CN114574621A - 一种李属资源分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种李属资源分子标记及其应用，李属资源包括大石早生、五月脆、好莱坞和冰糖李，分子标记为DNA条形码，DNA条形码为叶绿体rbcL‑accD基因间隔区的序列，还公开了应用，分子标记用于鉴定不同李属资源品种，还公开了一种李属资源的鉴定方法；本发明利用叶绿体rbcL‑accD基因间隔区进行引物设计，设计出的引物对经过PCR扩增后产物的碱基序列差异进行鉴定，可以直接获得鉴定结果，实现不同李属资源品种的快速鉴定，检测准确性高、可重复性高以及鉴定时间短。

Description

一种李属资源分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体一种李属资源分子标记及其应用。

背景技术

李是蔷薇科、李属植物，广泛分布于世界各国，也是我国重要的传统果树之一。李果实富含类胡萝卜素、维生素和花色苷等生物活性物质，具有预防多种疾病的功效，深受消费者喜爱。我国李属资源极其丰富，李品种数量繁多，随着育种水平的提高，大量优质地方品种被成功选育，我国李种质资源极其丰富，李品种数量繁多，命名不科学，同名异物或同物异名的现象十分严重，严重阻碍了李种质资源的开发利用。因此，通过系统的研究，完善品种资源分类，对李种质资源的收集、保存和利用具有十分重要的意义。

近年来，DNA条形码对物种进行分类鉴定已经成为一种准确高效的方法，DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和物种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，可实现对物种的快速自动鉴定；该技术已被成功应用于生物物种分类和鉴定等领域，并成为进展最迅速的学科前沿之一，且由于植物叶绿体基因组进化速率较快、单性遗传等特点，适合用来筛选植物DNA条形码以对同类植物资源加以鉴定。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种李属资源分子标记及其应用，本发明通过实验，以叶绿体基因组为基础，筛选设计出了一对高质量的引物序列，根据基因测序结果有效鉴定区分四种李属资源大石早生、五月脆、好莱坞和冰糖李，并通过三次重复试验及不同产地的材料验证，证明该引物对鉴定四种李属资源的可行性。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种李属资源分子标记，所述李属资源包括大石早生、五月脆、好莱坞和冰糖李，所述分子标记为DNA条形码，DNA条形码为叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列，其序列为SEQ ID NO.1。

为解决以上技术问题，本发明还提供了一种李属资源分子标记的应用，所述分子标记用于鉴定不同李属资源品种，所述分子标记利用叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列设计引物对。

为解决以上技术问题，本发明还提供了用于鉴定不同李属资源品种的引物对，所述引物对序列为：

Flz006(上游引物序列)：5’AGGATTGAGCCGAATACAATAA3’(SEQ ID NO.2)；Rlz006(下游引物序列)：5’AAACGCAGGATCAGGATATAAT 3’(SEQ ID NO.3)。

为解决以上技术问题，本发明还提供了一种李属资源的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)提取待测李属资源样品的基因组DNA，每个李属资源样品各取三份；

(2)利用设计出的引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)对扩增产物进行测序，对测序结果比对分析后，通过碱基序列的差异进行鉴定；

进一步的，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为25μL：DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、PCR SuperMix(+dye)12.5μL和ddH2O8.5μL；其反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃修复延伸5min，保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：与传统的形态学鉴定方法相比，本发明利用叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列设计出的引物对鉴定不同李属资源品种，可通过设计出的引物对进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，可以实现不同李属资源品种的快速鉴定，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。

附图说明

图1为本发明实施例的三组四种不同李属资源目的片段序列的比对结果；

图2为本发明实施例的三组四种不同李属资源PCR扩增结果电泳图，其中泳道2～12分别为：DS1：大石早生1；WY1：五月脆1；HW1：好莱坞1；BT1：冰糖李1；DS2：大石早生2；WY2：五月脆2；HW2：好莱坞2；BT2：冰糖李2；DS3：大石早生3；WY1：五月脆3；HW3：好莱坞3；BT3：冰糖李3，M为TaKaRaDL1,000DNAMarker；

图3为本发明实施例验证可行性的三组不同产地的四种李属资源目的片段序列的比对结果；

图4为本发明实施例的三组四种李属资源目的片段的碱基位点示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1鉴定不同李属资源品种的前期准备

本实施例包括四种李属资源，分别为大石早生、五月脆、好莱坞和冰糖李，每种李属资源各取三份进行实验，其来源详见表1。

表1李属资源的来源

本实施例鉴定不同李属资源的分子标记为DNA条形码，DNA条形码为叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列，为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

本实施例的DNA条形码的获得过程如下：

首先对叶绿体基因组进行测序，测序完成后组装注释，然后用MATTT version7在线版(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)进行多重序列比对，筛选出差异片段，结合注释信息，最后确定出是在rbcL-accD基因间隔区内。

本实施例的引物设计过程如下：

采用筛选出的差异片段前后各取200bp左右的保守区间，利用IDT网站(https:// sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest？returnurl＝％2FPrimerquest％2FHome％ 2FIndex)设计引物，设计出的引物对可用于鉴定不同李属资源的品种。

引物对的序列为：

Flz006(上游引物序列)：5’AGGATTGAGCCGAATACAATAA 3’(SEQ ID NO.2)；

Rlz006(下游引物序列)：5’AAACGCAGGATCAGGATATAAT 3’(SEQ ID NO.3)。

实施例2鉴定不同李属资源品种的方法

鉴定不同李属资源品种的具体方法步骤如下：

1.使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)进行四个李属资源DNA提取。

关于DNA提取的具体操作步骤如下：

(1)取700μl缓冲液GP1至2ml离心管，加入2％体积的β-巯基乙醇，混匀，作为缓冲液GP1工作液，并放置65℃水浴锅预热。

(2)取100mg植物材料至研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末。立即加入700μl预热缓冲液GP1工作液，漩涡震荡30s。

(3)将离心管放在65℃水浴锅30min,每隔5min取出颠倒混匀。

(4)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。

(5)将上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

(6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。

(7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复此操作。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置20min，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.利用上述设计出的引物对进行PCR扩增

PCR扩增的反应体系为25ul,在0.2ml的离心管配置，具体如表2所示。

表2 PCR扩增的反应体系

PCR扩增的反应程序如表3所示。

表3 PCR扩增的反应程序

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图如附图2所示，其中DS1：大石早生1；WY1：五月脆1；HW1：好莱坞1；BT1：冰糖李1；DS2：大石早生2；WY2：五月脆2；HW2：好莱坞2；BT2：冰糖李2；DS3：大石早生3；WY1：五月脆3；HW3：好莱坞3；BT3：冰糖李3，共为三组实验。

图中不同条带代表一个长度信息，验证产物的长度是否和目的片段一致。

3.扩增产物测序与结果分析

若PCR产物长度与目的片段一致，送至北京诺赛生物公司进行Sanger法DNA测序，再用MATTT version7在线版(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)进行多重序列比对，通过四种李属资源的碱基序列的差异进行不同品种李属资源的鉴定。

测序结果分别进行拼接和比对，矩阵中的插入缺失用“-”代替，测序结果如附图1所示，测序结果差异片段的碱基位点如附图4所示，由此可知四种李属资源的DNA碱基序列不同，其中大石早生品种的第159bp-179bp碱基序列缺失，第200bp碱基缺失、以及201bp为T；五月脆品种的第159bp-179bp碱基序列缺失，第200bp和第201bp为T；好莱坞品种的第159bp-179bp碱基序列缺失，第200bp和第201bp均缺失；冰糖李品种的第159bp-179bp的碱基序列为AGGATTGGCGTATTCTT,第200bp和第201bp缺失，从而区分出不同李属资源的品种，且三组实验的结果相同，由此可反向证明该引物对的可行性。

4.验证实验

为验证该分子标记的可行性，另在不同产地采样，如表3所示，以同样方法提取DNA、PCR扩增和测序，结果如附图3所述，从而说明不同产地的李属资源不影响实验结果，该分子标记可用于鉴定本实施例中的四种李属资源。

表3与本实施例不同产地的四种李属资源

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 重庆市农业科学院 方波

<120> 一种李属资源分子标记及其应用

<130> 2022

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ttgaattgaa attaaactcg gcccaatctt ttactaaaag gattgagccg aatacaataa 60

aaagatccta ttgtatagat gtatagattt ttgatagata catacttata tagatataca 120

agatcttaaa tacaaaaata taagacgaaa caactaattc ttttattgtt gggttggatc 180

cacaattaat cctatggatc cttaggattg gcgtattctt aaggattggc gtattcttat 240

aatatttttt tttatattag tttagtatat tcttttttta tatattatta tattttttta 300

tatattatta tatcctgatc ctgcgttttt ggatcatgga tcgagccaaa tatc 354

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aggattgagc cgaatacaat aa 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aaacgcagga tcaggatata at 22

Claims (5)

1.一种李属资源分子标记，其特征在于，所述李属资源包括大石早生、五月脆、好莱坞和冰糖李，所述分子标记为DNA条形码，DNA条形码为叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列，为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的一种李属资源分子标记的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定不同李属资源品种，所述分子标记利用叶绿体rbcL-accD基因间隔区的序列设计引物对。

3.用于鉴定不同李属资源品种的引物对，其特征在于，所述引物对序列为：Flz006(上游引物序列)：5’AGGATTGAGCCGAATACAATAA 3’(SEQ ID NO.2)；Rlz006(下游引物序列)：5’AAACGCAGGATCAGGATATAAT 3’(SEQ ID NO.3)。

4.一种李属资源的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测李属资源样品的基因组DNA，每个李属资源样品各取三份；

(2)利用设计出的引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)对扩增产物进行测序，对测序结果比对分析后，通过碱基序列的差异进行鉴定。

5.根据权利要求4所述的一种李属资源的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为25μL：DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、PCR SuperMix(+dye)12.5μL和ddH2O 8.5μL；其反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃修复延伸5min，保存。

Images