CN105671185A - Its序列作为dna条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用及鉴定方法，属于分子鉴定技术领域。所述鉴定方法包括：利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”，则判定待测样品为嘉兴槜李。本发明还公开了一种鉴别嘉兴槜李早熟品种和晚熟品种的方法，如果ITS序列的碱基序列如SEQ？ID？NO.1所示，则判定待测样品为嘉兴槜李早熟品种；如果ITS序列的碱基序列如SEQ？ID？NO.2所示，则判定待测样品为嘉兴槜李晚熟品种。本发明利用ITS序列作为DNA条形码鉴定嘉兴槜李，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。
Description
技术领域
本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用及鉴定方法。
背景技术
槜李(PrunussalicinaLindl.)是蔷薇科(Rosaceae)李属(PrunusL.)植物，是浙江省嘉兴市特产，也是浙江省传统名果。槜李品质细腻鲜润，完熟时能化成甘甜略带酒香的浆液，风味品质极佳，是夏季消费者喜爱的优质水果之一。目前除浙江嘉兴的桐乡、海宁、海盐、湖州等地有槜李栽培外，在江苏省和安徽省也有少量引种。
槜李多采用嫁接繁殖，在不同栽培区域进行引种嫁接，极易造成同名异物及同物异名的现象。另外槜李受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实在成熟期的生物学特性及品质外观方面呈现一定的差异，市场上鱼目混珠给消费者带来极大困惑。
传统的植物分类方法是借助于对植物形态构造、生活习性等进行比较研究，随着科技的不断进步，植物分类方法逐步发展到分子生物学方法。目前，尚无关于嘉兴槜李分子鉴定的文献报道，关于槜李的研究多集中在栽培及低坐果率方面。由于槜李的果实外观受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实色泽往往不同，仅仅依靠果实形态来区分槜李与其他品种李难度较大，依靠传统的形态分类学方法在嘉兴槜李的鉴别上存在局限性。鉴于嘉兴槜李在地方特产及农业领域的重要地位，针对嘉兴槜李建立一套可靠的分子鉴别方法势在必行，对于嘉兴槜李的种质资源保护具有重要意义。
DNA条形码(DNAbarcoding)技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和物种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，可实现对物种的快速自动鉴定。该技术已被成功应用于生物物种分类和鉴定等领域，并成为进展最迅速的学科前沿之一。
DNA条形码技术研究中常用的DNA序列有matK、trnH-psbA、rbcL和ITS等。核基因组的ITS区位于18S和26SrRNA基因之间，被5.8SrRNA基因分为两段，即ITS1和ITS2，是核糖体DNA(nrDNA)转录单位的一部分。在被子植物中，ITS区具有长度保守性和核苷酸序列的高度变异性，使得这些间隔区的DNA序列较为容易排序，而高度变异性可以为重建较低分类阶元的系统发育提供分子证据。ITS序列区间已经广泛地应用于植物分类、起源、进化等方面的研究。
现有研究报道中，王化坤等选择桃、李、梅、杏、樱桃各2～4个主要种或变种共16个基因型测定其ITS序列，与从GenBank下载的6个核果类果树ITS序列形成了较为全面的数据矩阵。采用二次置根法用樱桃置根，用PAUP软件计算数据集在56个进化模型的得分，Modeltest筛选最佳模型和参数，计算遗传距离、变异，用最大简约法构建了桃、李、梅、杏、樱桃的系统发育树。
发明内容
本发明通过实验研究发现嘉兴槜李的ITS序列的第165位和第195位的碱基与其他品种存在差异，基于以上发现，本发明提供了ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用。
ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用，所述ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
嘉兴槜李早熟品种的ITS序列如SEQIDNO.1所示，晚熟品种的ITS序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供了ITS序列作为DNA条形码在制备鉴定嘉兴槜李试剂盒中的应用，所述ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
本发明将嘉兴槜李(包括早熟和晚熟)与其他品种李的ITS序列比对，早熟和晚熟品种的嘉兴槜李的ITS序列在第165位和第195位的碱基皆为“T”，与其他品种李的碱基不同，基于这点，通过比对第165和195位的碱基，即可判断待测样品是否为嘉兴槜李。
本发明提供了一种鉴定嘉兴槜李的方法，包括以下步骤：
利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”，则判定待测样品为嘉兴槜李。
鉴定范围包括浙江嘉兴槜李、宁波茄皮李、舟山金塘李、福建红心李、湖北玉皇李、贵州九阡李、安徽麦苋李、江西朱砂李、山东牛心李、美国恐龙蛋、美国拉罗达、美国玫瑰皇后、美国安哥里诺、日本大石早生、日本白李、日本秋姬、日本贵陵和新西兰密斯李。
本发明对嘉兴槜李的早熟和晚熟品种的ITS序列进行比对，发现两者在第168位、285位和第331位碱基存在差异，基于这点，本发明还可以对嘉兴槜李的早熟和晚熟品种进行鉴别。
本发明提供了一种鉴别嘉兴槜李早熟品种和晚熟品种的方法，包括以下步骤：
利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示，在331bp碱基为“C”，则判定待测样品为嘉兴槜李早熟品种；如果ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.2所示，在168bp碱基为“A”、285bp碱基为“A”，则判定待测样品为嘉兴槜李晚熟品种。
所述PCR扩增的引物对为：
上游引物：5’-GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3’，
下游引物：5’-GACGTGTGACGCCCAGGCA-3’。
所述PCR扩增的反应体系为：
10×PCR缓冲液，2μL；dNTP混合液，0.5μL；10μM上游引物，0.5μL；10μM下游引物，0.5μL；样品DNA，1μL；TaqDNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。
所述PCR扩增的反应条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
本发明还提供了一种鉴定嘉兴槜李的DNA条形码，碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
与传统的形态学鉴定方法和DNA指纹标记相比，本发明利用ITS序列作为DNA条形码鉴定嘉兴槜李，可通过对ITS序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。
附图说明
图1是嘉兴槜李果实照片。
图2是本发明的嘉兴槜李及其他品种李ITS序列PCR扩增结果电泳图，其中，泳道2～20分别为：浙江嘉兴槜李(早熟)(T1)、浙江嘉兴槜李(晚熟)(T2)、宁波茄皮李(T3)、舟山金塘李(T4)、福建红心李(T5)、湖北玉皇李(T6)、贵州九阡李(T7)、安徽麦苋李(T8)、江西朱砂李(T9)、山东牛心李(T10)、美国恐龙蛋(T11)、美国拉罗达(T12)、美国玫瑰皇后(T13)、美国安哥里诺(T14)、日本大石早生(T15)、日本白李(T16)、日本秋姬(T17)、日本贵陵(T18)、新西兰密斯李(T19)，M为DL2000plusDNAmarker。
图3是嘉兴槜李及其他品种李ITS序列的比对，黑色箭头分别标注嘉兴槜李ITS序列的序列特异位点，第165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
实施例1槜李的分子鉴定
分别从浙江省嘉兴市李子园艺科学研究所取样，19个鉴定样品分别为浙江嘉兴槜李(早熟)(T1)、浙江嘉兴槜李(晚熟)(T2)、宁波茄皮李(T3)、舟山金塘李(T4)、福建红心李(T5)、湖北玉皇李(T6)、贵州九阡李(T7)、安徽麦苋李(T8)、江西朱砂李(T9)、山东牛心李(T10)、美国恐龙蛋(T11)、美国拉罗达(T12)、美国玫瑰皇后(T13)、美国安哥里诺(T14)、日本大石早生(T15)、日本白李(T16)、日本秋姬(T17)、日本贵陵(T18)、新西兰密斯李(T19)。槜李果实照片参见附图1。
利用CTAB法提取上述槜李叶片的基因组DNA，利用下述引物对进行PCR扩增，PCR扩增使用rTaq(Takara，大连，中国)。
Trapa-F1:5’-GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3’；
Trapa-R1:5’-GACGTGTGACGCCCAGGCA-3’。
PCR扩增体系为：10×PCRbuffer，2μL；dNTPmixture，0.5μL；10μMPrunus-F1引物，0.5μL；10μMPrunus-R1引物，0.5μL；样品DNA1μL；TaqDNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定。电泳图谱参见附图2。
将PCR产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所用引物相同)，所得基因序列经校正后即为目的基因序列。用DNAMAN序列比对软件进行多重序列比对。序列比对结果见附图3。槜李的ITS序列在165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”。
Claims (8)
1.ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用，所述ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
2.ITS序列作为DNA条形码在制备鉴定嘉兴槜李试剂盒中的应用，所述ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
3.一种鉴定嘉兴槜李的方法，包括以下步骤：
利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”，则判定待测样品为嘉兴槜李。
4.一种鉴别嘉兴槜李早熟品种和晚熟品种的方法，包括以下步骤：
利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示，则判定待测样品为嘉兴槜李早熟品种；如果ITS序列的碱基序列如SEQIDNO.2所示，则判定待测样品为嘉兴槜李晚熟品种。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物对为：
上游引物：5’-GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3’，
下游引物：5’-GACGTGTGACGCCCAGGCA-3’。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
10×PCR缓冲液，2μL；dNTP混合液，0.5μL；10μM上游引物，0.5μL；10μM下游引物，0.5μL；样品DNA，1μL；TaqDNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。
7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
8.一种鉴定嘉兴槜李的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
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