CN111663001B - 一种区分甘蔗种间三号染色体遗传背景的ssr标记与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体遗传背景的微卫星分子标记与应用，包括四对位于甘蔗高贵种三号染色体的SSR分子标记核心引物对，研究基于甘蔗高贵种和割手密种全基因组数据，设计、合成SSR标记引物，并对5份高贵种材料、4份割手密种材料、2份栽培种材料品种资源进行分析。筛选出的4对引物可以分清SSR所在甘蔗高贵种和割手密种的染色体位置，准确、高效地鉴定甘蔗品种，可用于甘蔗遗传分析和品种鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术开发及应用技术领域，特别涉及一种区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体(对应高贵种)遗传背景的分子标记开发与应用。
背景技术
甘蔗(Saccharum hybrids)是中国乃至全球重要的糖料作物，甘蔗糖分别占我国和全球食糖总量的90%和 80%。甘蔗除了制糖，还可以生产燃料乙醇、制作青贮饲料，制糖副产品还可以进行高值化、资源化为目的的多元化利用。甘蔗属(Saccharum)包含热带种(S. officinarum)、中国种(S. sinense)、印度种(S. barberi)、大茎野生种(S. robustum)以及割手密种(S. spontaneum)等原始野生种和栽培种。
现代甘蔗育种的主要突破是通过种间杂交将野生割手密的抗性基因资源整合到热带种中。热带种与割手密杂交后，还经过了少于八代的杂交产生了现代栽培甘蔗，因此其基因组结构复杂，其染色体数目在 2n = 100~130 之间，其中 80%~90%的染色体来自于热带种，10%~20%来自于割手密，而染色体的 5%~17%为两个种间的染色体重组类型。甘蔗每条染色体都携带不同的遗传信息，分清现代甘蔗栽培种中高贵种不同染色体及其对应的割手密种染色体血缘背景，对现代甘蔗起源及扩大现代甘蔗育种的应用遗传资源研究具有重要指导意义。
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星 DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。SSR分子标记技术以其标记的多态性高、重复性好、操作相对简单、成本低等优点被广泛地应用于甘蔗遗传多样性、遗传连锁图构建等方面的研究。随着分子标记辅助选育种技术的应用和发展，SSR分子标记技术已经成为目前应用最广泛的分子标记之一。
由于甘蔗是异源多倍体，基因组血缘组成高度复杂，染色体数量庞大，目前获得的甘蔗SSR分子标记数量有限、多态性低，无法满足甘蔗分子标记辅助育种和遗传作图等工作的要求。且传统的SSR标记开发方法耗费人力、物力、且效率低下，尤其是对于多倍体的甘蔗，开发难度更加大。不过随着目前甘蔗基因组序列测定的完成，将使得甘蔗实施分子育种策略成为可能，本发明基于我们已经破译的甘蔗全基因组序列，利用生物信息学手段来分析SSR的分布特点和规律，设计、合成甘蔗高贵种和割手密种种间特异性SSR引物，通过实验验证引物的多态性进而开发相关的标记，这显然是效率最高、费用最低的一种方法。
发明内容
本发明的目的是针对目前甘蔗SSR分子标记数量少、多态性低的现状，运用甘蔗全基因组扫描开发SSR标记引物，提供一组与甘蔗高贵种三号染色体位置相关联的、尤其适合于甘蔗属的资源遗传分析和品种鉴定的SSR标记引物组及其应用。具体为分清SSR所在甘蔗高贵种、割手密种基因组染色体的位置，进而分清甘蔗高贵种和割手密种的遗传背景，对现代甘蔗起源及扩大现代甘蔗育种的应用遗传资源提供技术支撑。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，提供一种区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体（对应高贵种）遗传背景的的SSR标记，包括4对多态性引物，其引物核苷酸序列及所在高贵种、割手密种染色体位置如下：
引物对1：
So.3B.Ss(AGT)6-F：5’-CGCTTCTCCTTCTGTGCAGT-3’；SEQ ID NO .1；
So.3B.Ss(AGT)6-R：5’-TACAATATACGGGCGCGTTC-3’；SEQ ID NO .2；
所在染色体位置：高贵种3号染色体/割手密3号染色体。
引物对2：
So.3D.Ss(CA)10-F：5’-GCAAAGCACTATGCGATCCT-3’；SEQ ID NO .3；
So.3D.Ss(CA)10-R：5’-GTGACTGACACCCCTGACCT-3’；SEQ ID NO .4；
所在染色体位置：高贵种3号染色体/割手密5号染色体。
引物对3：
So.3E.Ss(A)10(A)10-F：5’-CCTGCCAGAAAGTCACCAAT’；SEQ ID NO .5；
So.3E.Ss(A)10(A)10-R：5’-AAACCAGTCTACCGATGCAAA-3’；SEQ ID NO .6；
所在染色体位置：高贵种3号染色体/割手密7号染色体。
引物对4：
So.3G.Ss(AC)7-F：5’-AGCTGGCTATATGAAGCCCC-3’；SEQ ID NO .7；
So.3G.Ss(AC)7-R：5’-TGGGTATGCAGAGTGAGCAG-3’；SEQ ID NO .8。
所在染色体位置：高贵种3号染色体/割手密3号染色体。
第二方面，提供一种开发能够区分甘蔗高贵种和割手密种遗传背景的微卫星分子标记的方法，包括以下步骤：
（1）本研究应用MISA（Microsatellite identification tool）软件扫描甘蔗高贵种、割手密种基因组的SSR 位点。
（2）对SSR位点两侧截取各150 bp序列设计引物，将候选的SSR序列与全基因组序列进行BLASTN比对。
（3）用Primer3对候选SSR位点设计两侧引物。
（4）将设计好的引物在自身基因组上进行e-PCR 模拟扩增，之后将高贵种获得的引物比对到割手密种，同时将割手密种获得的引物比对到高贵种，筛选甘蔗高贵种和割手密种均存在但片段大小存在差异的SSR即甘蔗高贵种和割手密种种间特异性SSR能够区分其遗传背景。
（5）选择有代表性的5份甘蔗高贵种、4份割手密种材料、2份栽培种材料，用甘蔗种间特异性SSR引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。
（6）将得到的扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。
本发明的有益效果是：本发明提供了4对区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体（对应高贵种）遗传背景的微卫星分子标记，可明确分清SSR所在高贵种和割手密种基因组染色体的位置，从分子标记的角度分析现代甘蔗的起源进化过程，为现代甘蔗的进化分析提供新的思路和依据。
附图说明
图1为四对SSR标记两侧基因的GO项富集。
图2为 So.3B.Ss(AGT)6引物在11个甘蔗材料上的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图3为So.3D.Ss(CA)10引物在11个甘蔗材料上的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图4为So.3E.Ss(A)10(A)10引物在11个甘蔗材料上的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图5为So.3G.Ss(AC)7SSR引物在11个甘蔗材料上的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图2-5中1-5为甘蔗高贵种、6-9为割手密种、10-11为栽培种材料，M为50 bp DNALadder。
具体实施方式
实施例1
1.甘蔗高贵种和割手密种全基因组序列中SSR序列的查找和SSR引物的设计及验证
1.1 寻找SSR
本研究利用 Micro Satellite identification tool-MISA 软件包中的 Perl脚本进行扫描甘蔗高贵种、割手密种基因组的SSR 位点，在配置文件中设置参数，核苷酸重复基序(motif)分别为单(mononucleotide repeats MDRs)、二(dinucleotide
repeats DNRs)、三(trinucleotide repeats TNRs)、四 (tetranucleotiderepeats TtNRs)、五(pentanucleotide repeats PNRs)、六(hexanucleotide repeatsHNRs)，对应最短序列长度分别定为10、14、18、20、20、24bp；两个 SSR 之间距离小于 100bp 时组合为一个复合 SSR。
1.2 序列截取
计算每个SSR位点在基因组序列上的物理位置，对SSR位点两侧截取各150 bp序列设计引物，将候选的SSR序列与全基因组序列进行BLASTN搜索（E取值1e-5），序列相似度100%，侧翼序列长度100%对齐。
1.3 寻找可设计引物的SSR
MISA软件提供与批量设计引物软件Primer3的接口工具，把MISA识别出来的SSR序列转为Primer3需要的格式，从而方便批量设计引物。设置参数为：引物长度18-23bp，最佳为20bp，最大、最小GC含量分别为60%、40%，产物目标片段大小在100-300bp，引物设计时要确保产物序列中包括SSR位点。引物设计完成后将引物提取出并将重复的引物去除。高贵种有63415个SSR设计到引物，割手密种有68214个设计到引物。
1.4 引物验证
利用 Electronic PCR(https://www.animalgenome.org/bioinfo/resour
-ces/manuals/ePCR.html)将设计好的引物在基因组上进行电子 PCR 模拟扩增，将能够在基因组上扩增出特异性片段的引物提取出来作为甘蔗 SSR的储备引物。最终高贵种获得44048个引物，割手密获得45412个引物。之后将高贵种获得的引物比对到割手密种，同时将割手密种获得的引物比对到高贵种，筛选甘蔗高贵种和割手密种均存在但片段大小存在差异的SSR即甘蔗高贵种和割手密种种间特异性SSR进行验证。
2.甘蔗高贵种和割手密种种间特异性SSR引物的筛选
2.1提取基因组DNA
选择有代表性的5份甘蔗高贵种、4份割手密种、2份栽培种材料（表1），用于检测甘蔗全基因组SSR标记的扩增效率及种间特异性，采用CTAB法提取基因组DNA。
表1 11份甘蔗材料信息
2.2 PCR扩增
采用合成的引物，在11份材料的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选出扩增结果稳定、种间特异性高及多态性丰富的引物。PCR反应体系20μL，其中25 ng/μL DNA样品0.5μL、10 μmol L-1 正向、反向引物各0 .5μL、2× Taq Master Mix 10μL，最后用ddH2O补足20μL。PCR扩增程序为94℃预变性1min30s；94℃变性20S，59.5℃退火20S，72℃延伸30S，共34个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。2× Taq Master Mix试剂购自铂尚生物科技有限公司。
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
所有PCR产物在9%的聚丙烯酰胺凝胶中进行分离，160V恒压下，电泳2h30min，电泳结束后，采用核酸染料（GelStain，购自北京全式金生物技术有限公司，货号：GS101-01），泡染法进行染色、拍照及保存。
根据11个甘蔗属材料的条带情况，筛选出4对位于高贵种三号染色体的带型清晰且明显存在种间特异性的目标引物，表2为目标引物序列SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .8及其所在染色体位置。后根据染色体位置寻找SSR标记两侧基因，发现这些SSR标记两侧的基因主要富集在GO生物合成和代谢通路上（附图1）。
表2 4对SSR引物所在染色体位置及序列
筛选获得4对引物其电泳结果如图2-5，从电泳图中明显看到在甘蔗高贵种和割手密种中均存在条带，且条带对应片段大小存在差异；在栽培种中可能存在其中一种条带，或者两种类型条带均存在，可以辅助验证这是一种区分甘蔗高贵种和割手密种遗传背景的SSR分子标记，且能够分清现代甘蔗栽培种中高贵种和割手密种染色体的血缘背景。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示，通过生物信息学得到的种间特异性SSR与实验结果是完全一致的，证明此项研究确实提高了开发SSR标记的效率。综上所述，本发明是一种低廉高效地开发基因组SSR种间特异性标记的好方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种能区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体遗传背景的微卫星分子标记开发与应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctgccagaa agtcaccaat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaccagtct accgatgcaa a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agctggctat atgaagcccc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgggtatgca gagtgagcag 20
Claims (2)
1.一种区分甘蔗高贵种和割手密种三号染色体遗传背景的SSR分子标记引物，其特征在于，包括4对特异性引物，其引物核苷酸序列如下：
So.3B.Ss(AGT)6上游引物如SEQ ID NO.1所示；
So.3B.Ss(AGT)6下游引物如SEQ ID NO.2所示；
So.3D.Ss(CA)10上游引物如SEQ ID NO.3所示；
So.3D.Ss(CA)10下游引物如SEQ ID NO.4所示；
So.3E.Ss(A)10(A)10上游引物如SEQ ID NO.5所示；
So.3E.Ss(A)10(A)10下游引物如SEQ ID NO.6所示；
So.3G.Ss(AC)7上游引物如SEQ ID NO.7所示；
So.3G.Ss(AC)7下游引物如SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的SSR分子标记引物在甘蔗高贵种和割手密种遗传分析和鉴定中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基于已通过测序组装得到的甘蔗高贵种和割手密种全基因组数据，设计、合成权利要求1所述的SSR分子标记引物；
（2）提取不同甘蔗属的基因组DNA，用所述的SSR分子标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增产物利用9%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物根据条带位置进行分析；
所述的PCR扩增反应的体系为：总体系20μL，其中25 ng/μL DNA样品0.5μL、10 μmol/L正向、反向引物各0.5μL、2× Taq Master Mix 10μL，最后用ddH2O补足20μL；
所述的PCR扩增反应的程序为：
94℃预变性1min30s；94℃变性20S，59 .5℃退火20S，72℃延伸30 S，共34个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
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| CN104321440A (zh) * | 2012-03-26 | 2015-01-28 | 丰田自动车株式会社 | 来源于甘蔗野生种基因组的茎长相关标志物及其利用 |
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| 小麦2B染色体新SSR标记开发;李小军等;《华北农学报》;20191230;第34卷(第3期);摘要、第69-71页第1.2节以及第2.1-2.3节 * |
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