ES2822159T3 - Método para generar una biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al antígeno, dicha biblioteca y la(s) aplicación(ones) de la misma - Google Patents

Abstract

Un método para generar una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno o una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada, dicho método comprende el procesamiento de muestras biológicas que comprenden una agrupación de genes de anticuerpos para aislar una pluralidad de ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) un repertorio de anticuerpos de origen natural, seguido de amplificación, la introducción de marcadores de secuencia de trinucleótido específicos en el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la cadena pesada del repertorio de anticuerpos para catalogar el producto de la agrupación de genes respectiva y permitir el rastreo del anticuerpo presentado hasta la agrupación de genes de anticuerpos de origen, en donde el marcador de secuencia de trinucleótido codifica el aminoácido respectivo idéntico al codificado originalmente por dicho ácido nucleico, la agrupación del(de los) producto(s) amplificado(s) que tiene(n) los marcadores de secuencia de trinucleótido de diferentes muestras y la clonación de dicho(s) producto(s) amplificado(s) en vectores fagémidos para obtener una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno, la presentación del anticuerpo en el fago seguido de cribado del anticuerpo presentado contra el(los) antígeno(s) específico(s) para eliminar los anticuerpos no aglutinantes de antígeno(s) específico(s) y para obtener una agrupación seleccionada de moléculas de anticuerpos contra antígeno(s) específico(s), la transferencia del(de los) ácido(s) nucleico(s) de las moléculas de anticuerpo seleccionadas a levadura para la presentación de dichas moléculas de anticuerpo en la superficie de la levadura, seguido del cribado del anticuerpo presentado en la levadura contra la(s) diana(s) antigénica(s) específica(s), y la selección de los anticuerpos presentados en la levadura que muestran una afinidad mayor por el antígeno diana para formar la biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada o el aislamiento de los anticuerpos seleccionados con las propiedades funcionales deseadas de la biblioteca de anticuerpos en fago o la biblioteca de anticuerpos en levadura para generar la biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada.

Description

DESC

Método para generar una biblioteca de anticuerpos s aplicación(ones) de la misma

Campo técnico

La presente descripción se refiere generalmente al camp Particularmente, la presente descripción se refiere a u limitarse a una biblioteca de expresión génica de anticue una agrupación de secuencias de ácidos nucleicos deriva inmunidad humoral de poblaciones humanas sanas y emplea una combinación de concepto de presentación de cribar una biblioteca de anticuerpos de gran tamaño y faci presente descripción también se refiere a una biblioteca generada mediante el empleo del proceso de la presen método y la(s) aplicación(es) de dicha biblioteca de antic

Antecedentes de la descripción

El anticuerpo monoclonal humano (mAb) y sus derivad crecimiento de la industria biofarmacéutica. La aplicación y expresar anticuerpos generó un gran interés entre los c

Los mAb humanos, quiméricos y humanizados, los for dominios constantes humanos pero se distinguen por el un conjunto de dominios variables que se derivan co anticuerpos quiméricos se desarrollan artificialmente me resultar en una respuesta anti-anticuerpos. Esta es una d temprana con anticuerpos monoclonales. Además, est eficacia y seguridad, por ejemplo, reducir la unión a la dia anticuerpos humanizados producidos por el proceso de h CDR se unen al antígeno de manera diferente que el ant los anticuerpos monoclonales humanos tienen mejore comparación con los anticuerpos monoclonales de reper los mAb humanizados es sustancialmente menor en com humanos.

Enfoques como la inmunización y la tecnología de hibrido de anticuerpos. Sin embargo, las limitaciones de la inm farmacocinéticas que impactan directamente en la utilid limitaciones de la tecnología de hibridomas se relacionan ratones. Teniendo en cuenta las altas homologías entr respectivo, la generación de anticuerpos contra autoantíg

Más específicamente, las limitaciones asociadas con la t controlar los epítopos contra los que se forman los anti después de su creación con la esperanza de que se haya el investigador. Además, los Antígenos sensibles (por ej destruirse en el animal mientras que los antígenos tóx homología entre la secuencia del humano y los ratones, inmunogenicidad en ratones en donde la generación de El alcance del desarrollo adicional de anticuerpos en térm una mayor afinidad es extremadamente limitado y difícil

Los repertorios de anticuerpos humanos que son coleccio cadenas humanas ligeras y pesadas incluyen segmentos el cromosoma 14; segmentos de genes Vk, Jk y Ck d segmentos de genes VA, JA y CA del locus de la cadena li respuesta inmunitaria natural in vivo genera una varied moderada hacia el antígeno, a través de procesos de rec de unión VHDJH, VkJk y VAJA. Todos los procesos de siguen una regla inviolable que se relaciona con la estruct de reconocimiento de un giro o de dos, que dan lugar tant una diversidad en el repertorio inmune. El proceso de r existe en múltiples formas. Las enzimas cruciales q CIÓN

exposición previa al antígeno, dicha biblioteca y la(s)

e la biotecnología, la ingeniería genética y la inmunología.

étodo para generar una biblioteca de anticuerpos, sin s humanos sin exposición previa al antígeno que abarca de un repertorio de anticuerpos naturales que comprende néticamente diversas. Más específicamente, el método perficie de anticuerpos de fagos y/o levaduras que permite un mejor plegamiento de la estructura del anticuerpo. La anticuerpos sin exposición previa al antígeno humanos descripción, un conjunto de cebadores empleados en el pos

son uno de los segmentos más largos y de más rápido iente de la tecnología del ADN recombinante para generar tíficos de la industria y el mundo académico.

tos predominantes de los mAb terapéuticos, comparten en de sus dominios variables. Los mAb humanos tienen letamente de repertorios de anticuerpos humanos. Los nte el uso del uso de codones en humanos que pueden s limitaciones terapéuticas más importantes de la terapia esarrollo de la respuesta inmunitaria puede afectar su alterar el aclaramiento y la farmacocinética. Además, los anización de los anticuerpos o el injerto de secuencias de erpo parental. Por tanto, generalmente se considera que aracterísticas farmacocinéticas y farmacodinámicas en ios de anticuerpos no humanos. La inmunogenicidad de ración con los anticuerpos monoclonales quiméricos y no

s murinos se siguen tradicionalmente para la generación zación se relacionan con la seguridad y las propiedades y eficacia del desarrollo de moléculas de fármacos. Las n la toxicidad o no inmunogenicidad de los antígenos en a secuencia del antígeno humano y el antígeno murino os puede ser un desafío.

nología de hibridomas son multifactoriales. No hay como rpos. Los anticuerpos deben examinarse extensamente eado uno con características que sean convenientes para plo, proteínas de membrana y ácidos nucleicos) pueden s podrían matar al animal. Teniendo en cuenta la alta ntígeno murino respectivo podría dar lugar a una falta de ticuerpos contra los autoantígenos puede ser un desafío. s de introducir racionalmente características que exhiben realizar.

s de genes de inmunoglobulina (Ig) humana que codifican genes VH, D, JH y CH del locus de la cadena pesada en locus de la cadena ligera kappa en el cromosoma 2; y ra lambda en el cromosoma 22 en el genoma humano. La de moléculas de anticuerpos, con una afinidad baja a binación independientes del antígeno como los procesos n de genes V, D y J, como VH-D, D-JH, Vk-Jk y VA-JA, de su secuencia de reconocimiento, tanto en secuencias uniones en fase o fuera de fase que dan como resultado mbinación V(D)J se inicia por la recombinasa VDJ, que median el proceso son los Genes Activadores de la Recombinación 1 y 2 (RAG), la Transferasa desoxinucleot Artemis es un miembro de la trayectoria ubicua de unión d del ADN. Todos estos segmentos de unión de genes está que comprenden elementos heptámeros y nonámeros co de 12 o 23 pares de bases. El proceso de recombinación del grupo de alta movilidad, al ensamblar un par de RSS rupturas de ADN de doble cadena entre las RSS y lo maquinaria de recombinación V(D)J comprenden tres loci receptor de células T (TCR) distintos, Tcrb, Tcra/Tcrd y T procede dentro del contexto de programas de desarroll procede en primer lugar, con un reordenamiento de reordenamientos en el marco conducen al ensamblaje de expresión de los RAG, lo que da como resultado un aum una segunda etapa de expresión de los RAG. En esta eta Jk y VA a JA. En los linajes de células B y T, la recombin RAG.

La diversidad a través de reordenamientos de genes ocu ordenada. La hipermutación somática o SHM es una de l diversidad de anticuerpos en los linfocitos B de los mamífe de la diversidad es la recombinación conmutante de clase Cy, Ce o Ca para generar anticuerpos IgG, IgE e IgA, res recombinación intracromosómica entre la región de cam abajo. Estas regiones S están ubicadas inmediatamente y contienen repeticiones pentaméricas ricas en G y C i proceso de recombinación. Curiosamente, la CSR es espe de la región V con cambios que tienen sustituciones de Existen puntos calientes potenciales para las mutacion sugieran que otras secuencias locales o estructuras d mutaciones. La tasa de la SHM es de ~10-5 a 10-3 muta veces más plegamiento que la tasa de mutación espontá de transición surgen con más frecuencia que las transve está sesgado hacia muchas enfermedades, desde infec posibilidad de una variación hereditaria en la composició inherente de enfermedades específicas. Sin embargo, hereditarias sobre la diversidad del repertorio de anticuer

Además, aún no está disponible una biblioteca nueva y a una cuidadosa selección de donantes de diversos antec grandes y diversas están asociadas con varias ventajas antígenos de manera que puede evitarse la inmunización antígenos tóxicos o inmunogénicos bajos tras la inmuni murinos, el riesgo de respuesta alérgica puede reducirs biblioteca determina la probabilidad de aislar un anticuer tanto, varios estudios en la técnica están en marcha, y e anticuerpos humanos grandes y diversas.

Los anticuerpos son glicoproteínas y actúan como u reconocimiento y la unión específica a antígenos particu eficiente. Los anticuerpos son de varios isotipos y difieren distribución de la diana. Por tanto, la evaluación de los is información útil sobre la respuesta inmunitaria humoral anticuerpos, como la mezcla aleatoria de los genes de l región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de la introducción de mutaciones basadas en reacciones en clasifican en dos formas diferentes: i) solubles; ii) unid expresados por las células B son IgM e IgD, prototipo del receptor de células B (BCR) solo puede unirse a antígen célula transducir la señal y responder a la presencia d crecimiento y la proliferación de las células B y la produc anticuerpos producidos por las células plasmáticas se antigénicas principalmente debido a la variabilidad de la e cinco isotipos principales: IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. Los i diferencias en su secuencia de aminoácidos en la región inmunoglobulinas IgG e IgA se agrupan además en subc humanas) basándose en pequeñas diferencias adiciona Terminal (TdT) y la nucleasa de Artemis. La nucleasa de xtremos no homólogos (NHEJ) y funciona en la reparación nqueados por secuencias señal de recombinación (RSS) ervados, mientras que están separados por separadores iniciado por las proteínas RAG1 y RAG2 y las proteínas rentes en un complejo sináptico (la regla 12/23) y genera egmentos codificantes. Los sustratos fisiológicos de la inmunoglobulina (Ig) distintos, Igh, Igk e Igl, y tres loci de . Este proceso de recombinación estrictamente regulado imilares en los linajes de células B y T. El ensamblaje a J seguido de un reordenamiento de V a DJ. Los -receptores, que señalizan una regulación negativa de la o de la proliferación y una transición del desarrollo hacia , las células pre-B experimentan un reordenamiento Vk a n V(D)J finaliza mediante el cese de la expresión de los

durante la maduración de los linfocitos B en una manera transacciones de ADN que contribuye a la generación de . Otro proceso crucial que está involucrado en el aumento R). En la CSR, la región C|j se reemplaza por segmentos tivamente. Este proceso se ve facilitado por un evento de (S) de la región C j (S j) y una de las regiones S aguas as arriba de cada una de las regiones C (excepto para 5) rfectas que sirven como donantes y receptores para un ica de la región, no de la secuencia. La SHM es específica a sola base, con inserciones y deleciones ocasionales. , aunque no existen preferencias por ubicaciones que orden superior pueden influir en la focalización de las nes por par de bases por generación que es unas ~106 en la mayoría de los otros genes donde las mutaciones nes. Se ha descubierto que el repertorio de anticuerpos nes hasta trastornos autoinmunes y cánceres. Existe la del repertorio de anticuerpos que puede alterar el riesgo eda por descifrar la caracterización de las influencias .

zada, sin exposición previa al antígeno o no inmune, con ntes genéticos. Las bibliotecas de anticuerpos humanos e pueden usarse, explorarse y mejorarse contra varios imal resultante. Los anticuerpos pueden generarse contra ión. Además, contrario a los anticuerpos monoclonales on el uso de anticuerpos humanos. La diversidad de la con alta eficacia y afinidad por un antígeno dado. Por lo ten técnicas que están dirigidas a generar bibliotecas de

parte crítica de la respuesta inmunitaria mediante el es, como bacterias o virus, y ayudan a una destrucción su estructura, características biológicas, especificidad y os y la diversidad de los anticuerpos puede proporcionar pleja. Hay varias formas de aumentar la diversidad de cadenas pesadas y ligeras, mediante la alteración de la s genes de la cadena pesada clonados de la biblioteca y adena de la polimerasa (PCR). Las inmunoglobulinas se a la membrana. Los primeros receptores de antígenos ticuerpo que la célula B está preparada para producir. El Es el heterodímero de Ig alfa e Ig beta que permite a la antígenos en la superficie celular. La señal provoca el n de anticuerpos en el interior de la célula. Los diversos sifican en isotipos que difieren en función y respuestas ctura. En los mamíferos placentarios, se han identificado tipos de los anticuerpos se clasifican de acuerdo con las nstante (Fc) de las cadenas pesadas del anticuerpo. Las es (por ejemplo, en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 en las secuencias de aminoácidos. Basándose en las diferencias en la secuencia de aminoácidos en la región se pueden subclasificar en dos; cadena ligera kappa o c las células B proporcionan principalmente la respuesta para dirigirse a los cuerpos invasores y sus productos tó provoca la expresión de un nuevo isotipo de anticuerpo. de una IgM a un anticuerpo de todas las clases posibles ( constante de la cadena pesada cambia, mientras que l cambios. Este cambio no afecta la especificidad del antic que puede ejecutar cada clase de anticuerpo. Los esta una clase o subclase de isotipo hasta una deficienci autoinmunes y las afecciones gastrointestinales se concentraciones variables de uno o más isotipos. En el y la generación de formato Fab, se prefiere el isotipo Ig en la circulación, representan el 75 % de los anticuer anticuerpos terapéuticos adopten dominios constantes. B además en 4 subcategorías; IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. E un 66 %. Además, propiedades como la capacidad de a activación del complemento, la afinidad extremadamente alta hacen de la IgG1 una cadena principal preferida par

Las bibliotecas sin exposición previa al antígeno se elab de anticuerpos en múltiples donantes. Se usaron la PCR de ADNc preparada a partir de células B de sangre perif del gen de la línea germinal DP-47 (familia VH3). La completamente diferente a la creada naturalmente en el este enfoque puede dar lugar a un nuevo tipo de moléc varios formatos, los genes que codifican el anticuerp combinación aleatoria de genes V de cadena pesada y li puede clonarse en fagémidos o vectores de levaduras p

Se mantiene una necesidad general en la técnica de l diversidad que permitirá la rápida selección y la pro funcionalidad mejorada contra la molécula de antígeno e

Las principales estrategias para extraer los repertorios d y b) combinatorias. Las estrategias no combinatorias rec originales de cadena pesada y ligera, mientras que anticuerpos humanos con cadenas ligeras y pesadas co mAb humanos aprobados por la Administración de alime Entre los enfoques no combinatorios, la adaptación de la ha visto sinceros esfuerzos durante años, sin embargo, células B estimuladas con un antígeno de interés y d generación de hibridomas viables es típicamente un des opción popular para extraer repertorios de anticuerpos repertorios de anticuerpos humanos se entrelaza con el un enlace compartimental o físico de fenotipo (proteína) se basa en la capacidad de recuperar la información g visualización ideados y validados están disponibles, c sistemas de presentación e interacción de proteínas q interacción antígeno-anticuerpo, los más preferidos son sea de fagos, levaduras o ribosomas, después de una tra de presentación e interacción de proteínas está asociad

La presentación en fago se estableció por primera vez p de péptidos se logró en fagos filamentosos. Varios form en el espacio periplasmático de E. coli. Hay dos tipos de y el otro el sistema de presentación basado en fagémid del fago con el gen del anticuerpo insertado como fusión sistema de fagémidos consta de dos componentes: un fa del fago y el fago auxiliar, que ayuda el ensamblaje del fa comparación con el sistema de fagos, ya que el tamaño acomodar bibliotecas de gran tamaño. La diferencia prin de los anticuerpos. La presentación en los sistemas de fa la superficie, mientras que cada fago producido por un s en su superficie (presentación multivalente). Además, la usa para el efecto de avidez durante la selección contra nstante de la cadena ligera, las inmunoglobulinas también na ligera lambda. Como parte de la inmunidad adaptativa, oral a través de la secreción de anticuerpos específicos os. Las células B pueden sufrir un "cambio de clase" que mo se ejemplifica, el isotipo del anticuerpo puede cambiar r ejemplo, IgG1, IgG4, IgE). Durante este cambio, la región regiones variables de la cadena pesada permanecen sin rpo por su antígeno, pero sí altera las funciones efectoras de una enfermedad pueden variar desde la ausencia de otal de clases de inmunoglobulinas. Las enfermedades racterizan por deficiencias de isotipos específicos o texto del desarrollo de la cadena principal de la biblioteca Los anticuerpos IgG son los más comunes y abundantes s séricos, precisamente una razón crucial para que los ándose en su abundancia en suero, la IgG se ha clasificado e cuatro subgrupos, la IgG1 es la IgG más abundante con vesar la placenta fácilmente, la capacidad significativa de lta con el receptor Fc en los fagocitos y la vida media más esarrollar anticuerpos monoclonales terapéuticos.

n mediante el uso de la diversidad incorporada de genes extensión por superposición para preparar una biblioteca a que se combinaron dentro de un armazón seleccionado ersidad de anticuerpos producida con este proceso es istema inmunológico en un individuo, lo que significa que de anticuerpo con un mayor potencial terapéutico. Entre onocatenario (ScFv) o Fab se elaboraron mediante la ra mediante el uso de la PCR y la biblioteca combinatoria mostrarlos en la superficie de un fago o levadura.

eneración de bibliotecas de anticuerpos con una mayor ción de anticuerpos terapéuticos con mayor afinidad y cífico.

nticuerpos humanos son: a) estrategias no combinatorias ran mAb humanos de células B individuales con los pares estrategias combinatorias implican una biblioteca de inadas aleatoriamente. Ambos enfoques han dado lugar a s y fármacos (FDA) y la Agencia médica europea (EMA). cnología de hibridomas a la generación de mAb humanos ido un proceso lento y difícil debido al número limitado de do a la falta de su estabilidad genética. Por lo tanto, la para aplicaciones prácticas y no se ha convertido en una anos. Por el contrario, la extracción combinatoria de los Nm de células B en lugar de las células B que muestran genotipo (ADNc). El éxito de la selección de presentación ética junto con la proteína funcional. Varios métodos de o los sin células y los basados en células. Entre varios se han establecido como métodos de selección para la diante la presentación del anticuerpo en la superficie, ya cripción in vitro. Sin embargo, cada uno de estos sistemas n ventajas e inconvenientes respectivos.

Smith y colaboradores, en donde la expresión heteróloga s de anticuerpos pueden expresarse de manera eficiente temas de presentación en fago, uno es el vector de fagos El sistema de vector de fagos consta de todo el genoma n una proteína de la superficie del fago. Por otro lado, el ido que lleva la fusión proteína-anticuerpo de la superficie . El sistema de fagémidos tiene una ventaja importante en l vector más pequeño y la facilidad de clonación permiten l entre ambos sistemas radica en el nivel de presentación midos es monovalente y los anticuerpos se transportan en ma de vector de fagos lleva de 3-5 copias del anticuerpo esentación multivalente del sistema de vector de fagos se antígeno, mientras que la presentación monovalente del sistema de fagémidos se vincula con más rigurosidad o formatos de anticuerpo que se presentan en el fago, el q debido a la falta de cualquier modificación postraduccio presentación en fago es el método más aceptado debido de biblioteca, presentación monovalente y facilidad para con la presentación en fago existen limitaciones asociada trata de un sistema de expresión procariota y carece d anticuerpo presentados de esta manera. Por lo tanto, au robustez, así como también ciertas limitaciones, aún se usados para bibliotecas de anticuerpos combinatorios.

Por otro lado, la presentación de anticuerpos ScFv en la Boder y Wittrup en 1997, mientras que Feldhaus y colabor antígenos de grandes bibliotecas. A diferencia de la pres presentar con éxito en células de levaduras. La principal v compatibilidad con FACS, lo que permite seleccionar anti también pueden determinarse en paralelo parámetros co antígenos unidos o las reactividades cruzadas. Sin embarg de superficie de células eucariotas están restringidos por l en el tamaño que puede alcanzar la biblioteca.

Además, la metodología sin células incluye una transcrip concepto de presentación del ribosoma se introdujo por

lo establecieron y validaron como un método de selec visualización del ribosoma es técnicamente más desafian ribosómico. Por lo tanto, la característica clave de la prese de proteína-ribosoma-ARNm (PRM) a través del estanca el ARNm permanecen asociados. Hay dos estrategias d antibióticos para detener la traducción; ii) agotamiento del invita a los factores de liberación seguidos por el despre manera el complejo. Una de las principales ventajas de restricción de la transformación. Sin embargo, la limitación como ScFv.

Por lo tanto, cada uno de estos sistemas de presentación méritos y deméritos.

Desde mediados de la década de 1990, los anticuerpos Hasta ahora, 18 anticuerpos están aprobados con fines clínicos, que incluyen diversas áreas como enfermedad cardiovascular y enfermedades infecciosas. Al menos > encuentran en diversas etapas de desarrollo clínico. El ant establecida con una alta tasa de éxito: 29 % para anticue comparación con una tasa de éxito de ~11 % para fárm anticuerpos es bien tomada por humanos, aunque las re manejables.

Una resistencia clave de los anticuerpos como terapéutico mejorando sus propiedades existentes. Los anticuerpos tie ajustarse para mejorar su potencial clínico, tales como in funciones efectoras y otras actividades biológicas, farmaco la unión celular y propiedades biofísicas. Todos los anticu inmunogénicos. Generalmente, se ha visto que los pacien específica de anticuerpos de ratón cuando se admini aclaramiento, neutralización directa, inducción de enfer inmunogenicidad de los anticuerpos a menudo depende d los contaminantes agregados o mal plegados, de la heter de epítopos de células T. La inmunogenicidad de los antic clínicos, incluida la dosis, la vía y la frecuencia de ad enfermedad y el estado inmunológico, el haplotipo del MH

Un requisito previo para la terapia dirigida exige que los an una selectividad muy específica. El éxito al generar anticu relación de secuencia del antígeno en diferentes especie de generación de anticuerpos.

lección relacionada con la afinidad. Con respecto a los se presenta principalmente es ScFv o Fab; sin embargo, , la expresión de Ig de longitud completa es difícil. La facilidad de clonación, lo que permite grandes tamaños terminar varios parámetros de estabilidad. Sin embargo, n el plegamiento de proteínas adecuado debido a que se odificaciones postraduccionales de los fragmentos de e la presentación en fago tiene pocas ventajas, como la convertido en uno de los métodos de presentación más

perficie de la levadura se instituyó por primera vez por res demostraron su aplicabilidad para la selección contra tación en fago, las IgG de longitud completa se pueden taja de la plataforma de presentación en levaduras es su erpos contra antígenos que imitan la condición natural y los niveles de expresión de anticuerpos, el número de la levadura y de manera similar todos los demás sistemas ficiencia de transformación limitada que establece límites

n in vitro seguida de una presentación en ribosomas. El heakis y colaboradores mientras que Hanes y Plückthun n de fragmentos de anticuerpos ScFv. El método de debido a la inestabilidad relativa del ARN y el complejo ción del ribosoma es la generación de complejos estables nto del ribosoma, de manera que la proteína naciente y rentes que se usan para estabilizar el complejo i) usar ón de terminación para detener el ribosoma, ya que esto miento de la proteína naciente desestabilizando de esta e sistema es adaptarse al tamaño de la biblioteca sin la esta técnica es presentar una proteína de cadena única

teracción de proteínas está asociado con sus respectivos

rgieron como una nueva clase importante de fármacos. apéuticos en los Estados Unidos en diversos entornos inflamatorias crónicas, oncología, trasplantes, medicina 0 fármacos adicionales de anticuerpos terapéuticos se erpo terapéutico pertenece a una clase de fármacos bien s quiméricos y 25 % para anticuerpos humanizados en s de molécula pequeña. En general, la tolerancia a los iones a la primera dosis de infusión son comunes pero

que su potencial clínico puede incrementarse fácilmente n numerosas propiedades interdependientes que pueden ogenicidad, especificidad y afinidad de unión a antígeno, ética, arquitectura molecular, internalización después de os, incluidos los fármacos proteicos, son potencialmente comúnmente desarrollan una respuesta de anticuerpos an anticuerpos de ratón, tales como aceleración del dad del suero y prevención de dosis adicionales. La a estructura primaria de aminoácidos del anticuerpo o de eneidad en el conjunto de anticuerpos y de la presencia pos también está influenciada por multitud de parámetros istración y factores específicos del paciente, como la la medicación concomitante.

uerpos deban unirse típicamente a su antígeno diana con os de reacción cruzada de tales especies depende de la incluida la conservación del epítopo diana) y del método La tecnología de presentación de anticuerpos evita la i preferentemente, la selección directa para la reactividad c terapia incluye una alta afinidad como atributo clave. El a bloqueo estequiométrico de una proteína diana, por lo qu para una dosis determinada de fármaco. Es esencial co segmentos de la CDR que son más apropiados para las afinidad del anticuerpo por mutación, existen limitaciones generarse y probarse.

Muchas estrategias de construcción de bibliotecas, junto éxito para la maduración por afinidad de anticuerpos, co para aumentar la afinidad de un fragmento de anticuerp VIH-1 y un fragmento de anticuerpo monoclonal espe picomolar. Se observaron éxitos similares con el uso de bi de presentación de ribosomas y levaduras. Las mutacione de forma rutinaria y, a menudo, aumentan aún más la afi

Otros pocos atributos clave de los dominios variables biofísicas tales como estabilidad, solubilidad y cinética de de anticuerpos para la selección de fragmentos de ant seleccionan a la vez propiedades favorables como exp directa de propiedades biofísicas favorables puede logra reductores y de alta temperatura o proteasas.

Estados Unidos 2013/085072 A1 y Fortunato y otros ("U cientos de anticuerpos monoclonales: aplicación al Antíg núm. 11, 14 de noviembre de 2012, página e49535) des policlonales renovable específica para un antígeno diana, anticuerpos; seleccionar de la colección una población transferir la población seleccionada de clones de anticue una biblioteca de anticuerpos de presentación en lev presentación en levaduras una población de clones de le generar una población de anticuerpos policlonales específ de anticuerpos policlonales renovable específica para el

WO 03/029456 A1 describe unos vectores de present transferencia de presentación eucariota de presentaci polipéptidos multicaten arios complejos en la superficie energía de la tecnología de presentación en fago. Median eucariota de presentación en fago como se describió, los diversidad proporcionada por las bibliotecas de presenta expresión, procesamiento, ensamblaje y presentación eucariota multicatenaria antes mencionada.

Hutchings y otros ("Antibody engineering, Chapter 6, ENGINEERING, 1 de enero de 2001, páginas 93-108) humanos sin exposición previa al antígeno como Fab o vector fagémido. En D7, se describe la construcción de cebadores VH 5'y 3' están marcados con sitios de restric

Vinita Puri y otros "Highly efficient selection of epitope sorting", mAbs, vol. 5, núm. 4, 1 de julio de 2013, pá específicos de epítopo de una biblioteca de anticuerpo competitiva de bibliotecas de presentación en levaduras.

La presente descripción tiene como objetivo superar presentación. Las bibliotecas combinatorias, en compara número de genes VH y genes VL, en donde el número d recién formadas y podría exhibir una actividad de unión e de estas bibliotecas depende únicamente del tamaño fin Por lo tanto, la presente descripción tiene como objetiv diversa que sea capaz de acomodar una biblioteca de gra de generación de moléculas líderes contra dianas antigé

Declaración de la descripción

ucción de tolerancia inmunitaria y permite el cribado o, ada de especies. La aplicación exitosa de anticuerpos en ecto funcional de muchos anticuerpos está dictado por el na mayor afinidad permite una mayor duración del efecto ender los sesgos de composición de aminoácidos en los eracciones de antígenos de alta afinidad. Para mejorar la ácticas en el número de secuencias variantes que pueden

n varias tecnologías de presentación, se han usado con la presentación de una biblioteca de presentación en fago onoclonal específico de la glicoproteína 120 (gp120) del co de ERBB2 (HER2) desde el intervalo nanomolar al otecas de presentación en fago y con el uso de bibliotecas eparadas que aumentan la afinidad de unión se combinan ad de una manera aditiva o sinérgica.

los anticuerpos difieren ampliamente en propiedades gamiento. Mediante el uso de bibliotecas de presentación erpos con actividad de unión optimizada, a menudo se ión robusta, alta estabilidad y solubilidad. La selección mediante el uso de desnaturalizantes químicos, agentes

de la presentación en fago y levaduras para seleccionar 85, un biomarcador de tuberculosis", PLOS ONE, vol. 7, ben métodos para generar una población de anticuerpos ue comprenden: proporcionar una colección de clones de clones de anticuerpos que se unan al antígeno diana; s a un vector de presentación en levadura para generar ura; y seleccionar de la biblioteca de anticuerpos de ura que se unan específicamente al antígeno diana para s de la diana, para de esta manera generar una población ígeno diana.

ón eucariotas de cadenas múltiples. Dicho sistema de en fago comprende el avance técnico para presentar una célula eucariota hospedera para acoplarse con la el empleo de un sistema de transferencia de presentación fesionales pueden, por primera vez, combinar la inmensa n en fago y la tecnología de presentación en fago con la lular proporcionada por la tecnología de presentación

eneration of Naive Anti body Libraries", ANTIBODY scribe métodos para generar bibliotecas de anticuerpos Fv a partir de genes V reordenados naturalmente en un repertorio de VH sin exposición previa al antígeno. Los SfiI y XhoI para facilitar la clonación (Tabla 1).

ecific antibody through competitive yeast display library s 533-539 describe un método para aislar anticuerpos in exposición previa al antígeno mediante clasificación

limitaciones asociadas con diferentes plataformas de n con el enfoque no combinatorio, se derivan de un gran ombinaciones posibles podría dar lugar a combinaciones cífica de antígeno que es razonablemente fuerte. El éxito de la biblioteca, que debe ser lo suficientemente grande. crear una biblioteca de genes de anticuerpos altamente amaño, lo que puede mejorar de esta manera el potencial s.

En consecuencia, la presente descripción se refiere a exposición previa al antígeno que comprende procesar amplificación, agrupar los productos amplificados y clo biblioteca de anticuerpos en fago seguido de cribado de biblioteca de anticuerpos en fago tamizada o agrupar e anticuerpos directamente en levaduras para obtener un genes de anticuerpos en la superficie de la levadura; s antígeno(s) para obtener la biblioteca de anticuerpos en fago cribada de la biblioteca de fagos a la levadura para la de la levadura, seguido del cribado de los genes de anti para obtener la biblioteca de anticuerpos en levadura cr fagos o la levadura con propiedades funcionales desea previa al antígeno o aislar anticuerpos seleccionados

anticuerpos en fago o la biblioteca de anticuerpos en exposición previa al antígeno cribada; la presente descri exposición previa al antígeno obtenida mediante el méto secuencias de cebadores establecidas como cualquier cebadores se emplean para obtener la biblioteca de antic llevar a cabo el método anterior para generar/obtener la la presente descripción también se refiere a una bibliot anteriormente o que se obtiene mediante un método com enfermedades seleccionadas de un grupo que compr enfermedades infecciosas y trastornos metabólicos o c pronósticos; para fines de investigación; descubrimient aplicación donde se empleen anticuerpos o derivados de

Breve descripción de las figuras adjuntas

Las características de la presente descripción resultarán tomada junto con las figuras adjuntas. En la comprensión acuerdo con la invención y no deben considerarse limitan mediante el uso de las figuras adjuntas:

Figura 1 ilustra Regiones de recolección de las muestr hablados.

Figura 2 ilustra el análisis de PBMC mediante el uso de

Figura 3 ilustra la amplificación por PCR primaria de fami

Figura 4 ilustra la amplificación por PCR secundaria de f

Figura 5 ilustra el análisis del conjunto de la PCR a part cadena ligera Kappa, (B) Genes de cadena ligera Lambd

Figura 6 ilustra la digestión por restricción de vectores e i B. Digestión del vector Kappa, C. Digestión de la agrupac

Figura 7 ilustra el análisis de clones independientes de la HindIII - HF y enzimas de AscI y se procesan en gel de a

Figura 8 ilustra la digestión por restricción con NcoI y biblioteca Kappa y (B) biblioteca Lambda y se procesan e

Figura 9 ilustra el análisis de digestión por restricción de confirmar la inserción de cadenas ligeras Kappa, B. Dige pesada.

Figura 10 ilustra el análisis de la digestión por restricció para confirmar la inserción de cadenas ligeras Lambda, cadena pesada.

Figura 11 ilustra la corrección de la secuencia de las bibl pesadas, (B) Bibliotecas de cadenas Kappa y Lambda.

Figura 12 ilustran el ensayo de placa de la biblioteca de método para generar una biblioteca de anticuerpos sin estras biológicas para aislar ácidos nucleicos seguido de r los genes de anticuerpos en fagos para obtener una genes presentados contra antígeno(s) para obtener una roducto o productos amplificados y clonar los genes de iblioteca de anticuerpos en levaduras que presenta los ido del cribado de los genes presentados contra el(los) vadura cribada, transferir la biblioteca de anticuerpos en sentación de dichos genes de anticuerpos en la superficie rpos presentados en levadura contra el(los) antígeno(s) da, y seleccionar los anticuerpos/genes presentados en que forman la biblioteca de anticuerpos sin exposición propiedades funcionales deseadas de la biblioteca de vadura para generar una biblioteca de anticuerpos sin ón también se refiere a una biblioteca de anticuerpos sin anterior; la presente descripción también se refiere a las e las SEQ ID NO 1 a 68 en donde las secuencias de rpos sin exposición previa al antígeno como antes o para lioteca de anticuerpos sin exposición previa al antígeno; y de anticuerpos sin exposición previa al antígeno como l anterior para el uso en la terapia para el tratamiento de e cáncer, artritis reumatoide, trastornos neurológicos, lquiera de sus combinaciones; como diagnóstico; como e dianas; validación en genómica funcional o cualquier ticuerpos.

pletamente evidentes a partir de la siguiente descripción e que las figuras representan solo varias modalidades de de su alcance, la invención se describirá con más detalle

Se muestran las ubicaciones geográficas y los idiomas

citómetro de flujo.

s de genes de anticuerpos a partir de ADNc de PBMC.

ilias de genes de anticuerpos.

e genes de anticuerpos. (A) Genes de cadena pesada y

erciones. A. Digestión de la agrupación de clones Kappa, de clones Lambda, D. Digestión del vector Lambda.

blioteca Kappa y la biblioteca Lambda mediante el uso de osa al 1%.

aI para clonar el conjunto de cadenas pesadas en (A) el de agarosa al 1 %.

ones independientes A. Digestión con HindIII y AscI para n con NcoI y XbaI para confirmar la inserción de cadena

e clones independientes A. Digestión con HindIII y AscI Digestión con NcoI y XbaI para confirmar la inserción de

ecas de genes de anticuerpos. (A) Biblioteca de cadenas

es de anticuerpos.

Figura 13 ilustra la estimación de la eficiencia de conju flujo.

Figura 14 ilustra el ensayo de placa de la biblioteca de g

Figura 15 ilustra la amplificación por PCR de la cadena cadenas ligeras lambda del anticuerpo a partir del ADN d

Figura 16 ilustra la digestión con enzimas de restricción d la clonación en el sistema de expresión de levadura.

Figura 17 ilustra la digestión con enzimas de restricción la clonación en el sistema de expresión de levadura.

Figura 18 ilustra el análisis de citometría de flujo para co

Figura 19 ilustra la presentación en la superficie de la l expresan Fab anti Her2. (A) Células de levadura no ind levadura inducidas durante 24 horas que muestran Fab A la clasificación inicial, se cultivan y se repite la clasificació

Figura 20 ilustra la amplificación por PCR de la cadena después de la clasificación por citometría de flujo

Figura 21 ilustra un anticuerpo de superficie de levadura TEV y es usado en ELISA con el antígeno Her 2. El panel derecho indica células de levadura inducidas. La proteasa de cultivo correspondiente de 1 mL, 2 mL y 4 mL. De anticuerpo se diluye y se lleva a cabo un ELISA. Los da 1000 veces.

Figura 22 ilustra un anticuerpo presentado en la superfi con la proteasa de TEV y se usa en un estudio de afinida en concentraciones de 1 U a 10 U en el volumen de culti

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de cualquier otra manera en la pre en relación con la presente descripción tendrán los signifi técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de plural y los términos en plural incluirán el singular como s diversas permutaciones de singular/plural se pueden descripción por motivos de claridad. Generalmente, la biotecnología, inmunología, biología molecular y celular y descripción son bien conocidas y comúnmente usadas descripción, incluidas las definiciones.

Además, los métodos, la preparación y el uso de la bibliote emplean, a menos que se indique de otra forma, técnicas computacional, cultivo celular, tecnología de ADN recombi afines. Estas técnicas, sus principios y requerimientos se la técnica.

Antes de que se revele y se describa el método de gener antígeno y los ácidos nucleicos que componen la bibliot de las modalidades de la presente descripción, debe descripción tienen el fin de describir solo modalidades pa tal como se usa en esta descripción y las reivindicaciones referentes en plural a menos que el contexto claramente

Como se usa en la presente descripción, los términos " esta descripción con relación al producto de la descri secuencias de ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente descripción, los términos contexto de la presente descripción significa combinar l ión de microesferas magnéticas mediante citometría de

s de anticuerpos después de una ronda de tamizaje.

ada del anticuerpo, la cadena kappa del anticuerpo y las ago.

ragmentos de cadena pesada de anticuerpos después de

fragmentos de cadena ligera de anticuerpos después de

mar la expresión de Fab del anticuerpo.

dura - Clasificación de flujo de células de levadura que idas que no muestran expresión de Fab, (B) Células de Her2, (C) Las células de levadura se recogen después de de flujo después de 24 horas de inducción

sada y la cadena ligera de células de levadura diploides

e se aísla mediante el uso de la división de la proteasa de quierdo indica células de levadura no inducidas y el panel V se usa en concentraciones de 1 U a 10 U en el volumen és de la digestión con TEV, la mezcla que contiene el representan muestras sin diluir hasta muestras diluidas

de levadura que se aísla mediante el uso de la escisión IACORE con el antígeno Her 2. La proteasa TEV se usa correspondiente de 1 ml y 5 ml.

nte descripción, los términos científicos y técnicos usados dos que se entienden comúnmente por los expertos en la alquier otra manera, los términos en singular incluirán el onsidere apropiado para el contexto y/o la aplicación. Las tablecer expresamente más adelante en la presente nomenclaturas usadas en relación con las técnicas de tecnología de ADN recombinante descritas en la presente la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá la presente

de anticuerpos sin exposición previa al antígeno descritos nvencionales en biología molecular, bioquímica, química nte, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y campos plican en la bibliografía y son conocidas por un experto en

ón de la biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al de anticuerpos sin exposición previa al antígeno y otras tenderse que las terminologías usadas en la presente ulares y no pretenden ser limitantes. Debe señalarse que, juntas, las formas singulares "un," "una" y "el/la" incluyen ndique de otra manera.

lioteca" y "bibliotecas" se usan indistintamente dentro de ón. Además, se refiere a una colección o conjunto de

rupación', 'agrupada', 'agrupación', 'agrupaciones' en el muestras/secuencias de ácidos nucleicos/fragmentos de ácidos nucleicos/clones de genes/producto amplificado/ descripción de múltiples donantes, es decir, más de un d Como se usa en la presente descripción, el término "PB tiene un núcleo redondo que consiste de linfocitos (célula y granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos).

Como se usa en la presente descripción, el término "Div genéticas para una población con variaciones de alelos. Como se usa en la presente descripción, el término "etni las similitudes observadas en una sociedad en la que viv Como se usa en la presente descripción, el término "Antíg respuesta inmunitaria en el cuerpo.

Como se usa en la presente descripción, el término "antic de fuentes naturales o producirse sintéticamente, en "inmunoglobulina" se usan como sinónimos a lo largo d manera.

Como se usa en la presente descripción, el término monoclonales como policlonales y también incluye lo si F(ab')2 y F(ab), moléculas Fv, moléculas Fv monocatenari minicuerpos, moléculas de anticuerpos monoclonales h comprenden la región Fc de anticuerpo y cualquier fra moléculas derivadas retienen la funcionalidad inmunológi Como se usa en la presente descripción, el término "anti una composición de anticuerpos que tiene una población especie o fuente del anticuerpo ni a la manera en la que así como también fragmentos como Fab, F(ab')2, Fv y otr homogéneos quiméricos y humanizados que exhiben pro monoclonal parental.

Como se usa en la presente descripción, "fragmento de conserva la capacidad de exhibir actividad de unión a an de anticuerpos con mención específica.

Como se usa en la presente descripción, "Biblioteca de plataformas que expresan anticuerpos en la superficie de de proyección contra antígenos diana. En la presente des de presentación en levaduras se usan con una especif manera.

Como se usa en la presente descripción, el término "bi colección de secuencias de ácidos nucleicos que codific inmunizada.

Como se usa en la presente descripción, el término "VH anticuerpo del tipo que se puede encontrar en mamífero las mismas; en consecuencia, puede entenderse VH sin Como se usa en la presente descripción, el término "VL" anticuerpo; se encuentran en dos tipos basados en la kappa) y Vl (región constante lambda) se entienden en c Como se usa en la presente descripción, el término "CDR" de la estructura del anticuerpo.

Como se usa en la presente descripción, el término "reper Como se usa en la presente descripción, el término "regi las regiones de secuencias de ácidos nucleicos de estructurales de la molécula.

icuerpos obtenidos al emplear el método de la presente nte.

" se refiere a cualquier célula sanguínea periférica que , células B, células NK) y monocitos, eritrocitos, plaquetas

dad Genética" significa el número total de características

ignifica un estado heredado de una población basado en persona.

o" se refiere a cualquier sustancia extraña que induce una

po" se refiere a una inmunoglobulina que puede derivarse u totalidad o en parte. Los términos "anticuerpo" e a descripción a menos que se indique de cualquier otra

nticuerpo" incluye preparaciones de anticuerpos tanto iente: Moléculas de anticuerpos quiméricos, fragmentos (ScFv), fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos, nizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que ento funcional que surja de estas moléculas, donde las de la molécula de anticuerpo parental.

rpo monoclonal" en la presente descripción, se refiere a e anticuerpos homogénea. El anticuerpo no se limita a la produce. El término abarca inmunoglobulinas completas ragmentos, así como también poblaciones de anticuerpos ades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo

ticuerpo" es una porción de un anticuerpo completo que eno. Los términos Fab o ScFv se usan como fragmentos

sentación de anticuerpos" se refiere a una plataforma o célula o libre de células adecuadas para una metodología pción, la biblioteca de presentación en fago y la biblioteca ción precisa a menos que se indique de cualquier otra

teca sin exposición previa al antígeno" se refiere a una un repertorio de VH de origen natural de una fuente no

e refiere al dominio variable de cadena pesada única del esprovistos naturalmente de cadenas ligeras o partes de osición previa al antígeno.

refiere a un dominio variable de cadena ligera simple del uencia de dominio constante. Vk (con región constante ecuencia.

refiere a una región determinante de complementariedad

io" significa una colección, que indica diversidad genética. marco" se usa en la presente descripción para referirse a molécula de anticuerpo que codifican los elementos Como se usa en la presente descripción, el término "Ag proteína de anclaje que presenta el anticuerpo de interés

Como se usa en la presente descripción, "Célula B" se re funciona en el componente de inmunidad humoral d anticuerpos.

Como se usa en la presente descripción, "Célula B sin e de célula B que no ha sido expuesta a un antígeno.

Como se usa en la presente descripción, el término instrucciones genéticas de por vida.

Como se usa en la presente descripción, el término "A funciones biológicas tales como codificación, decodificaci

Como se usa en la presente descripción, el término "ARN información genética desde el ADN al ribosoma para su t

Como se usa en la presente descripción, el término "AD patrón de ARN monocatenario (por ejemplo, ARN men catalizada por la enzima transcriptasa inversa.

Como se usa en la presente descripción, la abreviatura que está involucrado en la glucólisis y se conoce como como control interno en experimentos.

Como se usa en la presente descripción, el término "trans y usada para generar ADN complementario (ADNc) a parti inversa.

Como se usa en la presente descripción, el término "In actúan como una parte crítica de la respuesta inmun particulares.

Como se usa en la presente descripción, el término "PC técnica de biología molecular que se usa para amplifi apropiados.

Como se usa en la presente descripción, el término "Ce iniciar la síntesis de ADN.

Como se usa en la presente descripción, "Cebador oligonucleótidos en las que algunas posiciones contien cebadores con secuencias similares que cubren todas las de proteína/anticuerpo dada. Más específicamente, los c en las tablas 4 y 5 y las secuencias de cebadores únic listado de secuencias indicadas como identidad de secu Dichas secuencias incorporan una secuencia de trinucle se generan sintéticamente y no son complementarias d naturaleza, también se denominan secuencias artificiales

Como se usa en la presente descripción, "vector" se re expresión para acomodar genes de anticuerpos en d fagémidos (aplicables al sistema de presentación en f presentación en levaduras) se entienden en consecuenci

Como se usa en la presente descripción, el término "Fagé puede replicarse como un plásmido y también empaqu fagémido se usa para acomodar el repertorio completo d las bacterias, se requieren proteínas adicionales proporci proyecten la proteína recombinante.

Como se usa en la presente descripción, el término "Fag amplifica.

" se refiere a una proteína de levadura usada como una la superficie de la levadura.

re a un tipo de glóbulo blanco del subtipo de linfocitos que sistema inmune adaptativo mediante la secreción de

sición previa al antígeno" menciona un subtipo específico

ADN" significa ácido desoxirribonucleico que lleva las

" se refiere a un ácido ribonucleico implicado en varias , regulación y expresión de genes.

significa una familia de moléculas de ARN que transportan ucción.

se refiere a un ADN bicatenario sintetizado a partir de un jero (ARNm) o microARN (microARN)) en una reacción

APDH" significa gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa n de mantenimiento, razón por la cual se usa a menudo

tasa inversa" se refiere a una enzima unida a un retrovirus e un patrón de ARN, un proceso denominado transcripción

noglobulina" se refiere a moléculas de glicoproteína que ria al reconocer y unirse específicamente a antígenos

se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa, una un segmento de ADN mediante el uso de cebadores

or" se refiere a un fragmento corto de ADN o ARN para

undante" se refiere a una mezcla de secuencias de un número de bases posibles, dando una población de mbinaciones de nucleótidos posibles para una secuencia dores empleados en la presente descripción se exponen generadas sintéticamente se capturan en la sección de ia separadas desde la SEQ ID NO 1 a la SEQ ID NO 68. o única en ellas. Como dichas secuencias de cebadores s secuencias de genes nativos que se encuentran en la

e a un ADN relacionado con un sistema de clonación o ignados sitios de restricción específicos. Los vectores ) o los vectores de levadura (aplicables al sistema de

o" se refiere a un sistema de expresión de ADN en donde rse como ADN monocatenario en partículas virales. El nes de anticuerpos en donde, después de la infección de adas por el fago auxiliar para crear partículas de fago que

significa una partícula de virus que infecta bacterias y se Como se usa en la presente descripción, "Fago Auxiliar" todas las proteínas/materiales necesarios para producir p

Como se usa en la presente descripción, el término "Plac bacterias debido a la destrucción celular.

Como se usa en la presente descripción, "Amplificación d

Como se usa en la presente descripción, el término "Cri selecciona los aglutinantes contra una diana/antígeno es

Como se usa en la presente descripción, "ADN de esper bajo peso molecular aislado de la esperma de salmón qu

Como se usa en la presente descripción, "ADNss" se refi

La presente descripción se refiere a un método para ge antígeno que comprende procesamiento de muestras biol agrupación de los productos amplificados y clonación de de anticuerpos en fago seguida de un cribado de los gene de anticuerpos en fago tamizada o una agrupación de los directamente en levadura para obtener una biblioteca anticuerpos en la superficie de la levadura; seguido de obtener una biblioteca de anticuerpos en levadura cribad la biblioteca de fagos a la levadura para la presentación d seguido del cribado de los genes de anticuerpos pres biblioteca de anticuerpos cribada en levadura, y la sele levaduras con las propiedades funcionales deseadas que antígeno o el aislamiento de anticuerpos seleccionados c anticuerpos en fago o la biblioteca de anticuerpos en leva previa al antígeno cribados.

En una modalidad, la muestra biológica se selecciona d exprese genes de anticuerpos.

En otra modalidad, la muestra biológica se obtiene de s de selección se basa en la diversidad en el idioma hablad y en donde los sujetos son humanos.

En otra modalidad más, el procesamiento de la muestr periférica seleccionadas de un grupo que comprende linf sus combinaciones a partir de la muestra de sangre s exposición previa al antígeno mediante citometría de flujo

En aún otra modalidad, la estimación de la población de identificar la expresión diferencial de marcadores de la s que comprende IgD, CD20, CD19, CD27, CD24 y CD38 población de células B sin exposición previa al antígeno

En aún otra modalidad, el aislamiento de los ácidos generación de ADNc.

En aún otra modalidad, la amplificación implica una ampl PCR secundaria mediante el empleo de cualquiera de lo como la SEQ ID NO 1 a 68.

En aún otra modalidad, la amplificación por PCR se lleva ciclo con una etapa de desnaturalización durante 1 minut seguido de una etapa de hibridación durante 1 minuto a a etapa de extensión durante 50 segundos a aproximadam productos de PCR obtenidos después de la amplificación

En aún otra modalidad, la clonación en fago o directame anticuerpo seguida de la clonación de la cadena pesada de aproximadamente 108 a 1010, preferentemente 108; y de partículas de fagos en la biblioteca en el intervalo de refiere a una partícula de fago específica que suministra ículas funcionales de fago.

se refiere a una estructura visible formada en la grama de

agos" se refiere al crecimiento de partículas de fagos.

o" se refiere a una técnica de selección por afinidad que ífico.

de salmón" se refiere a un ácido desoxirribonucleico de yuda a la precipitación del ADN del fago.

a ADN monocatenario.

ar una biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al icas para aislar ácidos nucleicos seguido de amplificación, nes de anticuerpos en fagos para obtener una biblioteca resentados frente a antígenos para obtener una biblioteca ductos amplificados y clonación de genes de anticuerpos anticuerpos en levadura que presente los genes de cribado de los genes presentados contra antígenos para ransferir la biblioteca de anticuerpos en fago tamizada de ichos genes de anticuerpos en la superficie de la levadura, ados por la levadura contra antígenos para obtener la n de los genes/anticuerpos presentados en los fagos o rman la biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al las propiedades funcionales deseadas de la biblioteca de a para generar la biblioteca de anticuerpos sin exposición

n grupo que comprende sangre o cualquier muestra que

tos o donantes sanos seleccionados, en donde el criterio tnia o ubicación geográfica de dichos sujetos o donantes;

iológica implica aislar células mononucleares de sangre itos, monocitos, plaquetas y granulocitos o cualquiera de uido de la estimación de la población de células B sin

ulas B sin exposición previa al antígeno se lleva a cabo al erficie celular o intracelulares seleccionados de un grupo alquiera de sus combinaciones; y en donde se obtiene la 10 % a aproximadamente el 15 % de las PBMC totales.

leicos incluye el aislamiento de ARNm, seguido de la

ación por PCR primaria seguida de una amplificación por ebadores redundantes o de sus combinaciones indicados

abo durante 18 ciclos a aproximadamente 25 ciclos, cada a aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 94 °C ximadamente 2 minutos a aproximadamente 50 °C y una e 90 segundos a aproximadamente 72 °C; y en donde los purifican opcionalmente.

en levadura implica la clonación de la cadena ligera del l anticuerpo, ambas con una eficiencia de transformación donde la clonación en fago produce un número estimado 0 a aproximadamente 1011 pfu/mL.

En aún otra modalidad, la proyección para obtener la bibli sobre microesferas magnéticas para aislar el anticuerpo d en fago se emplea para eliminar los anticuerpos no agluti

En aún otra modalidad, el formato de anticuerpo se selec

En aún otra modalidad, el cribado para obtener la bibliot lleva a cabo mediante el empleo de epítopos antigénicos secuencias y motivos de secuencia o cualquiera de sus c el uso de sitios de escisión de proteasa seleccionados d (TEV), enteroquinasa, trombina, factor X a, proteasa

cualquiera de sus combinaciones.

En aún otra modalidad, la presentación de la biblioteca aislamiento de ADN plasmídico de la biblioteca de f transformación en células de levadura haploides o en cél células de levadura haploides.

En aún otra modalidad, la transferencia se realiza median con una eficiencia de transformación de 108 a aproximad

En aún otra modalidad, la proyección de la presentación afinidad, al clasificar los anticuerpos aglutinantes.

En aún otra modalidad, los anticuerpos/genes se sele técnicas/tecnologías seleccionadas de un grupo que com basadas en microesferas, formación de imágenes y SPR

En aún otra modalidad, la biblioteca de anticuerpos anticuerpos/genes expresados en la superficie del fago aislados del fago o la levadura o una de sus combinacio previa al antígeno comprende de 107 a aproximadamente

La presente descripción también se refiere a una bibliotec mediante el método anterior.

La presente descripción también se refiere a las secuenc NO 1 a 68 en donde las secuencias del cebador se empl previa al antígeno como anteriormente o llevar a cabo el m de anticuerpos sin exposición previa al antígeno.

En una modalidad de la presente descripción, las secue catalogar genes de anticuerpos de ubicaciones geogr anticuerpos hasta la agrupación de genes de anticuerpos

La presente descripción también se refiere a una bibliot anteriormente o como se obtiene mediante el método enfermedades seleccionadas de un grupo que compr enfermedades infecciosas y trastornos metabólicos o c pronósticos; para fines de investigación; descubrimiento aplicación donde se empleen anticuerpos o derivados de

La presente descripción se refiere a un método para ge biblioteca de expresión génica de anticuerpos humano anticuerpos humanos sin exposición previa al antígeno derivadas de un repertorio de anticuerpos naturales qu sanas y genéticamente diversas.

En una modalidad ilustrativa, se emplean herramientas co y tecnología de presentación en levadura en el presente modalidad, el método emplea tecnología de presentac presentación en levadura para crear una biblioteca de exp al antígeno.

En una modalidad no limitante de la presente descripción sin exposición previa al antígeno permite el aislamiento a de fagos implica el tamizaje con antígenos revestidos erés; y en donde dicho cribado/tamizaje de presentación es.

a de un grupo que comprende Fab o ScFv.

de levaduras mediante la presentación en superficie se petidores, conformación de paratopos de anticuerpos, inaciones para aislar la molécula Fab o ScFv mediante grupo que comprende el virus del grabado del tabaco 3C y proteínas de escisión de proteasa similares o

anticuerpos en la superficie de la levadura implica el s seguido de digestión por restricción, clonación y de levadura diploides mediante el apareamiento de dos

transformación de los genes proyectados en levadura, nte 1010.

vadura se emplea para ejecutar la selección basada en

nan basados en su unión con antígenos empleando de citometría de flujo, ELISA, plataformas de detección alquiera de sus combinaciones.

exposición previa al antígeno es una colección de la levadura, o es una colección de anticuerpos/genes y en donde la biblioteca de anticuerpos sin exposición clones.

anticuerpos sin exposición previa al antígeno obtenida

del cebador expuestas como cualquiera de las SEQ ID para obtener la biblioteca de anticuerpos sin exposición o como anteriormente para generar/obtener la biblioteca

s abarcan etiquetas de secuencia de trinucleótido para s respectivas, lo que permite rastrear los genes de inal.

de anticuerpos sin exposición previa al antígeno como ior para su uso en terapéutica para el tratamiento de cáncer, artritis reumatoide, trastornos neurológicos, uiera de sus combinaciones; como diagnóstico; como dianas; validación en genómica funcional o cualquier cuerpos.

r una biblioteca de anticuerpos que no se limita a una in exposición previa al antígeno. Dicha biblioteca de prende un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos mprende inmunidad humoral de poblaciones humanas

atorias que incluyen tecnología de presentación en fago do para generar una biblioteca de anticuerpos. En otra en fago seguida secuencialmente por tecnología de n génica de anticuerpos humanos sin exposición previa

biblioteca de expresión génica de anticuerpos humanos moléculas de anticuerpos únicas con las propiedades funcionales deseadas para un objetivo terapéutico espe humanos sin exposición previa al antígeno en la presen ácidos nucleicos de anticuerpos agrupadas que se prepa

En una modalidad no limitante de la presente descripció se seleccionan de un grupo que comprende, pero no s generación de nuevos epítopos, estabilidad térmica, an cualquiera de sus combinaciones. Dichas propiedade inherentes de la biblioteca de anticuerpos sin exposició presente descripción. Existe el alcance de mejorar aún m

En una modalidad no limitante de la presente descripció de anticuerpos sin exposición previa al antígeno incluye l en función de perfiles genéticamente diversos o criterios d origen étnico, ubicación geográfica, etc.

En otra modalidad no limitante de la presente descripció de anticuerpos humanos sin exposición previa al antíg muestras biológicas tales como muestras de sangre de c diversa composición genética. Las muestras biológicas ta que exprese genes de anticuerpos.

En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, s que se identifican en función de criterios de inclusi predominantes.

En otra modalidad no limitante de la presente descripció de anticuerpos sin exposición previa al antígeno incluye grupo de clones de genes mediante el uso de dos her presentación en fago y 2) una tecnología de presentación aprovechar un conjunto mayor de diversidad de genes d Los clones de anticuerpos después se criban a través del de levadura para la expresión de genes de anticuerpos plegamiento apropiado de las proteínas eucariotas de los la expresión de levadura permite una interacción apr información obtenida mediante el uso de estos dos siste anticuerpos específicos a un antígeno) con una mayor ta

Las estrategias de cribado y perfil de expresión adoptad entre plataformas de presentación en fago y levaduras. L (-1 011) para el cribado primario que se centra en el rigo un formato de alto rendimiento, mientras que las mol aleatorización para imitar la presentación nativa a travé contribuye de forma combinatoria al proceso de desarroll estructuralmente variados. El proceso de múltiples rond antígenos a través de dos sistemas de presentación dife o negativamente un intervalo de propiedades de anticu especificidad, capacidad de fabricación, nuevos epítopos de anticuerpos, actividad catalítica, etc. El presente mét capaz de identificar moléculas únicas contra dianas antigé sin exposición previa al antígeno humanos con alta diver de nuevos anticuerpos y un mayor desarrollo comercial.

En otra modalidad no limitante de la presente descripción diversidad se traduce entre dos plataformas y se explo como, pero sin limitarse a, moléculas de anticuerpos qui ScFv, ScFab, fragmentos de anticuerpos diméricos y trim humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusió fragmento funcional que surja de estas moléculas d inmunológica de la molécula de anticuerpo parental y tod

En una modalidad ilustrativa, el término "anticuerpo

composición de anticuerpos que tiene una población de a o fuente del anticuerpo ni a la manera en la que se produ también fragmentos como Fab, F(ab')2, Fv y otros fr co, es decir, un antígeno. Una biblioteca de anticuerpos descripción se refiere a una colección de secuencias de empleando el método como se detalla en la descripción.

as propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos ita a, afinidad, especificidad, capacidad de fabricación, nicidad, solubilidad, agregación y catalítica actividad, o funcionales son extensiones naturales o propiedades revia al antígeno generada empleando el método de la dichas propiedades.

l método para generar la biblioteca de expresión génica entificación de múltiples donantes sanos que se clasifican clusión/exclusión, tales como, pero sin limitarse al idioma,

el método para generar la biblioteca de expresión génica , incluye aislar genes de expresión de anticuerpos de donante individual para crear una biblioteca de genes de ién pueden incluir bazo, médula ósea o cualquier muestra

ecogen muestras de sangre de donantes de sangre sanos exclusión siguiendo las normas éticas y regulatorias

el método para generar la biblioteca de expresión génica xplorar secuencialmente los perfiles de expresión de un ientas de exploración separadas, 1) una tecnología de levadura. El uso secuencial de estas tecnologías permite nticuerpos, un carácter de la biblioteca basada en fagos. stema de presentación en levadura. El uso de un sistema ventajoso debido a la traducción, el procesamiento y el roductos de anticuerpos en la superficie celular. Además, ada con dianas antigénicas con alta especificidad. La s complementarios genera "moléculas líderes" (es decir, de éxito en términos de potencial de comercialización.

en la presente descripción permiten transitar fácilmente resentación en fago se adapta al tamaño de la biblioteca la especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno en las cribadas pasarían nuevamente por un proceso de e la plataforma de levadura. Por tanto, cada plataforma e restos de anticuerpos funcionalmente específicos pero de selección en un antígeno o en células que expresan tes es extremadamente valioso para seleccionar positiva os deseadas, tales como, pero sin limitarse a, afinidad, stabilidad térmica, antigenicidad, solubilidad, agregación permite preservar la diversidad en la biblioteca que es as variadas. La generación de la biblioteca de anticuerpos ad sirve como un recurso tremendo para la identificación

metodología también implica una estrategia en donde la como varios formatos de anticuerpos modificados, tales icos, Fab, fragmentos, fragmentos F(ab')2, moléculas Fv, os, minicuerpos, moléculas de anticuerpos monoclonales que comprenden la región Fc del anticuerpo, cualquier e las moléculas derivadas retengan la funcionalidad los demás formatos de anticuerpos.

oclonal" en la presente descripción, se refiere a una uerpos homogénea. El anticuerpo no se limita a la especie El término abarca inmunoglobulinas completas así como entos, así como también poblaciones de anticuerpos homogéneos quiméricos y humanizados que exhiben pro monoclonal parental.

En aún otra modalidad no limitante, las moléculas de ant se optimizan aún más a través de un diseño racional anticuerpo-antígeno. El proceso de desarrollo de fárma desafiante, lento y costoso. Se requieren varios enfoque forman colectivamente la base del diseño racional de fár fabricación de fármacos de anticuerpos monoclonales so y/o correlacionadas tales como solubilidad, agregación, a son dependientes de diferentes motivos estructurales de silico. Como se ejemplifica, el diseño de fármacos basad más rápido, ha contribuido enormemente en el campo de a los fármacos, las enfermedades neurológicas, por men la presente descripción para mejorar la construcción de l moléculas seleccionadas.

En aún otra modalidad no limitante, el método de la p basadas en el tipo de apareamiento de levadura, una car que permite la generación de bibliotecas más grandes (S vectores de levadura separados y también es susceptible

En conjunto, el método de la presente descripción se c tienen como objetivo una generación/utilización más efica sin exposición previa al antígeno permite la selecció especificidad y afinidad. Debido a su diseño, esta técnic mAb seleccionados lo que facilita los estudios sobre los m de investigación traslacional que abarcan dicha biblioteca

En una modalidad no limitante de la presente descripción de biblioteca más grande y la diversidad en la composici para lograr un mejoramiento en la afinidad y especificida

En una modalidad no limitante de la presente descri anticuerpos sin exposición previa al antígeno permite propiedades funcionales deseadas para un objetivo tera dicha categoría de biblioteca es tener una amplia variedad por el mecanismo de tolerancia y se cree que recubren c

El presente método de generación o desarrollo de la b antígeno se expone en el diagrama de flujo más abajo.

ades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo

erpo candidatas obtenidas mediante el presente método ado por estudios de estructura-función de interacciones s, especialmente fármacos basados en anticuerpos, es ultidisciplinarios para hacer frente a estos desafíos que cos. El requisito previo para el éxito de la capacidad de dependientes de una variedad de propiedades biológicas genicidad, estabilidad, etc. Muchas de estas propiedades nticuerpo; que podría predecirse a través de enfoques in n la estructura que es racional, basado en la evidencia y quimioterapia contra el cáncer, las infecciones resistentes nar algunos. El resultado de estos métodos se emplea en iblioteca de anticuerpos y la capacidad de fabricación de

ente descripción también implica incorporar estrategias terística del ciclo de vida haploide/diploide de la levadura o Fab o anticuerpo completo) en levadura a partir de dos aleatorización de cadenas para mejorar la afinidad.

aliza en torno a técnicas de biblioteca combinatoria que el repertorio de anticuerpos. La biblioteca de anticuerpos in vitro de mAb humanos de prácticamente cualquier permite análisis tanto genéticos como funcionales de los anismos del sistema inmunológico humano. Los enfoques ueden converger en nuevas terapias futuras.

e sospecha que las características tales como un tamaño genética de los donantes están directamente vinculadas e anticuerpos.

n, la biblioteca de anticuerpos como la biblioteca de islamiento de moléculas de anticuerpos únicas con las tico específico, es decir, un antígeno. La singularidad de anticuerpos que no se eliminan del sistema inmunológico quier posible antígeno.

ioteca de anticuerpos humanos sin exposición previa al

La respuesta inmunitaria humoral reconoce nuevas su repertorio de posibles compañeros de unión, es decir, a aislaron de una biblioteca combinatoria de anticuerp anticuerpos, los agentes de reconocimiento molecular h proteína-antígeno que varía drásticamente entre molécul un nuevo antígeno. Por lo tanto, la diversidad del repertori complementario específico. Bajo tales circunstancias sele de reconocimiento del repertorio de anticuerpos juega u Los paratopos de anticuerpos se encuentran en la región en donde cada cadena contribuye tres vueltas a

determinantes de complementariedad (CDR). El repert contra el antígeno) dentro de las células B contiene potencialmente una variedad de antígenos; esta serie pu al antígeno" o no inmune de genes reordenados, recolect humanos no inmunizados, aislados de linfocitos de san diseñado exclusivamente, la plataforma de presentación una gran diversidad de anticuerpos que aún no han enco de "línea germinal" dependerá en gran medida de la fuen

El presente método para generar una biblioteca de antic contra antígeno(s) comprende los actos/etapas de:

a) aislar PBMC de la sangre de múltiples donantes;

b) procesar las PBMC para obtener ARN (ARNm) seguid

c) agrupar el producto amplificado (genes de anticuerpo una biblioteca sin exposición previa al antígeno de fagos o contra antígenos;

d) transferir/clonar el producto cribado de la etapa c) en contra antígenos; y

e) seleccionar anticuerpos con propiedades funcionales

En una modalidad preferida de la presente descripción, e humanos sin exposición previa al antígeno comprend poblaciones de donantes sanos en función de perfiles muestras de sangre de donantes recogidas. Posteriorm (ARNm) seguido de la generación de ADNc y la amplific mediante el empleo de cebadores redundantes. Los frag en vectores de fagos y/o levadura, seguido de la realiza bibliotecas contra dianas de antígenos específicos. A co vectores de levadura y se realiza de una a aproximad específicas. Se aíslan las poblaciones específicas que características de anticuerpo deseadas, se separan lo obtenidas a partir de ellos para seleccionar una molécula

En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, e sin exposición previa al antígeno comprende las siguient

Etapa 1: identificar múltiples donantes sanos que se clasifi de inclusión/exclusión que incluyen, pero no se limitan recolección de muestras de sangre de los donantes, seg el proceso conocido como Ficoll-paque, hisPaque. Las m células B sin exposición previa al antígeno mediante pru ácidos nucleicos, es decir, el ARN de IgM para la bibliot células B sin exposición previa al antígeno que están pr periférica (PBMC) de muestras de sangre. Etapa 2: Las luego se convierten en ADNc in vitro. Etapa 3: Un conjun el conjunto de cadenas de anticuerpos de IgM sin expo también incluye un marcador trinucleotídico específico qu estos marcadores se usan para rastrear las moléculas necesario. Etapa 4: La agrupación amplificada de fragm (mediante la PCR primaria y secundaria) de grupos dif funcional y se clonan en un conjunto específico de fagé rficies moleculares mediante la exposición a un vasto enos. En 1989, los primeros anticuerpos funcionales se derivada de un ratón inmunizado. Los paratopos de oral, median la unión específica a través de una interfaz Esta biblioteca exhibe baja afinidad cuando se enfrenta a e anticuerpos determina si se recuperará o no un paratopo as, una serie de mecanismos para maximizar el potencial apel crucial en la selección de su compañero adecuado. ervariable de un heterodímero de cadena ligera y pesada conglomerado distribuido espacialmente de regiones de anticuerpos primarios naturales (no seleccionados na gran serie de anticuerpos que pueden reconocer aprovecharse como un repertorio "sin exposición previa o los genes V del ARNm de IgM de células B de donantes periférica. Además, la ventaja del sistema de expresión to con el enfoque combinatorio proporcionará acceso a ado antígenos, aunque la frecuencia de esos anticuerpos de células B.

pos sin exposición previa al antígeno humanos y cribado

e amplificación;

y clonar en vectores de fagos y/o levadura para generar vaduras seguido de expresión y cribado de dicho producto

tores de levadura seguido de cribado de dicho producto

eadas de bibliotecas de fagos y/o levaduras.

resente método para generar la biblioteca de anticuerpos as siguientes etapas en donde se clasifican múltiples néticamente diversos seguidos de aislar las PBMC de te, las PBMC se procesan para el aislamiento de ARN ión de la agrupación de IgM de cadenas de anticuerpos tos de ácidos nucleicos amplificados se agrupan y clonan de dos a aproximadamente cinco rondas de cribado de nuación, se clona un conjunto de moléculas cribadas en ente tres rondas de cribado contra dianas antigénicas estran una mayor afinidad por el antígeno diana u otras lones individuales y se usan las poblaciones clonales pecífica para el posterior desarrollo de anticuerpos.

étodo para generar la biblioteca de anticuerpos humanos etapas.

n en función de perfiles genéticamente diversos o criterios l idioma, la ubicación geográfica y el origen étnico, y la o del aislamiento de las PBMC de las muestras mediante stras se identifican/prueban para detectar la presencia de as de marcadores específicos. La fuente del conjunto de a sin exposición previa al antígeno se origina a partir de ntes en la fracción de células mononucleares de sangre MC aisladas se procesan para el aislamiento de ARNm y único de cebadores redundantes se usan para amplificar ón previa al antígeno. El diseño único de los cebadores s específico para cada grupo de donantes. Más adelante, badas en la biblioteca hasta su población original, si es os de ácidos nucleicos sin exposición previa al antígeno ntes se agrupan, se purifican, se verifica la diversidad os (preferentemente fagémidos internos) y/o vectores de levadura con una noción de captura del gran tamaño y div de la biblioteca de moléculas se realiza a través de bio antígeno específico. Durante cada ronda, se seleccion aglutinantes que no lo son, Etapa 6: La agrupación presentación en fago se transfiere con o sin aleatorizaci decir, plataforma de presentación en levadura que evita c la agrupación de moléculas seleccionada. Esta transfere el plegamiento y el emparejamiento de cadenas pesad plataforma de presentación en levadura comprende vari anticuerpos en diferentes formatos. Etapa 7: Los frag específicas y se separan las poblaciones específicas qu 8: Estos conjuntos seleccionados se prueban adicional necesario. Etapa 9: Finalmente, los clones individual poblaciones clonales se usan para aislar secuencias de Los análisis cuidadosos y la comprensión de los estudios herramientas bioinformáticas permitirán una mayor incor de las moléculas principales. El sistema de cribado está i no se limita a, afinidad, nuevo epítopo, estabilidad térmic relacionadas con la comercialización exitosa de producto

El uso secuencial de plataformas de presentación en fa humanos sin exposición previa al antígeno, que se desarr un amplio intervalo de dianas terapéuticas y orientar ha una afinidad única. La flexibilidad del sistema/plataforma presentación en fago no es solo para los diversos form formato de anticuerpo, sino que también es una opción co La disponibilidad de múltiples opciones permite que e presentación en fago sea una plataforma única, flexible estructura de la inmunoglobulina en vivo, un éxito. La co de partida para modificarlas a nivel de ácido nucleico a función de antígeno-anticuerpo y el alcance de generar u eficacia, etc. Por tanto, la presente descripción archiva n contra dianas de varias enfermedades que no se limit enfermedades infecciosas y trastornos metabólicos; sino t y la validación de objetivos en el área de la genómica fun

La presente descripción también se refiere a una bibliot repertorio de secuencias de ácidos nucleicos sin exposi amplias y genéticamente diversas empleando el método

La presente descripción también se refiere a una biblio presente descripción, en donde dicha biblioteca pued adicionales de donantes de sangre sanos, secuencias de empleando un diseño racional de anticuerpos. Este enfoq al conjunto de moléculas de anticuerpos exclusivas en la

La presente descripción también se refiere al uso de una b un repertorio de secuencias de ácidos nucleicos sin exp la presente descripción, para proyectar ante antígenos di

En una modalidad no limitante, la biblioteca de expresión aplicación en varios campos, incluidos, pero que no se investigación y prácticamente cualquier aplicación donde

La biblioteca de presentación de anticuerpos represe expresados en la superficie celular unidos a otras prote aceptado debido a la facilidad de clonación, lo que permit y facilidad para determinar varios parámetros de estab limitaciones asociadas en el plegamiento de proteínas ad de modificaciones postraduccionales de los fragmentos d limitaciones, se emplea una plataforma de presentación para aislar y modificar fragmentos de anticuerpos. La lev ya que es compatible con la evaluación cuantitativa y en activadas por fluorescencia (FACS).

idad de las moléculas de la biblioteca. Etapa 5: El cribado izaje mediante múltiples rondas de selección contra un aglutinantes específicos de la biblioteca eliminando los eccionada de moléculas cribadas en la plataforma de de la diversidad seleccionada a un sistema eucariota, es uier método basado en la PCR, de esta manera, preserva se realiza específicamente para superar problemas con y ligeras en la plataforma de presentación en fago. La configuraciones que expresan una variedad de restos de ntos presentados se criban contra dianas antigénicas uestran una mayor afinidad por el antígeno diana. Etapa nte para determinar la especificidad del antígeno, si es de las agrupaciones seleccionadas se separan y las idos nucleicos que codifican las "moléculas principales". interacción anticuerpo-antígeno mediante el uso de varias ación de los cambios en la secuencia de ácidos nucleicos grado con características de anticuerpos como, pero que gregación, solubilidad, antigenicidad y otras propiedades e anticuerpos.

y levaduras que expresan un repertorio de anticuerpos n mediante un enfoque combinatorio, permite seleccionar la identificación de moléculas de anticuerpos únicas con presentación combinatoria de levaduras y el sistema de s de producción como Fab, ScFv, moléculas o cualquier eniente para la expresión de células haploides y diploides.

formato de presentación combinatoria de levaduras y indispensable para seleccionar un ligando que imita la ensión detallada de estas moléculas diana sería un punto corporar el conocimiento de los estudios de estructuramolécula líder con mayor afinidad, estabilidad, expresión, olo la identificación de anticuerpos monoclonales únicos al cáncer, artritis reumatoide, trastornos neurológicos, bién para desempeñar un papel vital en el descubrimiento nal.

de expresión génica de anticuerpos que comprende un n previa al antígeno preparadas a partir de poblaciones la presente descripción.

a de anticuerpos obtenida empleando el método de la esarrollarse y mejorarse aún más al añadir conjuntos enes de anticuerpos de varios grupos y/o individuos, etc., iterativo aumenta las posibilidades de enriquecer/agregar lioteca.

ioteca de expresión génica de anticuerpos que comprende ión previa al antígeno preparada mediante el método de .

nica de anticuerpos de la presente descripción encuentra mita a, terapéuticos, diagnósticos, pronósticos, fines de empleen anticuerpos o derivados de anticuerpos.

una biblioteca de anticuerpos parciales o completos s celulares. La presentación en fago es el método más randes tamaños de biblioteca, presentación monovalente ad. Sin embargo, con la presentación en fago existen ado debido al sistema de expresión procariótico y la falta nticuerpo presentado de esta manera. Para superar estas levadura, una metodología cuantitativa robusta y versátil ura, un sistema de presentación eucariota es de elección mpo real empleando técnicas de clasificación de células En comparación con otras tecnologías de presentaci anticuerpos sin exposición previa al antígeno/no inmu aglutinina Aga1 y Aga2 tiene un número significativo de permite la caracterización rápida de clones, que incluy epítopos de clones mutuamente excluyentes directamen de purificación de proteínas para realizar estas car anticuerpos Fab en levaduras sugiere un enfoque más fragmentos Fab están compuestos de cadenas ligera polipéptidos en vectores diferentes en cepas diferentes sola levadura diploide mediante apareamiento, un proc caso de la presentación en levaduras es un tamaño eficiencia de transformación en la levadura, que se descripción, que emplea una combinación del concepto

La presente descripción se describe adicionalmente naturaleza ilustrativa y no deben interpretarse como li manera.

EJEMPLOS

Materiales empleados:

Tubo SepMate™ (Stem cell technologies, Canadá); Hist FBS (Moregate Biotech, Australia); IgD antihumana de ratón PE (BD Biosciences, EE.UU.); CD19 antihuma antihumano de ratón APC (BD Biosciences, EE.UU.); C antihumano de ratón APC (BD Biosciences, EE.UU.); EE.UU.); Superscript IV; cebador hexámero aleatorio, Escalera de 1 Kb (Invitrogen, EE.UU.); Enzima Phusion por la PCR (Qiagen, EE.UU.); Agarosa (SIGMA, EE.UU. Scientific, EE. UU.); Mini kit de preparación (Qiagen, EE ADN ligasa T4 (NEB, EE.UU.); Agar LB (Himedia, Indi EE.UU.); NcoI-HF, (NEB, EE.UU.); Xbal, (NEB, EE.UU.) (NEB, EE.UU.); AscI (NEB, EE.UU.); NotI (NEB, EE. EE.UU.); Kit de purificación por la PCR (Qiagen, EE.UU EE.UU.); Cultivo LB (Himedia, India); Ampicilina (MP B Fago auxiliar M13KO7 (Thermo Scientific, EE.UU.); Glic Cloruro de sodio, (SIGMA, EE.UU.); Enzima TEV (In Estados Unidos); Anti-FLAg, (Sigma, EE.UU.); Antir (Sunmodics, EE.UU.); Herclon® (Roche, EE.u U.); Co Tween 20 (Fisher Scientific, EE.UU.); Her2 (Acrobiosyst

Ejemplo 1:

Procedimiento generalizado para la generación de Bibli

El éxito de las bibliotecas sin exposición previa al antíge debe ser lo suficientemente grande. El tamaño y la dive antígeno y la especificidad y afinidad de los anticuerpo donantes de sangre sanos se aleatoriza en términos de s son examinados para análisis de sangre regulares, com El donante individual se clasifica en función de factores materna) y el origen étnico. Basándose en esta informac

Se recolectan muestras de sangre de múltiples donan células mononucleares de sangre periférica (PMBC) se se convierte en ADNc (in vitro). Dicha agrupación de AD anticuerpos sin exposición previa al antígeno. Se usa u redundantes para amplificar la agrupación de IgM y los fr único, desarrollado internamente. La amplia clasificació trinucleótido específica para rastrear clones de antic fagémidos de la biblioteca sin exposición previa al a específico basándose únicamente en el rigor seguido de La agrupación seleccionada de moléculas se transfiere cualquier tecnología basada en la PCR y preservando de cadenas pesadas y ligeras para compensar las dife n vitro, la presentación en levaduras de bibliotecas de mediante el uso del complejo receptor de adhesión de ajas. Por ejemplo, el uso de análisis de citometría de flujo determinación de KD, la medición de koff y la unión de bre la superficie de la levadura. Esto elimina la necesidad rizaciones. La presentación exitosa de fragmentos de le para la construcción de bibliotecas grandes. Como los pesadas, por consiguiente, es posible codificar los dos levadura en donde dos cadenas se pueden unir en una altamente eficaz. Sin embargo, el desafío principal en el iblioteca relativamente más pequeño debido a la menor era por los aspectos proporcionados por la presente presentación en fago y/o levaduras.

referencia a los siguientes ejemplos, que son solo de ntes del alcance de la presente descripción de ninguna

ue (SIGMA, St. Louis, EE.UU.); DPBS (GIBCO, EE.UU.); n FITC (BD Biosciences, EE.UU.); CD20 antihumano de e ratón perCP-Cy5,5 (BD Biosciences, EE.UU.); CD27 antihumano de ratón p E (BD Biosciences, EE.UU.); CD38 i kit Qiagen RNeasy (Qiagen, EE.UU.); dNTP (Ambion, d(T)16 (Invitrogen, EE.UU.); dNTPS (Ambion, EE.UU.); B, e E.UU.); Agarosa (SIGmA, EE.UU.); Kit de purificación t de elución en gel (Qiagen, EE.UU.); pTZ-57R/T (Thermo .); Polimerasa Taq (NEB, EE.UU.); dATP (NEB, Ee .UU.); Neb5alpha (NEB, EE.UU.); Ampicilina (MP Biomedicals, ndIII-HF, (NEB, EE.UU.); AscI (NEB, EE.UU.); HindIII-HF, , células TG1 (Lucigen, EE.UU.); ADN ligasa T4 (NEB, gar LB (Himedia, India); Mini kit de preparación (Qiagen, edicals, EE.UU.); Kanamicina (MP biomedicals, Ee .UU.); (Fischer Scientific, EE.UU.); PEG 8000, (SIGMA, EE.UU.); gen, EE.UU.); PBS (SIGMA, EE.UU.); BSA (Biovision, de cabra HRP (Biolegend, EE.UU.); Sustrato TMB ado de cabra-antihumano IgGFc-HRP (Bethyl, EE.UU.); , China);

as de anticuerpos sin exposición previa al antígeno.

epende únicamente del tamaño final de la biblioteca, que d de la biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al tán vinculados directamente. El proceso de selección de ción de individuos de cualquier sexo. Todos los individuos hace para la donación de sangre con fines de transfusión. no se limitan a la ubicación geográfica, el idioma (lengua las muestras recolectadas se clasifican en varios grupos.

sanos de diversos idiomas y antecedentes étnicos. Las n y procesan para el aislamiento de Ig-ARN-m que luego es usada además para capturar el repertorio de genes de arcador trinucleotídico específico que contiene cebadores entos amplificados se combinan y clonan en un fagémido muestras de PBMC se etiquetará con una secuencia de os hasta una población particular. La agrupación de eno se tamiza por múltiples rondas contra el antígeno onfirmación mediante el uso del método basado en ELISA. ctores específicos de presentación en levadura, evitando a diversidad. Sin embargo, se permite una aleatorización ias entre dos sistemas de presentación. Los fragmentos presentados se criban contra dianas antigénicas específi afinidad por el antígeno diana. Las agrupaciones selecci antígeno y los clones individuales de las agrupaciones secuencias de ácidos nucleicos que codifican las molécul

Ejemplo 2:

Para obtener un número suficiente de células B sin expo de sangre de múltiples donantes sanos. Los donantes se en la India con un idioma específico hablado. La confirm antígeno es necesaria no solo en términos de confirmaci términos del número que debería ser lo suficientemente presente en la población de células B sin exposición prev al antígeno nunca es inferior a 107. Para evitar cualquier aislado, las muestras de PBMC se procesan para el aisl cantidad de ARN aislado, que se usa para generar ADNc, cubriendo el número teórico de diversidad de anticuerp cebadores redundantes diversos con un número limitado del repertorio mientras hay menos probabilidad de inco retiene también para la PCR secundaria. Además, la canti ng por reacción para asegurarse de que el número

trinucleotídico se coloca estratégicamente para cribar la b del repertorio de cadenas ligeras y pesadas se realiza en f de > 108 en donde la confirmación de la presencia de restricción y que no es inferior al 90-95 %. Opcional adicionalmente para estimar la diversidad funcional, que fagos se lleva a cabo cuidadosamente con el número experimentos de tamizaje contra antígenos, se adopta el los aglutinantes. Para la preparación de antígeno recubie conjugación de microesferas se establece en >90 %. Ade no aglutinantes con un número no superior a 107 de partíc etapa del cribado de la biblioteca de presentación en enriquecimiento de la población diana no relacionada, se fagos. Para transferir la biblioteca sin exposición previa de esperma de salmón seguido de amplificación de la ins El repertorio purificado se digiere y se liga en vectores d vectores bidireccionales, unidireccionales o de tipo aparea los casos la eficiencia de transformación en levadura es > determinar la expresión de la cadena pesada, la cadena l población total. Para el tipo de apareamiento, la eficienci análisis de expresión se realiza con múltiples etiquetas c y cadenas ligeras respectivamente. La clasificación basa positivo tanto para el antígeno como para la cadena pesa al menos una vez más antes de que se cultiven individu estudios basados en ELISA y SPR para confirmar y volve

Los siguientes diagramas de flujo describen las etapas im y se separan las poblaciones que muestran una mayor as se prueban opcionalmente para la especificidad de eparan y las poblaciones clonales se usan para aislar rincipales.

n previa al antígeno en PBMC, se recolectan muestras en estratégicamente de varias ubicaciones geográficas n de la población de células B sin exposición previa al e marcadores de superficie en PBMC, sino también en nde para aprovechar toda la diversidad teórica posible antígeno. El número de células B sin exposición previa de inestabilidad y problemas relacionados con el ARN nto de ARN y la generación de ADNc el mismo día. La de -10-25 pg de cada región, suficientemente grande y Configurar la reacción de la PCR se realiza con ~100 iclos 10-18 para asegurar el aprovechamiento completo ación de mutación mediada por la PCR. Lo mismo se de amplicón de la PCR primaria se mantiene de 50-150 oléculas de amplicón no esté limitado. El marcador teca específica de la región más adelante. La clonación ato Fab con una eficiencia de transformación obligatoria nserción se realiza mediante análisis de digestión por te, la secuenciación del grupo de pares se ejecuta spera que sea > 80 %. La generación de la biblioteca de cto de partículas de fagos que es 1010-1011. Para los do de base magnética para tener un mejor control sobre e microesferas magnéticas dynabeads, la eficiencia de , el tamizaje se fija en una ronda para eliminar solo los de fagos. Esta etapa está bien alineada con la siguiente adura. Para evitar cualquier amplificación sesgada o lea una duración fija de 90 minutos de amplificación de tígeno tamizada, se aísla ADNss en presencia de ADN n, es decir, el repertorio de cadenas pesadas y ligeras. presión de levadura en cualquier formato fab, que son nto, o en formato ScFv, que son vectores ScFv. En todos . Las células de levadura transformadas se revisan para a y la molécula Fab, que no es inferior al 15-50 % de la apareamiento está en un intervalo entre el 30-50 %. El FLAG, c-Myc y His-tag y V5-tag para cadenas pesadas n flujo para la unión del antígeno se analiza con doble ligera. Las moléculas clasificadas se vuelven a clasificar ente y se prueben para estudios de unión. Se realizan onfirmar la unión del antígeno con moléculas Fab/ScFv.

antes del proceso de la presente descripción.

Etapa 1: etapas del proceso comenzan sangre hasta la creación de la bibliotec con la recolección de muestras de e anticuerpos en fagos

Etapa 2: Etapas del proceso involucrando desarrollo de los clones de levaduras me aglutinantes independientes

cribado de la biblioteca de fagos hasta el nte el uso de la clasificación de flujo de

Ejemplo 3:

Selección del donante de PBMC:

Los participantes del estudio se seleccionan de donantes regiones de la India (Figura 1). Todos los individuos son e para la donación de sangre con fines de transfusión. Los criterios importantes, que incluye el idioma único que se específica. Todos los donantes voluntarios están inform procesos regulatorios.

Recolección de muestras:

Las muestras biológicas, como las muestras de sangre, s Las muestras de sangre se recolectan de voluntarios distintas de la India. Las muestras se codifican adecuada existentes, como el resumen de la dieta, el volumen d voluntario. La recolección de sangre se realiza de cada v ciencia médica. Los médicos examinan cuidadosament posterior.

Aislamiento de PBMC:

El método adoptado para la separación y el aislamiento como Ficoll-paque, histoPaque (SIGMA). Este medio de SepMate™ basado en el principio de migración diferenci sangre sanos independientes de ambos sexos de varias minados para análisis de sangre regulares, como se hace antes individuales se clasifican en función de unos pocos abla (lengua materna), la etnia y la ubicación geográfica os y reciben su consentimiento informado siguiendo los

ecogen con éxito en un volumen que varía de 200-250 ml. éticamente diversos de cinco o más regiones únicas y nte en la fuente para mantener el anonimato. Las pautas angre a recolectar, se siguen estrictamente para cada ntario de acuerdo con un procedimiento aprobado por la l informe de sangre antes de cualquier procesamiento

PBMC para todas las muestras es un proceso conocido adiente de densidad se realiza mediante el uso un tubo de las células sanguíneas a través del medio durante la etapa de centrifugación del procedimiento. La muestra d FBS al 2 %. Además, se añaden 15 ml de histopaque e de tampón PBMC en él. Toda la mezcla se centrifuga a diluye con 50 ml de tampón DPBS que contiene FBS al El sobrenadante se descarta mientras que los gránulo tampón DPBS que contiene FBS al 2 %. Las muestras d la solución de Ficoll, seguido de centrifugación para for La capa inferior consta de glóbulos rojos (eritrocitos) y Ficoll. La capa superior que consta de PBMC(s) se enc de Ficoll. Para recuperar las PBMC, esta capa se recupe al 2 % mediante centrifugación. El uso de PBMC aislada de genes de anticuerpos para desarrollar bibliotecas de ética.

Identificación de la población de células B sin exposici previa al antígeno:

La expresión diferencial de la superficie celular y los mar de secreción de inmunoglobulinas y citocinas, proporci los diferentes subconjuntos de células B. La presencia CD20, CD19, CD27, CD24, CD38) se aprovecha para id B. Las muestras de PBMC aisladas de cada voluntario s de glóbulos rojos y se determina que están libres de gl total de PBMC y el número de células B sin exposición citometría de flujo, en donde el uso de una selecció CD19+/CD27+/IgD- en PBMC se considera como Pobla 1x106 células se toman y se resuspenden en PBS 1 anticuerpos durante 25 minutos en hielo (Ver Tabla-1).

5 minutos a 1500 rpm seguido de resuspensión en PBS a 2500 rpm durante 5 minutos seguido de la adición d análisis de citometría de flujo. El otro conjunto de marcad no B y otros subconjuntos de células B, como células B de cada muestra se aíslan de 40 a 50 millones de célul previa al antígeno varía de 4 a 5 millones por muestra. células se usan para aprovechar el repertorio de anticue número de diversidad teórica para el repertorio de cade sin exposición previa al antígeno es lo suficientemente

T re se mezcla con 150 ml de tampón DPBS que contiene ubo SepMate seguido de la adición de 30 ml de mezcla g durante 10 minutos. La capa de PBMC se recoge y se seguido de centrifugación a 300 xg durante 10 minutos.

contienen las PBMC puras se resuspende en 2 ml de gre anticoagulantes o desfibrinadas se estratifican sobre erentes capas que contienen diferentes tipos de células. locitos que son recolectados o agregados por el medio típicamente en la interfaz entre el plasma y la solución idadosamente, se lava con un tampón que contiene FBS muestras de sangre para la amplificación de fragmentos entación de anticuerpos está aprobado por el comité de

via al antígeno/estimación de células B sin exposición

es intracelulares, así como también sus distintos perfiles pistas valiosas sobre la diversa naturaleza y función de sencia de varios marcadores únicos (por ejemplo: IgD, ar un subconjunto específico de la población de células izan para la validación microscópica de la contaminación rojos. Además, para tener una estimación del número al antígeno en él, se realizan experimentos basados en pleta de anticuerpos que es la población de células e células B sin exposición previa al antígeno (Figura 2). contiene un 1 % de BSA seguido de incubación con és de la incubación, las muestras se centrifugan durante e contiene un 1 % de BSA. La suspensión se centrifuga 1X con un 1 % de BSA. Las muestras se pasan por ambién está atrapado para diferenciarse de los linfocitos ansición, células B de memoria, etc. Aproximadamente, MC. La población estimada de células B sin exposición derando cinco regiones juntas, un número total de ~107 sin exposición previa al antígeno. Teniendo en cuenta el sada y cadena ligera, el número disponible de células B como para aprovechar toda la diversidad posible.

:

Aislamiento de ARN total:

Para evitar cualquier problema relacionado con el almac del ARN, el aislamiento de ARN total se completa el Aproximadamente un número de 107 células se resuspe la suspensión, que incluye cualquier precipitado, a una de recolección de 2 ml y se centrifuga durante 15 segun lava con 700 pl de tampón RWT a s 8000 g durante 20 500 pl de tampón RPE durante 15 segundos y 2 minuto agua libre de nucleasas mediante la centrifugación dur un ARN total que varió de 15-20 pg. Un análisis adicional de ARN que se usa directamente para la generación de

Generación de ADNc:

iento que pueda interferir con el rendimiento o la calidad día del aislamiento de la muestra con sumo cuidado. n 650 pl de tampón RLT seguido de la transferencia de na de centrifugación RNeasy Mini colocada en un tubo s 8000 g. El flujo continuo se descarta y la columna se dos. La columna se lava y se centrifuga dos veces con pectivamente a s 8000 g. El ARN se eluye en 30 pL de minuto a s 8000 g. La muestra de cada región produjo muestra de ARN indicó una alta pureza de cada muestra .

Para recuperar completamente todo el repertorio de gen y Oligo dT como cebadores; se usa ~0,6-1 pg de ARN t de ADNc de la primera cadena. El cebador de ARN (ceb mM dNTP se incuban a 65 °C durante 5 minutos, seguido reacción que contiene hexámero aleatorio, la mezcla de r 10 minutos mientras que para la reacción que contiene añaden 1 pl de ditiotreitol (100 mM), RNaseOUT (40 uni un volumen total de 20 pl y se continúa a 50-55 °C dura durante 10 minutos. La integridad del ADNc generado se de reacción son como se describió en las tablas más ab se usa por separado para generar ADNc para una posteri de ARN (0,6 a 1 pg de ARN) de cada región para rec relacionado con el almacenamiento que pueda interferir ARN total se completa el mismo día del aislamiento de la se valida mediante amplificación de GAPDH. La validació se usa para la amplificación por PCR primaria. No se obt la primera cadena del ADNc, lo que indica que los produc

Ta de anticuerpos, se prepara ADNc con hexámero aleatorio para cada cebador con Superscript™ IV para la síntesis r aleatorio u Oligo dT) y 1 pl de mezcla de mezcla de 10 incubación en hielo durante al menos 5 minutos. Para la ción combinada se incuba adicionalmente a 23 °C durante igo dT no se incluye esta etapa. Subsecuentemente, se es/pl) y Superscript IV (200 unidades/pl) a la reacción en 10 minutos. La reacción se inactiva incubándola a 80 °C lida mediante amplificación de GAPDH. Las condiciones (Tabla 2 y Tabla 3). El ARN total aislado de cada región mplificación por PCR. Se usan al menos ~1012 moléculas rir la diversidad teórica. Para evitar cualquier problema n el rendimiento o la calidad del ARN, el aislamiento de estra con sumo cuidado. La integridad del ADNc generado e la integridad posterior al ADNc del ADNc total generado en bandas en ausencia de un cebador en la reacción de resultaron de la amplificación del ARN y no del ADN.

2:

Ta 3:

Diseño de cebadores redundantes:

El diseño optimizado de los cebadores de la PCR para ge de los productos de PCR. Los cebadores están ubicad respectivamente) de las regiones V maduras, pero no inc patrón y la amplificación de sesgo. Los cebadores directo las familias de genes humanos VH (9 cebadores) o Vk (6 emparejar cada uno de los segmentos de IgM o Ck o Cl secundarios para optimizar el enlace de genes VH y Vk, o Los cebadores inversos para la PCR secundaria están d s V reorganizados se realiza para maximizar la diversidad en los extremos 5' y 3' (cebadores directos e inversos oran sitios de restricción internos que no coincidan con el rimarios están diseñados para coincidir con cada una de badores) o Vl (11 cebadores) y cebadores inversos para manos. Se diseñan conjuntos adicionales de cebadores al azar y añadir sitios de restricción a los genes enlazados. ñados para aprovechar el extremo de los segmentos Jh, Jk o Jl. Como variación hereditaria que existe en la com marcadores trinucleotídicos únicos en los cebadores sec idioma hablado y la ubicación geográfica en la India de (Figura 1). Los marcadores trinucleotídicos enumerado específicamente en las subfamilias de cadenas pesadas p de cadenas pesadas se eligen debido a su mayor diversi el aminoácido idéntico, es decir, alanina, y no interfiere co triplete se coloca estratégicamente después del sitio de después de transferir los clones de fagos a la levadura. S un quinto marcador trinucleotídico único, es decir, CAC, conservado en la región del marco 4 de la cadena pesad moléculas obtenidas contra un antígeno específico (Tabla

Ta ición del repertorio de anticuerpos, se incorporan cuatro arios diseñados que especifican la región en función del de se eligen los donantes y se recolectan las muestras como tripletes GCC, GCG, GCA y GCT se etiquetan las regiones 1,2, 3 y 4 respectivamente. Las subfamilias teórica. Todos los marcadores trinucleotídicos codifican a conformación del anticuerpo o la unión del antígeno. El tricción para que el marcador se pueda retener incluso iseña un conjunto de cebadores inversos que contienen codifica valina. El aminoácido valina es un aminoácido Esto se hace específicamente para rastrear la fuente de y Tabla 5).

4:

Ta 5:

La PCR primaria para amplificar la agrupación de IgM

La configuración de la PCR primaria se realiza para q representa el repertorio sin exposición previa al antígeno. en un volumen de 50 pl como se describió en la tabla má pl. Esta configuración se realiza para todas las combinaci kappa y lambda, las reacciones de la PCR se llevan a cab inversos Ck o CA constantes. Existen ligeras diferencias lo tanto, ambos cebadores se incluyen individualmente en de la PCR se realizan para la amplificación con 18-25 cicl 90 s a 72 °C. El número bajo de ciclos de amplificación mutación introducida por la PCR. Se encontró que el ampl Vk y Vl tiene un tamaño de ~680 pb. Todas las subfamilias esperada (Figura 3).

Ta cada subfamilia aproveche la agrupación de IgM que ra la cadena pesada, la configuración de la PCR se realiza bajo (Tabla 4) por triplicado con un volumen total de 150 es de los cebadores. Para las familias de cadenas ligeras on varios cebadores redundantes directos con cebadores secuencia en el diseño de los cebadores inversos CA, por configuración de las reacciones de la PCR. Las reacciones durante 1-2 minutos a 94 °C, 1-2 minutos a 50 °C y 50 s-PCR se fija con la idea de reducir la probabilidad de una n de la PCR primario para subfamilias individuales de Vh, cadena pesada y cadena ligera muestran la amplificación

6:

Purificación de la PCR primaria:

Los amplicones primarios de familias individuales se agru Se añaden 5 volúmenes de Tampón PB, es decir, 750 |jl 150 j l de producto agrupado de la PCR. Se coloca una c de 2 ml proporcionado, seguido de la unión del ADN medi PE seguido de un centrifugado vacío para eliminar el ta libre de nucleasas. La estimación de la concentración par

La PCR secundaria para enriquecer la población sin e vector interno:

La configuración de la PCR secundaria se realiza con 50 de la PCR se mantienen similares a las primarias. Sin em clonarlos en fagémidos más adelante. Para las familias d con varios cebadores redundantes directos con sitio de cadena pesada son para amplificar la región que abarca mientras que el sitio de restricción es Xbal. Para la cadena de 50 j l como se describió en las tablas más abajo (tabl configuración se realiza para todas las combinaciones de ligera, las reacciones de la PCR se llevan a cabo con var es decir, HindIII mientras que AscI es el sitio de restricc realizan para la amplificación con 18 ciclos durante 1 mi observa un tamaño de amplicón esperado de ~350-400 pb 4).

Ta y limpian mediante el uso del kit de limpieza de la PCR. ampón PB a 1 volumen de la muestra de la PCR que es na de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección el método de centrifugación. Se pasan 750 j l de tampón PE restante. El ADN limpio se eluye en 40 j l de agua da subfamilia se mide en 2-4 jg .

sición previa al antíaeno y hacerla compatible con el

ng de amplicón primario como patrón. Las condiciones o, los cebadores se marcan con sitios de restricción para dena pesada, las reacciones de la PCR se llevan a cabo tricción, es decir, Ncol. Los cebadores inversos para la de la parte variable hasta el principio del segmento Jh, ada, la configuración de la PCR se realiza en un volumen y 8) por triplicado con un volumen total de 150 jl. Esta cebadores. Para las familias kappa y lambda de cadena cebadores redundantes directos con sitio de restricción, para el cebador inverso. Las reacciones de la PCR se a 94 °C, 1 minuto a 50 °C y 50 segundos a 72 °C. Se que indica que solo se amplifica la región variable (Figura

7:

T 8:

Estimación del producto de la PCR secundaria:

Todas las subfamilias respectivas se limpian en columna biofotómetro. Esto es esencial para tener una estimació reflejará el número de moléculas que irán para la gener ~30 |jg y se agrupan en una relación equimolar.

Estimación de la diversidad del producto de la PCR:

Los productos de PCR secundaria se agrupan de acuer |jg de cada subfamilia por separado con la mezcla de 2 u de extensión de la PCR se realiza durante 20 minutos a de un kit de purificación de la PCR. Se añaden 750 j l de j l de producto agrupado de la PCR. Se coloca una colu 2 ml proporcionado, seguido de la unión del ADN media PE seguido de un centrifugado vacío para eliminar el ta libre de nucleasas. La estimación de la cantidad de ADN subfamilia se liga en el vector de clonación individualme

Antes de generar la biblioteca real, es esencial tener u agrupación de nucleótidos. Para ello, se clona una fracci Los clones seleccionados que se confirman mediant secuenciación del grupo de pares. El resultado de la se diferentes secuencias de CDR, longitud y son productiv sin embargo, esto no es suficientemente significativo. La enfoque in-silico mediante el uso de secuencias c representativos de la familia se ven en la agrupación se se envían para una secuenciación profunda para compr

Clonación de cadenas ligeras

5 jg de las cadenas ligeras kappa y lambda de la agrup digieren con HindIII y AscI a 37 °C durante la noche en en gel seguido de una ligación fijada a 4 °C durante l transforman en 25 j l de células TG1 mediante electropo óptimo de 1800 voltios, 600 ohmios y 10 jF . Después de j l de células transformadas en placas de 144 mm y se i las que se raspan las colonias al día siguiente y se transformación se calcula por placas de dilución y se preferentemente a ~108.

El número total de células se determina por vial de res que es 1012. Las colonias se inoculan en 5 ml de LB-Am para análisis de digestión por restricción. La liberación ligera, tanto kappa como lambda en la agrupación.

Se inocula un vial de la agrupación de cadenas ligeras (t durante 2-3 horas a 37 °C en un agitador-incubador segui qiagen midi según el protocolo del fabricante. El ADN pr un análisis de digestión por restricción antes de procede ligera kappa y lambda de la agrupación de la PCR secun guido de la estimación de la concentración a través de un e la cantidad de ADN en cada agrupación, que a su vez ón de bibliotecas. El rendimiento global de Vh, Vk y Vl es

con las respectivas subfamilias (Vh, Vk y Vl). Se mezcla 1 ades de ADN polimerasa Taq y dATP 0,2 mM. La reacción °C. Los productos extendidos se purifican mediante el uso mpón PB a 1 volumen de la muestra de PCR que es 150 de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de el método de centrifugación. Se pasan 750 j l de tampón ón PE restante. El ADN limpio se eluye en 40 j l de agua realiza mediante el uso de un bioespectrofotómetro. Cada incubando con la enzima ligasa a 4 °C durante la noche.

comprensión/estimación de la diversidad funcional de la de amplicón de cada familia V en el vector de clonación. digestión por restricción (Figura 5) se envían para la nciación indicó que todas las moléculas clonadas tienen También se observan pocas secuencias no productivas, ecuencias se clasifican en diferentes familias mediante un enso de cadenas pesadas y ligeras. Los miembros nciada. Además, las muestras se amplifican por la PCR y er la profundidad completa de la diversidad funcional.

n de la PCR secundaria junto con un fagémido interno se olumen total de 100 jl. Las muestras digeridas se eluyen oche (Figura 6). Los 25-50 ng de mezcla de ligación se ión en donde se usa una cubeta de 1,0 mm con un ajuste recuperación en medio de recuperación, se esparcen 200 ban durante la noche a 37 °C. En total hay 6-8 placas de eparan reservas con glicerol al 20 %. La eficiencia de cuentra en el intervalo de 108 a aproximadamente 1010,

s de glicerol mediante placas de dilución y se determina se aísla el plásmido. Los plásmidos aislados se controlan la inserción de ~300 pb confirmó la presencia de cadena

to kappa como lambda) en 100 ml de LB-Amp y se cultiva del aislamiento del plásmido mediante el kit de preparación rado en midi para ambas cadenas ligeras se confirma con on la incorporación de la cadena pesada en él. La cadena ria junto con un fagémido interno se digieren con HindIII y AscI seguido de ligación y transformación individualment formato de anticuerpo, se prefiere el Fab ya que esto imp de alto rendimiento para preparaciones de anticuerpos

La eficiencia de transformación de ~108 indica un alto que aprovecha la diversidad. Las colonias se raspan y al estimado de células por vial es 1010, que represent representativos se usan para el aislamiento de plásmido que indica la presencia de ~100 % de la inserción de c aislar el ADN de la biblioteca de cadenas ligeras, tanto confirma de nuevo mediante digestión por restricción a cadenas pesadas. Las tablas 9 y 10 proporcionan los c

T TG1, células altamente competentes. Como elección del a el desarrollo de ensayos rápidos de cribado de afinidad .

o de clones independientes presentes en la agrupación an como reservas de glicerol para uso futuro. El número iversidad completa en exceso. Pocos de los clones confirman mediante digestión por restricción (Figura 7) ligera. Se realiza una preparación Midi separada para como lambda de la agrupación. El ADN de Midi prep se e usarse para la inserción adicional de la agrupación de entes aplicables para la clonación de cadenas ligeras.

:

T 0:

Clonación de cadenas pesadas:

5 pg del ADN de la biblioteca de cadenas ligeras kapp cadena pesada se digieren con Ncol y Xbal a 37 °C d digeridas se eluyen en gel seguido de una ligación fijad de ligación se transforman en 25 pl de células TG1 med con un ajuste óptimo de 1800 voltios, 600 ohmios y 10 esparcen 200 pl de células transformadas en placas de 6-8 placas de las que se raspan las colonias al día siguie en una nevera a -80 °C. La eficiencia de transformación de 108 a aproximadamente 1010, preferentemente a ~10

El número total de células se determina por vial de res que es 1012. Las colonias se inoculan en 5 ml de LB-Am para análisis de digestión por restricción con Ncol y Xba Kappa y Lambda. La liberación de la inserción de ~400 kappa (Figura 9) y en la agrupación lambda (Figura 10).

La cadena pesada junto con la agrupación de la PCR biblioteca de ADN se digieren individualmente con Ncol en TG1, células de E. coli altamente competentes. Las t la clonación de cadenas pesadas.

bda junto con la agrupación de la PCR secundaria de la noche en un volumen total de 100 pl. Las muestras °C durante la noche (Figura 8). Los 25-50 ng de mezcla electroporación en donde se usa una cubeta de 1,0 mm spués de la recuperación en medio de recuperación, se m y se incuban durante la noche a 37 °C. En total hay e preparan reservas con glicerol al 20 % y se almacenan cula por placas de dilución y se encuentra en el intervalo

de glicerol mediante placas de dilución y se determina aísla el plásmido. Los plásmidos aislados se controlan cadenas pesadas y HindIII y AscI para cadenas ligeras nfirmó la presencia de cadena pesada, en la agrupación

daria de cadena ligera kappa y lambda que contiene la al seguido de ligación y transformación individualmente 11 y 12 proporcionan los componentes aplicables para Ta 11:

Ta 12:

Clonación de la cadena pesada en una biblioteca de cad raspado de células, preparación de reserva de glicerol. E

La eficiencia de transformación de ~108 a aproximadam clones independientes presentes en la agrupación que a como reservas de glicerol para uso futuro. El número esti completa. Pocos de los clones representativos se usan digestión por restricción que indica la presencia de ~90 que confirma la presencia del formato Fab. Los clones se del grupo de pares. El resultado de la secuenciación ind (Figura 11) y tienen diferentes secuencias de CDR y l observan pocas secuencias no productivas, sin embarg transferencia completa de la diversidad del repertorio d bacteriana a través de la agrupación de la PCR.

Generación de la biblioteca de fagos:

Se cultiva 1 ml de solución almacenada de glicerol bacte hasta que la DO a 600 nm alcanza 0,8. Además, se aña (MOI) de 10 a las bacterias y se incuba a 37 °C durant infectadas se centrifugan y los gránulos se resuspenden kanamicina seguido de crecimiento a 30 °C durante la durante 15 minutos a 4 °C seguido del descarte de los grá de PEG/NaCl en % de volumen de sobrenadante y la mez a 10 000 g durante 15 minutos y los gránulos de fagos concentración final del 50 % a toda la suspensión de fag de biblioteca de fagos.

Las reservas de glicerol de las bibliotecas bacterianas generación de bibliotecas de fagos. Con la adición de diversidad se precipitan y purifican, y se almacenan com número estimado de biblioteca de fagos que se deriva del 1011, preferentemente -1011 pfu/ml (Figura 12).

Cribado de biblioteca/Estrategia de tamizaje:

El cribado de la biblioteca sin exposición previa al antíge de aglutinantes potenciales contra el antígeno diana esp desarrollo de los aglutinantes, el objetivo del tamizaje e exposición previa al antígeno. Por lo tanto, la estrateg amplificación y digestión por restricción y confirmación de as ligeras, cribado de clones, estimación de la eficiencia, ación de células/vial:

te 1010, preferentemente ~109 indica un alto número de vecha la diversidad. Las colonias se raspan y almacenan o de células por vial es 1012, que representa la diversidad ra el aislamiento de plásmidos y se confirman mediante e la inserción tanto de cadena ligera y la cadena pesada cionados se envían opcionalmente para la secuenciación que > 80 % de las moléculas clonadas son funcionales itudes que varían de 4 a 22 aminoácidos. También se esto no es suficientemente significativo. Esto indica una élulas B sin exposición previa al antígeno a la biblioteca

no kappa y lambda en 200 ml de medio LB-AMP a 37 °C el fago auxiliar M13KO7 a una multiplicidad de infección otros 30 minutos. Después de la infección, las bacterias 200 ml de LB con 100 qg/ml de ampicilina y 25 qg/ml de he a 250 rpm. La suspensión se centrifuga a 8000 rpm os. El sobrenadante separado se mezcla con una solución se incuba en hielo durante 1 hora. La mezcla se centrifuga resuspenden en 20 ml de PBS. Se añade glicerol a una y se congela en alícuotas de 1 ml a -80 °C como reserva

ppa y lambda se mezclan e inoculan y se usan para la os auxiliares, las partículas de fagos que presentan la reservas de glicerol para uso futuro. Se encuentra que el ayo de formación de placa es de 1010 a aproximadamente

es la etapa más importante, ya que producirá la corriente ico. Teniendo en cuenta todo el proceso de generación y liminar los aglutinantes no específicos del repertorio sin de cribado de fagos que consiste de etapas de unión, uencia debe decidirse cuidadosamente. Además de tener una unión eficaz, la relación de moléculas de antígeno cualquier tipo de sesgo durante la unión.

Una biblioteca de anticuerpos presentados en fagos cont y clones que se amplifican más rápido que otros clones. también indica que un período más largo de amplificació Además, podría haber un enriquecimiento de anticuerpo

Manteniendo en la práctica los criterios mencionados ant de fagos se mantiene al menos 10-100 veces mayor. P aglutinante, la amplificación se mantiene durante no más

Estimación del número de fagos:

Una sola colonia de la placa bacteriana TG1 se inocula una DO600 = 0,9. Se prepara 0,7 % de agarosa en agua 15 ml de tubos Falcon. El sobrenadante del fago y los gr añaden 100 pl de fago diluido y 100 pl de células TG1 a de un esparcimiento inmediato en una placa de agar LB. noche. La formación de placa se observa y se cuenta al en función del número de placas observadas.

Conjugación de microesferas:

Las microesferas de Dyna se pesan en una cantidad de en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4. Esta suspe incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos tampón de fosfato de sodio 0,1 M y se resuspende de solución de ligando, (~100 pl) se añaden los 10 pg de mezcla bien antes de añadir los 100 pl de solución de sul durante 20 horas a 37 °C con inclinación lenta pero rotac el soporte del imán durante 1 minuto para la separación pone cuidadosamente boca abajo dos veces para asegu el sobrenadante y las microesferas se lavan cuatro veces las microesferas se resuspenden en 100 pl de PBS 1X c

Eficiencia de conjugación de microesferas por FACS:

Para realizar un enfoque basado en la separación magné magnéticas recubiertas de antígeno. La eficiencia de la c flujo (Figura 13). Se usa Her2 purificado como antígeno microesferas con varias combinaciones de anticuerpos.

se marca con biotina. Las biotinas activadas por éster reactivo de biotinilación. Los ésteres de NHS reaccionan de pH 7-9 para formar enlaces amida estables. Debido a múltiples residuos de lisina (K) además del N-termin disponibles como dianas para el marcaje con reactivos del tamaño y distribución de los grupos amino en la prote de biotina 10 mM mezclando 2,2 mg de sulfo-NHS-biotin anti-Her2 en PBS 1X se prepara a una concentración d trastuzumab seguido de incubación durante 2 horas en se usa para desalar el exceso de moléculas de biotina estima mediante el uso de un espectrofotómetro y se en El rituximab, un anticuerpo no específico, también está biotinilación es de 2 mg/ml. La estreptavidina con fluo aprovechar el grado de biotinilación. 1 pl de microesfera anticuerpo, trastuzumab biotinilado, rituximab biotinilad hasta 100 pl con PBS 1X que contiene BSA al 0,5 %. L lavado con PBS 1X que contiene BSA al 0,5 %. Finalme estreptavidina-alexa633 en PBS 1X que contiene BSA al lecturas. Todos los experimentos de flujo se realizan me análisis se realiza mediante el uso del software BD Accur frontal y lateral fijan una puerta seguida de lectura de flu 000 puntos de datos para cada muestra.

Cribado:

o también debe decidirse en consecuencia para evitar

clones que se unen a una diana mejor que otros clones características son en su mayoría independientes. Esto dría conducir a la pérdida de diversidad de aglutinantes. na no relacionados.

ente, la relación de moléculas de antígeno a partículas vitar cualquier tipo de enriquecimiento inespecífico del 0 minutos.

acterias en 3 ml de medio LB y se cultiva a 37 °C hasta y se almacena a 50 °C en alícuotas de 3 ml cada una en s se diluyen en los etapas respectivas de 10-1 a 10-4. Se una de las alícuotas de agarosa y se mezclan seguido placas se incuban en una incubadora a 37 °C durante la iguiente. El número de moléculas tamizadas se calcula

mg correspondiente a ~108 microesferas y se disuelven se agita con vórtex durante 30 segundos seguido de otación continua. La suspensión se lava dos veces con en 100 pl de tampón de fosfato de sodio 0,1 M. Her2, uspensión de microesferas. Además, la suspensión se de amonio (sulfato de amonio 3 M). La mezcla se incuba ontinua. Después de la incubación, el tubo se coloca en nética. El soporte del imán (con el tubo en su lugar) se de que no queden microesferas en la tapa. Se elimina 1 ml de PBS 1X que contiene BSA (0,05 %). Finalmente, SA (0,05 %) y se usan en el tamizaje.

ara el tamizaje, se realiza la generación de microesferas gación se determina mediante el uso de un citómetro de experimentos comienzan con una incubación de ~105 presente descripción, el anticuerpo que se une al ligando -hidroxisuccinimida (NHS) son el tipo más popular de zmente con grupos amino primarios (-NH) en tampones s anticuerpos y otras proteínas generalmente contienen cada polipéptido, tienen múltiples aminas primarias dos por NHS. El grado de marcaje con biotina depende la cantidad de reactivo usado. Se prepara una solución 500 pl de agua. La solución de trastuzumab, anticuerpo g/ml. Se añaden 27 pl de solución de biotina a 1 ml de La columna de desalación Thermo Scientific ZebaSpin nidas de la solución. La concentración de proteína se tra que la concentración tiene un cambio insignificante. ilado y la estimación de la concentración después de la Alexa 633 se usa como anticuerpo secundario para y microesfera recubierta con ligando Her2 se mezcla sin na concentración de 0,05 mg/ml seguido por volumen zcla se incuba durante 2 horas en hielo seguido de un s microesferas se resuspenden en 25 pl de solución de % y el volumen se aumenta a 500 pl antes de tomar las el uso del citómetro de flujo Accuri C6, mientras que el En primer lugar, se observa que los datos de dispersión encia a través del filtro FLH4. Se recopilan al menos 10 Se inocula una sola colonia de la placa bacteriana TG1 37 °C hasta una DO600 =0,9 y esto se usa luego para la suspensión de 100 pl de microesferas magnéticas c temperatura ambiente. Se descongela una alícuota de l 250 pl (1/4 del volumen de suspensión del fago) de sol incuban en hielo durante 30 minutos, seguido de centrif El sobrenadante se descarta y los gránulos de fago suspensión de fagos (200 pl) a la microesfera conjug ambiente durante 2 h. Las microesferas se lavan al men % en PBS). Finalmente, las microesferas magnéticas u en 100 pl de PBS. Se mantienen aparte 10 pl de suspen Los 90 pl restantes de la suspensión se añaden a 2 ml de se incuba a 37 °C durante 1 hora. Después de la incuba a una concentración final de 25 pg/ml. Después de dos aumenta la concentración de ampicilina hasta una con mezcla en las células TG1 amplificadas con una MOI centrifugan bacterias infectadas con fagos auxiliares suplementado con 100 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml d minutos para la amplificación del fago. El cultivo bacteri 000 g. Los gránulos se descarta y el sobrenadante se añadiendo una solución de PEG/NaCL al sobrenadant durante 30 minutos en hielo, seguido de centrifugació sobrenadante se descarta y los gránulos se resuspende los 10 pl de suspensión de fagos amplificados para esti fago precipitado se almacena con glicerol al 50 % a -80

El ensayo de placa se realiza en cada etapa para aseg placa bacteriana TG1 se inocula en bacterias en 3 ml d prepara 0,7 % de agarosa en agua MQ y se almacena a El sobrenadante del fago y los gránulos se diluyen en lo diluido y 100 pl de células TG1 a cada una de las alícu inmediato en una placa de agar LB. Las placas se incub de placa se observa y se cuenta al día siguiente. El núm de placas observadas (Figura 14).

Aislamiento del ssDNA del fago y amplificación de la div

Se descongela un vial de fago amplificado y se le añade de esperma de salmón invirtiendo la mezcla varias ve transferir la agrupación tamizada al sistema de presenta ADNss de los aglutinantes debe aislarse en una cantid uso de ADN de esperma de salmón cortado y hervido m ADN de esperma de salmón se corta y se hierve antes libre de nucleasas hasta una concentración de 5 mg/ml calibre 22, 3 veces, y luego se hierve durante 5 minutos 20 °C para uso futuro. La mezcla, que contiene fagos, 000X rpm durante 10 minutos a 4 °C y se descarta el s no se vean gránulos de fagos, la mezcla se vuelve a ce se pipetea cuidadosamente dejando solo un gránulo. El de yoduro (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, yodu 250 pl de etanol al 100 % y se incuban durante la noche 30 minutos a 4 °C y se descarta el sobrenadante. El grá de secado del sedimento al aire. El gránulo que contien

La amplificación por PCR se realiza con un conjunto e correcto que es ~500 pb para Vh mientras que 450 pb pa en un número limitado evitando las posibilidades de incor se eluyen en gel y se digieren con Ncoly Notl para Vh

de la configuración del PCT se proporcionan en la Tabla

Ta estriada en 3 ml de medio LB seguido de incubación a ción por fagos. Se añaden 100 pl de MPBS al 0,5% a la adas con antígeno y se incuban durante 2 horas a oteca de fagos y las partículas de fago se precipitan con es de PEG/NaCl (PEG 8000 al 20% y NaCl 2,5 M) y se ón del fago precipitado a 10000x g durante 10 minutos. suspenden en 200 pl de solución de PBS. Se añade on antígeno y se incuba en un rotador a temperatura s veces con 1 ml de PBST al 0,05 % (Tween-20 al 0,05 con aglutinantes de partículas de fagos se resuspenden de microesferas para el ensayo de placas más adelante. ivo de células TG1 preparadas anteriormente y la mezcla se diluye en 10 ml de medio LB que contiene ampicilina más de incubación a 37 °C con agitación a 250 rpm, se ación final de 100 pg/ml. M13KO7, un fago auxiliar, se 10 y se incuba a 37 °C durante otros 30 minutos. Se s gránulos se resuspenden en 10 ml de medio LB amicina seguido de una incubación a 30 °C durante 90 e granula mediante centrifugación durante 10 min a 10 ara la precipitación de moléculas de fago amplificadas 4 de volumen de sobrenadante). La mezcla se incuba l fago precipitado a 10 000 g durante 10 minutos. El 1 ml de PBS. El ensayo de placas se realiza a partir de número de fagos amplificados, mientras que el resto del un congelador para almacenamiento a largo plazo.

l número de partículas de fagos. Una sola colonia de la dio LB y se cultiva a 37 °C hasta una DO600 = 0,9. Se en alícuotas de 3 ml cada una en 15 ml de tubos Falcon. as respectivas de 10-1 a 10-4. Se añaden 100 pl de fago de agarosa y se mezclan seguido de un esparcimiento una incubadora a 37 °C durante la noche. La formación e moléculas tamizadas se calcula en función del número

ad de cadenas pesadas y ligeras mediante la PCR:

0 pl de PEG al 20 %/NaCl 2,5 M junto con 5 pg de ADN luego se deja reposar a 4 °C durante 2 horas. (Para en levadura para una mayor selección y clasificación, el ficiente para que represente la diversidad tamizada. El específicamente el rendimiento del ADNss tamizado). El uso. El ADN de salmón se pesa y se mezcla con agua ADN se corta con una mezcla suave con una aguja de más, el ADN fragmentado se almacena en alícuotas a -NaCl y ADN de esperma de salmón, se centrifuga a 14 adante. El punto a señalar aquí es que en caso de que gar brevemente a la misma velocidad. El sobrenadante ulo se resuspende completamente en 100 pl de tampón sodio 4 M (Nal) agitando el tubo con vórtex. Se añaden °C. La preparación se centrifuga a 14000 rpm durante se lava dos veces con 0,5 ml de etanol al 70 % seguido ss se resuspende en 20 pl de agua libre de nucleasas.

fico de cebadores Vh, Vl y Vk y se amplifica al tamaño y Vl (Figura 15). El uso de ciclos de la PCR se mantiene ión de mutaciones mediada por la PCR. Los amplicones as que para Vk o Vl, se usan HindIII y AscI. Los detalles

3:

Construcción de bibliotecas de cadenas pesadas y ligera

El plan de toda la estrategia es transferir los aglutinantes e para realizar el cribado y la clasificación en el sistema de l el uso de un método compatible, es decir, FACS para sel

Como elección del formato de anticuerpo, se prefiere el de cribado de afinidad de alto rendimiento para prepa desarrolla aprovechando el sistema de apareamiento e cadenas pesadas se clonan en diferentes vectores de ex de cadenas ligeras kappa y lambda de moléculas tamiz diseñado y generado exclusivamente para cadenas lig transformación individualmente en TG1, células altament

Igualmente, la agrupación de cadenas de CP y el vector transformación en TG1, células altamente competentes. tamizada de cadena pesada y ligera es > 107 ufc. Adem que se generan con características exclusivas que son formatos de los fragmentos de anticuerpos presentados de variables transferidas permanece constante en todo

Las colonias transformadas obtenidas para las bibliote liberación de la inserción mediante el uso de NcoI/NotI antes de que se raspen para la preparación de reserva d confirmó la presencia de moléculas tamizadas. Las rese tablas 12, 13 y 14 proporcionan componentes aplicables

Ta n vectores lanzadera de levadura:

ecíficos de los vectores de expresión de fagos a levaduras dura. Se emplea un método basado en afinidad mediante ionar y clasificar los mejores aglutinantes.

ya que esto impulsaría el desarrollo de ensayos rápidos iones de anticuerpos crudos. La biblioteca de Fab se onde la biblioteca de cadenas ligeras y la biblioteca de sión de levadura. Sin embargo, la agrupación de la PCR as junto con el vector de expresión de levadura interno s se digieren con HindIII y AscI seguido de ligación y ompetentes.

pectivo se digieren con Ncol y NotI seguido de ligación y eficiencia de transformación obtenida para la biblioteca de estos vectores, existen varios vectores de expresión unes a todos los vectores; por el contrario, aunque los la superficie de la levadura pueden variar pero el conjunto ento.

de cadenas pesadas y ligeras se comprueban para la ra cadenas pesadas y HindIII/AscI para la cadena ligera licerol. La liberación de la inserción para ambas cadenas s de glicerol se almacenan a -80 °C para uso futuro. Las la construcción de bibliotecas en vector de levadura.

14:

Ta 15:

Ta 16:

La mezcla de ligación anterior se incubó a 4 °C durante transformó en TG1 mediante el método de electroporaci

Transformación de la biblioteca de cadenas pesadas y

Se realiza una gran cantidad de aislamiento de ADN restricción con las enzimas respectivas para la confirm cada ADN y se transforma en células de levadura a ~5 Con respecto a las cepas para la transformación, EBY1 celular de la biblioteca de cadenas pesadas, mientras ligeras.

Más específicamente, las células de levadura en 5 ml de El cultivo de una noche se diluye hasta una DO600 ~0, x 106-2 x 107 células/ml o DO600 de 0,8-1,0). Las célul minutos y se desecha el sobrenadante. Se agrega 1 ml d a granular y se desecha el sobrenadante. Se añaden mezclan 400 pl de células competentes con 1 pg de ADN EZ 3 y se mezclan completamente. Dicha mezcla se in se lleva a cabo una mezcla vigorosa agitando con el d 100 pl de la mezcla de transformación anterior en una se incuban a 30 °C durante 2-4 días para permitir el cr cadena pesada como de cadena ligera se transforman una eficiencia > 106.

Construcción de biblioteca diploide de levadura a través

Para presentar el formato Fab de la biblioteca en la sup cultivadas que representan las bibliotecas de cadena pe haploides. La eficiencia de apareamiento se calcula c selectividad dividido por el número de colonias totales e apareamiento calculado es ~40 %. Además, las células antes de cualquier análisis de crecimiento y expresión.

Más específicamente, los transformantes EBY100-ura p414GAL1 y los transformantes YVH10 (MATa) que co durante la noche a 30 °C y 220 rpm en 5 ml del medio eliminación de Ura respectivamente. Luego, las células =0,3 en medios recién preparados por encima de los m ópticas de ~1,2-1,8. El apareamiento de las dos células células (DO 1,0) mediante la agitación en vórtex, exten durante la noche. Las células se recogen raspando sua Ura Trp de doble selectividad y se granulan mediante c mediante resuspensión con 1 ml de agua desionizada frí restantes del medio. Para estimar la eficiencia de apar total de 1 ml de medio de glucosa con carencia doble d agar de glucosa con carencia doble de Trp Ura de doble y placas de agar de glucosa de eliminación de Ura. La número de colonias. El porcentaje de la eficiencia de a en las placas de doble selectividad dividido por el núm Para enriquecer los diploides, las células se inoculan a una densidad celular muy baja de DO600 = 0,1 y se cult

Expresión de genes de anticuerpos y análisis de clasific

La biblioteca 2N de Saccharomyces cerevisiae que tien y la agrupación de cadenas ligeras se inoculan en 10 ml oche, se limpió con el kit de purificación de la PCR y se

as ligeras

ídico para ambas bibliotecas seguido de digestión por (Figuras 16 y 17). Tras la validación, se toma 1 pg de 66-2 x 107 células/ml por el método de electroporación. usa como huésped para la presentación en la superficie YVH10 se usa para expresar la biblioteca de cadenas

YPD se cultivan durante la noche a 30 °C con agitación. en 10 ml y se cultiva hasta la fase media logarítmica (~5 la fase logarítmica media se granulan a 500 g durante 4 ción EZ 1 para lavar los gránulos. Las células se vuelven pl de solución EZ 2 para resuspender los gránulos. Se menos de 5 pl de volumen); se añaden 500 pl de solución a 30 °C durante 1-1,30 horas. Durante esta incubación, agitando con vórtex cada 15-20 minutos. Se siembran de glucosa sintética de desecho apropiada. Las placas ento de transformantes. Tanto la biblioteca tamizada de xito en cepas de levadura (EBY100-ura3ú y YVH10) con

pareamiento de levadura:

, se realiza el apareamiento de las dos células haploides y de cadena ligera mezclando un igual número de células l número de colonias diploides en las placas de doble placas de selectividad simple en donde el porcentaje de ides se enriquecen en medios de doble caída (ura-, Trp-)

ATa) que contienen la biblioteca tamizada de CP en n la biblioteca tamizada de CL en p416GAL1 se cultivan cosa con eliminación de Trp y el medio de glucosa con ides se vuelven a inocular a la DO600 inicial de la célula selectivos y se cultivan hasta que alcanzan densidades ides cultivadas se realiza mezclando un igual número de olas en una placa de agar YPD y la incubación a 30 °C te con 1 ml del medio de glucosa con carencia doble de gación (2500 g durante 3 minutos). Las células se lavan erilizada y se centrifugan para eliminar los componentes nto, las células lavadas se resuspenden en un volumen Trp, se diluyen en serie y se extienden sobre placas de tividad, placas de agar de glucosa de eliminación de Trp cas se incuban a 30 °C durante 2-3 días y se cuenta el miento se calcula como el número de colonias diploides e colonias totales en las placas de selectividad simple. uación en medio de glucosa doble eliminación Trp Ura a a 30 °C durante 24 horas, siempre que sea necesario.

de flujo de células de levadura:

midos que expresan la agrupación de cadenas pesadas edio con carencia doble de Ura TrpSDCAA y se cultivan durante la noche a 30 °C (16-20 horas). La DO600nm de se inocula en 10 ml de medio de glucosa con carencia d 2XSGCAA (cultivo inducido) de manera que la DO600 inducidas se cultivan durante diferentes puntos de tiemp

Para los estudios de clasificación, la unión del antígeno y se selecciona y clasifica en función de los eventos p antígeno biotinilado. Se prepara una solución de biotina agua. El antígeno, la solución de Her2 en PBS 1X se pr 20 veces que mide una solución de biotina 0,28 mM se seguido de una incubación durante 2 horas en hielo. La para desalar el exceso de moléculas de biotina no unida biotinilada es de 0,56 mg/ml. Se usa una concentra experimentos de unión. La biblioteca diploide de levadura pesadas y la agrupación de cadenas ligeras se inoculan y se cultivan durante la noche a 30 °C (16-20 horas). La consecuencia se inocula en 10 ml de medio de glucosa c medio de galactosa con carencia doble de Ura Trp (culti 0,2 a 0,3. Las células de levadura inducidas y no inducid 48 horas a 20 °C. Para recurrir, las células de levadura s de glucosa con carencia doble de Ura-Trp y se incuban cultivadas en placa de glucosa-Ura-Trp, se recurren a la anteriormente y se repiten después de 24 horas de indu

Para todos los análisis de flujo, se prepara tampón de transferencia de 4x 105 células (inducidas/no inducidas) durante 2 minutos a 4 °C. El sobrenadante se elimina anticuerpos primarios (Anti-His para cadena ligera, anti para Her2 biotinilado) a las muestras y se incubaron a 4 de anticuerpos a realizar en tampón de marcado). Se muestra y después se lavan las células dos veces con ta conjugado con fluoróforo en los tubos de muestra. Las se lavan dos veces como se mencionó anteriormente co en 350 j l de PBS 1X seguido del análisis de las muestra

La expresión de cadena ligera y cadena pesada se obs ligera es probada por el anticuerpo anti-His y se encuen probada con el anticuerpo anti-c-Myc aparece en el cuad 7,2 (Figura 18). Este resultado indica la formación de Fab mientras que se clasifica el marcador de cadena ligera, l que es positiva ante la tinción del antígeno Her2 mientras con los resultados encontrados y compartidos por otros i seleccionados con marcador auxotrófico dual expresan l

Amplificación de cadena pesada y cadena ligera de diplo

Las colonias diploides de levadura cultivadas en placas y la cadena ligera. Para la PCR de colonias, las célula continuación, las células se centrifugan y el sobrenada PCR se purifican y luego se eluyen en gel y se envían p respectivos indicó que las células son verdaderamente di (Figura 20). Como prueba de confirmación, se realiza un y la cadena ligera se amplifican con un par específico d V^l (Tabla 17). Los resultados de la secuencia se analiza las cadenas pesada y ligera de anticuerpos.

Ta ivo crecido durante la noche se mide y en consecuencia e SDCAAUra Trp (cultivo no inducido) y 10 ml de medio nal se vuelve de 0,2 a 0,3. Las células inducidas y no varían de 24 a 48 horas a 20 °C.

onitorea mediante el uso del antígeno biotinilado (Her2) os para la doble tinción que es la cadena pesada y el M mezclando 2,2 mg de sulfo-NHS-biotina con 500 |jl de a a una concentración de 1 mg/ml. Un exceso molar de de a 1 ml de solución de Her2 para iniciar la reacción, mna de desalación Thermo Scientific ZebaSpin se usa la solución. Se encuentra que la concentración de Her2 de 500 nM de antígeno biotinilado para realizar los tiene plásmidos que expresan la agrupación de cadenas ml de medio de glucosa con carencia doble de Ura Trp 00nm del cultivo crecido durante la noche se mide y en arencia doble de Ura Trp (cultivo no inducido) y 10 ml de ducido) de manera que la DO600nm final se vuelve de cultivan durante diferentes tiempos que varían de 24 a gen, se cultivan en medio YPD y se siembran en placas °C durante 2-3 días. Las células de levadura diploides etría de flujo con un procedimiento similar mencionado a 20 °C.

do, PBS 1X que contiene BSA al 0,5 %, seguido de la 100 j l de LB. Las células se centrifugan a 10 000 rpm cuidado sin alterar las células. Se agregaron 25 j l de o Anti-c-Myc para cadena pesada y STREP-Alexa 633 rante 30 minutos (todas las preparaciones de diluciones en otros 100 j l de tampón de marcado a los tubos de de marcado. Se mezclan 25 j l de anticuerpo secundario tras se incuban a 4 °C durante 20 minutos. Las células j l de tampón de marcado y las células se resuspenden un citómetro de flujo (Figura 18).

en porcentajes significativos. La expresión de la cadena 7 % (Figura 18) mientras que la cadena pesada que es doble positivo con Her2 biotinilado en un porcentaje de unión exitosa del mismo con el antígeno diana. Además, iquetas anti-His y V5 también se explora y se encuentra el porcentaje es ~4 % (Figura 19). Esto está de acuerdo igadores. Este resultado también indica que los diploides ena ligera asociada con la cadena pesada.

cosa UraTrp' se usan para amplificar la cadena pesada tratan con SDS al 0,1% a 95 °C durante 5 minutos. A utiliza como patrón. Las muestras amplificadas por la ecuenciación. La aparición de amplicones con tamaños es y contienen tanto cadena pesada como cadena ligera erimento basado en la PCR en donde la cadena pesada adores. Se usan dos conjuntos de cebadores para V^h y os resultados coinciden con los de la región variable de

7:

Estudios de unión In vitro de agrupaciones de biblioteca ificadas con antígeno Her2: La biblioteca combinatoria de levadura se crea mediante la selección contra Her2, el antígeno diana. Las células en medio YPD y se siembran en placas de glucosa con c días. Además, las células se inoculan en medio Trp-Gluco de 48 horas de inducción, se mide la DO de los cultivos.

107) son usados para la escisión de la proteasa TEV y c la enzima. Las mezclas de reacción se preparan como si

Tab areamiento de células haploides y es usada luego para positivas para uniones con Her2 y c-Myc se clasifican cia doble de Ura-Trp y se incuban a 30 °C durante 2-3 no inducido) y medio Trp-Galactosa (inducido). Después rentes números de células (1,2 X 107, 2,4 X 107, 4,8 X una se trata con 1 unidad, 5 unidades y 10 unidades de

8:

La mezcla de reacción se incuba a 30 °C, a 220 rpm dura centrifugan a 4000 rpm durante 10 minutos y los sobrena

Para el experimento de ELISA, las placas se recubren con recubiertas se lavan dos veces con 200 pl de PBST, se bloqueo en un balancín. A esto le siguen dos lavados co °C.

Las placas se lavan de nuevo dos veces con 200 pl de PB (sobrenadante recogido después de la escisión con TEV) 1 hora seguido de dos lavados con PBST de 200 pl. Las ambiente durante 1 hora en condición de balanceo segui con anticuerpo secundario a temperatura ambiente. A c reacción se desarrolla mediante el uso de 100 pl de sustr 50 pL de H² SO⁴ IN. Se usa Herclon® como estándar par

Las construcciones de levadura se generan de tal manera Aga2p, por escisión de proteasa TEV. El fragmento de a Esta característica se introduce en la estrategia para ayu

Para liberar los fragmentos de anticuerpo, varios número 4,8 X 107 se tratan con 1 unidad, 5 unidades y 10 unida confirma adicionalmente mediante experimentos de ELIS

Los experimentos de ELISA se realizan contra placas r sondar la cadena pesada y Herclon® para sondar dir secundario. Para la reacción de unión se usa un volumen

Se usa una preparación idéntica para los experimentos llevan a cabo controles apropiados para descartar cual respuesta de unión para los resultados experimentales d

Ventajas del enfoque empleado por la presente descripci

1. La biblioteca sin exposición previa al antígeno obteni mayor diversidad de anticuerpos considerando que la diversas, preferentemente una población india. La div repertorio de anticuerpos específicos de la población. Est la biblioteca de anticuerpos.

2. La presente descripción emplea una combinación de pr que permite cribar un gran tamaño de biblioteca (más de del anticuerpo debido a las modificaciones postraduccion 4,5-5 horas. Después de la incubación, las muestras se es se almacenan a 2-8 °C.

pl de Her21pg/ml durante la noche a 2-8 °C. Las placas o de 2 horas de incubación con 300 pl de tampón de 0 pl de PBST. Las placas se secan y almacenan a 2-8

Se añaden a la placa diferentes diluciones de la muestra e incuban a temperatura ambiente en balanceo durante tras se incuban con el anticuerpo primario a temperatura e lavados con PBST. Además, las muestras se incuban nuación, las placas se lavan con 200 pl de PBST y la MB. Después del desarrollo, la reacción se detiene con ISA y se procesa como se mencionó anteriormente.

puedan ser liberadas de la proteína de anclaje, es decir, erpo liberado es usado para estudios de unión in vitro. la selección de clones en función de la afinidad.

células de levadura que varían desde 1,2 X 107 hasta de la enzima proteasa TEV y el anticuerpo liberado se SPR.

iertas con antígeno Her2 en donde el anti-FLAG para ente el antígeno Her2 son usados como anticuerpo ciente de sobrenadante tratado con proteasa TEV.

nión de Her2 mediante el uso de Biacore. También se r respuesta engañosa. Se observa un aumento de la ISA y Biacore (Figuras 21 y 22).

or el método de la presente descripción albergará una uestras se recolectan de poblaciones genéticamente ad de muestras en este estudio permitirá buscar un actualmente un recurso sin aprovechar en el espacio de

tación de anticuerpos de superficie de levadura y fagos, clones) y facilita un mejor plegamiento de la estructura de la levadura.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un método para generar una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno o una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada, dicho método comprende

   el procesamiento de muestras biológicas que comprenden una agrupación de genes de anticuerpos para aislar una pluralidad de ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) un repertorio de anticuerpos de origen natural, seguido de amplificación,

   la introducción de marcadores de secuencia de trinucleótido específicos en el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la cadena pesada del repertorio de anticuerpos para catalogar el producto de la agrupación de genes respectiva y permitir el rastreo del anticuerpo presentado hasta la agrupación de genes de anticuerpos de origen, en donde el marcador de secuencia de trinucleótido codifica el aminoácido respectivo idéntico al codificado originalmente por dicho ácido nucleico, la agrupación del(de los) producto(s) amplificado(s) que tiene(n) los marcadores de secuencia de trinucleótido de diferentes muestras y la clonación de dicho(s) producto(s) amplificado(s) en vectores fagémidos para obtener una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno,

   la presentación del anticuerpo en el fago seguido de cribado del anticuerpo presentado contra el(los) antígeno(s) específico(s) para eliminar los anticuerpos no aglutinantes de antígeno(s) específico(s) y para obtener una agrupación seleccionada de moléculas de anticuerpos contra antígeno(s) específico(s), la transferencia del(de los) ácido(s) nucleico(s) de las moléculas de anticuerpo seleccionadas a levadura para la presentación de dichas moléculas de anticuerpo en la superficie de la levadura, seguido del cribado del anticuerpo presentado en la levadura contra la(s) diana(s) antigénica(s) específica(s), y

   la selección de los anticuerpos presentados en la levadura que muestran una afinidad mayor por el antígeno diana para formar la biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada o el aislamiento de los anticuerpos seleccionados con las propiedades funcionales deseadas de la biblioteca de anticuerpos en fago o la biblioteca de anticuerpos en levadura para generar la biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno cribada.
2. 2. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se selecciona de un grupo que comprende sangre o cualquier muestra que exprese genes de anticuerpos; y en donde la muestra biológica se obtiene de donantes o sujetos sanos seleccionados, en donde el criterio de selección se basa en la diversidad del idioma hablado, la etnia o la ubicación geográfica de dichos donantes o sujetos; y en donde los sujetos son humanos; y

   en donde, el procesamiento de la muestra biológica implica aislar células mononucleares de sangre periférica seleccionadas de un grupo que comprende linfocitos, monocitos, plaquetas y granulocitos o cualquiera de sus combinaciones a partir de la muestra de sangre seguido de la estimación de la población de células B sin exposición previa al antígeno mediante citometría de flujo; y

   en donde la estimación de la población de células B sin exposición previa al antígeno se lleva a cabo al identificar la expresión diferencial de marcadores de la superficie celular o intracelulares seleccionados de un grupo que comprende IgD, CD20, CD19, CD27, CD24 y CD38 o cualquiera de sus combinaciones; y en donde se obtiene una población de células B sin exposición previa al antígeno de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 15 % de las PBMC totales.
3. 3. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el aislamiento del(de los) ácido(s) nucleico(s) incluye el aislamiento de ARNm, seguido de la generación de ADNc.
4. 4. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la amplificación implica una amplificación por PCR primaria seguida de una amplificación por PCR secundaria mediante el empleo de cualquiera de los cebadores redundantes o de sus combinaciones indicados como la SEQ ID NO 1 a 68, y

   en donde la amplificación por PCR se lleva a cabo durante aproximadamente 18 ciclos a aproximadamente 25 ciclos, cada ciclo con una etapa de desnaturalización durante aproximadamente 1 min a aproximadamente 2 min a aproximadamente 94 °C seguido de una etapa de hibridación durante aproximadamente 1 min a aproximadamente 2 min a aproximadamente 50 °C y una etapa de extensión durante aproximadamente 50 s a aproximadamente 90 s a aproximadamente 72 °C; y en donde los productos de PCR obtenidos después de la amplificación se purifican opcionalmente.
5. 5. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la clonación en fago o directamente en levadura implica la clonación de la cadena ligera del anticuerpo seguida de la clonación de la cadena pesada del anticuerpo, ambas con una eficiencia de transformación de aproximadamente 108 a 1010, preferentemente 108; y en donde la clonación en fago produce un número estimado de partículas de fagos en la biblioteca en el intervalo de 1010 a aproximadamente 1011 pfu/ml.
6. 6. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el cribado para obtener la biblioteca de fagos implica el tamizaje con antígenos revestidos sobre microesferas magnéticas para aislar el anticuerpo de interés; y en donde dicho cribado/tamizaje de presentación en fago se emplea para eliminar los anticuerpos no aglutinantes.
7. 7. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el formato de anticuerpo se selecciona de un grupo que comprende Fab o ScFv; y

   en donde el cribado para obtener la biblioteca de levaduras mediante la presentación en la superficie se lleva a cabo mediante el empleo de epítopos antigénicos competidores, conformación de paratopos de anticuerpos, secuencias y motivos de secuencia o cualquiera de sus combinaciones para aislar la molécula Fab o ScFv mediante el uso de sitios de escisión con proteasa seleccionados de un grupo que comprende el virus del grabado del tabaco (TEV), enteroquinasa, trombina, factor X a, proteasa HRV 3C y proteínas de escisión proteasas similares o cualquiera de sus combinaciones.
8. 8. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la presentación de la biblioteca de anticuerpos en la superficie de la levadura implica el aislamiento de ADN plasmídico de la biblioteca de fagos seguido de digestión por restricción, clonación y transformación en células de levadura haploides o en células de levadura diploides mediante el apareamiento de dos células de levadura haploides.
9. 9. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la transferencia se realiza mediante la transformación de los genes cribados en levadura, con una eficiencia de transformación de aproximadamente 108 a aproximadamente 1010.
10. 10. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el cribado de presentación en levadura se emplea para ejecutar una selección en función de la afinidad, la clasificación de anticuerpos aglutinantes; y en donde los anticuerpos/genes se seleccionan en función de su unión con antígenos mediante el empleo de técnicas/tecnologías seleccionadas de un grupo que comprende citometría de flujo, ELISA, plataformas de detección basadas en microesferas, formación de imágenes y SPR o cualquiera de sus combinaciones.
11. 11. El método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al antígeno es una colección de los anticuerpos/genes expresados en la superficie del fago o la levadura, o es una colección de los anticuerpos/genes aislados del fago o la levadura o una de sus combinaciones; y en donde la biblioteca de anticuerpos sin exposición previa al antígeno comprende de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 clones.
12. 12. Una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno obtenida mediante el método de la reivindicación 1.
13. 13. La biblioteca de expresión génica de anticuerpos sin exposición previa al antígeno de la reivindicación 12, en donde la biblioteca se obtiene por amplificación del(de los) ácido(s) nucleico(s) aislado(s) de muestras biológicas mediante el uso de la(s) secuencia(s) de cebador(es) indicada(s) como cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 68; y

    en donde la(s) secuencia(s) abarca(n) etiquetas de secuencia de trinucleótido para catalogar genes de anticuerpos de ubicaciones geográficas respectivas, lo que permite rastrear los genes de anticuerpos hasta la agrupación de genes de anticuerpos original.
14. 14. La biblioteca de expresión génica de anticuerpos sin exposición previa al antígeno de la reivindicación 12 o como se obtiene mediante el método de la reivindicación 1 para su uso en el método para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de un grupo que comprende cáncer, artritis reumatoide, trastornos neurológicos, enfermedades infecciosas y trastornos metabólicos o cualquiera de sus combinaciones; como diagnóstico; como pronóstico; para fines de investigación; descubrimiento de dianas; validación en genómica funcional o cualquier aplicación donde se empleen anticuerpos o derivados de anticuerpos.
15. 15. Una biblioteca de expresión génica de anticuerpos monoclonales sin exposición previa al antígeno, dicha biblioteca comprende ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) un repertorio de anticuerpos de origen natural, en donde el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la cadena pesada comprende(n) un marcador trinucleotídico colocado estratégicamente para catalogar la cadena pesada de la agrupación de genes respectiva, y permitir el rastreo del anticuerpo expresado hasta la agrupación de genes del anticuerpo de origen, en donde el marcador de secuencia de trinucleótido codifica el aminoácido respectivo idéntico al codificado originalmente por dicho ácido nucleico.