WO2017026532A1 - 抗原特異的モノクローナル抗体作製方法 - Google Patents

抗原特異的モノクローナル抗体作製方法 Download PDF

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信幸 黒澤
正治 磯部
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    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating cells having the ability to produce a target antigen-specific monoclonal antibody and a method for producing a target antigen-specific monoclonal antibody using cells separated by this method.
  • Antibody is a central molecule of biological defense and has been used as an important tool in research and diagnosis. Furthermore, in recent years, antibody drugs using antibodies as pharmaceuticals have been remarkably effective as new therapeutic drugs. In order to acquire new antibodies that can be used as pharmaceuticals more quickly and more reliably, it is necessary to establish a production base through the introduction of new technologies.
  • a method of separating a single antigen-specific plasma cell is used.
  • methods for separating a single antigen-specific plasma cell a method using an antibody secreted from a single plasma cell or a method using an antibody expressed on the surface of a single plasma cell has been proposed. ing.
  • Patent Document 1 discloses a fluorescent probe for plasma cell identification and isolation and a plasma cell identification or isolation method using this probe. Furthermore, Patent Document 2 discloses a method for producing a target antigen-specific antibody from plasma cells isolated using this method.
  • Non-Patent Document 1 describes the efficient production of monoclonal antibodies from single human B cells by single-cell RT-PCR and expression vector cloning (Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning) is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 discloses cloning and expression of murine Ig genes from single human B cells (Cloning and expression of murine and IgGenes from single and B cells).
  • Non-Patent Document 3 discloses rapid isolation of antigen-specific antibody-secreting cells using a chip-based immunospot array (Rapid isolation-antibody-secreting cells-using-a-chip-based immunospot array).
  • Patent Document 1 WO2011 / 118579 (PCT / JP2011 / 56831)
  • Patent Document 2 WO2012 / 133572 (PCT / JP2012 / 058216)
  • Non-Patent Document 1 Thomas Tiller et al., Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124
  • Non-Patent Document 2 Thomas Tiller et al., Journal of Immunological Methods 350 (2009) 183-193
  • Non-Patent Document 3 Jin A et al., Nat Protoc. (2011) 6 (5) 668-76.
  • Non-Patent Document 4 Kurosaw et al., BMC Biol.
  • Non-Patent Document 5 Isolation of full-size mRNA from cells sorted by flow cytometry (J Biochem Biophys Methods, 1999)
  • Non-Patent Document 6 MARIS: Method for Analyzing RNA following Intracellular Sorting (PLOS one, 2014)
  • PLOS one Intracellular Sorting
  • Patent Document 1 The method described in Patent Document 1 is a method capable of separating plasma cells from various animals. However, when the present inventors examined, it was difficult to isolate
  • Non-Patent Documents 1 and 2 are mouse and human monoclonal antibody production methods using recombinant DNA technology. However, this method could not be applied to animal species other than mice and humans. Furthermore, this method has a problem that antigen-specific clones cannot be selected.
  • Non-Patent Document 3 is a method capable of selecting antigen-specific clones in mice and humans. However, it was necessary to create a complicated device for selecting antigen-specific clones, and plasma cells had to be concentrated as a pretreatment.
  • Non-Patent Document 4 is a method capable of selecting antigen-specific clones from various animals.
  • the amount of antibody secreted from a single cell or expressed on the membrane is extremely small. Therefore, the antigen-specific plasma cell separation method using a signal obtained by binding a labeled antigen to these antibody molecules still has many problems in both accuracy and sensitivity. For this reason, when the content rate of the antigen-specific plasma cell in the cell group is 0.01% or less, there is a problem that it is impossible to select a highly accurate antigen-specific clone.
  • the present invention is a method capable of separating with high accuracy at least one cell having the ability to produce a target antigen-specific monoclonal antibody from various animals without using a complicated method, and has been separated by this method. It is an object of the present invention to provide a method capable of producing a target antigen-specific monoclonal antibody from various animals using at least one cell without using a complicated method and with high accuracy. Another object of the present invention is to obtain a novel target antigen-specific monoclonal antibody.
  • Non-patent Document 4 It is known that antibodies of 1000 times or more are stored in the cytoplasm of antibody-producing cells compared to antibodies expressed on the membrane.
  • the present inventors pay attention to this point, and when a signal is obtained by binding a labeled antigen to the antibody in the cytoplasm, the obtained signal is obtained by binding the labeled antigen to the membrane antibody. I guessed it was very strong compared to the signal.
  • pretreatment such as protein immobilization using a crosslinking agent and membrane permeation treatment using a surfactant is required. Inferred.
  • Non-Patent Documents 5 and 6 Non-Patent Documents 5 and 6).
  • the present inventors conducted various studies to break through the extremely difficult situation. Among them, antigen-specific plasma cells were identified and isolated from the cell population that had been fixed with a reversible cross-linking agent, membrane permeabilized, and stained with labeled antigen, and the immunoglobulin variable region gene was cloned from this. As a result, a new method for producing an antigen-specific monoclonal antibody was developed and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows. [1] A step of immobilizing a cell group containing antibody-producing cells with a crosslinking agent (immobilization step), provided that the crosslinking agent is a reversible crosslinking agent having cell membrane permeability.
  • cell membrane lysis step (2) a step of treating the immobilized cells with a surfactant (cell membrane lysis step), (3) a step of reacting a cell membrane lysed cell group with a labeled target antigen (hereinafter, labeled target antigen) (staining step), (However, the cell membrane lysis step (2) and the staining step (3) can be performed sequentially or in parallel.) (4) a step of separating at least one cell that has reacted with the labeled target antigen in the cell group that has undergone the staining step (cell isolation step); A method for separating cells having the ability to produce a target antigen-specific monoclonal antibody.
  • [6] (5) a step of preparing mRNA by separating mRNA from at least one cell separated by the method according to any one of [1] to [5] (cDNA preparation step), (6) a step of preparing an antigen-specific monoclonal antibody or a fragment thereof from the cDNA prepared in the cDNA preparation step (target antigen-specific monoclonal antibody preparation step),
  • a method for producing a target antigen-specific monoclonal antibody comprising: [7] The method according to [6], wherein at least step (5) is performed in the presence of an RNase inhibitor.
  • [8] The method according to [6] or [7], wherein the mRNA is separated from 10 or less separated antibody-producing cells.
  • Threonine 18 comprising a ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 each having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 5 and a ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 each having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 6 to 8 Phosphorylated p53 (pT18-p53) specific monoclonal antibody.
  • a threonine 68 phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) -specific monoclonal antibody having a ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 as a variable region or a ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 as a variable region.
  • Threonine 68 comprising a ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 each having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 11 to 13 and a ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 each having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 14 to 16 Phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) specific monoclonal antibody.
  • At least one cell having the ability to produce a target antigen-specific monoclonal antibody is isolated with high accuracy without using a complicated method without restriction by the animal species used for immunization (hereinafter, referred to as the following). Separation of at least one cell may be expressed as isolating the cell), and using the isolated cell to produce a target antigen-specific monoclonal antibody Can provide a possible method.
  • the present invention provides new possibilities for the development of antibody drugs / diagnostic drugs for target molecules that have been difficult to produce with existing techniques.
  • a novel threonine 18 phosphorylated p53 (pT18-p53) specific monoclonal antibody and a threonine 68 phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) specific monoclonal antibody are provided.
  • Example 2 shows a fluorescence micrograph of Example 1 (A).
  • the electrophoresis image of (B) of Example 1 is shown.
  • the result of FACS method of (C) of Example 1 is shown.
  • the electrophoresis image of (D) of Example 1 is shown.
  • the amplification success rate of (E) in Example 1 is shown.
  • the result of FACS method of (A) of Example 2 is shown.
  • the result of FACS method of (B) of Example 2 is shown.
  • the electrophoresis image of (C) of Example 2 is shown.
  • the amplification success rate of Example 2 (D) is shown.
  • the fluorescence micrograph of (A) of Example 3 is shown.
  • the result of FACS method of (B) of Example 3 is shown.
  • the electrophoresis image of (C) of Example 3 is shown.
  • the specificity analysis result by ELISA method of Example 3 (D) is shown.
  • the result of FACS method of (A) of comparative example 1 is shown.
  • the electrophoresis image of (B) of the comparative example 1 is shown.
  • the specificity analysis result by ELISA method of (C) of the comparative example 1 is shown.
  • the fluorescence micrograph after the immuno-staining of (E) of Example 3 is shown.
  • the fluorescence micrograph after the immuno-staining of (E) of Example 3 is shown.
  • the result of the Western blot of (E) of Example 3 is shown.
  • the result of the Western blot of (E) of Example 3 is shown.
  • Example 3 The (F) surface plasmon resonance SPR measurement result of Example 3 is shown.
  • the result of FACS method of (A) of Example 4 is shown.
  • the specificity analysis result by ELISA method of (B) of Example 4 is shown.
  • the fluorescence micrograph of (C) of Example 4 is shown.
  • the fluorescence micrograph of (D) of Example 4 is shown.
  • the result of the surface plasmon resonance SPR measurement of (E) in Example 4 is shown.
  • the method for isolating cells capable of producing an antigen-specific monoclonal antibody of the present invention includes the following steps (1) to (4).
  • a step of immobilizing a cell group containing antibody-producing cells with a crosslinking agent immobilization step, provided that the crosslinking agent is a reversible crosslinking agent having cell membrane permeability.
  • a step of treating the immobilized cells with a surfactant (cell membrane lysis step), (3) a step of reacting a cell membrane lysed cell group with a labeled target antigen (hereinafter labeled target antigen) (staining step), (However, the cell membrane lysis step (2) and the staining step (3) can be performed sequentially or in parallel.)
  • a step of isolating at least one cell that has reacted with the labeled target antigen in the cell group that has undergone the staining step (cell isolation step).
  • the method for producing a target antigen-specific monoclonal antibody of the present invention includes the following (5) and (6).
  • (5) A step of removing mRNA from at least one cell isolated by the cell isolation method of the present invention to prepare cDNA (cDNA preparation step), (6)
  • (6) A step of preparing an antigen-specific monoclonal antibody or a fragment thereof from the cDNA prepared in the cDNA preparation step (target antigen-specific monoclonal antibody preparation step).
  • Immobilization process In an immobilization process, the cell group containing an antibody producing cell is fixed with a crosslinking agent.
  • This immobilization treatment is a treatment for immobilizing an antibody (for example, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, IgY) and mRNA of this antibody in antibody-producing cells.
  • Various methods are known for immobilizing a living body containing cells. In the present invention, by immobilizing the antibody and its mRNA in the antibody-producing cell, it is possible to suppress the elution of the antibody and its mRNA in the cell with the dissolution of the cell membrane in the subsequent surfactant treatment step.
  • the antibody in the cell is used to identify an antibody-producing cell using the labeled target antigen in the subsequent stage. Therefore, it is preferable that the antibody in the cell can remain in the cell even after cell membrane lysis by immobilization, and the immobilized antibody is preferably immobilized in a state where it can react with the target antigen for labeling.
  • antibody mRNA immobilized in the cell after cell membrane lysis is used for cDNA synthesis in a later step. Immobilize the immobilized antibody mRNA before cDNA synthesis, but immobilize the immobilized mRNA so that it can be used for cDNA synthesis.
  • the immobilized mRNA of the antibody can be immobilized, and preferably it can be easily immobilized.
  • the immobilization treatment satisfying such conditions is a method using a divalent crosslinking agent having an SS bond in formalin or a spacer chain. Details will be described later.
  • a cell group containing antibody-producing cells can be obtained by immunizing an animal with a target antigen and collecting it from the immunized animal.
  • Methods for immunizing an animal with a target antigen and collecting a group of cells containing antibody-producing cells from the immunized animal include a method for a non-human animal (hereinafter referred to as NHA method) and a human (Human) The method is divided into two methods (hereinafter referred to as HU method).
  • NHA method non-human animal
  • Human Human
  • It includes sensitizing in vitro, or immunizing a non-human animal with an antigen of interest, and collecting lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells from the animal after immunization.
  • NHA method a group of cells containing antibody-producing cells of a non-human animal that specifically binds to the target antigen can be collected.
  • lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells are collected from humans, and the collected lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells are sensitized in vitro to the target antigen. Or collecting lymph, lymphoid tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells from a human having antibodies to the antigen of interest.
  • a cell group containing human antibody-producing cells that specifically bind to the target antigen can be collected.
  • non-human animal is immunized with the antigen of interest.
  • non-human animal means all animals having an immune system other than human. Examples of such animals include mammals and birds.
  • mammals examples include ape, monkey, dog, cat, horse, cow, pig, sheep, goat, donkey, camel, llama, alpaca, reindeer, buffalo, yak, guinea pig, rabbit, mink, mouse, rat, gerbil Hamsters, golden hamsters, Armenian hamsters, ferrets, miniature pigs, raccoons, black rats, sunks, kangaroos, dolphins and the like.
  • birds include chickens, quails or ostriches.
  • the “target antigen” refers to microorganisms such as viruses, mycoplasma, bacteria, and molds, coronal animals such as shellfish, molting animals such as insects and crustaceans, new mouth animals such as vertebrates, and constituents thereof, Proteins, sugars, lipids, complex carbohydrates, nucleic acids, natural low molecular organic compounds, natural high molecular organic compounds, artificial low molecular organic compounds, artificial high molecular organic compounds, metal complexes, and the like.
  • it is not intended to limit the type of target antigen and these are merely examples.
  • the target antigen used for immunization of a non-human animal can be the target antigen as it is, but it can also be used as it is or in a state in which an organism containing the target antigen is killed or as an extract thereof, or an appropriate carrier. They can also be combined or mixed.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Collect lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells from non-human animals, and sensitize the collected lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells to the target antigen in vitro.
  • Sensitization with the target antigen in vitro to lymph fluid and the like can be performed as follows. Dendritic cells, T cells, and B cells, which are antigen-presenting cells, are collected from non-human animals. Next, an antigen is allowed to act on a dendritic cell in a test tube to be phagocytosed and digested to produce a mature dendritic cell having the ability to present the antigen.
  • T cells and B cells T cells and B cells, cytokines such as interleukin 2, and immunostimulants such as poly (dI-dC) are added, and B cells that respond to the antigen are proliferated and differentiated in vitro to finally produce antibodies.
  • cytokines such as interleukin 2, and immunostimulants such as poly (dI-dC) are added, and B cells that respond to the antigen are proliferated and differentiated in vitro to finally produce antibodies.
  • B cells that respond to the antigen are proliferated and differentiated in vitro to finally produce antibodies.
  • a cell group containing cells is obtained.
  • “immunizing a non-human animal with a target antigen” means bringing the target antigen into contact with the non-human animal and expressing immunity against the target antigen in the non-human animal.
  • the method for expressing immunity to the target antigen is not particularly limited.
  • a non-human animal can be immunized by administering or transplanting the target antigen to the non-human animal.
  • the administration method or transplantation method of the target antigen include intraperitoneal administration, oral administration, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or gene transfer into non-human animals.
  • the non-human animal can be immunized by bringing the target antigen into contact with the skin of the non-human animal.
  • Immunization with a target antigen of a non-human animal is performed until immunization with the target antigen is established in the non-human animal. Therefore, the non-human animal is brought into contact with the target antigen until immunity with the target antigen is established.
  • the frequency and duration of contact of the target antigen with the non-human animal and the amount of the target antigen used for one contact can be appropriately determined according to the ease of establishing immunity. Whether or not immunity with a target antigen is established in a non-human animal can be confirmed by a conventional method, for example, by collecting blood from the non-human animal and measuring the antibody contained in the serum by ELISA. .
  • Lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow-derived cells are collected from the animal after immunization.
  • the purpose of this method is to collect a group of cells containing antibody-producing cells of a non-human animal that specifically binds to the target antigen. Therefore, it is highly possible that the cell group contains antibody-producing cells. Tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells are collected.
  • the lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow can be prepared, for example, as follows.
  • the swollen lymph fluid and lymph tissue are surgically removed from a non-human animal that has been injected with the antigen subcutaneously, muscle, or footpad for about one month.
  • the cells inside the lymph node are in PBS solution (10 mM phosphate buffer, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.6) by breaking the lymph node membrane using tweezers.
  • PBS solution 10 mM phosphate buffer, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.6
  • As the blood cell sample mononuclear cells obtained by separating blood obtained by heparin blood collection from an immunized animal by density gradient centrifugation are used.
  • Bone marrow is cut from both bone ends of the femur removed from the immunized animal, and PBS solution is allowed to flow into the bone marrow from an injection needle inserted into one bone end, so that bone marrow cells that have flowed out from the other bone end are removed. Use. In this way, a cell group containing antibody-producing cells can be collected.
  • a cell group containing antibody-producing cells is treated with a cross-linking agent such as formalin or a bivalent cross-linking agent having an SS bond in a spacer chain, thereby at least immobilizing the antibody and its mRNA in the antibody-producing cell.
  • a cross-linking agent such as formalin or a bivalent cross-linking agent having an SS bond in a spacer chain
  • the protein constituting the cell is immobilized.
  • glutaraldehyde is an irreversible cross-linking agent, antibodies and mRNA in cells are altered.
  • the cross-linking agent used in the present invention is a reversible cross-linking agent having cell membrane permeability (hereinafter sometimes referred to as a reversible cross-linking agent).
  • a reversible cross-linking agent By having cell membrane permeability, antibodies and mRNA in the cell can be immobilized in the cell, and at the stage of cDNA preparation from mRNA, which is a post-process, it is possible to prepare cDNA by decrosslinking mRNA.
  • a reversible crosslinking agent is used.
  • examples of such a reversible crosslinking agent include formalin and a bivalent crosslinking agent having an SS bond in the spacer chain.
  • the divalent cross-linking agent having an SS bond in the spacer chain include dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP).
  • the antibody in the cell and its mRNA are not substantially altered (in a debridable state) in the cell.
  • the antibody is immobilized in a state of reactivity with the labeled target antigen, and the mRNA of the antibody can be decrosslinked in a later step and used for cDNA synthesis.
  • the degree of immobilization varies depending on the type and concentration of the reversible crosslinking agent and the processing temperature and time.
  • An optimal immobilization state can be obtained by changing the type and concentration of the reversible cross-linking agent and the treatment temperature and time depending on the type of antibody-producing cells to be used.
  • a cell group containing antibody-collected cells collected in an aqueous solution such as phosphate buffered saline (PBS) containing 1 to 10% of a reversible cross-linking agent is preferably used at 0 to 30 ° C., for example. May be a condition of immersing for 1 to 60 minutes at a temperature in the range of 0 to 10 ° C. (dispersing the collected cell group containing antibody-producing cells in an aqueous solution containing a reversible crosslinking agent). According to this condition, the antibody and its mRNA can be immobilized in a good state (there is no substantial alteration). The immobilized cell group thus obtained is preferably separated from the solution by centrifugation or the like and subjected to the next step.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Cell membrane lysis step a lysis treatment for opening a hole in the cell membrane is performed on the cell group treated in the immobilization step. Specifically, the cell group fixed in the fixing step is mixed with a solution containing a surfactant. By mixing with a surfactant-containing solution, the cell membrane of the cell is dissolved and a hole is made in the cell membrane. This pore facilitates the entry of the labeled target antigen into the cell in the next step, and facilitates the movement of substances inside and outside the cell in the synthesis of cDNA from mRNA in the subsequent step.
  • Cell membrane lysis in this step is not limited as long as pores suitable for the above purpose are formed in the cell membrane, and it can withstand subsequent cell identification and isolation operations despite being used for cell membrane lysis.
  • a treatment that can provide a state in which a certain degree of strength is maintained is appropriate. Therefore, a surfactant is used in the present invention.
  • concentration of surfactant can be suitably selected in consideration of the said objective.
  • the surfactant can be at least one surfactant selected from the group consisting of nonionic surfactants, amphoteric surfactants and ionic surfactants.
  • Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether (triton), fatty acid sorbitan ester (tween), alkyl polyglucoside, fatty diethanolamide, alkyl monoglyceryl ether, etc. Can be mentioned.
  • a specific example of the polyoxyethylene alkyl ether-based nonionic surfactant is, for example, Triton X-100 (octylphenol poly (ethylene glycol ether) n , n is about 10, HLB 13.4 to 13.5).
  • a specific example of the fatty acid sorbitan ester-based nonionic surfactant is, for example, Tween 20 (polysorbate 20, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, HLB 16.7).
  • Tween 20 is a kind of polysorbate, and polysorbate is a sorbitan fatty acid ester obtained by condensation of about 20 molecules of ethylene oxide.
  • Tween 40 polysorbate 40, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, HLB15.6
  • Tween 60 polysorbate 60, polyoxyethylene sorbitan monostearate, HLB14.9
  • Tween65 polysorbate 65, polyoxystearate polyoxyethylene
  • Tween 80 polysorbate 80, polyoxyethylene sorbitan oleate, HLB 15.0
  • n-dodecyl ⁇ -D-maltosito, digitonin, saponin and the like can also be mentioned.
  • amphoteric surfactant examples include CHAPS, 3- (N, N-dimethyloctylammonio) propanesulfonic acid, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid, 3- ( N, N-dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate and the like are also included.
  • These amphoteric surfactants are known as surfactants that hardly break the three-dimensional structure of proteins, and can be used for dissolving a membrane in the same manner as the nonionic surfactants.
  • At least one ionic surfactant selected from the group consisting of cholic acid derivatives can be used.
  • At least one ionic surfactant selected from the group consisting of cholic acid derivatives is an anionic surfactant such as an alkali metal salt of cholic acid (for example, sodium cholate), a derivative of cholic acid (alkylene carboxyl group) And digoxigenin, which is a modified form.
  • alkali metal salt of cholic acid for example, sodium cholate
  • a derivative of cholic acid alkylene carboxyl group
  • digoxigenin which is a modified form.
  • These ionic surfactants are known as surfactants that do not easily break the three-dimensional structure of proteins, and can be used for dissolving a membrane in the same manner as the nonionic surfactants.
  • the concentration of the surfactant can be, for example, in the range of 0.1 to 5% depending on the type of surfactant, the type of cells, and the processing conditions (temperature and time).
  • the size of the hole opened in the cell membrane can be appropriately controlled by the type and concentration of the surfactant and the treatment conditions (temperature and time).
  • the treatment conditions (temperature and time) are, for example, 0 to 30 ° C., preferably 10 to 25 ° C., and immersed in a solution containing a surfactant (for example, phosphate buffered aqueous solution) for 1 to 60 minutes. can do.
  • the cell membrane lysis step can be performed prior to the subsequent reaction step with the labeled target antigen, or in the same solution in parallel with the reaction step with the labeled target antigen. You can also.
  • the cell group lysed in the cell membrane lysis step is mixed with the labeled target antigen (labeled target antigen), and the antibody in the cell and the labeled target antigen are reacted.
  • the cell membrane lysis step and the staining step are performed in parallel, the cell group obtained in the immobilization step is treated with a surfactant and reacted with the labeled target antigen in the same solution.
  • the target antigen in the labeled target antigen is a substance containing the same epitope as the target antigen used for immunization of a non-human animal or the like. Therefore, the labeled target antigen and the target antigen used for immunization can be the same substance or different substances containing a common epitope.
  • the label of the target antigen can be used without particular limitation as long as it can identify and separate cells that have reacted with the labeled target antigen.
  • Examples of such a label include a fluorescent label and a magnetic bead label. There are no particular restrictions on the type of fluorescent label.
  • the labeling operation to the target antigen can be appropriately performed by a known method according to the type of label used.
  • the reaction between the cell group obtained in the cell membrane lysis step and the labeled target antigen can be carried out, for example, by bringing the cell group and the labeled target antigen into contact in an aqueous solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • concentration, temperature, and time of the cell group and labeled target antigen in the aqueous solution can be appropriately determined by confirming the progress of the reaction.
  • the treatment conditions are, for example, 0 to 30 ° C., preferably 0 to 10 ° C., and immersed for 1 to 60 minutes in a solution containing the antigen for labeling (eg, phosphate buffered aqueous solution). can do.
  • the cell membrane lysis treatment and the reaction with the labeled target antigen are performed in parallel on the cell group obtained by the immobilization treatment, for example, for cell membrane lysis in an aqueous solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • concentration, temperature, and time of the cell group, surfactant, and labeled antigen in the aqueous solution can be appropriately determined by confirming the progress of the reaction.
  • the treatment conditions are, for example, 1 to 30 ° C., preferably 0 to 10 ° C., in a solution containing a surfactant and a target antigen for labeling (eg, phosphate buffered aqueous solution). Soak for ⁇ 60 minutes.
  • step (4) Cell isolation step
  • at least one cell that has reacted with the labeled target antigen is separated as a single cell.
  • individual cells that have reacted with the labeled target antigen are identified using the label of the labeled target antigen as a landmark, and the identified single cells are separated.
  • a treatment for immobilizing the antibody in the cell and its mRNA is performed, and then in the step (2), the immobilized cell group is treated with a surfactant.
  • the labeled target antigen is likely to enter the cell through the pores of the cell membrane.
  • the labeled target antigen binds to the antibody in the cell that has been immobilized and subjected to the cell membrane lysis treatment, and the cell in which the labeled target antigen is bound to the antibody in the cell can be identified.
  • a cell in which the labeled target antigen remains in the cell has a high possibility that the labeled target antigen is bound to the antibody in the cell, and thus is highly likely to be an antibody-producing cell.
  • Separation of the identified individual antibody-producing cells can be performed using, for example, a cell sorter. Separation of a single antibody-producing cell by a cell sorter can be performed using a known method. Although the cells can be selected and separated as a group of a plurality of cells, the cells are preferably selected and separated one by one. The cells selected here are cells that are highly likely to have a binding property to the target antigen, but the antibodies to the target antigen that each cell has are not necessarily the same, and the amino acid sequence of the antigen binding site of each antibody is Expected to be different.
  • the same target antigen can be obtained by individually selecting and separating cells one by one and applying each cell one by one to the method for producing an antibody or antibody fragment specific for the target antigen described later. It is possible to obtain different monoclonal antibodies that specifically bind to.
  • ⁇ Removal of non-specific cells during isolation (optional)> Since the cell isolated in the step (4) is highly likely to be a cell exhibiting reactivity with the labeled target antigen, it is highly likely to be an antibody-producing cell. However, in reality, it is undeniable that cells labeled by non-specific staining (reaction with labeled target antigen) are mixed. Therefore, if necessary, non-specific stained cells can be removed (excluded) by using a labeled non-target antigen.
  • DsRed protein which is an unlabeled antigen, is added to the cell staining solution to exclude cells positive for DsRed protein as nonspecifically stained cells.
  • phosphorylated peptide-positive cells can be separated from non-phosphorylated peptide-positive cells by adding non-phosphorylated peptides to the cell staining solution.
  • the degradation of mRNA extracted from the cells is suppressed, and the target antigen-specific monoclonal antibody or fragment thereof It is preferable from the viewpoint of easy preparation of cDNA.
  • the RNase inhibitor include DEPC (Diethylpyrocarbonate), vanadyl ribonucleotide, ribonuclease A, ribonuclease B, inhibitor protein against ribonuclease C, and anti-ribonuclease antibody.
  • RNase inhibitors examples include RNaseOUT (Life Technologies), RNasin (R) (Promega), Ribonuclease Inhibitor (pig liver-derived) (Takara Bio), and the like.
  • the steps carried out in the presence of an RNase inhibitor are all the steps (1) to (4) above. More specifically, each solution containing cells, antibodies and antigens used in each step. It is preferable to add an appropriate amount of an RNase inhibitor. An appropriate amount of the RNase inhibitor can be appropriately determined depending on the type of RNase inhibitor, the type of solution, and the like.
  • the method for producing a target antigen-specific monoclonal antibody of the present invention is a method of preparing a target antigen-specific monoclonal antibody from at least one cell obtained by the cell separation method of the present invention through the following (5) and (6).
  • a method comprising: (5) A step of taking out mRNA from at least one cell obtained by the cell separation method of the present invention and preparing cDNA (cDNA preparation step), (6) A step of preparing an antigen-specific monoclonal antibody or a fragment thereof from the cDNA prepared in the cDNA preparation step.
  • step (5) mRNA is separated from at least one cell obtained by the cell separation method of the present invention, and cDNA is prepared from the separated mRNA.
  • the mRNA in the cell immobilized in step (1) can be deimmobilized (decrosslinked).
  • the method for defixation can be appropriately selected according to the type of the reversible crosslinking agent used in step (1).
  • the reversible cross-linking agent used in step (1) is formalin, it can be carried out by heating the isolated cells.
  • a compound having an amino group is allowed to coexist during the heating, (Crosslinking) becomes easy.
  • the compound having an amino group include trishydroxymethylaminomethane, amino acid, ethanolamine and the like.
  • the conditions for the heat treatment can be appropriately selected in consideration of the degree of immobilization, the type and concentration of the compound having an amino group, and the stability of mRNA. For example, it can be performed by heating at 20 to 70 ° C. for 1 to 120 minutes. More preferably, the defixation is performed by heat-treating the isolated cells in the presence of protease.
  • the heat treatment conditions and the amount of protease used can be appropriately selected in consideration of the type and amount of protease, the degree of immobilization, and the stability of mRNA. For example, it can be performed by heating at 40 to 60 ° C. for 1 to 120 minutes.
  • the amount of protease used can be in the range of 0.1 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml.
  • the protease may be any existing protease, for example, protease K can be used.
  • protease K By heat treatment in the presence of protease K, mRNA can be de-immobilized more efficiently from the isolated cells, and the ratio of obtaining variable region gene fragments of antibody genes increases. As a result, antigen-specific monoclonal antibodies can be efficiently prepared in the subsequent step.
  • the reversible cross-linking agent used in step (1) is dithiobis (succinimidylpropionate) (DSP)
  • DSP dithiobis (succinimidylpropionate)
  • a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol or sodium borohydride.
  • the conditions for the reduction treatment can be appropriately selected in consideration of the degree of immobilization, the type and concentration of the reducing agent, and the stability of mRNA. For example, it can be performed by heating at 20 to 70 ° C. for 1 to 120 minutes. Defixation by reduction treatment can be used in combination with treatment with protease.
  • the separation of mRNA from at least one cell and the preparation of cDNA can be performed by known methods. For example, it can implement by the method as described in patent document 2 or nonpatent literature 4 (method of Kurosawa et al.). (The entire descriptions of Patent Document 2 and Non-Patent Document 4 are incorporated herein by reference.)
  • the separation of mRNA can be carried out from a single isolated antibody-producing cell so that the amount of antibody against the target antigen can be reduced. This is preferable from the viewpoint of obtaining a chain gene and a light chain gene.
  • the separation of mRNA can also be performed from two or more separated antibody-producing cells. In that case, the separated mRNA is a mixture of mRNA obtained from each cell.
  • the correct heavy chain gene and light chain gene combination is 50%, but technically, the correct pair can be reached.
  • the correct combination ratio of the heavy chain and light chain genes obtained from mRNA collected from more than 10 antibody-producing cells is less than 1%, and it is possible to reach the correct combination.
  • the efficiency decreases. Therefore, it is preferable to isolate mRNA from 10 or less antibody-producing cells that have been separated.
  • WO2009 / 091048 US2011 / 0020879A1
  • the prepared cDNA can be cloned if necessary, for example, WO2009 / 110606, US2011 / 0117609A1 (the entire description is specifically disclosed herein)
  • the nucleotide sequence of the prepared cDNA can also be identified by the cloning method using the homologous recombination method described in the above-mentioned (incorporated as a common reference). This method can be carried out using the nucleotide sequence determination method. By identifying the base sequence of DNA, it is possible to identify antibodies gene for the antigen of interest.
  • the second primer used for cDNA synthesis is preferably changed from the known method.
  • degradation of mRNA inevitably occurs in the steps up to cDNA synthesis. Therefore, the full-length cDNA synthesis efficiency is poor, and the normal 5'RACE PCR has a tendency to amplify the band with a smear (the 10 min band and the unfixed band in FIG. 1E, which are the results of Example 1).
  • the second primer used for cDNA synthesis is used as the sense primer for the second PCR so that only the full-length antibody gene is amplified, and the sequence around the start codon of the target immunoglobulin is used.
  • the sequence around the start codon of guinea pig immunoglobulin is used as the sense primer for the second PCR.
  • the sequence around the start codon of an immunoglobulin is known, if known, or the sequence of an immunoglobulin gene expressed in an immunized animal (for example, guinea pig in the case of Example 3) by performing high-throughput sequencing. Information can be obtained and created based on the obtained sequence information.
  • Antigen-specific monoclonal antibody preparation step an antigen-specific monoclonal antibody or a fragment thereof is prepared from the cDNA prepared in the cDNA preparation step.
  • Preparation of an antigen-specific monoclonal antibody or fragment thereof from cDNA can be carried out by a known method. For example, it can be performed using a fragment of an antibody gene prepared using a specific method for producing a DNA fragment described in WO2011 / 027808 (the entire description is specifically incorporated herein by reference).
  • the description in Patent Document 2 or Non-patent Document 4 (method of Kurosawa et al.) Can also be referred to for the preparation of an antibody or antibody fragment.
  • the antibody obtained by the method of the present invention is an antibody that exhibits specific binding to the target antigen, and the fragment is an antigen-binding fragment that exhibits specific binding to the target antigen.
  • the antigen-specific antibody fragment include Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, diabody, single chain antibody (for example, scFv, dsFv) and the like. These antibody fragments can be appropriately prepared using known methods if the amino acid sequence and base sequence of the antibody gene are determined from the cDNA cloned in step (5).
  • step (5) When the above step (5) is carried out in the presence of an RNase inhibitor, the degradation of mRNA taken out from the cells is suppressed, and the cDNA of the target antigen-specific monoclonal antibody or fragment thereof can be easily prepared. It is preferable from a viewpoint of becoming.
  • the RNase inhibitor are the same as those in the above steps (1) to (4).
  • An appropriate amount of the RNase inhibitor can be appropriately determined depending on the type of RNase inhibitor, the type of solution, and the like.
  • RNase activity suppression can be obtained by performing an experimental operation under cooling conditions such as in ice or on ice.
  • the present invention encompasses a threonine 18 phosphorylated p53 (pT18-p53) specific monoclonal antibody.
  • This monoclonal antibody is specific for threonine 18 phosphorylated p53 (pT18-p53) having a ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 as the variable region or a ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 as the variable region Monoclonal antibody, and ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 3 to 5, respectively, and ⁇ having CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 6 to 8, respectively Includes a threonine 18 phosphorylated p53 (pT18-p53) specific monoclonal antibody comprising a chain. Any antibody can be prepared by the method of the present invention and is specifically described in Example 3.
  • the present invention includes a threonine 68 phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) specific monoclonal antibody.
  • This monoclonal antibody is specific for threonine 68 phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) having the ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 as the variable region or the ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 as the variable region
  • Monoclonal antibody and ⁇ chain having CDR1, CDR2 and CDR3 having amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 11 to 13, respectively, and ⁇ having CDR1, CDR2 and CDR3 having amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 14 to 16, respectively.
  • Example 1 (A) OKT10 hybridoma cells attached on a glass slide were treated with 2% paraformaldehyde (PFA), 2% glutaraldehyde (GA), acetone, ethanol or 95% ethanol-5% acetic acid at room temperature for 10 minutes. Minute fixation was performed (immobilization).
  • PFA paraformaldehyde
  • GA glutaraldehyde
  • acetone ethanol
  • ethanol or 95% ethanol-5% acetic acid 95% ethanol-5% acetic acid
  • PBS containing 0.1% Triton X-100 is referred to as PBST (cell membrane lysis).
  • the cells were stained with cell membrane lysis and intracellular antibodies using 250 ⁇ l of PBST containing 5 ⁇ l of Dylight594-labeled anti-mouse IgG antibody and RNase inhibitor RNase OUT (cell membrane lysis and labeled target antigen reaction).
  • a cell lysate 100 mM Tris HCl (pH 7.5), 500 mM LiCl, 1% lithium dodecyl sulfate 5 mM dithiothreitol
  • a cell lysate 100 mM Tris HCl (pH 7.5), 500 mM LiCl, 1% lithium dodecyl sulfate 5 mM dithiothreitol
  • mRNA wash solution A 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 0.1% LiDS or 50 mM Tris HCl (pH 8.3)
  • mRNA wash solution B 3 ⁇ l
  • cDNA was synthesized. That is, a magnetic synthesis solution (50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor / ⁇ L, 10 unit SuperScript III Reverse transcriptase (Invitrogen) was added and reacted for 1 hour at 40 ° C.
  • a magnetic synthesis solution 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor / ⁇ L, 10 unit SuperScript III Reverse transcriptase (Invitrogen) was added and reacted for 1 hour at 40 ° C.
  • the labeled anti-mouse IgG antibody was diluted with PBST containing RNaseOUT and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the cells were diluted in 3 ml of PBS containing 0.1 ⁇ g / mL DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) and subjected to FACS.
  • a single cell was selected by setting the R1 gate and the R2 gate, and a cell in which the labeled antibody was bound to the immunoglobulin in the cell was selected by setting the R3 gate (cell isolation). The results are shown in FIG. 1C.
  • Example 2 OKT10 hybridoma cells and Jurkat cells were mixed at a ratio of 1: 100 (1%), 1: 1000 (0.1%), 1: 0,000 (0.01%), and 1: 100,000 (0.001%), respectively. These were fixed with a 2% paraformaldehyde PBS solution at 4 ° C. for 10 minutes (immobilization).
  • OKT10 hybridoma cells were isolated using a flow cytometer.
  • Single cell populations were identified by setting the R1 gate (FSC vs SSC) and R2 gate (DAPI). Furthermore, cells with autofluorescence as well as cells that received non-specific staining were removed from the single cell population using the FL2 channel (R3 gate).
  • R4 anti-mouse IgG Dylight488 strong positive cells and anti-mouse IgG Dylight650 strong positive cells were identified as OKT10 hybridoma cells (R4) (cell isolation).
  • FIG. 2A is a FACS graph when OKT10 hybridoma cells and Jurkat cells are mixed at 1: 100 (1%), respectively.
  • FIG. 2B is a FACS graph with mixing ratios of 100%, 0.1%, 0.01%, and 0.001%. In either case, cells were observed in the R4 gate corresponding to the hybridoma cells.
  • Example 3 An iliac lymph node was collected from a p53 phosphorylated peptide immune guinea pig, and a cell suspension was prepared therefrom. Cells (1 ⁇ 10 7 cells) were fixed with 2% paraformaldehyde PBS solution at 4 ° C. for 10 minutes (immobilization).
  • Collect cells by centrifugation and contain 250 ⁇ l of staining solution (anti-guinea pig IgG Dylight 650, phosphorylated peptide-streptavidin Dylight488, non-phosphorylated peptide-streptavidin Dylight550, 0.1 ⁇ g / ml DsRed, and 200 units of RNaseOUT PBST) was added and allowed to stand on ice for 15 minutes for staining (cell membrane lysis and labeled target antigen reaction).
  • phosphorylated p53-specific plasma cells were identified as anti-guinea pig IgG strong positive, phosphorylated peptide-streptavidin strong positive, non-phosphorylated peptide-streptavidin negative.
  • P53-specific plasma cells were identified as strong anti-guinea pig IgG positive, strong phosphorylated peptide-streptavidin positive, and strong non-phosphorylated peptide-streptavidin positive.
  • Non-specific plasma cells were identified as strong anti-guinea pig IgG positive, negative phosphopeptide-streptavidin negative, negative non-phosphorylated peptide-streptavidin negative.
  • Example 3C Single cell sorting was performed on the cells in the R4 gate using the same method as in Example 2 (cell isolation). Thereafter, the V gene was amplified using the isolated 5′RACE® PCR in the same manner as in Example 1 (B). The results are shown in FIG. 3C. When the V gene was amplified from 72 cell lysates, the amplification efficiency was 84%.
  • Comparative Example 1 (Method of Non-Patent Document 4)
  • a cell suspension was prepared from iliac lymph nodes of p53 phosphopeptide-immunized guinea pigs. Suspend cells (1x10 7 cells) in PBS containing anti-guinea pig IgG Dylight650, phosphorylated peptide-streptavidin Dylight488, non-phosphorylated peptide-streptavidin Dylight550, and ER-tracker and leave at 4 ° C for 30 minutes. The cells were stained with
  • Example 2 Single cell sorting was performed on the cells in the R4 gate using the same method as in Example 2 (cell isolation). Thereafter, the V gene was amplified using 5'RACE PCR in the same manner as in Example 1 (B). The result is shown in FIG. 3F. When the V gene was amplified from 72 cell lysates, the amplification efficiency was 16%.
  • Example 3 The list of results of Example 3 and Comparative Example 1 is shown in Table 1 below. The remarkableness of the effect of the method of the present invention is clear.
  • Example 3 In order to produce a threonine 18 phosphorylated p53 (pT18-p53) specific monoclonal antibody, immunostaining of HEK293 cells was performed using the antibody clone obtained in Example 3 (D).
  • Antibody # 23 was identified as an antibody clone that detects a specific signal in the nucleus of HEK293 cells in which DNA damage was caused by etoposide treatment. The signal obtained with antibody # 23 disappeared in cells treated with ⁇ phosphatase. The results are shown in FIG. 3H.
  • Table 23 shows the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the ⁇ chain (SEQ ID NOs: 3 to 5) and the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the ⁇ chain (SEQ ID NOs: 6 to 8) of the # 23 antibody.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of the variable regions of the ⁇ chain and ⁇ chain of the # 23 antibody (SEQ ID NOs: 9 to 10).
  • Example 4 In order to prepare a threonine 68 phosphorylated CHK2 (pT68-CHK2) specific monoclonal antibody, iliac lymph nodes were collected from a pT68-CHK2 peptide immunoguinea pig, and a cell suspension was prepared therefrom. Cells (1 ⁇ 10 7 cells) were fixed with 2% paraformaldehyde PBS solution at 4 ° C. for 10 minutes (immobilization).
  • Example 2 Single cell sorting was performed on the cells in the R4 gate using the same method as in Example 2 (cell isolation). Thereafter, in the same manner as in Example 1 (B), V gene was amplified using isolated 5′RACE PCR, and from the obtained V gene, according to the method of Kurosawa et al. (Non-patent Document 4), Recombinant antibodies were prepared by preparing full-length heavy and light chain immunoglobulin genes and introducing them into 293FT cells. The specificity of the obtained antibody was analyzed using the ELISA method. The results are shown in FIG. 4B. Of these, 59% (10/17) were pT68-CHK2 peptide specific.
  • Table 4 shows the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the ⁇ chain (SEQ ID NOs: 11 to 13) and the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the ⁇ chain (SEQ ID NOs: 14 to 16) of the # 34 antibody.
  • Table 5 shows the amino acid sequences of the variable regions of the ⁇ chain and ⁇ chain of the # 34 antibody (SEQ ID NOs: 17 to 18), respectively.
  • the present invention is useful in the field related to antibody preparation.
  • SEQ ID NO: 1 PCR primer
  • SEQ ID NO: 2 PCR primer
  • SEQ ID NO: 3 to 5 CDR1, CDR2 and CDR3 of ⁇ chain of pT18-p53 specific monoclonal antibody
  • SEQ ID NOs: 6 to 8 CDR1, CDR2, and CDR3 of kappa chain of pT18-p53 specific monoclonal antibody
  • SEQ ID NO: 9 ⁇ chain variable region of pT18-p53 specific monoclonal antibody
  • SEQ ID NO: 10 ⁇ chain variable region of pT18-p53 specific monoclonal antibody
  • SEQ ID NO: 11-13 CDR1 of ⁇ chain of pT68-CHK2 specific monoclonal antibody
  • CDR2 and CDR3 SEQ ID NOs: 14 to 16 CDR1, CDR2 and CDR3 of kappa chain of pT68-CHK2 specific monoclonal antibody
  • SEQ ID NO: 17 ⁇ chain variable region of pT68-CHK

Landscapes

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Abstract

本発明は、抗体産生細胞を含む細胞群を、架橋剤で固定化処理し（架橋剤は、細胞膜透過性を持つ可逆的な架橋剤）、固定化処理された細胞群を、界面活性剤で細胞膜溶解処理し、この細胞群と標識目的抗原とを反応させ、染色した細胞群において、標識目的抗原と反応した少なくとも１個の細胞を分離する、目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する細胞の分離方法に関する。本発明は、この方法で分離した細胞からｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを調製し、調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片を調製する、目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法にも関する。目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する少なくとも１個の細胞を、高い精度で分離できる方法、及びこの方法で分離された細胞を用いる目的抗原特異的モノクローナル抗体を作製可能な方法が提供される。本発明は、新規なトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体及びトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体を提供する。

Description

抗原特異的モノクローナル抗体作製方法
　本発明は、目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する細胞の分離方法及びこの方法で分離された細胞を用いる、目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法に関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１５年８月１０日出願の日本特願２０１５－１５７８５９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　抗体は生体防御の中心分子であり、研究・診断において重要なツールとして使用されてきた。さらに近年、抗体を医薬品として利用した抗体医薬が新たな治療薬としてめざましい治療効果を上げている。医薬品等として利用可能な新たな抗体をより早くより確実に取得するためには、新たな技術の導入を通じた作製基盤を確立する必要がある。
　抗体医薬の標的となるヒトタンパク質の機能的抗原エピトープの多くはマウスに対して抗原性が低い。そのため、このような抗原をマウスに摂取しても十分な免疫反応が引き起こされず、このような抗原性が低い抗原エピトープを有する抗原に対する抗体のマウスを用いての取得は容易ではなかった。このためヒト抗原に対して高い免疫原性を示すマウス以外の動物から効率良く抗体を取得する技術の開発が求められてきた。
　ところで、免疫動物から遺伝子工学的手法を用いて組換えモノクローナル抗体を取得するために、単一の抗原特異的形質細胞を分離する方法が用いられる。単一の抗原特異的形質細胞を分離するための手法としては、単一の形質細胞から分泌された抗体を利用する方法や、単一の形質細胞表面に発現する抗体を利用する方法が提案されている。
　特許文献１には、形質細胞同定及び単離用蛍光プローブ並びにこのプローブを用いた形質細胞の同定または単離方法が開示されている。さらに、特許文献２には、この方法を用いて単離した形質細胞から目的抗原特異的抗体を製造する方法が開示されている。
　非特許文献１には、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ及び発現ベクタークローニングによる単一ヒトＢ細胞からのモノクローナル抗体の効率的産生（Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning）が開示されている。
　非特許文献２には、単一ヒトＢ細胞からのネズミＩｇ遺伝子のクローニング及び発現（Cloning and expression of murine IgGenes from single B cells）が開示されている。
　非特許文献３には、チップ系イミュノスポットアレイを用いる抗原特異的抗体分泌細胞の迅速単離（Rapid isolation of antigen-specific antibody-secreting cells using a chip-based immunospot array）が開示されている。
特許文献１：WO2011/118579（PCT/JP2011/56831）
特許文献２：WO2012/133572（PCT/JP2012/058216）
非特許文献１：Thomas Tillerら, Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124
非特許文献２：Thomas Tillerら,Journal of Immunological Methods 350 (2009) 183-193
非特許文献３：Jin Aら, Nat Protoc. (2011) 6（５） 668-76.
非特許文献４：Kurosawら、BMC Biol.(2012) 10:80
非特許文献５：Isolation of full-size mRNA from cells sorted by flow cytometry (J Biochem Biophys Methods, 1999)
非特許文献６：MARIS: Method for Analyzing RNA following Intracellular Sorting(PLOS one, 2014)
特許文献１及び２並びに非特許文献１～６の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　特許文献1に記載の方法は、様々な動物より形質細胞を分離することが可能な方法である。しかし、本発明者らが検討したところ、形質細胞の中に存在する抗原特異的形質細胞を高精度に分離することは困難であった。そのため、この方法を利用する特許文献２に記載の方法でも、目的抗原特異的抗体を効率よく調製することはできなかった。
　非特許文献１及び２に記載の方法は、組換えＤＮＡ技術を用いたマウス、ヒトモノクローナル抗体作成方法である。しかし、この方法は、マウス及びヒト以外の動物種への応用はできなかった。さらに、この方法では、抗原特異的なクローンの選別ができないという問題もあった。
　非特許文献３に記載の方法は、マウス、ヒトにおいて抗原特異的なクローンの選別が可能な方法である。しかし、抗原特異的なクローンの選別のため煩雑な装置の作成が必要であり、前処理として形質細胞の濃縮が必要であった。
　非特許文献４に記載の方法は様々な動物から抗原特異的なクローンの選別が可能な方法である。しかし、単一の細胞から分泌される抗体や膜上に発現する抗体量は極微量である。そのため、これら抗体分子に標識抗原が結合することで得られるシグナルを利用した抗原特異的形質細胞の分離法は、精度・感度共に未だ多くの問題点が存在する。このため細胞群中の抗原特異的形質細胞の含有率が0.01％以下の場合、高精度な抗原特異的なクローンの選別ができないという問題もあった。
　そこで本発明は、様々な動物から、煩雑な方法を用いることなく、目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する少なくとも１個の細胞を、高い精度で分離できる方法、及びこの方法で分離された少なくとも１個の細胞を用いる、様々な動物から、煩雑な方法を用いることなく、かつ高い精度で目的抗原特異的モノクローナル抗体を作製可能な方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、新規な目的抗原特異的モノクローナル抗体を得ることも目的とする。
　抗体産生細胞の細胞質には、膜上に発現する抗体に比べ1000倍以上の抗体が蓄えられていることが知られている（非特許文献４）。本発明者らはこの点に注目し、かつ、上記細胞質内の抗体に標識抗原が結合することでシグナルを得た場合、得られるシグナルは、膜型抗体に標識抗原が結合することで得られるシグナルに比べ非常に強いと推察した。しかし、現実には、細胞質内に存在する抗体に抗原を作用させるには、例えば、架橋剤を用いたタンパク質の固定化、界面活性剤を用いた膜透過処理などの前処理が必要であると推察された。ところが、このような前処理は、細胞質内のタンパク質とｍＲＮＡの分子間架橋や、ヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を引き起こす可能性が高いと推察される。そのため、架橋剤による固定化と界面活性剤による膜透過、及び標識抗原による染色が行われた単一細胞からのｍＲＮＡ抽出、さらには、抽出ｍＲＮＡからの２５０ｂｐ以上の長さの遺伝子断片の増幅を行うことは、非常に困難であるとされてきた(非特許文献５及び６)。
　このような状況下、本発明者らは、上記非常に困難な状況をブレークスルーすべく様々な検討を行った。その中で、可逆的架橋剤による細胞固定、膜透過処理、標識抗原による染色が行われた細胞集団から、抗原特異的形質細胞を同定し、分離し、これより免疫グロブリン可変領域遺伝子をクローン化することで抗原特異的モノクローナル抗体を作製する新規手法を開発し、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下の通りである。
［１］
（１）抗体産生細胞を含む細胞群を、架橋剤で固定化処理する工程（固定化工程）、但し、前記架橋剤は、細胞膜透過性を持つ可逆的な架橋剤である、
（２）固定化処理された細胞群を、界面活性剤で処理する工程（細胞膜溶解工程）、
（３）細胞膜溶解処理された細胞群と標識した目的抗原（以下、標識目的抗原）とを反応させる工程(染色工程)、
(但し、細胞膜溶解工程（２）と染色工程（３）とは、順次実施することも、並行して実施することもできる。)
（４）染色工程を経た細胞群において、標識目的抗原と反応した少なくとも１個の細胞を分離する工程（細胞単離工程）、
を含む、目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する細胞の分離方法。
［２］
前記架橋剤は、ホルマリン、又はスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤である［１］に記載の方法。
［３］
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びイオン性界面活性剤から成る群から選ばれる少なくとも1種の界面活性剤である［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である［１］又は［２］に記載の方法。
［５］
工程（１）～（４）の少なくとも１つの工程を、RNase阻害剤の存在下で実施する［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
（５）［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法で分離した少なくとも１個の細胞からｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを調製する工程（ｃＤＮＡ調製工程）、
（６）ｃＤＮＡ調製工程で調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片を調製する工程（目的抗原特異的モノクローナル抗体調製工程）、
を含む目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法。
［７］
少なくとも工程（５）を、RNase阻害剤の存在下で実施する［６］に記載の方法。
［８］
前記ｍＲＮＡの分離は、分離した１０個以下の抗体産生細胞から行う、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
工程（５）におけるｃＤＮＡ調製において、ｃＤＮＡ合成に用いる２回目のＰＣＲのセンスプライマーとして、目的とする免疫グロブリンの開始コドン周辺の配列を有するプライマーを用いる、［６］～［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
工程（５）におけるｍＲＮＡ分離は、単離した細胞を脱架橋処理することを含む［６］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
前記脱架橋処理は、架橋剤がホルマリンである場合は、熱処理である［１０］に記載の方法。
［１２］
前記熱処理は、プロテアーゼの共存下で行い、抗体遺伝子の可変領域遺伝子断片を得る［１１］に記載の方法。
［１３］
前記脱架橋処理は、架橋剤がスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤である場合は、還元処理である、［１０］に記載の方法。
[１４]
可変領域として配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、トレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体。
[１５]
配列番号3～5で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号6～8で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体。
[１６]
可変領域として配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、トレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体。
[１７]
配列番号11～13で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号14～16で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体。
　本発明によれば、免疫に用いる動物種による制限なしに、煩雑な方法を用いることなく、かつ高い精度で目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する少なくとも１個の細胞を分離する（以下、少なくとも１個の細胞を分離することを、細胞を単離する、と表現することがある）ことができ、ここで単離された細胞を用いることで、目的抗原特異的モノクローナル抗体を作製することが可能な方法を提供することができる。その結果、本発明は、既存の技術では作製が困難であった標的分子に対する抗体医薬品・診断薬の開発に新たな可能性を与えるものである。本発明によれば、新規なトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体及びトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体が提供される。
実施例1の(A)の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例1の(B)の電気泳動画像を示す。 実施例1の(C)のFACS法の結果を示す。 実施例1の(D)の電気泳動画像を示す。 実施例1の(E)の増幅成功率を示す。 実施例2の(A)のFACS法の結果を示す。 実施例2の(B)のFACS法の結果を示す。 実施例2の(C)の電気泳動画像を示す。 実施例2の(D)の増幅成功率を示す。 実施例3の(A)の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例3の(B)のFACS法の結果を示す。 実施例3の(C)の電気泳動画像を示す。 実施例3の(D)のELISA法による特異性解析結果を示す。 比較例1の(A)のFACS法の結果を示す。 比較例1の(B)の電気泳動画像を示す。 比較例1の(C)のELISA法による特異性解析結果を示す。 実施例3の(E)の免疫染色後の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例3の(E)の免疫染色後の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例3の(E)のウエスタンブロットの結果を示す。 実施例3の(E)のウエスタンブロットの結果を示す。 実施例3の(F)表面プラズモン共鳴SPR測定結果を示。 実施例4の(A)のFACS法の結果を示す。 実施例4の(B)のELISA法による特異性解析結果を示す。 実施例4の(C)の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例4の(D)の蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例4の(E)の表面プラズモン共鳴SPR測定の結果を示す。
　本発明の目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する細胞の単離方法は、下記（１）～（４）の工程を含む。
（１）抗体産生細胞を含む細胞群を、架橋剤で固定化処理する工程（固定化工程）、但し、前記架橋剤は、細胞膜透過性を持つ可逆的な架橋剤である、
（２）固定化処理した細胞群を、界面活性剤で処理する工程（細胞膜溶解工程）、
（３）細胞膜溶解処理した細胞群と標識した目的抗原（以下、標識目的抗原）とを反応させる工程(染色工程)、
(但し、細胞膜溶解工程（２）と染色工程（３）とは、順次実施することも、並行して実施することもできる。)
（４）染色工程を経た細胞群において、標識目的抗原と反応した少なくとも１個の細胞を単離する工程（細胞単離工程）。
　さらに本発明の目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法は、下記（５）及び（６）を含む。
（５）前記本発明の細胞単離方法で単離した少なくとも１個の細胞からｍＲＮＡを取出し、ｃＤＮＡを調製する工程（ｃＤＮＡ調製工程）、
（６）ｃＤＮＡ調製工程で調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片を調製する工程（目的抗原特異的モノクローナル抗体調製工程）。
＜目的抗原特異的モノクローナル抗体産生細胞の単離方法＞
（１）固定化工程
　固定化工程では、抗体産生細胞を含む細胞群を架橋剤で固定化処理を行う。この固定化処理は、抗体産生細胞中の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）及びこの抗体のｍＲＮＡを固定化するための処理である。細胞を含む生体の固定化には種々の方法が知られている。本発明では、抗体産生細胞中の抗体及びそのｍＲＮＡを固定化することで、次工程の界面活性剤処理工程において、細胞膜の溶解に伴って、細胞中の抗体及びそのｍＲＮＡが溶出することを抑制する。細胞中の抗体は、後段の標識目的抗原を用いた抗体産生細胞の特定に用いられる。そのため、細胞中の抗体が固定化により、細胞膜溶解後も細胞中にとどまり得ることが好ましく、固定化された抗体は、標識目的抗原と反応し得る状態で固定化されることが好ましい。また、細胞膜溶解後に細胞内に固定化された抗体のｍＲＮＡは、後工程でｃＤＮＡ合成に使用される。ｃＤＮＡ合成の前に、固定化された抗体のｍＲＮＡを脱固定化するが、脱固定化により固定化された抗体のｍＲＮＡがｃＤＮＡ合成に利用し得る状態になるように固定化すること、及び固定化した抗体のｍＲＮＡが脱固定化し得る方法が存在すること、好ましくは脱固定化が容易に行えることが好ましい。このような条件を満足する固定化処理は、ホルマリン又はスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤を用いる方法である。詳細は後述する。
　抗体産生細胞を含む細胞群は、動物を目的抗原で免疫し、免疫動物から採取することで得られる。動物を目的抗原で免疫し、免疫動物から抗体産生細胞を含む細胞群を採取する方法は、非ヒト動物（Ｎｏｎ－Ｈｕｍａｎ　Ａｎｉｍａｌ）を対象とする方法（以下ＮＨＡ法と呼ぶ）とヒト（Ｈｕｍａｎ）を対象とする方法（以下ＨＵ法と呼ぶ）の２つの方法に分けられる。非ヒト動物を対象とするＮＨＡ法は、非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取することを含む。ＮＨＡ法により、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の抗体産生細胞を含む細胞群を採取することができる。
　ヒトを対象とするＨＵ法は、ヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または目的抗原に対する抗体を有するヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取することを含む。ＨＵ法により、目的抗原に特異的に結合するヒトの抗体産生細胞を含む細胞群を採取することができる。
＜非ヒト動物の目的抗原での免疫＞
　以下、ＮＨＡ法について説明する。
　非ヒト動物を目的抗原で免疫する。本発明において「非ヒト動物」とは、ヒト以外の免疫系を有する全ての動物を意味する。そのような動物の例としては、哺乳動物、鳥類などを挙げることができる。哺乳動物の例としては、類人猿、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ラマ、アルパカ、トナカイ、スイギュウ、ヤク、モルモット、ウサギ、ミンク、マウス、ラット、スナネズミ、ハムスター、ゴールデンハムスター、アルメニアンハムスター、フェレット、ミニブタ、アライグマ、フクロネズミ、スンクス、カンガルー、イルカなどを挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ、ウズラまたはダチョウなどを挙げることができる。
　本発明において「目的抗原」とは、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、カビ等の微生物、貝類等の冠輪動物、昆虫や甲殻類等の脱皮動物、脊椎動物等の新口動物及びこれらの構成物質、蛋白質、糖、脂質、複合糖質、核酸、天然低分子有機化合物、天然高分子有機化合物、人工低分子有機化合物、人工高分子有機化合物、金属錯体などである。但し、目的抗原の種類を限定する意図ではなく、これらはあくまでも例示である。
　非ヒト動物の免疫に用いる目的抗原は、目的抗原をそのまま用いることもできるが、目的抗原を含む生物等をそのまま、あるいは死滅させた状態あるいはその抽出液として用いることもでき、あるいは、適当な担体結合または混合して用いることもできる。
　非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させる。リンパ液等に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏでの目的抗原による感作は、以下のように実施できる。非ヒト動物より抗原提示細胞である樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞を採取する。次に試験管中で抗原を樹状細胞に作用させ貪食・消化させ、抗原の提示能力を備えるようになった成熟樹状細胞を作製する。これにＴ細胞並びにＢ細胞とインターロイキン２等のサイトカインやpoly(dI-dC)等の免疫刺激剤を加え、抗原に対し応答するＢ細胞を試験管内で増殖・分化させ、最終的に抗体産生細胞を含む細胞群を得る。
　本発明において「非ヒト動物を目的抗原で免疫する」とは、非ヒト動物に目的抗原を接触させて、非ヒト動物において、目的抗原に対する免疫を発現させることを意味する。目的抗原に対する免疫の発現方法は特に制限されるものではないが、例えば、非ヒト動物に目的抗原を投与または移植することで非ヒト動物を免疫することができる。目的抗原の投与方法や移植方法にも特に制限はないが、投与方法としては、例えば、経気投与、経口投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、あるいは非ヒト動物への遺伝子導入により抗原を動物体内で発現させる方法がある。などを挙げることができる。あるいは、非ヒト動物の皮膚に目的抗原を接触させることでも非ヒト動物を免疫することができる。
　非ヒト動物の目的抗原での免疫は、目的抗原による免疫が非ヒト動物において成立するまで行う。従って、非ヒト動物は、目的抗原による免疫が成立するまで、目的抗原を接触させる。目的抗原の非ヒト動物への接触の頻度、期間、一回の接触に使用される目的抗原の量は、免疫成立の容易さに応じて適宜決定できる。非ヒト動物において、目的抗原による免疫が成立しているか否かは、常法、例えば、非ヒト動物より血液を採取し血清中に含まれる抗体をELISA法により測定することにより確認することができる。
＜免疫成立後の動物からのリンパ節等の採取＞
　免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取する。本方法の目的は、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の抗体産生細胞を含む細胞群を採取することであるので、抗体産生細胞を含む細胞群を含む可能性が高い、リンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取する。
　リンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄は、例えば、以下のように調製することができる。皮下、筋肉又はフットパッドに抗原を注射し約１ヶ月以上経過した非ヒト動物より、腫脹したリンパ液、リンパ組織を外科的に取り出す。リンパ節に付随した組織を実体顕微鏡下で取り除いた後、ピンセットを用いリンパ節の皮膜を破ることでリンパ節内部の細胞をPBS溶液（10mM phosphate buffer、120mM NaCl、2.7mM KCl、pH 7.6）中に分散させる。血球試料は、免疫動物からヘパリン採血によって得られた血液を密度勾配遠心法により分離された単核球を用いる。骨髄は、免疫動物より取り出された大腿骨の両骨末端を切断し、一方の骨末端に挿入した注射針からPBS溶液を骨髄に流入させることで、他方の骨末端から流出させた骨髄細胞を用いる。このようにして抗体産生細胞を含む細胞群を採取することができる。
＜架橋剤での細胞固定化処理＞
　前述したように、抗体産生細胞を含む細胞群を架橋剤であるホルマリン又はスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤で処理して、少なくとも抗体産生細胞中の抗体及びそのｍＲＮＡの固定化する。細胞中の抗体及びｍＲＮＡを固定化する目的で、細胞を例えば、グルタルアルデヒドのような架橋剤を用いたタンパク質の固定化のための前処理に付すと、細胞を構成するタンパク質は固定化される。しかし、グルタルアルデヒドは不可逆的な架橋剤であるため、細胞中の抗体及びｍＲＮＡは変質してしまう。それに対して本発明で用いる架橋剤は、細胞膜透過性を持つ可逆的な架橋剤（以下、可逆性架橋剤と呼ぶことがある）である。細胞膜透過性を持つことで、細胞中の抗体及びｍＲＮＡを細胞内に固定化でき、かつ後工程であるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ調製の段階において、ｍＲＮＡを脱架橋してｃＤＮＡ調製が可能なように、可逆性を有する架橋剤を用いる。このような可逆性架橋剤の例としては、ホルマリン、スペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤などを挙げることができる。スペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤としては、例えば、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（Dithiobis[succinimidyl propionate] (DSP)）などを挙げることができる。
　採取した抗体産生細胞を含む細胞群を、可逆性架橋剤を用いた処理に付すと、細胞中の抗体及びそのｍＲＮＡは実質的に変質することなく（脱架橋可能な状態で）、細胞中で固定化される。抗体は、標識目的抗原との反応性を有する状態で固定化され、抗体のｍＲＮＡは、後工程で脱架橋してｃＤＮＡの合成に用いることができる。固定化の程度は、可逆性架橋剤の種類及び濃度並びに処理温度及び時間により変化する。使用する、抗体産生細胞の種類に応じて、可逆性架橋剤の種類及び濃度並びに処理温度及び時間を変化させることで、最適な固定化状態を得ることができる。固定化は、例えば、１～１０％の可逆性架橋剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液に、採取した抗体産生細胞を含む細胞群を、例えば、０～３０℃、好ましくは０～１０℃の範囲の温度で、１～６０分浸漬する（採取した抗体産生細胞を含む細胞群を可逆性架橋剤含有水溶液に分散する）条件とすることができる。この条件によれば、抗体及びそのｍＲＮＡの固定化を良好な状態（実質的な変質がない状態）で固定化することができる。このようにして得られる固定化処理された細胞群は、好ましくは遠心等により溶液から分離され、次の工程に供される。
（２）細胞膜溶解工程
　細胞膜溶解工程では、固定化工程で処理された細胞群に対して、細胞膜に孔を開ける溶解処理を施す。具体的には、固定化工程で固定化処理された細胞群を、界面活性剤を含有する溶液と混合する。界面活性剤含有溶液と混合することで、細胞の細胞膜を溶解し、細胞膜に孔を開ける。この孔は、次工程において、標識目的抗原が細胞内に侵入しやすくするとともに、後工程において、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成における細胞内外の物質の移動を容易にする。この工程における細胞膜溶解は、上記目的に適した孔が細胞膜に形成されれば良く、また、細胞膜溶解に供されているにも関わらず、その後の、細胞の特定及び単離の操作に耐え得る程度の強度を維持した状態を提供できる処理であることが適当である。そのため、本発明では界面活性剤を用いる。また、界面活性剤の種類及び濃度は、上記目的を考慮して、適宜選択できる。
　界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びイオン性界面活性剤から成る群から選ばれる少なくとも1種の界面活性剤であることができる。
　非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系(Tritonが属する)、脂肪酸ソルビタンエステル系(Tweenが属する)、アルキルポリグルコシド系、脂肪酸ジエタノールアミド系、アルキルモノグリセリルエーテル系等を挙げることができる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系非イオン性界面活性剤の具体例は、例えば、Triton X-100(オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）n、nは約10である、HLB13.4～13.5)である。脂肪酸ソルビタンエステル系非イオン性界面活性剤の具体例は、例えば、Tween20(ポリソルベート 20、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB16.7)である。Tween20はポリソルベート類の一種であり、ポリソルベート類は、ソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドが約 20 分子縮合したものである。Tween20以外に、Tween40(ポリソルベート 40、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB15.6)、Tween60(ポリソルベート 60、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB14.9)、Tween65(ポリソルベート 65、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB10.5)、Tween80(ポリソルベート 80、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB15.0)、n-ドデシル β-D-マルトシト、ジギトニン、サポニンなども挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば、CHAPS、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホン酸、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホナートなども挙げられる。これらの両性界面活性剤は、タンパク質の立体構造を壊しにくい界面活性剤として知られており、上記非イオン性界面活性剤と同様に膜の溶解に使用することができる。
　イオン性界面活性剤としては、コール酸誘導体から成る群から選ばれる少なくとも1種のイオン性界面活性剤を用いることができる。コール酸誘導体から成る群から選ばれる少なくとも1種のイオン性界面活性剤は、コール酸のアルカリ金属塩（例えば、コール酸ナトリウム）等の陰イオン性界面活性剤、コール酸の誘導体（アルキレンカルボキシル基を修飾体）であるジゴキシゲニン等を挙げることができる。これらのイオン性界面活性剤は、タンパク質の立体構造を壊しにくい界面活性剤として知られており、上記非イオン性界面活性剤と同様に膜の溶解に使用することができる。
　界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類、細胞の種類、処理条件（温度及び時間）により、例えば、０．１～５％の範囲とすることができる。細胞膜に開ける孔の大きさは、界面活性剤の種類及び濃度、並びに処理条件（温度及び時間）で、適宜コントロールすることができる。処理条件（温度及び時間）は、例えば、０～３０℃、好ましくは１０～２５℃の範囲の温度で、界面活性剤を含有する溶液（例えば、リン酸緩衝水溶液など）に１～６０分浸漬することができる。尚、後述するように、細胞膜溶解工程は、後工程である標識目的抗原との反応工程に先だって行うこともできるし、標識目的抗原との反応工程と並行して、同じ溶液内で実施することもできる。
（３）染色工程
　この工程では、細胞膜溶解工程において溶解処理された細胞群と、標識した目的抗原（標識目的抗原）と混合し、細胞中の抗体と標識目的抗原とを反応させる。細胞膜溶解工程と染色工程とを並行して行う場合には、固定化工程で得られた細胞群を、界面活性剤での処理及び標識目的抗原との反応を同じ溶液内で行う。
　標識目的抗原における目的抗原とは、非ヒト動物等の免疫に用いた目的抗原と同一のエピトープを含む物質である。従って、標識した目的抗原と免疫に用いた目的抗原とは、全く同一の物質であることもできるし、共通するエピトープを含む別の物質であることもできる。
　目的抗原の標識は、標識目的抗原と反応した細胞を特定し、かつ分離することが可能な標識であれば、特に制限なく使用することができる。そのような標識としては、例えば、蛍光標識、磁気ビーズ標識などを挙げることができる。蛍光標識の種類には特に制限はない。目的抗原への標識操作は、使用する標識の種類に応じて、公知の方法で適宜実施できる。
　細胞膜溶解工程で得られた細胞群と標識目的抗原との反応は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液中で、細胞群と標識目的抗原とを接触させることで実施できる。細胞群及び標識目的抗原の水溶液中での濃度、温度、時間は、反応の進行を確認して、適宜決定できる。処理条件（温度及び時間）は、例えば、０～３０℃、好ましくは０～１０℃の範囲の温度で、標識目的抗原を含有する溶液（例えば、リン酸緩衝水溶液など）に１～６０分浸漬することができる。
　固定化処理で得られた細胞群に、細胞膜溶解処理と標識目的抗原との反応を並行して行う場合には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液中で、細胞膜溶解用の界面活性剤と標識目的抗原との共存下で、前記細胞群と接触させる。細胞群、界面活性剤及び標識目的抗原の水溶液中での濃度、温度、時間は、反応の進行を確認して、適宜決定できる。処理条件（温度及び時間）は、例えば、０～３０℃、好ましくは０～１０℃の範囲の温度で、界面活性剤及び標識目的抗原を含有する溶液（例えば、リン酸緩衝水溶液など）に１～６０分浸漬することができる。
（４）細胞単離工程
　工程（４）では、標識目的抗原と反応した少なくとも１個の細胞を、それぞれ単一の細胞として分離する。まずは、標識目的抗原と反応した個々の細胞を、標識目的抗原が有する標識を目印に特定し、特定した単一の細胞をそれぞれ分離する。
　本発明の方法では、工程（１）においては、細胞中の抗体及びそのｍＲＮＡを固定化する処理を行い、次いで、工程（２）では、固定化処理した細胞群を、界面活性剤で処理して細胞膜に孔を開ける処理をしている。そのため、目的抗原に対する抗体を産生する細胞に対しては、標識目的抗原が、細胞膜の孔を介して細胞内に侵入しやすい状態となっている。標識目的抗原は、固定化されかつ細胞膜溶解処理を施された細胞内の抗体と結合し、細胞内の抗体に標識目的抗原が結合した細胞を特定することができる。標識目的抗原が細胞内にとどまっている細胞は、標識目的抗原が細胞内の抗体と結合している可能性が高く、よって、抗体産生細胞である可能性が高い。
　標識目的抗原が有する標識を目印に特定した個々の細胞を、それぞれ単一の細胞として分離する。特定された個々の抗体産生細胞の分離は、例えば、セルソーターを使用して行うことができる。セルソーターによる単一の抗体産生細胞の分離は、公知の方法を用いて実施することができる。細胞の選択は、細胞を複数の細胞の集団として選択し、分離することもできるが、好ましくは、細胞を１つ１つ個別に選択し、分離する。ここで選択される細胞はいずれも目的抗原に対する結合性を有する可能性が高い細胞であるが、各細胞が有する目的抗原に対する抗体は、必ずしも同一ではなく、各抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列は異なることが予想される。従って、細胞を１つ１つ個別に選択し、分離し、後述する目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法に、それぞれの細胞を１つずつ適用することで、同一の目的抗原に対して特異的に結合する、異なるモノクローナル抗体を得ることが可能になる。
＜単離の際の非特異的細胞の除去（オプション）＞
　工程（４）で単離される細胞は、標識目的抗原との反応性を示す細胞である可能性が高いことから、抗体産生細胞の可能性が高い。しかし、現実には、非特異的染色（標識目的抗原との反応）により標識された細胞が混入する可能性は否定できない。そのため、必要により、標識非標的抗原を用いることで、非特異的染色細胞を除去（排除）することもできる。例えば、実施例２では、非標識抗原であるDsRedタンパク質を細胞染色液に加えることで、DsRedタンパク質陽性の細胞を非特異的染色細胞として除外している。また実施例３では、非リン酸化ペプチドを細胞染色液に加えることで、リン酸化ペプチド陽性細胞を非リン酸化ペプチド陽性細胞から分離することができる。
　上記工程（１）～（４）の少なくとも１つの工程は、RNase阻害剤の存在下で実施することが、細胞から取出したｍＲＮＡの分解を抑制し、目的とする抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片のｃＤＮＡを調製することが容易になるという観点から好ましい。RNase阻害剤としては、例えば、DEPC(Diethylpyrocarbonate)、バナジルリボヌクレオチド、リボヌクレアーゼA、リボヌクレアーゼB、リボヌクレアーゼCに対する阻害タンパク質、抗リボヌクレアーゼ抗体を度を挙げることができる。RNase阻害剤の市販品としては、例えば、RNaseOUT(Life Technologies社)、RNasin(R)(プロメガ社)、Ribonuclease Inhibitor（ブタ肝臓由来）(タカラバイオ社)、等を挙げることができる。RNase阻害剤の存在下で実施する工程は、上記工程（１）～（４）の全ての工程であり、より具体的には、各工程で用いられる、細胞、抗体及び抗原を含有する各溶液に適量のRNase阻害剤を加えることが好ましい。RNase阻害剤の適量は、RNase阻害剤の種類や溶液の種類等により適宜決定できる。
　また、工程（３）に用いる標識目的抗原等の材料もＲＮａｓｅの混入を防止したものであることがｍＲＮＡの回収率を向上させ、より効率的に目的抗原特異的抗体を調製することができる。
＜目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法＞
　本発明の目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法は、前記本発明の細胞分離方法で得られた少なくとも１個の細胞から下記（５）及び（６）を経て、目的抗原特異的モノクローナル抗体を作製することを含む方法である。
（５）前記本発明の細胞分離方法で得られた少なくとも１個の細胞からｍＲＮＡを取出し、ｃＤＮＡを調製する工程（ｃＤＮＡ調製工程）、
（６）ｃＤＮＡ調製工程で調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片を調製する工程。
　この方法により、目的抗原に特異的な結合性を示す抗体、または目的抗原に特異的な結合性を示す抗体の断片（断片自体が目的抗原に特異的な結合性を示す）を製造することができる。
（５）ｃＤＮＡ調製工程
　工程（５）では、前記本発明の細胞分離方法で得られた少なくとも１個の細胞からｍＲＮＡを分離し、分離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。
　ｍＲＮＡの分離に際して、工程（１）で固定化された細胞中のｍＲＮＡを脱固定化（脱架橋）することができる。脱固定化の方法は、工程（１）で用いた可逆性架橋剤の種類に応じて適宜選択することができる。工程（１）で用いた可逆性架橋剤がホルマリンの場合、単離した細胞を加熱することで行うことができ、加熱の際に、アミノ基を有する化合物を共存させると、脱固定化（脱架橋）が容易となる。アミノ基を有する化合物としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、アミノ酸、エタノールアミン等を挙げることができる。脱固定化することで、細胞中のｍＲＮＡをより効率的に回収し、ｃＤＮＡの回収量を増やすことができる。熱処理の条件は、固定化の程度、アミノ基を有する化合物の種類と濃度及びｍＲＮＡの安定性を考慮して、適宜選択することができる。例えば、２０～７０℃で、１～１２０分間加熱することで行える。脱固定化は、単離された細胞をプロテアーゼの共存下で熱処理することで実施することがより好ましい。熱処理の条件及びプロテアーゼの使用量は、プロテアーゼの種類及び量、固定化の程度、及びｍＲＮＡの安定性を考慮して、適宜選択することができる。例えば、４０～６０℃で、１～１２０分間加熱することで行える。プロテアーゼの使用量は、０．１μｇ/ｍｌ～１００μｇ/ｍｌの範囲とすることができる。プロテアーゼは、例えば、既存のプロテアーゼであれば良く、例えば、プロテアーゼＫなどを用いることができる。プロテアーゼＫの共存下での加熱処理により、単離した細胞から、より効率的にｍＲＮＡの脱固定化を行うことができ、抗体遺伝子の可変領域遺伝子断片を得られる割合が増える。その結果として、後工程において、抗原特異的モノクローナル抗体を効率よく調製することができる。
　工程（１）で用いた可逆性架橋剤がジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）(DSP)の場合、単離した細胞をβ－メルカプトエタノールや水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することで行うことができる。この場合も、脱固定化することで、細胞中のｍＲＮＡをより効率的に回収し、ｃＤＮＡの回収量を増やすことができる。還元処理の条件は、固定化の程度、還元剤の種類と濃度及びｍＲＮＡの安定性を考慮して、適宜選択することができる。例えば、２０～７０℃で、１～１２０分間加熱することで行える。還元処理による脱固定化も、プロテアーゼでの処理を併用することができる。
　少なくとも１個の細胞からのｍＲＮＡの分離及びｃＤＮＡの調製は、公知の方法で実施することができる。例えば、特許文献２又は非特許文献４（Ｋｕｒｏｓａｗａらの方法）に記載の方法で実施することができる。（特許文献２及び非特許文献４の全記載は、ここに特に開示として援用される。）尚、ｍＲＮＡの分離は、分離した１個の抗体産生細胞から行うことが、目的抗原に対する抗体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を得るという観点から好ましい。但し、ｍＲＮＡの分離は、分離した２個以上の抗体産生細胞から行うこともでき、その場合、分離されるｍＲＮＡは、各細胞から得られるｍＲＮＡの混合物となる。例えば、２個の抗体産生細胞からの場合、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子がそれぞれ２ペアずつクローン化される。その場合、正しい重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子組み合わせは50％となるが、技術的には、正しいペアに到達可能である。しかし、10個を超える数の抗体産生細胞から採取されたｍＲＮＡから得られる重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の組合せにおける正しい組み合わせの割合は、1％未満となり、正しい組み合わせに到達することは可能であるが、効率が低下する。そのため、ｍＲＮＡの分離は、分離した１０個以下の抗体産生細胞から行うことが好ましい。
　より具体的には、目的抗原に対する抗体ｍＲＮＡの採取及び採取したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法は、例えば、ＷＯ２００９／０９１０４８（ＵＳ２０１１／００２０８７９Ａ１（その全記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の方法を利用して行うことができる。さらに、調製したｃＤＮＡは、必要によりクローニングすることができる。クローニング方法は、例えば、ＷＯ２００９／１１０６０６、ＵＳ２０１１／０１１７６０９Ａ１（その全記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の相同組換方法を利用したクローニング方法で行うことができる。さらに、調製したｃＤＮＡの塩基配列の同定を行うこともできる。ｃＤＮＡの塩基配列の同定は、公知のＤＮＡの塩基配列決定方法を用いて実施できる。ｃＤＮＡの塩基配列を同定することで、目的抗原に対する抗体遺伝子を同定することができる。
　但し、本発明の方法では、ｃＤＮＡ合成に用いる２回目のプライマーを、上記公知の方法とは変更することが好ましい。本発明の方法では、ｃＤＮＡ合成までの工程においてｍＲＮＡの分解が不可避的に生じる。そのため完全長のcDNA合成効率が悪く、通常の5'RACE PCRを行うとスメアを引いたバンドが増幅される傾向がある（実施例１の結果である図１Ｅの10minのバンドとunfixedのバンドを比較。10minの細胞から増幅されたバンドはスメアを引いている。実施例２の結果である図２Ｃも同様）。
　そこで本発明では、完全長の抗体遺伝子のみが増幅されるように、ｃＤＮＡ合成に用いる２回目のプライマーを、目的とする免疫グロブリンの開始コドン周辺の配列を２回目のPCRのセンスプライマーとして用いることが好ましい。例えば、実施例３（Ｃ）ではモルモット免疫グロブリンの開始コドン周辺の配列を２回目のPCRのセンスプライマーとして用いている。免疫グロブリンの開始コドン周辺の配列は、既知の場合は、既知の情報から、あるいはハイスループットシークエンスを行い、免疫動物（例えば、実施例３の場合はモルモット）で発現されている免疫グロブリン遺伝子の配列情報を入手し、入手した配列情報を基に作成することができる。
（６）抗原特異的モノクローナル抗体調製工程
　工程（６）では、ｃＤＮＡ調製工程で調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体又はその断片を調製する。ｃＤＮＡからの抗原特異的モノクローナル抗体又はその断片の調製は、公知の方法で実施することができる。例えば、ＷＯ２０１１／０２７８０８に記載のＤＮＡ断片の特異的作製方法を用いて作製した抗体遺伝子の断片を用いて行うことができる（その全記載は、ここに特に開示として援用される。）。また、特許文献２又は非特許文献４（Ｋｕｒｏｓａｗａらの方法）の記載も、抗体または抗体の断片の調製に、参照することができる。本発明の方法で得られる抗体は、目的抗原に特異的な結合性を示す抗体であり、その断片は、断片自体が目的抗原に特異的な結合性を示す抗原結合性断片である。抗原特異的抗体断片としては、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、diabody、一本鎖抗体（例えば、scFv、dsFv）等を挙げることができる。これらの抗体断片は、抗体遺伝子のアミノ酸配列及び塩基配列を、工程（５）でクローニングしたｃＤＮＡから求めておけば、公知の方法を利用して適宜調製することができる。
　上記工程（５）は、RNase阻害剤の存在下で実施することが、細胞から取出したｍＲＮＡの分解を抑制し、目的とする抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片のｃＤＮＡを調製することが容易になるという観点から好ましい。RNase阻害剤の例は、前述の工程（１）～（４）と同様である。RNase阻害剤の存在下での実施は、工程（５）で用いられる各溶液に適量のRNase阻害剤を加えることが好ましい。RNase阻害剤の適量は、RNase阻害剤の種類や溶液の種類等により適宜決定できる。
　本発明の（１）～（５）の工程の少なくとも一部、又は全部を、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下で行うことに加えて、あるいはＲＮａｓｅ阻害剤の使用に代えて、ＲＮａｓｅ活性抑制条件下で行うこともできる。これらの条件下で実施することで、ｍＲＮＡの回収率を向上させ、より効率的に目的抗原特異的抗体を調製することができる。
　ＲＮａｓｅ活性抑制は実験操作を、例えば、氷中又は氷上などの冷却条件下で実施することで得られる。
＜目的抗原特異的モノクローナル抗体＞
本発明は、トレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体を包含する。このモノクローナル抗体は、可変領域として配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有するトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体、並びに配列番号3～5で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号6～8で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体を包含する。何れの抗体も本発明の方法で調製することができ、実施例３に具体的に記載する。
さらに本発明は、トレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体を包含する。このモノクローナル抗体は、可変領域として配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有するトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体、並びに配列番号11～13で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号14～16で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体を包含する。何れの抗体も本発明の方法で調製することができ、実施例４に具体的に記載する。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例１
（A）スライドガラス上に付着させたOKT10ハイブリドーマ細胞を、２％パラフォルムアルデヒド（PFA）、2%グルタルアルデヒド(GA)、アセトン、エタノールあるいは95％エタノール-５％酢酸を用いて室温にて10分固定を行った（固定化）。
　細胞を0.1% TritonX-100を含むPBS (以下、0.1% TritonX-100を含むPBSをPBSTと表記する) にて洗浄した（細胞膜溶解）。
　その後、Dylight594標識抗マウスIgG抗体及びDylight488標識CD38にて染色を行った（標識目的抗原反応）。
　パラフォルムアルデヒド固定細胞では、細胞内に存在する抗体に抗原であるCD38が結合している様子が観察された。他の固定液で処理された細胞では、CD38への結合が観察されなかった。結果を図1Aに示す。
（B）OKT10ハイブリドーマ細胞を、２％パラフォルムアルデヒドを用いて４℃にて20分固定を行った（固定化）。
　その後細胞を、Dylight594標識抗マウスIgG抗体及びRNase阻害剤であるRNaseOUT 5μlを含むPBST 250μlを用いて細胞膜溶解及び細胞内の抗体を染色した(細胞膜溶解及び標識目的抗原反応)。
　遠心により細胞を回収した(細胞単離)。
　その後、40個細胞/１μlの濃度となるように細胞溶解液（100mM Tris HCl (pH7.5), 500ｍＭ LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitol）を加えた。細胞からのmRANの抽出並びにcDNA合成はKurosawaらの方法に準じて行った（Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals, BMC Biology 2012, 10:80）（cDNA合成）。
　即ち、上記の細胞溶解液2.5μl（細胞100個分）をオリゴdT25が結合した磁気ビーズ（ダイナビーズ）3μgに加え、細胞内のmRNAを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズを、3μｌのmRNA洗浄用溶液A(10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% LiDS又は50mM Tris HCl (pH8.3))、続いて3μｌのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% TritonX, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor/μＬ）にて1回洗浄した後、cDNA合成を行った。すなわち洗浄後の磁気ビーズにｃＤＮＡ合成用溶液（50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor/μＬ, 10 unit SuperScript III Reverse transcriptase （Invitrogen）を加え、40℃にて1時間反応させた。磁気ビーズを3μｌのＴＥ溶液（10ｍＭ　Tris HCl(pH7.5),1mM EDTA, 0.1% TritonX）にて洗浄後、マウス免疫グロブリンγ鎖定常領域遺伝子の増幅を行った。磁気ビーズに２５μlのPCR反応溶液（プライマー１及び２各10pmol、dNTP 10nmol、タカラバイオPrimeSTAR耐熱性DNAポリメラーゼ１Ｕ）を加え94℃30秒-68℃40秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーは5'-GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC-3'(配列番号1)　5'-ACGCTGCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAG-3'(配列番号2)
　免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子断片の増幅がパラフォルムアルデヒド固定細胞において確認された。結果を図1Bに示す。
（C）1ｘ106個ハイブリドーマ細胞を２％パラフォルムアルデヒドを用いて10分から30分間４℃にて固定した(固定化)。
　遠心分離により細胞を回収し、これに250 μLの Dylight488標識抗マウスＩｇＧ抗体及び200unitのRNaseOUTを含むPBSTを加え、4℃にて15分間抗原抗体反応を行った(細胞膜溶解及び標識目的抗原反応)。
　標識抗マウスＩｇＧ抗体はRNaseOUTを含むPBSTにて希釈し、室温にて1時間放置したものを用いた。細胞を0.1μg/mLの DAPI（4′, 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を含むPBS 3mlに希釈し、これをFACSにかけた。R1ゲート及びR2ゲートを設定することで、単一細胞を選択した、R3ゲートを設定することで細胞内の免疫グロブリンに標識抗体が結合した細胞を選択した(細胞単離)。結果を図1Cに示す。
（D）上記（C）で得られたR3ゲート内の細胞を、磁気ビーズ3μgを含む細胞溶解液15μL、あるいは1μg/mLのプロテアーゼKを含む磁気ビーズ3μgを含む細胞溶解液15μLにシングルソートした。プロテアーゼKを含む細胞溶解液はさらに50℃にて1時間加熱することでパラフォルムアルデヒドにより形成された架橋の脱架橋反応を行った。細胞からの全長の免疫グロブリン可変領域を増幅反応はKurosawaらの方法(非特許文献4)に準じて行った。短時間の固定を行った細胞の脱クロスリンク反応を行うことで、単一のハイブリドーマ細胞から効率よく全長の免疫グロブリン可変領域を増幅できることが明らかとなった。結果を図1Dに示す。
（E）上記（D）の結果をグラフにまとめたものである。実験は3回行い平均と標本標準偏差を示した（N=12）。結果を図1Eに示す。
実施例２
　OKT10ハイブリドーマ細胞とJurkat細胞を、それぞれ1:100（1%）, 1:1000（0.1%）, 1:0,000（0.01%）, 1:100,000（0.001%）の割合で混合した。これらを２％パラフォルムアルデヒドPBS溶液にて４℃で10分間の固定を行った(固定化)。
　遠心にて細胞を回収し、これに250μlの染色液（抗マウスIgG Dylight488, 抗マウスIgG Dylight650, 0.1μg/mlのDsRed、200unitのRNaseOUTを含むPBST）を加え、氷上にて15分間放置した(細胞膜溶解及び標識目的抗原反応)。
　本溶液に1μg/mlのDAPIを含むPBS溶液を３ml加え、フローサイトメータを用いてOKT10ハイブリドーマ細胞の単離を行った。R1ゲート（FSC vs SSC）およびR2ゲート（DAPI）を設定することで、単一細胞集団を同定した。更に単一細胞集団から、自己蛍光を有する細胞並びに非特異的染色を受けた細胞を、FL2チャンネルを用いて除去した（R3ゲート）。これらの細胞のなかで、抗マウスIgG Dylight488強陽性並びに抗マウスIgG Dylight650強陽性細胞を、OKT10ハイブリドーマ細胞として同定した（R4）(細胞単離)。
（Ａ）図2Aは、OKT10ハイブリドーマ細胞とJurkat細胞を、それぞれ1:100（1%）で混合した際のFACSグラフである。
（Ｂ）図2Bは、100％、0.1％,0.01％,0.001％の混合比のFACSグラフである。何れの場合もハイブリドーマ細胞に相当するR4ゲート内に細胞が認められた。
（Ｃ）R4ゲート内の細胞を、3μgのoligo-dT磁気ビーズ, 1μg/mlのプロテアーゼKを含む細胞溶解液15μにシングルセルソーティングを行った。実施例1(B)に記した方法を用い細胞からのRNA抽出並びにcDNA合成並びに5‘RACE PCRを用いてV遺伝子の増幅を行った。結果を図2C及び2Dに示す。72個の細胞溶解液からV遺伝子を増幅させたところその増幅成功率は、1%の混合比では89％, 0.1%では53％, 0.01%では47％, 0.001%では31％であった。
実施例３
（Ａ）p53リン酸化ペプチド免疫モルモットから腸骨リンパ節を採取し、これより細胞懸濁液を調製した。細胞（1x107個）を２％パラフォルムアルデヒドPBS溶液にて４℃で10分間の固定を行った(固定化)。
　遠心にて細胞を回収し、これに250μlの染色液（抗モルモットＩｇＧ Dylight650, リン酸化ペプチド-ストレプトアビジンDylight488, 非リン酸化ペプチド-ストレプトアビジンDylight550、0.1μg/mlのDsRed、および200unitのRNaseOUTを含むPBST）を加え、氷上にて15分間放置することで、染色を行った(細胞膜溶解及び標識目的抗原反応)。
　本溶液に1μg/mlのDAPIを含むPBS溶液を３ml加えた後、一部を蛍光顕微鏡にて観察を行った。結果を図3Aに示す。
　その結果、リン酸化p53特異的形質細胞は、抗モルモットＩｇＧ強陽性, リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン強陽性, 非リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン陰性として同定された。
　p53特異的形質細胞は、抗モルモットＩｇＧ強陽性, リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン強陽性, 非リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン強陽性として同定された。
　また非特異的形質細胞は抗モルモットＩｇＧ強陽性, リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン陰性, 非リン酸化ペプチド-ストレプトアビジン陰性として同定された。
（Ｂ）これらの細胞を、フローサイトメータを用いて解析し、p53特異的形質細胞の分離を行った。R1ゲート（FSC vs SSC）およびR2ゲート（DAPI）を設定することで、単一細胞集団を同定した。更に単一細胞集団から、自己蛍光を有する細胞、非特異的染色を受けた細胞、並びに非リン酸化ペプチドに反応するp53特異的形質細胞をFL2チャンネルによって除去した（R3ゲート）。これらの細胞のなかで、抗マウスＩｇＧ 強陽性、リン酸化ペプチド強陽性細胞を、リン酸化p53特異的形質細胞として同定した（R4）。R4ゲート内に出現する細胞は、他の細胞に比べ、リン酸化ペプチドの結合に関して100倍、抗モルモット抗体の結合に関して10倍ＩｇＧの蛍光強度を有していた。結果を図3Bに示す。
（Ｃ）R4ゲート内の細胞を、実施例２と同様の手法を用いてシングルセルソーティングを行った(細胞単離)。その後、実施例1(B)と同様の方法で、単離した5'RACE PCRを用いてV遺伝子の増幅を行った。結果を図3Cに示す。72個の細胞溶解液からV遺伝子を増幅させたところその増幅効率は、84%であった。
（Ｄ）得られたV遺伝子より、Kurosawaらの方法(非特許文献４)に従って、全長の重鎖、軽鎖免疫グロブリン遺伝子を作成し、これを293FT細胞に導入することで組み換え抗体を作成した。得られた抗体の特異性を、ELISA法を用いて解析した。結果を図3Dに示す。93％（25/27）がリン酸化ペプチドに結合し、このうち68％（17/25）がリン酸化ペプチド特異的であった。
比較例１（非特許文献４の方法）
（Ａ）p53リン酸化ペプチド免疫モルモットの腸骨リンパ節から細胞懸濁液を調製した。細胞（1x107個）を、抗モルモットIgG Dylight650, リン酸化ペプチド-ストレプトアビジンDylight488, 非リン酸化ペプチド-ストレプトアビジンDylight550、及びER-trackerを含むPBSに懸濁し、4℃にて30分放置することで細胞の染色を行った。
　これら細胞を、フローサイトメータを用いて解析し、p53特異的形質細胞の分離を行った。R1ゲート（FSC vs SSC）を設定することで、単一細胞集団を同定した。更に単一細胞集団から、自己蛍光を有する細胞、非特異的染色を受けた細胞、並びに非リン酸化ペプチドに反応するp53特異的形質細胞をFL2チャンネルによって除去した（R２ゲート）。次にER-tracker強陽性の細胞を選択することで形質細胞を同定し（R3ゲート）、これらの細胞のなかで、抗モルモットIgG弱陽性、リン酸化ペプチド陽性細胞を、リン酸化p53特異的形質細胞として同定した（R4）。R4ゲート内に出現する細胞は他の細胞に比べ、リン酸化ペプチドの結合に関して10倍、抗モルモット抗体の結合に関しては数倍程度の蛍光強度を有しているのみであった。結果を図３Eに示す。
（Ｂ）R4ゲート内の細胞を、実施例２と同様の手法を用いてシングルセルソーティングを行った(細胞単離)。その後、実施例1(B)と同様の方法で、5‘RACE PCRを用いてV遺伝子の増幅を行った。結果を図３Fに示す。72個の細胞溶解液からV遺伝子を増幅させたところその増幅効率は、16%であった。
（Ｃ）実施例３（Ｄ）と同様の方法で、得られたV遺伝子より全長の重鎖、軽鎖免疫グロブリン遺伝子を作成し、これを293FT細胞に導入することで組換え抗体を作成した。得られた抗体の特異性をELISA法を用いて解析した結果(図３G参照)、33％（9/27）がリン酸化ペプチドに結合し、このうち44％（4/9）がリン酸化ペプチド特異的であった。
　実施例３及び比較例１の結果の一覧を以下の表１に示す。本発明の方法の効果の顕著性が明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３（続き）
（Ｅ）トレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体を作製するため、実施例３（Ｄ）で得られた抗体クローンを用いてHEK293細胞の免疫染色を行った。エトポシド処理によりDNAダメージが引き起こされたHEK293細胞の核において特異的なシグナルを検出する抗体クローンとして＃23抗体を同定した。＃23抗体により得られたシグナルは、λホスファターゼ処理が施された細胞において消失した。結果を図3Hに示す。更に本シグナルは、pT18を含むp53ペプチド存在下において消失したが、隣接するセリン15およびセリン20がリン酸化されたペプチド存在下では消失しなかった。結果を図3Iに示す。またウエスタンブロット解析において＃23抗体は、エトポシド処理が施されたHEK293において50kDaの特異的なバンドを検出した。＃23抗体により得られたシグナルは、λホスファターゼ処理が施された細胞において消失した。結果を図3Jに示す。更に本シグナルは、過剰なpT18を含むp53ペプチド存在下において消失したが、隣接するセリン15およびセリン20がリン酸化されたペプチド存在下では消失しなかった。結果を図3Kに示す。
（Ｆ）＃23抗体のpT18-p53に対する親和性を、表面プラズモン共鳴SPR装置を用いて測定した。その結果、＃23抗体はpT18-p53ペプチドに対し0.20nMの結合定数KDを示した。結果を図3Lに示す。
（Ｇ）＃23抗体のγ鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列(配列番号3～5)及びκ鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列(配列番号6～8)をそれぞれ表2に示す。＃23抗体のγ鎖及びκ鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号9～10)を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例４
（Ａ）トレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体を作製するため、pT68-CHK2ペプチド免疫モルモットから腸骨リンパ節を採取し、これより細胞懸濁液を調製した。細胞（1x107個）を２％パラフォルムアルデヒドPBS溶液にて４℃で10分間の固定を行った(固定化)。
　遠心にて細胞を回収し、これに250μlの染色液（抗モルモットＩｇＧ Dylight650, pT68-CHK2ペプチド-ストレプトアビジンDylight488, 非リン酸化ペプチド(UM-CHK2)-ストレプトアビジンDylight550、0.1μg/mlのDsRed、および200unitのRNaseOUTを含むPBST）を加え、氷上にて15分間放置することで、染色を行った(細胞膜溶解及び標識目的抗原反応)。
　本溶液に1μg/mlのDAPIを含むPBS溶液を３ml加え細胞核の染色を行った。
（Ｂ）これらの細胞を、フローサイトメータを用いて解析し、pT68-CHK2特異的形質細胞の分離を行った。R1ゲート（FSC vs SSC）およびR2ゲート（DAPI）を設定することで、単一細胞集団を同定した。更に単一細胞集団から、自己蛍光を有する細胞、非特異的染色を受けた細胞、並びに UM-CHK2ペプチドに反応するCHK2特異的形質細胞をFL2チャンネルによって除去した（R3ゲート）。これらの細胞のなかで、抗マウスＩｇＧ 強陽性、pT68-CHK2ペプチド強陽性細胞を、pT68-CHK2特異的形質細胞として同定した（R4）。R4ゲート内に出現する細胞は、他の細胞に比べ、pT68-CHK2ペプチドの結合に関して100倍、抗モルモット抗体の結合に関して10倍ＩｇＧの蛍光強度を有していた。結果を図4Aに示す。
（Ｃ）R4ゲート内の細胞を、実施例２と同様の手法を用いてシングルセルソーティングを行った(細胞単離)。その後、実施例1(B)と同様の方法で、単離した5'RACE PCRを用いてV遺伝子の増幅を行い、得られたV遺伝子より、Kurosawaらの方法(非特許文献４)に従って、全長の重鎖、軽鎖免疫グロブリン遺伝子を作成し、これを293FT細胞に導入することで組み換え抗体を作成した。得られた抗体の特異性を、ELISA法を用いて解析した。結果を図４Bに示す。このうち59％（10/17）がpT68-CHK2ペプチド特異的であった。
（Ｄ）得られた抗体クローンを用いてHEK293細胞並びにHela細胞の免疫染色を行った。カンプトテシン処理によりDNA切断が引き起こされたHEK293細胞の核において特異的なシグナルを検出する抗体クローンとして＃34抗体を同定した。結果を図4C示す。本シグナルは過剰なpT68-CHK2ペプチド存在下において消失したが、UM-CHK2ペプチド存在下では消失しなかった。更に本シグナルは、λホスファターゼ処理が施された細胞において消失した。結果を図4Dに示す。以上の結果より#34抗体はトレオニン68番目がリン酸化された内在性CHK2を特異的に検出できる抗体であることが明らかになった。
（Ｅ）＃34抗体のpT68-CHK2に対する親和性を、表面プラズモン共鳴SPR装置を用いて測定した。その結果、＃34抗体はpT68-CHK2ペプチドに対し0.08nMの結合定数KDを示した。結果を図4Eに示す。
（Ｆ）＃34抗体のγ鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列(配列番号11～13)、κ鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列(配列番号14～16)をそれぞれ表4に示す(配列番号)。＃34抗体のγ鎖及びκ鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号17～18)をそれぞれ表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明は、抗体調製に関する分野に有用である。
配列番号1: PCRプライマー
配列番号2: PCRプライマー
配列番号3～5: pT18-p53特異的モノクローナル抗体のγ鎖のCDR1、CDR2及びCDR3
配列番号6～8: pT18-p53特異的モノクローナル抗体のκ鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3
配列番号9: pT18-p53特異的モノクローナル抗体のγ鎖可変領域
配列番号10: pT18-p53特異的モノクローナル抗体のκ鎖可変領域
配列番号11～13:pT68-CHK2特異的モノクローナル抗体のγ鎖のCDR1、CDR2及びCDR3
配列番号14～16:pT68-CHK2特異的モノクローナル抗体のκ鎖のCDR1、CDR2及びCDR3
配列番号17: pT68-CHK2特異的モノクローナル抗体のγ鎖可変領域
配列番号18: pT68-CHK2特異的モノクローナル抗体のκ鎖可変領域

Claims (17)

  1. （１）抗体産生細胞を含む細胞群を、架橋剤で固定化処理する工程（固定化工程）、但し、前記架橋剤は、細胞膜透過性を持つ可逆的な架橋剤である、
    （２）固定化処理された細胞群を、界面活性剤で処理する工程（細胞膜溶解工程）、
    （３）細胞膜溶解処理された細胞群と標識した目的抗原（以下、標識目的抗原）とを反応させる工程(染色工程)、
    (但し、細胞膜溶解工程（２）と染色工程（３）とは、順次実施することも、並行して実施することもできる。)
    （４）染色工程を経た細胞群において、標識目的抗原と反応した少なくとも１個の細胞を分離する工程（細胞単離工程）。
    を含む、目的抗原特異的モノクローナル抗体の産生能を有する細胞の分離方法。
  2. 前記架橋剤は、ホルマリン、又はスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤である請求項１に記載の方法。
  3. 前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びイオン性界面活性剤から成る群から選ばれる少なくとも1種の界面活性剤である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である請求項１又は２に記載の方法。
  5. 工程（１）～（４）の少なくとも１つの工程を、RNase阻害剤の存在下で実施する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. （５）請求項１～５のいずれか１項に記載の方法で分離した少なくとも１個の細胞からｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを調製する工程（ｃＤＮＡ調製工程）、
    （６）ｃＤＮＡ調製工程で調製したｃＤＮＡから抗原特異的モノクローナル抗体またはその断片を調製する工程（目的抗原特異的モノクローナル抗体調製工程）、
    を含む目的抗原特異的モノクローナル抗体の作製方法。
  7. 少なくとも工程（５）を、RNase阻害剤の存在下で実施する請求項６に記載の方法。
  8. 前記ｍＲＮＡの分離は、分離した１０個以下の抗体産生細胞から行う、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 工程（５）におけるｃＤＮＡ調製において、ｃＤＮＡ合成に用いる２回目のＰＣＲのセンスプライマーとして、目的とする免疫グロブリンの開始コドン周辺の配列を有するプライマーを用いる、請求項６～８いずれか１項に記載の方法。
  10. 工程（５）におけるｍＲＮＡ分離は、単離した細胞を脱架橋処理することを含む請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記脱架橋処理は、架橋剤がホルマリンである場合は、熱処理である請求項１０に記載の方法。
  12. 前記熱処理は、プロテアーゼの共存下で行い、抗体遺伝子の可変領域遺伝子断片を得る請求項１１に記載の方法。
  13. 前記脱架橋処理は、架橋剤がスペーサー鎖中にS-S結合を有する二価性架橋剤である場合は、還元処理である、請求項１０に記載の方法。
  14. 可変領域として配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、トレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体。
  15. 配列番号3～5で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号6～8で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン18リン酸化p53(pT18-p53)特異的モノクローナル抗体。
  16. 可変領域として配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖、又は可変領域として配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、トレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体。
  17. 配列番号11～13で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2及びCDR3を有するγ鎖及び配列番号14～16で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有するκ鎖を含むトレオニン68リン酸化CHK2(pT68-CHK2)特異的モノクローナル抗体。
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