CN110760510B - 用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用 - Google Patents

用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用 Download PDF

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CN110760510B CN201810825139.8A CN201810825139A CN110760510B CN 110760510 B CN110760510 B CN 110760510B CN 201810825139 A CN201810825139 A CN 201810825139A CN 110760510 B CN110760510 B CN 110760510B
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Abstract

本发明公开了一种用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用。本发明提供的引物组合由序列表的序列1‑序列16所示的单链DNA组成。利用本发明提供的特异引物，可开发鉴定蔷薇科植物物种的通用试剂盒，推动植物DNA条形码在社会服务中的应用。

Description

用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其 应用
技术领域
本发明涉及一种用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用。
背景技术
蔷薇科是经济意义非常重要的被子植物，大量的水果(如苹果、梨、山楂、草莓、桃、李、梅、杏、樱桃等)和观赏植物(如梅花、桃花、樱花、月季、玫瑰、花楸等)属于该科。在北半球的亚热带和温带地区，蔷薇科是大科之一，全世界约2800-3500种，在我国有约950种，一半以上为我国特有。仿冒、张冠李戴等问题，会带来一些经济的纠纷，例如我们市场上的樱桃，实际上是两个不同的物种：樱桃(Prunus pseudocerasus)、欧洲甜樱桃(C.avium)，而市面上售价较贵的“车厘子”实际上是指欧洲甜樱桃，一些商贩将樱桃冒充“车厘子”出售，获取高价利润；花卉市场中贩卖的所谓的“玫瑰”实际上为月季(Rosa chinensis)而并不是玫瑰(R.rugosa)。而解决这些问题的根本在于对蔷薇科植物进行有效的鉴定。
传统的形态学鉴定方法需要基于完整的形态特征，同时需要鉴定人员具有扎实的分类学基础以及丰富的鉴定经验进行鉴定，一旦待鉴定植物形态特征不完整(如碎片、加工过的果实等)则很难鉴定准确。除此之外，植物形态受生长环境影响极大，许多生长在不同生态环境中的同种植物，形态上会发生很大的变异，单纯从形态进行鉴定也是存在一定的误差。因此从DNA分子水平上对植物进行鉴定，是有效解决植物准确鉴定，保障市场公平竞争的迫切需要。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指利用一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA序列片段作为标记来实现对物种的快速、准确和自动化鉴别技术。该技术弥补了传统分类方法的不足，能够快速、准确地鉴定物种。在2009年第三届国际DNA条形码会议上，决定将叶绿体基因片段rbcL和matK作为植物DNA标准条形码的核心码，同时建议将叶绿体基因片段trnH-psbA和核基因ITS作为植物DNA条形码的补充码。然而，上述的几个条形码并不能在所有类群中都有较高的分辨率，因此针对不同的类群，还会在此基础上筛选类群专一的DNA条形码片段。而针对蔷薇科植物有效的鉴定方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用。
本发明提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物对1至引物对8组成；
(a2)引物对1至引物对8中的任意一个引物对；
(a3)引物对1至引物对8中的任意2个引物对的组合、任意3个引物对的组合、任意4个引物对的组合、任意5个引物对的组合、任意6个引物对的组合或任意7个引物对的组合；
(a1)或(a2)或(a3)中，所述引物对1由引物Ros-matK-F和引物Ros-matK-R组成；
所述引物Ros-matK-F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-matK-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对2由引物Ros-ITS-1-F和引物Ros-ITS-1-R组成；
所述引物Ros-ITS-1-F为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-ITS-1-R为如下(c3)或(c4)：
(c3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(c4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对3由引物Ros-ITS-2-F和引物Ros-ITS-2-R组成；
所述引物Ros-ITS-2-F为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-ITS-2-R为如下(d3)或(d4)：
(d3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(d4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物对4由引物Ros-rbcL-F和引物Ros-rbcL-R组成；
所述引物Ros-rbcL-F为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(e2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-rbcL-R为如下(e3)或(e4)：
(e3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(e4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物对5由引物Ros-trnH-psbA-F和引物Ros-trnH-psbA-R组成；
所述引物Ros-trnH-psbA-F为如下(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(f2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-trnH-psbA-R为如下(f3)或(f4)：
(f3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(f4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物对6由引物Ros-atpB-rbcL-F和引物Ros-atpB-rbcL-R组成；
所述引物Ros-atpB-rbcL-F为如下(g1)或(g2)：
(g1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(g2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-atpB-rbcL-R为如下(g3)或(g4)：
(g3)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(g4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物对7由引物Ros-trnL-F和引物Ros-trnL-R组成；
所述引物Ros-trnL-F为如下(h1)或(h2)：
(h1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(h2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-trnL-R为如下(h3)或(h4)：
(h3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(h4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物对8由引物Ros-sbeI-F和引物Ros-sbeI-R组成；
所述引物Ros-sbeI-F为如下(i1)或(i2)：
(i1)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(i2)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ros-sbeI-R为如下(i3)或(i4)：
(i3)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(i4)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为辅助进行蔷薇科植物物种鉴定。
本发明还保护所述引物组合在辅助进行蔷薇科植物物种鉴定中的应用。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助进行蔷薇科植物物种鉴定。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种蔷薇科植物物种鉴定的方法，包括如下步骤：
以待测植物基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对进行如下步骤：PCR扩增、测序、系统发育树构建和分析。
采用多个引物对进行分析时，可通过联合构建系统发育树进行分析。
所述系统发育树构建和分析的方法为：将待测植物得到的测序序列经过序列校对、拼接(Sequencher 4.7)和比对(MAFFT)后，与相应基因位点的蔷薇科数据合并，使用PAUP*4.0的Neighbor-joining算法进行系统发育树构建，通过进行1000次重复(Replicates)的自展分析(Bootstrap)获得各节点支持率来评估拓扑结构的可靠性。
引物对1检测的基因位点为matK。
引物对2检测的基因位点为ITS-1。
引物对3检测的基因位点为ITS-2。
引物对4检测的基因位点为rbcL。
引物对5检测的基因位点为trnH-psbA。
引物对6检测的基因位点为atpB-rbcL。
引物对7检测的基因位点为trnL。
引物对8检测的基因位点为sbeI。
系统发育树构建构建完成后，通过系统发育树结构、支持率等相关结果进行鉴定。相同种的样品在系统发育树中聚为一枝，支持率至少大于50％，则认为该种可被鉴定出来，支持率越高结果越可靠。
所述PCR扩增体系具体可为：10×PCR Buffer(Mg2+)1μl，2mM dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，基因组DNA 1μl，5U/μl Taq DNA polymerase 0.1μl，ddH2O 5.9μl。各条引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为5μM。基因组DNA以DNA溶液的形式加至反应体系中，基因组DNA在DNA溶液中的浓度为5ng-50ng/μl。
所述PCR反应程序具体可为94℃，4min预变性；94℃变性30s、50℃退火40s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
以上任一所述植物为蔷薇科植物，具体可为蔷薇属植物(更具体可如表2所示)、樱属植物(更具体可如表3所示)或悬钩子属植物(更具体可如表4所示)。
以上任一所述鉴定可包括植物的花、果、叶、种子材料鉴定。
利用本发明提供的特异引物，可开发鉴定蔷薇科植物物种的通用试剂盒，推动植物DNA条形码在社会服务中的应用。
附图说明
图1为实施例3的一中的鉴定结果。
图2为实施例3的二中的鉴定结果。
图3为实施例3的三中各样本目标片段测序结果第1-80位。
图4为实施例3的三中各样本目标片段测序结果第81-180位。
图5为实施例3的三中各样本目标片段测序结果第181-280位。
图6为实施例3的三中各样本目标片段测序结果第281-376位。
图7为实施例3的三中构建的系统发育树。
图8为实施例3的四中各样本目标片段测序结果第1-80位。
图9为实施例3的四中各样本目标片段测序结果第81-180位。
图10为实施例3的四中各样本目标片段测序结果第181-280位。
图11为实施例3的四中各样本目标片段测序结果第281-367位。
图12为实施例3的四中构建的系统发育树。
图13为实施例3的五中各样本使用Ros-matK-F和Ros-matK-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第1-80位。
图14为实施例3的五中各样本使用Ros-matK-F和Ros-matK-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第81-180位。
图15为实施例3的五中各样本使用Ros-matK-F和Ros-matK-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第181-280位。
图16为实施例3的五中各样本使用Ros-matK-F和Ros-matK-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第281-345位。
图17为实施例3的五中各样本使用Ros-rbcL-F和Ros-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第1-80位。
图18为实施例3的五中各样本使用Ros-rbcL-F和Ros-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第81-180位。
图19为实施例3的五中各样本使用Ros-rbcL-F和Ros-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第181-280位。
图20为实施例3的五中各样本使用Ros-rbcL-F和Ros-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第281-401位。
图21为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第1-80位。
图22为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第81-180位。
图23为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第181-280位。
图24为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第281-380位。
图25为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第381-447位。
图26为实施例3的五中各样本使用Ros-atpB-rbcL-F和Ros-atpB-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第1-80位。
图27为实施例3的五中各样本使用Ros-atpB-rbcL-F和Ros-atpB-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第81-180位。
图28为实施例3的五中各样本使用Ros-atpB-rbcL-F和Ros-atpB-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第181-280位。
图29为实施例3的五中各样本使用Ros-atpB-rbcL-F和Ros-atpB-rbcL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第281-381位。
图30为实施例3的五中各样本使用Ros-trnL-F和Ros-trnL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第1-80位。
图31为实施例3的五中各样本使用Ros-trnL-F和Ros-trnL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第81-180位。
图32为实施例3的五中各样本使用Ros-trnL-F和Ros-trnL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第181-280位。
图33为实施例3的五中各样本使用Ros-trnL-F和Ros-trnL-R组成的引物对扩增出的目标片段的测序结果第281-402位。
图34为实施例3的五中各样本使用Ros-matK-F和Ros-matK-R组成的引物对(A)、Ros-rbcL-F和Ros-rbcL-R组成的引物对(B)进行鉴定构建的系统发育树。
图35为实施例3的五中各样本使用Ros-trnH-psbA-F和Ros-trnH-psbA-R组成的引物对(A)、Ros-atpB-rbcL-F和Ros-atpB-rbcL-R组成的引物对(B)进行鉴定构建的系统发育树。
图36为实施例3的五中各样本使用Ros-trnL-F和Ros-trnL-R组成的引物对进行鉴定构建的系统发育树。
图37为实施例3的五中各样本使用5组引物对进行鉴定联合构建的系统发育树。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、筛选用于蔷薇科植物鉴定的基因位点及引物设计
收集大量已测蔷薇科叶绿体基因片段、核基因片段筛选蔷薇科植物中高变的基因片段的初始数据集，根据基因片段将数据集分组，保留基因片段至少包含5个种以上，使用MAFFT软件比对序列，然后使用BioEdit软件手动调整比对结果，通过编写的python脚本对个基因片段进行评估。最终选取了用于蔷薇科植物鉴定的7个基因片段，共计8个基因位点(matK、ITS-1、ITS-2、rbcL、trnH-psbA、atpB-rbcL、trnL、sbeI)。
针对8个基因位点设计了8对用于鉴定蔷薇科植物的特异引物，具体信息如表1。
表1引物信息
Figure BDA0001742303030000061
实施例2、检测方法的建立
1、提取待测样品的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用表1中的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，优先选用选择植物DNA标准条形码的核心码matK和rbcL以及补充条形码ITS和trnH-psbA对应的引物进行鉴定，如果上述四个条形码对应的引物不能够鉴定物种，再选择其他引物，简单类群可选择单一或少量引物对的组合进行鉴定，复杂类群则需要多个引物对联合进行鉴定。
PCR扩增体系(10μl)：10×PCR Buffer(Mg2+)1μl，2mM dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，基因组DNA 1μl，5U/μl Taq DNA polymerase 0.1μl，ddH2O 5.9μl。
各条引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为5μM。
基因组DNA以DNA溶液的形式加至反应体系中，基因组DNA在DNA溶液中的浓度为5ng-50ng/μl。
PCR反应程序：94℃，4min预变性；94℃变性30s、50℃退火40s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测同一引物对扩增产物是否在目标片段长度位置显示特异性条带(目标片段长度见表1)。
4、回收步骤3中的特异性条带进行测序。
5、数据分析，对测序得到的序列进行序列校对、拼接(Sequencher 4.7)和比对(MAFFT和BioEdit)，将待测样品序列与相应基因位点的蔷薇科数据合并进行系统发育分析，使用PAUP*4.0的Neighbor-joining算法进行系统发育树构建，通过进行1000次重复(Replicates)的自展分析(Bootsrap)获取各节点支持率来评估拓扑结构的可靠性，通过系统发育树结构、支持率等相关结果进行鉴定。相同种的样品在系统发育树中聚为一枝，支持率至少大于50％，则认为该种可被鉴定出来，支持率越高结果越可靠。
实施例3、实际检测
本实施例中的所有样品的DNA均可从中国植物DNA库获取。
一、鉴定白玉山蔷薇是否珍稀濒危物种
待测样本：BOP214501(特产于旅顺的白玉山蔷薇，用于鉴定其是否为珍稀濒危物种)。
按照实施例2的方法进行检测，采用表1中的Ros-ITS-1-F、Ros-ITS-1-R组成的引物对进行PCR扩增。目标片段的测序结果如序列表的序列17所示。
结果如图1拓扑结构所示。
结果显示，白玉山蔷薇来自欧洲的蔷薇遗传资源逃逸产生。
二、樱花鉴定
待测样本：未知樱花干燥叶片一份，编号为BOP204816。
按照实施例2的方法进行检测，采用表1中的Ros-ITS-1-F、Ros-ITS-1-R组成的引物对进行PCR扩增。目标片段的测序结果如序列表的序列18所示。
结果如图2所示。
结果显示，待测样品BOP204816最接近日本特有植物蔷薇科李属富士樱(Prunusincise Thunb.)。
三、鉴定蔷薇属植物
本实施采用蔷薇属的7个种的19份材料，实验材料信息见表2。
表2蔷薇属植物的材料信息
Figure BDA0001742303030000081
按照实施例2的方法进行检测，采用表1中的Ros-ITS-2-F、Ros-ITS-2-R组成的引物对进行PCR扩增。
目标片段的测序结果分别如图3-图6所示。系统发育树见图7。图7中，分支上的数字代表支持这一枝聚在一起的支持率(％)。结果显示，蔷薇属的Rosa banksiae、R.roxburghii、R.cymosa、R.halenae、R.soulieana、R.berberifolia、R.albertii七个种的样品分别聚成一枝，且支持率分别为100％、95％、100％、94％、86％、82％、98％，使用引物Ros-ITS-2-F和引物Ros-ITS-2-R组成的引物对能够鉴定蔷薇属的7个种。
四、鉴定樱属植物
本实施采用樱属的5个种的15份材料，实验材料信息见表3。
表3樱属植物的材料信息
Figure BDA0001742303030000082
Figure BDA0001742303030000091
按照实施例2的方法进行检测，采用表1中的Ros-sbeI-F和Ros-sbeI-R组成的引物对进行PCR扩增。
使用Ros-sbeI-F和Ros-sbeI-R组成的引物对进行PCR扩增得到的目标片段的测序结果分别如图8至图11所示。图12为使用Ros-sbeI-F和Ros-sbeI-R组成的引物对进行PCR扩增，所有样品测序结果构建的NJ树结果。由图12可见，Cerasus campanulata、C.subhirtella、C.serrulata、C.tomentosa、C.trichostoma、C.polytricha、C.pseudocerasus七个种的所有样品各自聚成一枝，且支持率分别为95％、87％、69％、85％、100％、85％、64％，均大于50％，该引物对能够鉴定材料表3中所有种。
五、鉴定悬钩子属植物
本实施采用的实验材料信息如表4所示。
表4悬钩子植物材料信息表
Figure BDA0001742303030000092
Figure BDA0001742303030000101
按照实施例2的方法进行检测，由于悬钩子属植物鉴定复杂，单一位点能够鉴定的种类较少，因此采用表1中的多个引物对分别进行PCR扩增。目标片段的测序结果如图13-33所示。各位点单独构建系统发育树(NJ树)结果如图34-图37所示。
图34A中，使用Ros-matK-F(序列1)和Ros-matK-R(序列2)组成的引物对能够鉴定出Rubus buergeri、R.sumatranus、R.corchorifolius、R.parviflorus四个种(图34A中这四个种的样品分别聚成一枝，且支持率分别为74％、93％、99％、98％)。
图34B中，使用Ros-rbcL-F(序列7)和Ros-rbcL-R(序列8)组成的引物对能够鉴定出R.buergeri、R.sumatranus两个种(图34B中上述三个种的样品分别聚成一枝，且支持率分别为94％、62％)。
图35A中，使用Ros-trnH-psbA-F(序列9)和Ros-trnH-psbA-R(序列10)组成的引物对能够鉴定出R.buergeri、R.sumatranus、R.corchorifolius、R.innominatus、R.mesogaeus、R.stans六个种(图35A中上述六个种的样品分别聚成一枝，且支持率分别为100％、100％、94％、75％、83％、94％)。
图35B中，使用Ros-atpB-rbcL-F(序列11)和Ros-atpB-rbcL-R(序列12)为引物对能够鉴定出R.buergeri、R.stans两个种(图35B中上述四个种的样品分别聚成一枝，且支持率分别为65％、86％)。
图36中，使用Ros-trnL-F(序列13)和Ros-trnL-R(序列14)组成的引物对能够鉴定出R.buergeri、R.mesogaeus、R.stans、R.sumatranus四个种(图36中上述五个种的样品分别聚成一枝，且支持率为98％、68％、86％、87％)。
图37为上述引物对联合构建的NJ树，表4中的七个种均可鉴定出来，对应的所有样品分别聚为一枝。由此可见，用于复杂类群鉴定时，多位点联合建树能够比单位点鉴定更多样品。
上述结果表明，采用实施例1中的引用组合可以实现蔷薇科植物物种的鉴定。实际应用中，可将实施例1引物组合中的一种或几种组合使用，完成蔷薇科植物物种的鉴定。
序列表
<110> 中国科学院植物研究所
<120> 用于进行蔷薇科植物物种鉴定的片段组合、特异引物及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttattacga ctctttcttc acgag 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> y=t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> k=t or g
<400> 2
aaatkgacaa gataatatyt cca 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaacaaggt ttccgtaggt gaacc 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> y=t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> r=g or a
<400> 4
gcgttcaaag aytcgatgrt tc 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> w=t or a
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> y=t or c
<400> 5
cawcgatgaa gaacgyagc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> r=g or a
<400> 6
rgtttctttt cctccgctta 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> r=g or a
<400> 7
cattacttra acgctactgc aggtaca 27
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> k=t or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> y=t or c
<400> 8
aaacgtgaat accccckgaa gcyac 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtatgcatga acgtaatgct c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcagcatatc gatttacgct tagcc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcaattaat aattctcaca agaac 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataggtgcag agactcaatg gaagc 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttggggata gagggacttg aacc 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ataccagaaa catcttcggc aatta 25
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> r=g or a
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> r=g or a
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> y=t or c
<400> 16
tgatggatrt trttcacagy catgcaa 27
<210> 17
<211> 670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgaacctgc ggaaggatca ttgtcgaaac ctgcctagca gaacgacccg agaacatgtt 60
tcaacgcttg ggggcggagg gtcttgcggc tctgcgcccc cttatcctag gaggcaagtg 120
tcttgcgtgt tgcatttcgg tgcttgtgct tgaccgaccc tcctaggcgt actgaacacc 180
ggcgtgaatt gcgccaagga acttgaatga aagagcgttc ccccgccttc ccggagacgg 240
tgctcgtgcg ggtggtttcg tcgtcttcaa tatgtctaaa cgactctcgg caacggatat 300
ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa 360
tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa gttgcgcccg aagccattag gccgagggca 420
cgtctgcctg ggcgtcacac gtcgttgccc cccccaaacc ccctcgggag ttggatggga 480
cggatgatgg ccttcccgtg tgctcagtca cgcggttggc ataaatacca agtcctcggc 540
gaccaacgcc acgacaatcg gtggttgtca aacctcggtt tcctgtcgtg cgcgcgtgtt 600
gatcgagtgc tttcttaaac aatgcgtgtc gatccgtcga tgctttcaac gcgaccccag 660
gtcaggcggg 670
<210> 18
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgaaacctg cctagcagaa cgacccgaga actagtttca aagcggggga tgaggggtct 60
tgcggctcct tgtcccttta tctcgggggg gttgcgttgc gttcgcgcaa ccgacccttc 120
cgtgcgtaca aacgaacacc ggcgcgaatt gcgccaagga acctgaatga gagagcgcgt 180
ccccgttgcc ccggaaacgg tgcgcgcggg cggcgtcgtc atcttcaaat atgtcaaaac 240
gactctcggc aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg aaatgcgata 300
cttggtgtga attgcagaat cccgtgaacc atcgagtctt tgaacgcaag ttgcgcccga 360
agccattagg ccgagggcac gcctgcctgg gcgtcacacg tcgttgcacc cccactactc 420
cctcgggatt gcggggtgcg gatgatggcc tcccgtacgc tccgtcgcgc ggttggcata 480
aataccaagt cctcggcgac gcacgccacg acaatcggtg gttgcgaaac ctcggttgcc 540
cgtcgtgtgc ggtcgtcgcg catcgggggc tcgaaaaaat gcttggctcc ggcttggctt 600
tcaacgcgac cccaggtcag gcggggttac ccg 633

Claims (6)

1.引物组合，由引物对1至引物对8组成；
所述引物对1由引物Ros-matK-F和引物Ros-matK-R组成；
所述引物Ros-matK-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-matK-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物对2由引物Ros-ITS-1-F和引物Ros-ITS-1-R组成；
所述引物Ros-ITS-1-F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-ITS-1-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
所述引物对3由引物Ros-ITS-2-F和引物Ros-ITS-2-R组成；
所述引物Ros-ITS-2-F为序列表的序列5所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-ITS-2-R为序列表的序列6所示的单链DNA分子；
所述引物对4由引物Ros-rbcL-F和引物Ros-rbcL-R组成；
所述引物Ros-rbcL-F为序列表的序列7所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-rbcL-R为序列表的序列8所示的单链DNA分子；
所述引物对5由引物Ros-trnH-psbA-F和引物Ros-trnH-psbA-R组成；
所述引物Ros-trnH-psbA-F为序列表的序列9所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-trnH-psbA-R为序列表的序列10所示的单链DNA分子；
所述引物对6由引物Ros-atpB-rbcL-F和引物Ros-atpB-rbcL-R组成；
所述引物Ros-atpB-rbcL-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-atpB-rbcL-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子；
所述引物对7由引物Ros-trnL-F和引物Ros-trnL-R组成；
所述引物Ros-trnL-F为序列表的序列13所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-trnL-R为序列表的序列14所示的单链DNA分子；
所述引物对8由引物Ros-sbeI-F和引物Ros-sbeI-R组成；
所述引物Ros-sbeI-F为序列表的序列15所示的单链DNA分子；
所述引物Ros-sbeI-R为序列表的序列16所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述的引物组合在辅助进行蔷薇科植物物种鉴定中的应用。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助进行蔷薇科植物物种鉴定。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种蔷薇科植物物种鉴定的方法，包括如下步骤：
以待测植物基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述的引物组合中的引物对进行如下步骤：PCR扩增、测序、系统发育树构建和分析。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述系统发育树构建和分析的方法为：将待测植物得到的测序序列经过序列校对、拼接和比对后，与相应基因位点的蔷薇科数据合并，使用PAUP*4.0的Neighbor-joining算法进行系统发育树构建，通过进行1000次重复的自展分析获得各节点支持率来评估拓扑结构的可靠性。
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