較長間隔子 情況下，RNA產量亦較低：短間隔子產生6 nmol RNA ;中 間隔子產生3.4 nmol RNA ;且長間隔子產生1.7 nmol RNA。因此，在一實施例中，短間隔子較佳用於scFv庫建 構。 亦藉由使用三種不同Y61構築體對不同間隔子與連接子 143627.doc -63 - 201024731 進行比較（參見圖23)。下表13中所示之結果顯示，在較長 間隔子情況下，RNA產量亦較低。另外，藉由將poly-A尾 自mRNA自身（Y61-sc基因3pA)移至mRNA與scFv蛋白之間 的DNA連接子（Y61-SC基因3pA)，mRNA分子純化無差異， 抗原結合亦無差異，因為在此兩種構築體之間，scFv蛋白 相同，如SEQIDNO:10及SEQIDNO:4分別所示。 表13:不同間隔子及連接子之比較 回收百分率 構築體 寡聚去氧胸苷純化 FLAG純化 IL-12(50 nM 選擇） Y61-scCL-短間隔子 1.00% 51.3% 21.1% Y61-SC基因 3 0.46% 50.3% 8.0% Y61-SC 基因 3pA 0.45% 47.4% 6.1% 如下文所示，17/9需要PDI在轉譯期間具有功能，且顯 示選擇之前反轉錄反應中之DTT影響其抗原結合。如此等 結果指示，二硫鍵為17/9功能所必需的，且由此使17/9成 為研究間隔子長度要求之良好候選藥物。圖9顯示儘管較 長間隔子長度不改良mRNA-scFv分子與抗原之結合，但其 降低其產量。 實例4 優化mRNA呈現技術以改良scFv蛋白摺疊及功能-忽略半胱 胺酸殘基上之化學修飾 此項技術中之信使RNA呈現技術包括游離半胱胺酸殘基 上之化學加帽反應，以防止2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（其導 致氰基化）或N-乙基順丁烯二醯亞胺（其與氫硫基共價鍵聯） 形成非所要之半胱胺酸二硫鍵。雖然此加帽反應排除由游 143627.doc -64- 201024731 離半胱胺酸殘基隨機交聯所引起之潛在蛋白質錯誤摺疊， 但本發明排除抗體中游離半胱胺酸之人為保留，此人為保 留會因不可預測之物理或化學性質而不利於其將來可製造 性。排除化學加帽步驟，以使得在庫選擇期間不主動保留 超過scFv Ig域摺疊所需之4個半胱胺酸之任何額外游離半 胱胺酸。 實例5 優化mRNA呈現技術以改蛋白指整及功能-需要共轉 譯蛋白質二硫鍵異構酶活性 已提出PDI藉由異構酶或伴侣蛋白活性或兩者而促進較 佳蛋白質功能及分泌（參見Shusta等人，Nat Biotechnol 16(8):773-7 ; Smith等人，Biotechnol Bioeng 85(3): 340-50)。兩個Ig内域二硫鍵由各scFv序列（一個處於VH中且另 一個處於VL域中）編碼。已提出共轉譯蛋白質二硫鍵異構 酶（PDI)活性對於活體外形成適當二硫鍵至關重要（參見 Ryabova等人，Nat Biotechnol 15(1): 79-84)。此項技術中 之mRNA呈現方案已規定轉譯反應中包含（PDI)。 使用D2E7、Y61及17/9 scFv測試其在mRNA呈現系統中 對PDI活性之需要。結果顯示，在無PDI情況下，兩種 scFv(D2E7及17/9)在其產生期間皆不結合至其同源抗原， 而Y61似乎不受影響（參見圖10)。結論為在大型抗體庫層 面下，高多樣性將需要PDI活性以確保最大scFv功能。 亦測試在添加或不添加其他PDI情況下所轉譯之D2E7 scFv的回收率及功能性。轉譯反應物包括1管溶解物（200 143627.doc -65- 201024731 μΐ)、100 pmol D2E7短間隔子 RNA及 PDI及 GSSG/GSH。無 PDI之轉譯不包括PDI及GSSG/GSH。使用FLAG純化回收 經轉譯之蛋白質且定量回收量。接著用50 mM生物素標記 TNFa執行抗原結合/回收且每次投入量相等（100000 cpm)。結果展示於下表14中。
表 14 :測試D2E7 scFv+/-PDI 轉譯 FLAG 回收率(cpm) FLAG 回收率(投入量°/〇) 抗原結合回收率 D2E7+PDI 290000 cpm 1.6% 25% D2E7-PDI 460000 cpm 2.5% 4% 下表1 5中所示之結果顯示Y61在轉譯期間就功能性而言 不需要PDI。 表15 : Y61-Sccl-短間隔子構築體在轉譯期間就功能性而言
不需要PDI PDI RT 回收0/〇 暮聚去氧胸苷純化 FLAG純化 IL-12(50 nM)遂擇 否 否 0.57% 34.0% 18.9% ~~~~- 否 是 9.2% 20.8% ~~- 是 否 0.50% 31.9% 24.3% ~~~~~ 是 是 9.8% 22.7% 下表16中所示之結果顯示17/9在轉譯期間就功能性而言 需要PDI。
表16: 17/9在轉譯期間就功能性而言需要PDI PDI 回收％ 寡聚去氧胸 苷純化 FLAG純化 HA(50 nM)選擇 無 &居~~~ 游離蛋白質 否 無 無 3.3% 5 · 是 30.5% 07% -- 接合蛋白質 否 3.4% 27.6% 2.3% 是 2.5% 39.3% 12.4% 0.8%-- — 143627.doc -66- 201024731 實例6 優化mRNA呈現技術以改良scFv蛋白摺疊及功能-自反應移 除二硫蘇糖醇 二硫蘇糖醇（DTT)為通常引入酶促反應中以最小化蛋白 質聚集且減少蛋白質氧化之還原劑。其亦通常用於mRNA scFv分子之活體外轉譯步驟後的反轉錄（RT)反應中。因為 包含其可減少scFv分子中因PDI活性所產生之兩個鏈内二 硫鍵，所以研究DTT對scFv抗原結合功能之潛在影響（參見 圖11)。DTT之存在顯著消除17/9 scFv在RT後之抗原結合 活性，此與圖11中所示之17/9功能對PDI活性之依賴性一 致。此抗原結合活性損失不歸因於RT反應本身，因為若 RT省去DTT，則1 7/9之大部分抗原結合活性得以保留。此 外，結果顯示17/9 scFv cDNA實際上在DTT不存在下藉由 PCR自mRNA反轉錄，從而表明DTT並非RT反^所必需的 (資料未展示）。 下表17中所示之結果顯示，選擇前之RT反應中的DTT影 響17/9功能性。然而，如圖12中所示，DTT不影響RT過 程。 表17:選擇前之RT反應中之DTT影響17/9功能性 PDI RT 回收％ 募聚去氧胸 苷純化 FLAG純化 HA(50 nM)選擇 無抗原選擇 否 否 3.4% 27.6% 2.3% 無 是 否 2.5% 39.3% 12.4% 0.8% 是，不存在DTT 14.2% 9.4% 無 是，存在DTT 9.9% 2.0% 無 143627.doc •67· 201024731 與17/9 scFv相比，抗IL-12 Y61 scFv功能不受DTT影響 (參見圖11)。此與上述對PDI活性之不敏感一致，且表明 並非所有抗體scFv就功能而言均需要二硫鍵。研究用於 Y61-scCL-短間隔子之不同RT條件及相應結果展示於下表 18以及圖13中。 表18:用於Y61-scCL-短間隔子之不同RT條件 RT RT反應中之 DTT 選擇中之核 糖核酸酶 OUT 回收％ 募聚去氧胸 苷純化 FLAG純化 IL-12 — (50nM)選擇 選擇前 是 否 1.6% 25.9% 21.6% 選擇前 否 否 一^ 29.3% 18.8% 選擇後 是 否 56.1% 22.2% 選擇後 是 是 21.0% 在一實施例中’ RT中不存在DTT或者延遲rt直至抗原選 擇後以使自mRNA-scFv庫產生功能性scFv之產量最大。下 表19及20分別展示針對Y61-ScCL-長間隔子及Y6i_ScCL-短間隔子延遲RT步驟直至抗原選擇步驟後之結果。 表19 :在有或無RT步驟下比較Y61-ScCL-長間隔子 RNA 產量 回收％ 去氧胸 皆純化 flag純化 IL-12(50 nM)選擇 Γ^抗原 選擇 游離蛋白質 3.2 奈莫耳 無 49.5% 0.3% 接合 無RT步驟 13% 57.6% 31% 0.2% 蛋白質 有RT步驟 15% 28.6% 0.3% 表20 :在有或無RT步驟下比較Y61-ScCL-短間隔子 RNA 產量 回收％ 寡聚去氧胸 苷纯化 FLAG純化 IL-12(50 nM)選擇 無抗 原選擇 游離蛋白突 奈莫耳 無1 無 40.2% 0.2% 接合 蛋白質 無RT步驊 有RT步驟 0.55% 47.6%~~ 20.8% 0.1% 193%~~ 21.8% 0.1% 143627.doc -68 - 201024731 實例7 優化mRNA呈現技術以改良scFv蛋白摺疊及功能-在抗原選 擇期間包含核糖核酸酶抑制劑 咸信藉由RT產生雙股mRNA-cDNA可製備用於抗原結合 之mRNA-scFv分子以防止RNA降解且減少RNA二級結構。 抗原選擇後，cDNA可藉由鹼性水解mRNA來回收且用作 PCR之擴增模板。為避免在抗原選擇前DTT藉由RT對scFv 功能產生潛在影響，需要使用替代性方法來保護用於選擇 後擴增之mRNA。 因此，研究缺乏其保護性cDNA股之mRNA-VH分子中之 mRNA是否足夠穩定且易於在抗原選擇後藉由rt-PCR進行 擴增。使用先前經驗證之結合IL-la的mRNA-VH分子作為 模型分子。對在抗原選擇之前或之後進行RT時之Phylos40 VH序列的回收率進行比較（參見圖丨4)。與此項技術中之方 法（對cDNA進行預選擇RT及鹼性溶離，左泳道）相比，當 mRNA-IL-la複合物捕捉於SA磁性珠粒上且直接用於RT 時，抗原選擇後藉由RT-PCR進行之mRNA回收似乎顯著減 少（右泳道）。此可能歸因於在抗原選擇期間部分RNA降解 或mRNA不易接近珠粒進行rT。為使mRNA易接近，試圖 中斷IL-la-Phylos40 VH相互作用且藉由酸性溶離（pH 3)使 mRNA-VH分子與SA珠粒解離似乎使其回收更差，此可能 歸因於在用SA珠粒移除複合物之前mRNA穩定性降低或 mRNA-VH分子與其抗原不良解離而進入溶離緩衝液中。 圖14展示抗原選擇後之反轉錄結果，其為先募聚去氧胸苷 143627.doc -69- 201024731 後RT-PCR的標準方法與直接進行RT_pCR後、酸性溶離捕 捉後之珠粒之比較。游離珠粒以1:10、1:1〇〇及1:1〇〇〇稀釋 顯示在1:1000稀釋度下達成高程度之再擴增。 因為在抗原選擇之前可省去仗丁且隨後藉由RT_pCR回收 mRNA ’所以研究mRNA模板之回收減少是否可藉由核糖 核酸酶抑制劑保護RNA以防損害核糖核酸酶活性來恢復或 增強。在抗原選擇步驟期間以1:2〇稀释度包含 RNase〇UTTM(Invitr0gen，目錄號 1〇777 〇19)且隨後進行 RT-PCR以比較mRNA回收（參見圖15)。與在抗原選擇前執 行RT相比’若在抗原選擇後在無核糖核酸酶抑制劑情況下 進行RT，則mRNA模板回收再次減少。有趣的是，抗原選 擇中包含核糖核酸酶抑制劑不僅恢復而且顯著增強mRNA 回收。因此’此增強似乎至少部分歸因於捕捉較輕約280 kDa mRNA-scFv分子之效率優於捕捉具有額ncDNA之較 重約560 kDa mRNA-scFv分子之效率。 亦在mRNA-scFv分子存在下對包含RNase OUT進行測 試。圖16描繪為在RNase OUT存在或不存在下比較Y61-CL-長間隔子與Y61-CL-短間隔子所執行之實驗。結果可見 於下表21以及圖17中。 表21 :在RNAseOUT存在或不存在下比較CL·長間隔子與 CL-短間隔子 回收％ 構築髏 RNase OUT 寡聚去氧胸苷純化 FLAG純化 IL-12(50 ιιΜ)選擇 Y61-scCL- 長間隔子 否 0.22% 29.3% 27.7% 是 0.25% 30.5% 33.8% ΥόΙ-scCL-短間隔子 否 0.64% 42.2% 47.2% 是 0.59% 46.2% 49.4% 143627.doc • 70- 201024731 實例8 針對17/9 scFv之庫選擇 為驗證mRNA-scFv分子可使用本文所述之mRNA呈現方 法、藉由多輪選擇來富集，藉由重疊PCR建構25種多樣性 之 scFv庫。為形成 scFv庫，將 17/9、D2E7、2SD4 ' Y61 及 MAK195之VH及VL片段等量混合且組合成25種最大多樣 性之scFv庫並如上文所述使用。接著藉由生物素標記HA 標籤肽，自此庫選擇17/9 scFv。選擇後，藉由選殖及群落 PCR來檢驗17/9富集。在一輪mRNA-scFv選擇之前及之後 定量17/9 seFv之結果展示於圖18中。一輪針對HA肽之選 擇後，所有自選擇產物回收之scFv序列均為17/9 scFv序 列。 實例9 mRNA呈現技術可用於辨別具有不同親和力之scFv結合物 為判定mRNA呈現技術（亦即如上文所述）是否可用於辨 別具有不同親和力之scFv結合物，製造D2E7與2SD4間之 嵌合體。2SD4為對TNFa展現低親和力（為游離蛋白質時， KD為約200 nM)之D2E7 scFv前驅體。圖19描繪該等嵌合 體。 對游離蛋白質執行滴定。圖20a展示不同嵌合體間之抗 原結合後之回收百分率，而圖20b描繪抗原選擇後之經校 正之回收百分率。上述結果顯示如本文中所述之mRNA呈 現技術可用於辨別具有不同親和力之結合物。 實例10 143627.doc -71 - 201024731 mRNA-scFv分子之熱穩定性 為測定mRNA-scFv分子之熱穩定性，如本文中所述，轉 譯D2E7-scCk及Y61-scCk且以mRNA-scFv形式純化。接著 於不同溫度下培育mRNA-scFv分子30分鐘，隨後進行抗原 選擇。抗原選擇後之經校正之回收百分率展示於圖21中。 圖22展示RNA可在高溫處理mRNA-scFv分子後回收。此 時，對回收有Y61-scCl mRNA-scFv分子的珠粒執行RT-PCR。 以引用的方式併入 整篇本申請案中所引用之所有引用參考文獻（包括文獻 參照案、專利、專利申請案及網站）之内容明確地以全文 引用的方式併入本文中以用於任何目的，該等參考文獻中 所引用之參考文獻亦如此併入本文中。除非另有指示，否 則可使用此項技術中熟知之細胞培養及分子生物學的習知 技術實施本發明。 均等案 本發明可以其他特定形式實施而不悖離本發明之精神或 、特徵因此，在各個方面，上述實施例均視為說明 非限制本文所述之本發日月。因此，本發明之範圍由隨附 申請專利範圍而非由以上說明來指定，且因此本文中希望 =蓋屬於中請專利範圍之均等案之含義及範圍内的所有變 【圖式簡單說明】 圖1描緣本發明之_些實施財之mRNA_seFv呈現技術 143627.doc 201024731 之一般流程； 圖2描繪本發明之其他實施例中之mRNA-scFv呈現技術 之一般流程； 圖3描繪庫DNA構築體之一般圖示； 圖4a描繪的結果顯示功能性scFv可以mRNA-scFv分子形 式產生； 圖4b描繪游離scFv分子及mRNA-scFv分子之模型； 圖5描繪的結果顯示mRNA-scFv分子形式中所連接之 scFv在功能上等效於游離scFv分子； 圖6描繪具有不同3'間隔子長度之3種D2E7 mRNA-scFv 構築體； 圖7描繪的結果顯示較短間隔子長度改良mRNA-scFv與 抗原之結合及mRNA-scFv抗體分子之產量； 圖8描繪D2E7短、中及長Ck 3'間隔子的序列（按出現順 序分別為 SEQ ID NO 42-44); 圖9a描繪具有短間隔子及長間隔子之17/9 mRNA-scFv構 築體； 圖9b描繪的結果顯示較短間隔子長度改良17/9 mRNA-scFv分子與標靶抗原之結合及mRNA-scFv抗體分子之產 量； 圖10描繪的結果顯示一些scFv功能需要PDI活性； 圖11描繪的結果顯示反轉錄期間存在之DTT抑制17/9 scFv與血球凝集素（HA)抗原之結合； 圖12描繪瓊脂糖凝膠電泳結果，其顯示DTT不顯著改變 143627.doc -73- 201024731 反轉錄過程； 圖13描繪在選擇之前與之後、在DTT及10^36〇111'1^存 在或不存在下、由不同RT條件所得的瓊脂糖凝膠電泳結 果； 圖14描繪瓊脂糖凝膠電泳結果，其顯示與對cDNA進行 選擇前RT及鹼性溶離（左泳道）相比，選擇之前或之後反轉 錄時之Phylos 40 VH序列之回收； 圖1 5描繪瓊脂糖凝膠電泳結果，其顯示抗原選擇後，核 糖核酸酶抑制劑藉由反轉錄保持RNA模板回收； 圖16描繪在RNaseOUTTM4在或不存在下CL長間隔子與 CL短間隔子的並行比較結果； 圖17描繪瓊脂糖凝膠電泳結果，其顯示在RNase〇UTTM 存在或不存在下CL長間隔子與CL短間隔子之回收之並行 比較； 圖18描繪在一輪mRNA-scFv選擇之前及之後定量17/9 scFv的瓊脂糖凝膠電泳結果； 圖19描繪D2E7與2SD4間之嵌合體的一般圖示； 圖20a描繪抗原結合後、不同嵌合體間之回收百分率， 顯示mRNA呈現技術可用於辨別具有不同親和力之結合 物； 圖20b描繪抗原選擇後之經校正之回收百分率，顯示 mRNA呈現技術可用於辨別具有不同親和力之結合物； 圖21描繪mRNA-scFv分子之熱穩定性； 圖22描繪瓊脂糖凝膠電泳結果，其顯示RNA可在高溫處 143627.doc -74- 201024731 理mRNA-scFv分子後回收； 圖23描繪具有短間隔子及長間隔子之mRNA-scFv Y61構 築體以及在mRNA與scFv蛋白之間的DNA連接子處包含 poly-A尾之PF-y61sc基因3構築體；及 圖24描繪本發明之其他實施例中之mRNA-scFv呈現技術 之一般流程。
143627.doc -75- 201024731 序列表 <110>美商亞培公司 <120> RNA呈現之改良方法
<130> BBI-315PC <140> 098133223 <141> 2009-09-30 <150> 61/101,471 <151> 2008-09-30 <160> 52 <170> Fatentln version 3.5 <230> 1 <211> 266 <212> PRT <2]3>人工序列 <220>
<223>人工序列的敘述：合成多肽 <400> 1
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Gin Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Set Gly Phe Ser Leu Thr Asp 20 25 30
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Ser Thr Thr Val Giy Asp Arg Va! Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin 145 150 155 160
Ala Val Ser Ser Ala Va! Aia 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 165 170 175
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro 143627-序列表.doc 201024731 180 185 190
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 195 200 205
His Asn Leu Gin Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His 210 215 220
Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 225 230 235 240
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Tyr 245 250 255
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Va) Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60
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130 135 HO
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201024731 <220> <223>人工序列的敘述：合成多核苷酸 <400> 15 ttaatacgac tcactatagg gacaattact atttacaatt acaccatgga ggtgcagctg gtggastctg ggggaggctt ggtacagccc ggcaggtccc tgagactctc ctgtgcggcc tctggattca cctttgatga ttatgccatg cactgggtcc ggcaagctcc agggaagggc ctggactggg tctcagctat cacttggaat agtggtcaca tagactatgc ggactctgtg gagggccgat tcgccgtctc cagagacaac gccaagaacg ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagac ctgaggacac ggcagtatat tactgtgcga aagtctcgta ccttagcacc gcgtcctccc ttgactactg gggccaaggt accctggtca ccgtctcgag tggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctat aggggacaga gtcaccatca cttgtcgggc aagtcagggc atcagaaatt acttagcctg gtatcagcaa aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca atcaggggtc ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagccta cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaggtata accgtgcccc gtacactttt ggccagggga ccaaggtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg actacaagga cgacgacgac aaggcatccg ctatttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa <210> 16 <211> 980 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多核甞酸 <400> 16 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caccatggag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcccg gcaggtccct gagactctcc tgtgcggcct ctggattcac ctttgatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca gggaagggcc tggactgggt ctcagctatc acttggaata gtggtcacat agactatgcg gactctgtgg agggccgatt cgccgtctcc agagacaacg ccaagaacgc cctgtatctg caaatgaaca gtctgagacc tgaggacacg gcagtatatt actgtgcgaa agtctcgtac cttagcaccg cgtcctccct tgactactgg ggccaaggta ccctggtcac cgtctcgagt ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctata ggggacagag tcaccatcac ttgtcgggca agtcagggca tcagaaatta cttagcctgg tatcagcaaa aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc cactttgcaa tcaggggtcc catctcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagcctac agcctgaaga tgttgcaact tattactgtc aaaggtataa ccgtgccccg tacacttttg gccaggggac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact totatcccag agaggccaaa gtacagtgga 143627-序列表.doc •15· 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 876 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 201024731 aggtggataa cgccctccaa tcggactaca aggacgacga cgacaaggca tccgctattt 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 980 <210> 17 <211> 1151 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多核苷酸 <400> 17 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caccatggag gtgcagctgg 60 tggagtctgg gggasgcttg gtacagcccg gcaggtccct gagactctcc tgtgcggcct 120 ctggattcac ctttgatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca gggaagggcc 180 tggactgggt ctcagctatc acttggaata gtggtcacat agactatgcg gactctgtgg 240 agggccgatt cgccgtctcc agagacaacg ccaasaacgc cctgtatctg caaatgaaca 300 gtctgagacc tgagsacacg gcagtatatt actgtgcgaa agtctcgtac cttagcaccg 360 cgtcctccct tgactactgg ggccaaggta ccctggtcac cgtctcgagt ggtggaggcg 420 gttcagscgg aggtgsctct ggcggtggcg gatcggacat ccagatgacc cagtctccat 480 cctccctgtc tgcatctata ggggacagag tcaccatcac ttgtcgggca agtcagggca 540 tcagaaatta cttascctgg tatcagcaaa aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct 600 atgctgcatc cactttgcaa tcaggggtcc catctcggtt cagtggcagt ggatctggga 660 cagatttcac tctcaccatc agcagcctac agcctgaaga tgttgcaact tattactgtc 720 aaaggtataa ccgtgccccg tacacttttg gccaggggac caaggtggaa atcaaacgta 780 cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 840 ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 900 aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 960 aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 1020 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 1080 tcaacagggg agaggactac aaggacgacg acgacaaggc atccgctatt taaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa a 1151 <210> 18 <211> 878 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多核甞酸 <400> 18 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caccatggaa gtgcagct^g 60 tggaaagcgg cggcgatctg gtgaaaccgg gcggcagcct gaaactgagc tgcgcggcga 120 gcggctttag ctttagcagc tatggcatga gctgggtgcg ccagaccccg gataaacgcc 180 tggaatgggt ggcgaccatt agcaacggcg gcggctatac ctattatccg gatagcgtga 240 aaggccgctt taccattagc cgcgataacg cgaaaaacac cctgtatctg cagatgagca 300 gcctgaaaag cgaagatagc gcgatgtatt attgcgcgcg ccgcgaacgc tatgatgaaa 360 •16· 143627-序列表.doc 201024731
acggctttgc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcgggt ggaggcggtt 420 caggcggagg tggcagcggc ggtggcggat cggatattgt gatgacccag agcccgagca 480 gcctgaccgt gaccgcgggc gaaaaagtga ccatgagctg caccagcagc cagagcctgt 540 ttaacagcgg caaacagaaa aactatctaa cctggtatca gcagaaaccg ggccagccgc 600 cgaaagtgct gatttattgg gcgagcaccc gcgaaagcgg cgtgccggat cgctttaccg 660 gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cgtgcaggcg gaagatctgg 720 cggtgtatta ttgccagaac gattatagca acccgctgac ctttggcggc ggcaccaaac 780 tggaactgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cgactacaag gacgacgacg 840 acaaggcatc cgctatttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 87S
<210> 19 <21]> 1166 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多核甞酸 <400> 19 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caccatggaa gtgcagctgg 60 tggaaagcgg cggcgatctg gtgaaaccgg gcggcagcct gaaactgagc tgcgcggcga 120 gcggctttag ctttagcagc tatggcatga gctgggtgcg ccagaccccg gataaacgcc 180 tggaatgggt ggcgaccatt agcaacggcg gcggctatac ctattatccg gatagcgtga 240 aaggccgctt taccattagc cgcgataacg cgaaaaacac cctgtatctg cagatgagca 300 gcctgaaaag cgaagatagc gcgatgtatt attgcgcgcg ccgcgaacgc tatgatgaaa 360 acggctttgc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcgggt ggaggcggtt 420 caggcggagg tggcagcggc ggtggcggat cggatattgt gatgacccag agcccgagca 480 gcctgaccgt gaccgcgggc gaaaaagtga ccatgagctg caccagcagc cagagcctgt 540 ttaacagcgg caaacagaaa aactatctaa cctggtatca gcagaaaccg ggccagccgc 600
cgaaagtgct gatttattgg gcgagcaccc gcgaaagcgg cgtgccggat cgctttaccg 660 gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cgtgcaggcg gaagatctgg 720 cggtgtatta ttgccagaac gattatagca acccgctgac ctttggcggc ggcaccaaac 780 tggaactgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc 840 agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg 900 ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca 960 cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 1020 cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc clgagctcgc 1080 ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagg actacaagga cgacgacgac aaggcatccg 1140 ctatttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1166 <210> 20 <211> 10 <212> RNA <2丨3>人工序列 -17- 143627-序列表.doc 201024731 <220> <223>人工序列敘述：合成寡核甞酸 <400> 20 uagcggaugc <210> 21 <211> 2δ <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成募核:y：酸 <400> 21 uagcggaugc aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述··合成引子 <400> 22 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caccatggag gtgcagctga aggagtcagg <210> 23
<211> 68 <212> WA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 23 cgatccgcca ccgccagagc cacctccgcc tgaaccgcct ccacctgcag agacagtgac cagagtcc <210> 24 <211> 67 <212> DNA <2l3>人工序列 <220> <223>人工序列欽述：合成引子 <400> 24 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat tgtgatgacc cagtctc <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述··合成引子 <400> 25 gatggtgcag ccaccgtacg itttatttcc aactttgtcc ccgag <210> 26 <211> 70 -18- 143627-序列表.doc 201024731 <212> DNA <2I3>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <40Q> 26 ggacaattac tatttacaat tacaccatgg aagtgcagct ggtggaaagc ggcggcgatc tggtgaaacc <210> 27 <211> 70 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 27 gctgctaaag ctaaagccgc tcgccgcgca gctcagtttc aggctgccgc ccggtttcac cagatcgccg
<211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 28 ggctttagct ttagcagcta tggcatgagc tgggtgcgcc agaccccgga taaacgcctg gaatgggtgg
<210> 29 <211> 70 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列敘述：合成引子 <400> 29 gcctttcacg ctatccggat aataggtata gccgccgccg ttgctaatgg tcgccaccca ttccaggcgt <210> 30 <211> 69 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 30 ccggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa caccctgtat ctgcagatg <210> 31 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列救述：合成引子 • 19· 143627·序列表.doc 60201024731 <400> 31 ' gttcgcggcg cgcgcaataa tacatcgcgc tatcttcgct tttcaggctg ctcatctgca gatacagggt 70 <210> 32 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 32 attgcgcgcg ccgcgaacgc tatgatgaaa acggctttgc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt 60 70 <210> 33 <211> 70 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 33 cgatccgcca ccgccgctgc cacctccgcc tgaaccgcct ccacccgcgc tcacggtcac cagggtgccc 60 70 <210> 34 <2Π> 70 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 34 agcggcggtg gcggatcgga tattgtgatg acccagagcc cgagcagcct gaccgtgacc gcgggcgaaa 60 70 <210> 35 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 35 tgtttgccgc tgttaaacag gctctggctg ctggtgcagc tcatggtcac tttttcgccc gcggtcacgg 60 70 <210> 36 <211> 70 <212> DNA 人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 36 gtttaacagc ggcaaacaga aaaactatct gacctggtat cagcagaaac cgggccagcc gccgaaagtg 60 143627-序列表.doc • 20- 70 201024731 <210> 37 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 37 cggtaaagcg atccggcacg ccgctttcgc gggtgctcgc ccaataaatc agcactttcg 60 gcggctggcc 70 <210> 38 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子
<400> 38 tgccggatcg ctttaccggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc attagcagcg 60 tgcaggcgga 70 <210> 39 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 39 aaaggtcagc gggttgctat aatcgttctg gcaataatac accgccagat cttccgcctg 60 cacgctgcta 70
<210> 40 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列敘述：合成引子 <400> 40 agcaacccgc tgacctttgg cggcggcacc aaactggaac tgaaacgtac ggtggctgca 60 ccatctgtct 70 <210> 4] <211> 64 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 人工序列敘述：合成引子 <400> 41 ttaaatagcg gatgccttgt cgtcgtcgtc cttgtagtcg atgaafiacag atggtgcagc 60 cacc
<210> 42 <211> 14 <212> PRT 143627-序列表.doc -21· 64 201024731 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多肽 <400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser ] 5 10 <210〉 43 <211> 49 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的敘述：合成多肽 <400> 43
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser <210> 44 <21I> 106 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列的敘述：合成多肽 <400> 44
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Va) Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Scr 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 100 105 •22- 143627-序列表.doc 201024731 <210> 45 <211> 48 <212> DNA <23 3> 人工序列 <220> <223> 合成募核甞酸 <400> 45 gtcgtcgtcg tccttgtagt cgaagacaga tggtgcagcc acagttcg 48 <210> 46 <211> 79 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成募核苷酸 <400> 46 tttttttttt tttttttttt aaatagcgga tgccttgtcg tcgtcgtcct tgtagtcgaa 60 gacagatggt gcagccaca 79
<210> 47 <211> 60 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成寡核苷酸 <400> 47 gtcgtcgtcg tccttgtagt cagtgacagt ggggttggcc ttgggctgac ckaggacggt 60 <210> 48 <211> 79 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成募核甞酸 <400> 48 tttttttttt tttttttttt aaatagcgga tgccttgtcg tcgtcgtcct tgtagtcagt 60 gacagtgggg ttggccttg 79 <210〉 49 <21 】> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成募核苷酸 <400> 49 cgctacctcc gccgccagac 20 <210> 50 <211> 76 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成寡核甞酸 <400> 50 tttttttttt tttttttttt aaatagcgga tgctttgtca tcatcatctt tataatcgct 60 23- 143627-序列表.doc 201024731 acctccgccg ccagac <230> 51 <211> 21 <212> DNA _ <213>人工序列 <223>合成寡核甞酸 <400> 51 gacacggccg tgtattactg t <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成寡核驻酸 <400> 52 gctgaggaga cggtgacc 143627-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201024731 七、申請專利範圍： 1 · 一種篩選scFv抗體RNA呈現庫之方法，該方法包含以下 步驟： (a)提供嗓呤黴素（puromycin)或其類似物交聯單鏈Fv (scFv) mRNA分子，該分子包含編碼5' scFv及3'間隔序列 ' 之mRNA，該分子與單股核酸連接子交聯，該連接子包 含嘌呤黴素或其類似物於1端及補骨脂素C6(Psoralen C6)於5'端； ® (b)該嘌呤黴素交聯scFv mRNA在標記存在下、在形 成經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子的條件 下於活體外轉譯； (c) 純化該經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質 分子； (d) 使該經純化經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋 白質分子經至少一種抗原之抗原選擇；及 • (e)使用基於親和力之磁性珠粒回收該等經純化經標 記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子。 2.如請求項1之方法，其進一步包含（g)在抗原選擇後反轉 . 錄該scFv mRNA以產生cDNA之步驟。 3.如請求項2之方法，其進一步包含（h)擴增該cDNA之步 驟。 4.如請求項1之方法，其中該標記為放射性標記。 5.如請求項4之方法，其中該標記為35S甲硫胺酸或半胱胺 酸0 143627.doc 201024731 6. 如請求項1之方法，其中該3’間隔序列包含約0至約200個 胺基酸。 7. 如請求項1之方法，其中該3'間隔序列包含約16個胺基 酸。 爲 8. 如請求項1之方法，其中該3’間隔序列包含親和標籤。 9. 如請求項1之方法，其中該核酸連接子自V至3’包含： 補骨脂素C6 ; 包含序列UAGCGGAUGC之2OMe核糖核苷酸（SEQ ID NO: 20)； 6個三乙二醇或PEG-150部分； 2個去氧胞苷殘基；及 嘌呤黴素。 10. 如請求項1之方法，其中該scFv mRNA分子藉由UVA光交 聯於該DNA連接子。 11. 如請求項1之方法，其中該scFv mRNA分子包含一個選自 由T7、SP6及T3組成之群的5'啟動子。 12. 如請求項1之方法，其中該scFv mRNA分子包含一個於草 鑲嵌病毒（tobacco mosaic virus)5'非轉譯區。 1 3.如請求項1之方法，其中該經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子係由寡聚去氧胸苷（oligodT)層析法純 化。 14.如請求項1之方法，其中該經標記之嘌呤黴素交聯scFv mRNA/蛋白質分子係使用抗FLAG M2單株抗體瓊脂糖珠 粒純化。 143627.doc 201024731 15·如仴求項1之方法，其中該經標記之嘌呤黴素交聯scFv mR^A/蛋白質分子係由寡聚去氧胸苷層析法及抗flag M2單株抗體瓊脂糖珠粒純化。 青长項1之方法，其中該抗原為生物素化之肽、蛋白 質或半抗原。 月求項1之方法，其中該抗原為與人類免疫球蛋白可 結晶片段（Fc)的融合蛋白。 0 8.如叫求項1之方法，其中該抗原為與鼠類免疫球蛋白可 結晶片段（Fc)的融合蛋白。 19. 如叫求項1之方法，其中該抗原為生物素化之肽、蛋白 質或半抗原。 20. 如請求項1之方法，其中該抗原為細胞群體。 2L如凊求項1之方法，其中該抗體為抗IL-12抗體。 22.如請求項1之方法，其中該抗體為抗HA抗體。 23 ·如印求項丨之方法，其中該抗體為鼠類抗體。 φ 24_如明求項1之方法，其中該抗體為人類抗體。 25. 如請求項丨之方法，其中該抗體為人類化抗體。 26. 如請求項i至24中任一項之方法，其中活體外轉譯該嘌 .吟徽素交聯scFv mRNA係另外在GSSH/GSH存在下執 ，行。 27. 如請求項26之方法，其中活體外轉譯該嘌呤黴素交聯 seFv mRNA係另外在蛋白質二硫鍵異構酶（PDI)存在下執 行。 28. 如請求項i至24中任一項之方法，其中活體外轉譯該嘌 143627.doc 201024731 一硫蘇糖醇不存在下執 呤黴素交聯scFv mRNA係另外在 行。 29. 如凊求項27之方法，其中活體外轉考兮^ X 肢卜得痒6亥嘌呤黴素交聯 scFv mRNA係另外在二硫蘇糖醇不存在下執行。 30. 如請求項1之方法’其中該方法不包含mRNA加帽 (capping)步驟。 31·如請求項1之方法，其中該方法在純化步驟之前不包含 活體外反轉錄步驟。 32.如凊求項1之方法，其中在步驟⑷至（轻）中任一步驟之 前、期間或之後添加核糖核酸酶抑制劑。 33·如請求項丨之方法，其中該純化步驟包含在二硫蘇糖醇 不存在下反轉錄該mRNA以產生cDNA » 34. 如請求項2或33之方法，其中該cdna係由在約pH=8.0至 約pH=l〇.〇鹼性水解溶離。 35. 如清求項2或33之方法’其中該cDNA係由加熱溶離。 36·如請求項2或33之方法，其中該cDNA係由約pH=3.0至約 pH=6.〇之酸溶離。 3 7.如請求項33之方法，其中該cDNA係由聚合酶鏈反應擴 增。 38. 如請求項37之方法，其中該聚合鏈反應使用熱穩定dna 聚合酶。 39. 如請求項37之方法，其中該聚合鏈反應使用選自由 Platinum HiFi及KOD組成之群的擴增酶。 40. 如請求項1之方法，其中該等珠粒係選自由以下組成之 143627.doc 201024731 群：抗生蛋白鏈菌素（streptavidin)-M280、 (neutravidin)-M280、SA-M270、NA-M270 NA-MyOne、SA-壤脂糖及ΝΑ-瓊脂糖。 中性鏈親和素 SA-MyOne、
    143627.doc
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