CN106957921A - 一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点及其在育种中的应用 - Google Patents

一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点及其在育种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种适合食人工配合饲料大口黑鲈相关SNP基因位点，所述SNP基因位点为三个紧密连锁的SNP位点，所述三个SNP位点分别为位于大口黑鲈klotho基因2089bp处的C‑T型SNP、位于大口黑鲈klotho基因2128bp处的G‑A型SNP和位于大口黑鲈klotho基因3212bp处的A‑G型SNP。由于其紧密连锁，我们将其视为一个SNP位点(用位于大口黑鲈klotho基因3212bp处的A‑G型SNP表示)来研究，所述大口黑鲈klotho基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述SNP基因位点，可用于选育易驯食人工配合饲料的大口黑鲈。

Description

一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点及 其在育种中的应用
技术领域
本发明涉及一种基因上的分子标记，尤其是一种与大口黑鲈适合食人工配合饲料相关的分子标记。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈，是一种原产于北美的肉食性鱼类，由于其生长快、肉质鲜美和易捕捞等特点，经过二十多年的养殖和驯化，目前已成为我国主要淡水养殖品种之一。由于大口黑鲈为肉食性鱼类，在养殖过程中需要利用冰鲜鱼或活鱼作为饲料的主要蛋白源，冰鲜鱼在储存过程中容易腐败产生生物胺等有毒有害物质，比投喂人工饲料产生更多养殖水体的有机污染。而人工配合饲料在制作过程中，一般经过高温熟化的过程，有效去除了病原体，可减少发病率，保护了水体环境。用人工配合饲料替代冰鲜鱼是大口黑鲈养殖业可持续健康养殖的必经之路。但目前养殖过程中发现，大口黑鲈目前的品系，虽然经过了多年的人工养殖和驯化，还是不能很好地适应人工配合饲料，往往投喂人工饲料喂养会减慢鱼的生长速度。解决这一矛盾可以通过选择育种对大口黑鲈进行食性改良，培育出对人工配合饲料也有良好消化能力和食欲，生长快速的鱼类新品系。
在进行传统选育的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可使亲鱼的遗传选择更加准确有效，加快大口黑鲈良种的进一步选育。SNP是单核苷酸多态的简称，是指在生物体的基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。单个核苷酸的变化可能会影响基因的编码区，进而引起所编码蛋白氨基酸的变化或基因表达调节蛋白的结构域和结合能力的变化，从而影响蛋白结构、功能和蛋白合成量的变化，最终引起生物体表型的变化。这些SNP位点的基因型与生物体的表型相关联。另外，SNP是可以从亲代遗传给子代的分子标记，可以通过选择含有目的性状相关的SNP标记的亲本，进行繁殖，以期获得含有这一性状的子代，以加快选育的进程。
小鼠klotho基因编码的蛋白具有防止衰老和延长寿命的作用，klotho基因的缺陷或表达不足会引起小鼠快速衰老的表型，包括生长迟缓、快速地胸腺萎缩、皮肤萎缩、肌肉减少症、血管钙化、骨质疏松、认知障碍、听力障碍、运动神经元变性和过早死亡。相反，klotho基因的过量表达可延长小鼠的寿命。klotho 基因与成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor-23，FGF23)受体形成复合物，可显著增强FGF23与FGF23受体的结合能力，从而激活下游信号通路。 FGF23-Klotho通路的生理平衡失调与慢性肾病、左心室肥大等多各疾病相关。
发明内容
本发明的目的在于通过对测序得到的大口黑鲈klotho基因序列进行分析，通过直接测序法筛选该基因SNPs，并对投喂人工配合饲料大口黑鲈个体进行分型，提供一种与大口黑鲈易驯食人工配合饲料相关的SNP位点，同时提供一种采用该分子标记进行食人工配合饲料的大口黑鲈亲本的筛选方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点，所述SNP位点为三个紧密连锁的SNP位点，所述三个SNP位点分别为位于大口黑鲈klotho基因2089bp处的C-T型SNP、位于大口黑鲈klotho基因2128bp处的G-A型SNP和位于大口黑鲈klotho基因 3212bp处的A-G型SNP，所述大口黑鲈klotho基因序列如SEQ ID NO.1所示。
申请人测序得到大口黑鲈klotho基因序列，长度为3422bp，其中113-3036bp 是蛋白编码区。通过直接测序的方法检测到，在2089bp处有一个C-T型SNP， 2128bp处有一个G-A型SNP，这两个SNP位于蛋白编码区内，但均为同义突变，不影响编码蛋白的序列，3212bp处有一个A-G型SNP，这一位点位于终止密码子的后面，可能和基因的表达调控相关。这三个SNP距离较近，在检测分析中发现这三个位点完全连锁，所以就把它看成一个SNP多态位点。大口黑鲈klotho基因序列如下所示：
CTGGCTGACTGCACTCAACAGCCCGCTGTTCAGTCACCGAAAGCTTCTAAGCATGGCTAAATGAAGATTTGAATCAAAAACGGGACATCCGAGGCCAGCACTGACAGGCGCCATGAGTGCTTTGCGCGCCCTTTTGACATTTCTCACCTTTGCCTATGCGGCAGCAAAGCCCAACGCTGGTTTGAAAACGTGGGGGCGTTTCAGTAAACTGCCCTATCCGGGAGACAAGGCTTTCCTTTATGATACCTTCCCCAAGGACTTCATATGGGCTGTGGGCACTGCGGCCTACCAGGTGGAGGGCGCGTTTGAGAAGGACGGCAAGGGGCTCTCCATTTGGGACACCTTTACGCGCGGTGGGAACCGGATGGCCACCGGGGACGTCGGCAGCGACAGCTATCACAACATCCACGCTGACATCCGAGCCATCAGGCAGCTTGGGGTCAGCCACTACAGGTTCTCCCTGTCCTGGTCCAGGATATTTCCCAACGGCACCCGCGGGAGTTACAACGAAATCGGCACGAACTACTACCGGTCCCTTATCAAGAGGCTGAAGGAGGTCCACGTGCAGCCGGTGGTCACGCTCTACCACTGGGACCTGCCCGATCACCTGCAGCAGACCCTCGGCGGCTGGAGGAACCCGGAGCTTGTGGGGATTTTCAAGGACTACGCCGATTTCTGTTTCCAGACTTTCGGGGATGATGTGAAGTATTGGATCACCATCGACAACCCGTTTGTGGTGGCGCGGCACGGATATGGCACCGGAGTGGTCGCACCAGGGATAAAGAACGATCCTGATCTCCCGTTCCGGGTTGGACACAATCTCCTGAAGGCTCACGCAGCGGCATGGCATCTCTACGACCGCCACTACCGACCCCGTCAGCAGGGCAAGCTGTCCATGGCGCTGGCCTCTCACTGGATCAAGCCCAGTCGCACCCGCCTGGAAAGCCTGCGAGAGTGCCAGTGTTCCCTGGACCACGTCCTGGGCTGGTTTGCCCGGCCGCTGTTCACAGACGGAGACTACCCTCCCTGCATGAAGGCGAGGCTGGGCTCACGGCTGCCCTCCTTCACCCGGGAGGAGAGTGAGCAGGTGAGGGGAACAGCAGACTTTTTTGCTCTCTCTCACGGAGCGGCTCTGAGCTTCCAGCTCATCAACGACAGCCTGAAGTTTGGGCAGCAGGAGGACCTGGACCTGAGGATGCTGCTGTACTGGGTCAACGCAGAGTACAATAAGCCTCCCATCTTTGTGGTGCAGAGTGGTTGGTACGTCCTTGGCAATACCAAGACAGAAGACCCAAAACACATGTACTACCTCAAGAGGTTCATTGCAGAGGCACTAAAATCGATCGTCATAGACGGAGTGAATGTGATTGGATACACAGCCTGGTCTCTTATAGACGGCTTCGAATGGCACAGGGAATATGGGATACGACGGGGGCTTTACTATGTTGACTTCAACACTCCTGACATGAAGAGGGAGCCAAAGACATCTGCCACCTTTTACAGAAACGTCATCCAGAAGAACGGTTTCCCAGAACTTCCAGAGAACAGGCCAGCACAAGGAGTCTTCCCGTGTGATTTTGCCTGGGGTGTATCCGCCAACTCCATACAGGTGGAGACCACGCCCAGCCAGTTTGCGGACCCCAGTGTTTACTTGTGGAACATCTCCAATAACGGAGAGCTGATGAGGCTGGAGGGCCTCAGCGCACCACCTTTACGCCGAACCACACACTGCGCTGATTACGCCACCATCCGACAACAGGTCGATGAAATCAGGCAGGTGGGGGTAAACCACTTCCACTTCTCCCTCAACTGGTCAGCTCTGGTGCCTACAGGCGACGTGGCTCACCCCAACACCACCCTGCTGGGCTACTACCGCTGCTTCACCCGCCAGCTGCTGCAGGCCAACGTCACGCCCGTGGTCACTCTGTGGCACCACACGCGCCAGCGCAGCAGCCTGCCGGCCCCGCTGGACACCGCCAACAAGTGGCTGAACAGGGAGACTCCAGAGGCATTCGCAGCCTATGCCCGACTTTGTTACAGAGAACTAGGTGCCTACGTTAAGATGTGGATTACCCTGAATGAGCCCAAC/TGATGAGATGGTGAGCTACCAGGAGGGCCATCAGATGCTG/ACGGGCGCACGCTCTAGCCTGGCACACTTATGACCGCGACTTCAGGCATGGACAGGGAGGACAGGTGTCTCTGGCTCTGCACATGGACTGGGTGGAACCAGCGTTTTCATTCAGCCGCGAAGACGTGGAACCAGCTAAAAGGGTGTTGGACTTCCGCGTTGGCTGGTTTGCAGAGCCGATCTTTGGCAGTGGGGACTATCCTCTGGGAATGAGGAGCTGGCTGCGTCAGCTCAACTCACTTGACCTGCCAGTGTTCAACGAGGAGGACAGACAACTTGTTAAAGGGACATATGACTTCTTTGCCATTAGTCACTTCAGTACCAAGTTGGTGACACATGCCAAGGAAGACTCGTACACCTACACAGCAATGCTAGAGGTCCAACACATGATAGACACCACGTGGATCATGTCTCCGAGGCCTGTTGTGCCCTGGGGCCTGAGGAAAGCCCTCAACTGGGTGAGGGAGCACTACTGTGATGTACCTGTCTATGTGATGGCCAACGGGGTCCAGGAAGACGCAGCCCACTTCAAAGACAGCCTGAGAGTCTACTACCTGTATAACTACATCAATGAGGCGCTGAAAGCGTACACTCTGGACGGCGTAAACCTGAAGGGTTACTTTGCTTACGCCCTGAGCGACCAAAGGGACCCAGGGTTTGGTTTGTACGGCCACGTTCATGAGGAGGTCATCGTCAAGGCCTCTCTCTCCAATTATCGCAACATCATCCAGCACAGTGGCTTCCCCATTCAGGGAGCTGCGCTCCGGCAGTGTCCCAGCATGCCTCAGCCCTGCCTAGGCTGCCACATACTGGTCAAGAGCCCTGTGGTGGGCTTCCTGACCCTGGTAGGTTCAGGGGTGCTGATCACCCTCGGCCTCATTATCTACTACACAGCCAAGAGACACAAGGAGAGTTACTGATGATTGTAACTTTTGATAAATGACTCAGTGAAAGAAAACTGAGCTTAATGTTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTCTGTATTTTATTGTACAACCCTAAATTATGGGACTTCTTTTGACCTTTATATTAAATGAAGTCTGGATAATGA AAGTGGTCCAATCCTCTTCACA/GTTGTAGCTGTTACAGCTGTTATTAGATGTTTATAAAGTTGGTGTAATTTTGTTACAAAACCTGTTTTTAAAGTCGATAGAGTGATGGTCAATGAGATAATAAAACCCACGCTTGGTCATATCCATGCAACACCAGACTTTTACATATCAACAAAGCAATTTATTGTACTGTTCTGATGT AGATTTTAAAGGGACAAAATGTTGTCCCTTT
注：从ATG到TAG是基因的蛋白编码区；
C/T、G/A和A/G是基因上的三个SNP位点，三个位点紧密连锁；
TTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTC和CTGGTGTTGCATGGATATGAC是扩增第一个SNP位点的上下游引物。
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点的优选实施方式，所述三个SNP位点的等位基因型分别为C-T、G-A和A-G。因为三个SNP位点紧密连锁，我们将其视为一个SNP位点，用位于大口黑鲈klotho 基因3212bp处的A-G型SNP(第三个SNP)表示，该SNP位点包括两个等位基因位点(A和G)，可在不同的大口黑鲈个体中形成三种基因型(A/A，A/G 和G/G)，也就是说每尾大口黑鲈有两个等位基因位点，一种基因型。
发明人发现，对喂食人工配合饲料的327尾大口黑鲈成鱼的DNA进行分型检测结果表明，序列中的三个SNP位点完全连锁，即这三个SNP位点只检测到三种基因型(CGA/CGA、CGA/TAG、TAG/TAG，以第三个SNP为检测目标，简写为A/A、A/G和G/G)，与大口黑鲈的生长性状的关联分析表明(A/A)型在体质量、全长、体宽和体高四个性状上的均值都显著高于(G/G)型(P<0.05)， (A/G)型在这四个性状上的均值也都显著高于(G/G)型的均值(P<0.05)。通过检测大口黑鲈上述SNP标记的单倍型，有可效地选择在喂食人工配合饲料养殖条件下，生长速度快、能适应人工配合饲料的大口黑鲈。
另外，本发明还提供了如上所述的SNP基因位点在筛选适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本中应用。
本发明的SNP标记能够用于适合食人工配合饲料的大口黑鲈的育种之中，可根据候选亲本在该SNP标记位点上的基因型对大口黑鲈亲本进行选择，挑选含有(A/A)基因型大口黑鲈亲本进行繁殖，淘汰掉含有G等位基因的亲本，可以获得适合食人工配合饲料大口黑鲈后代(鱼苗)，加快培育适合食人工配合饲料大口黑鲈，促进大口黑鲈食性转化进程，节约育种时间，保护环境，降低养殖成本。
最后，本发明还提供一种适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从待测大口黑鲈中提取样品DNA；
(2)对步骤(1)所得DNA进行PCR扩增，获取含有SNP位点的目标片段；
(3)对步骤(2)PCR产物进行纯化后测序，对测得的序列进行比对，分析样品的基因型，筛选出待测样本的klotho基因为(A/A)基因型的纯合个体，作为亲本。
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(1)中采用以下方法提取样品DNA：
(a)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化 1小时；
(b)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合物，混匀，室温下静置5分钟后， 12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
(c)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
(d)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μlTE溶解DNA，4℃贮存备用。
为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(a)中加入的裂解液中含有10mmol/LTris-HCl、0.1mol/LEDTA、0.5％SDS、30mg/LRNase、100mg/L蛋白酶K，且所述裂解液的pH为8.0；
所述步骤(b)中酚/氯仿/异戊醇混合物中酚、氯仿、异戊醇的体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1；
所述步骤(d)中所述TE中含有10mmol/LTris－HCl、1mmol/LEDTA，且其pH为8.0。
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，PCR扩增引物对为：
引物1：5’-TTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTC-3’(SEQ ID NO.2)
引物2：5’-CTGGTGTTGCATGGATATGAC-3’(SEQ ID NO.3)。
因为三个SNP位点紧密连锁，所以只要检测其中的一个SNP位点就可以确定其它两个位点的基因型，采用如上所述具体系列的引物1和引物2。
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述PCR反应体系为：
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，50℃退火 15秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。
作为本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(3)中用ABI 3730XL测序仪对纯化后的PCR产物进行测序，然后再用Vector 11.0软件对测得的序列进行比对。
本发明所述适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点，是通过对测序得到的klotho基因序列进行分析，通过直接测序法筛选该基因SNPs并对投喂人工配合饲料大口黑鲈个体进行分型，并与大口黑鲈的生长性状进行关联分析，从而得到的一种与大口黑鲈易驯食人工配合饲料相关的SNP标记，可用于鉴定或选育易驯食人工配合饲料的大口黑鲈，为筛选和建立大口黑鲈易驯食人工配合饲料新品系提供可靠的遗传数据。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点的发现
本申请发明人发现，在已知的大口黑鲈klotho基因序列SEQ ID NO.1的 2089bp处有一个C-T型SNP，2128bp处有一个G-A型SNP，3212bp处有一个 A-G型SNP，这三个SNP距离较近，完全连锁，所以把它看成一个SNP标记位点，即用3212bp处的A-G型SNP表示，命名为klotho-3212SNP位点。
CTGGCTGACTGCACTCAACAGCCCGCTGTTCAGTCACCGAAAGCTTCTAAGCATGGCTAAATGAAGATTTGAATCAAAAACGGGACATCCGAGGCCAGCACTGACAGGCGCCATGAGTGCTTTGCGCGCCCTTTTGACATTTCTCACCTTTGCCTATGCGGCAGCAAAGCCCAACGCTGGTTTGAAAACGTGGGGGCGTTTCAGTAAACTGCCCTATCCGGGAGACAAGGCTTTCCTTTATGATACCTTCCCCAAGGACTTCATATGGGCTGTGGGCACTGCGGCCTACCAGGTGGAGGGCGCGTTTGAGAAGGACGGCAAGGGGCTCTCCATTTGGGACACCTTTACGCGCGGTGGGAACCGGATGGCCACCGGGGACGTCGGCAGCGACAGCTATCACAACATCCACGCTGACATCCGAGCCATCAGGCAGCTTGGGGTCAGCCACTACAGGTTCTCCCTGTCCTGGTCCAGGATATTTCCCAACGGCACCCGCGGGAGTTACAACGAAATCGGCACGAACTACTACCGGTCCCTTATCAAGAGGCTGAAGGAGGTCCACGTGCAGCCGGTGGTCACGCTCTACCACTGGGACCTGCCCGATCACCTGCAGCAGACCCTCGGCGGCTGGAGGAACCCGGAGCTTGTGGGGATTTTCAAGGACTACGCCGATTTCTGTTTCCAGACTTTCGGGGATGATGTGAAGTATTGGATCACCATCGACAACCCGTTTGTGGTGGCGCGGCACGGATATGGCACCGGAGTGGTCGCACCAGGGATAAAGAACGATCCTGATCTCCCGTTCCGGGTTGGACACAATCTCCTGAAGGCTCACGCAGCGGCATGGCATCTCTACGACCGCCACTACCGACCCCGTCAGCAGGGCAAGCTGTCCATGGCGCTGGCCTCTCACTGGATCAAGCCCAGTCGCACCCGCCTGGAAAGCCTGCGAGAGTGCCAGTGTTCCCTGGACCACGTCCTGGGCTGGTTTGCCCGGCCGCTGTTCACAGACGGAGACTACCCTCCCTGCATGAAGGCGAGGCTGGGCTCACGGCTGCCCTCCTTCACCCGGGAGGAGAGTGAGCAGGTGAGGGGAACAGCAGACTTTTTTGCTCTCTCTCACGGAGCGGCTCTGAGCTTCCAGCTCATCAACGACAGCCTGAAGTTTGGGCAGCAGGAGGACCTGGACCTGAGGATGCTGCTGTACTGGGTCAACGCAGAGTACAATAAGCCTCCCATCTTTGTGGTGCAGAGTGGTTGGTACGTCCTTGGCAATACCAAGACAGAAGACCCAAAACACATGTACTACCTCAAGAGGTTCATTGCAGAGGCACTAAAATCGATCGTCATAGACGGAGTGAATGTGATTGGATACACAGCCTGGTCTCTTATAGACGGCTTCGAATGGCACAGGGAATATGGGATACGACGGGGGCTTTACTATGTTGACTTCAACACTCCTGACATGAAGAGGGAGCCAAAGACATCTGCCACCTTTTACAGAAACGTCATCCAGAAGAACGGTTTCCCAGAACTTCCAGAGAACAGGCCAGCACAAGGAGTCTTCCCGTGTGATTTTGCCTGGGGTGTATCCGCCAACTCCATACAGGTGGAGACCACGCCCAGCCAGTTTGCGGACCCCAGTGTTTACTTGTGGAACATCTCCAATAACGGAGAGCTGATGAGGCTGGAGGGCCTCAGCGCACCACCTTTACGCCGAACCACACACTGCGCTGATTACGCCACCATCCGACAACAGGTCGATGAAATCAGGCAGGTGGGGGTAAACCACTTCCACTTCTCCCTCAACTGGTCAGCTCTGGTGCCTACAGGCGACGTGGCTCACCCCAACACCACCCTGCTGGGCTACTACCGCTGCTTCACCCGCCAGCTGCTGCAGGCCAACGTCACGCCCGTGGTCACTCTGTGGCACCACACGCGCCAGCGCAGCAGCCTGCCGGCCCCGCTGGACACCGCCAACAAGTGGCTGAACAGGGAGACTCCAGAGGCATTCGCAGCCTATGCCCGACTTTGTTACAGAGAACTAGGTGCCTACGTTAAGATGTGGATTACCCTGAATGAGCCCAAC/TGATGAGATGGTGAGCTACCAGGAGGGCCATCAGATGCTG/ACGGGCGCACGCTCTAGCCTGGCACACTTATGACCGCGACTTCAGGCATGGACAGGGAGGACAGGTGTCTCTGGCTCTGCACATGGACTGGGTGGAACCAGCGTTTTCATTCAGCCGCGAAGACGTGGAACCAGCTAAAAGGGTGTTGGACTTCCGCGTTGGCTGGTTTGCAGAGCCGATCTTTGGCAGTGGGGACTATCCTCTGGGAATGAGGAGCTGGCTGCGTCAGCTCAACTCACTTGACCTGCCAGTGTTCAACGAGGAGGACAGACAACTTGTTAAAGGGACATATGACTTCTTTGCCATTAGTCACTTCAGTACCAAGTTGGTGACACATGCCAAGGAAGACTCGTACACCTACACAGCAATGCTAGAGGTCCAACACATGATAGACACCACGTGGATCATGTCTCCGAGGCCTGTTGTGCCCTGGGGCCTGAGGAAAGCCCTCAACTGGGTGAGGGAGCACTACTGTGATGTACCTGTCTATGTGATGGCCAACGGGGTCCAGGAAGACGCAGCCCACTTCAAAGACAGCCTGAGAGTCTACTACCTGTATAACTACATCAATGAGGCGCTGAAAGCGTACACTCTGGACGGCGTAAACCTGAAGGGTTACTTTGCTTACGCCCTGAGCGACCAAAGGGACCCAGGGTTTGGTTTGTACGGCCACGTTCATGAGGAGGTCATCGTCAAGGCCTCTCTCTCCAATTATCGCAACATCATCCAGCACAGTGGCTTCCCCATTCAGGGAGCTGCGCTCCGGCAGTGTCCCAGCATGCCTCAGCCCTGCCTAGGCTGCCACATACTGGTCAAGAGCCCTGTGGTGGGCTTCCTGACCCTGGTAGGTTCAGGGGTGCTGATCACCCTCGGCCTCATTATCTACTACACAGCCAAGAGACACAAGGAGAGTTACTGATGATTGTAACTTTTGATAAATGACTCAGTGAAAGAAAACTGAGCTTAATGTTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTCTGTATTTTATTGTACAACCCTAAATTATGGGACTTCTTTTGACCTTTATATTAAATGAAGTCTGGATAATGA AAGTGGTCCAATCCTCTTCACA/GTTGTAGCTGTTACAGCTGTTATTAGATGTTTATAAAGTTGGTGTAATTTTGTTACAAAACCTGTTTTTAAAGTCGATAGAGTGATGGTCAATGAGATAATAAAACCCACGCTTGGTCATATCCATGCAACACCAGACTTTTACATATCAACAAAGCAATTTATTGTACTGTTCTGATGT AGATTTTAAAGGGACAAAATGTTGTCCCTTT
注：从ATG到TAG是基因的蛋白编码区；
C/T、G/A和A/G是基因上的三个SNP位点，三个位点紧密连锁；
TTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTC和CTGGTGTTGCATGGATATGAC是扩增第一个SNP位点的上下游引物。
实施例2
一种适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，所述方法包括以下步骤
(一)样品DNA的提取
(1)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K， pH8.0)，55℃消化1小时；
(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
(4)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/LTris－HCl；1mmol/LEDTA，pH8.0) 溶解DNA，4℃贮存备用。
(二)引物的设计与合成
根据大口黑鲈序列klotho基因序列设计并合成一对引物用于扩增3212bp位置的SNP位点，引物序列如下：
引物1：5’-TTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTC-3’(SEQ ID NO.2)
引物2：5’-CTGGTGTTGCATGGATATGAC-3’(SEQ ID NO.3)
引物1和引物2预期扩增1条DNA带，大小251bp。
(三)PCR反应体系(25μL体系)
(四)PCR反应条件
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，50℃退火15秒， 72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。
(五)大口黑鲈候选亲本的基因型分析
直接测序klotho-3212SNP位点的PCR扩增产物，用chromas软件查看测序峰图，再用Vector 11.0软件，对测得的序列进行比对，分析每尾大口黑鲈的基因型，在3212位点为A单峰的个体是A/A基因型，A/G双峰的个体是A/G基因型，G 单峰的个体是G/G基因型。若是(A/A)基因型，则判定该样品来自于适合食人工配合饲料的大口黑鲈，可选做新本；若为(A/G)或(G/G)，则判定该样品自于不适合食人工配合饲料的大口黑鲈，应该淘汰。
实施例3
klotho-3212SNP位点与喂食人工配合饲料大口黑鲈成鱼生长性状的关联性分析。
随机取327尾大口黑鲈成鱼，测定其体质量、全长、体高等生长指标，并取鱼鳍提取基因组DNA，检测SNP位点的等位基因和基因型频率，检测结果见表1所示。
表1 klotho-3212SNP位点在327尾大口黑鲈成鱼中的等位基因和基因型频率
Tab.1 Genotype and allele frequencies ofklotho-3212SNP in327largemouth bass adults
该位点与体质量、全长、体宽和体高这四个生长性状的关联分析结果见表2 所示。
表2 klotho-3212SNP位点与大口黑鲈成鱼生长性状的相关关系
Tab.2 Correlation analysis between the growth traits oflargemouthbass adults and klotho-3212SNP
注：表中上标为平均值的差异显著性(最小显著差数法，LSD)，同一列数值中，上标含相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Values with different superscript letters within a column indicatessignificantdifference atP<0.05。
由该位点与体质量、全长、体宽和体高这四个生长性状的关联分析结果表明，A/A基因型上述四个生长性状的均值显著高于G/G型(P<0.05)，A/G型在这四个生长性状上的均值也值显著高于G/G型的均值(P<0.05)。A/A基因型为优势基因型，G/G基因型为劣势基因型。
综上所述，klotho-3212SNP位点与大口黑鲈适合食人工配合饲料性状密切关联，A/A基因型为优势基因型，A/G和G/G为劣势基因型。通过检测大口黑鲈候选亲本是否为A/A基因型个体，即可快速、准确地筛选出用来繁育适合食人工饲料大口黑鲈的亲本。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种适合食人工配合饲料大口黑鲈相关SNP基因位点及其在育种中的应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3422
<212> DNA
<213> 大口黑鲈（Micropterus salmoides）
<400> 1
ctggctgact gcactcaaca gcccgctgtt cagtcaccga aagcttctaa gcatggctaa 60
atgaagattt gaatcaaaaa cgggacatcc gaggccagca ctgacaggcg ccatgagtgc 120
tttgcgcgcc cttttgacat ttctcacctt tgcctatgcg gcagcaaagc ccaacgctgg 180
tttgaaaacg tgggggcgtt tcagtaaact gccctatccg ggagacaagg ctttccttta 240
tgataccttc cccaaggact tcatatgggc tgtgggcact gcggcctacc aggtggaggg 300
cgcgtttgag aaggacggca aggggctctc catttgggac acctttacgc gcggtgggaa 360
ccggatggcc accggggacg tcggcagcga cagctatcac aacatccacg ctgacatccg 420
agccatcagg cagcttgggg tcagccacta caggttctcc ctgtcctggt ccaggatatt 480
tcccaacggc acccgcggga gttacaacga aatcggcacg aactactacc ggtcccttat 540
caagaggctg aaggaggtcc acgtgcagcc ggtggtcacg ctctaccact gggacctgcc 600
cgatcacctg cagcagaccc tcggcggctg gaggaacccg gagcttgtgg ggattttcaa 660
ggactacgcc gatttctgtt tccagacttt cggggatgat gtgaagtatt ggatcaccat 720
cgacaacccg tttgtggtgg cgcggcacgg atatggcacc ggagtggtcg caccagggat 780
aaagaacgat cctgatctcc cgttccgggt tggacacaat ctcctgaagg ctcacgcagc 840
ggcatggcat ctctacgacc gccactaccg accccgtcag cagggcaagc tgtccatggc 900
gctggcctct cactggatca agcccagtcg cacccgcctg gaaagcctgc gagagtgcca 960
gtgttccctg gaccacgtcc tgggctggtt tgcccggccg ctgttcacag acggagacta 1020
ccctccctgc atgaaggcga ggctgggctc acggctgccc tccttcaccc gggaggagag 1080
tgagcaggtg aggggaacag cagacttttt tgctctctct cacggagcgg ctctgagctt 1140
ccagctcatc aacgacagcc tgaagtttgg gcagcaggag gacctggacc tgaggatgct 1200
gctgtactgg gtcaacgcag agtacaataa gcctcccatc tttgtggtgc agagtggttg 1260
gtacgtcctt ggcaatacca agacagaaga cccaaaacac atgtactacc tcaagaggtt 1320
cattgcagag gcactaaaat cgatcgtcat agacggagtg aatgtgattg gatacacagc 1380
ctggtctctt atagacggct tcgaatggca cagggaatat gggatacgac gggggcttta 1440
ctatgttgac ttcaacactc ctgacatgaa gagggagcca aagacatctg ccacctttta 1500
cagaaacgtc atccagaaga acggtttccc agaacttcca gagaacaggc cagcacaagg 1560
agtcttcccg tgtgattttg cctggggtgt atccgccaac tccatacagg tggagaccac 1620
gcccagccag tttgcggacc ccagtgttta cttgtggaac atctccaata acggagagct 1680
gatgaggctg gagggcctca gcgcaccacc tttacgccga accacacact gcgctgatta 1740
cgccaccatc cgacaacagg tcgatgaaat caggcaggtg ggggtaaacc acttccactt 1800
ctccctcaac tggtcagctc tggtgcctac aggcgacgtg gctcacccca acaccaccct 1860
gctgggctac taccgctgct tcacccgcca gctgctgcag gccaacgtca cgcccgtggt 1920
cactctgtgg caccacacgc gccagcgcag cagcctgccg gccccgctgg acaccgccaa 1980
caagtggctg aacagggaga ctccagaggc attcgcagcc tatgcccgac tttgttacag 2040
agaactaggt gcctacgtta agatgtggat taccctgaat gagcccaacg atgagatggt 2100
gagctaccag gagggccatc agatgctgcg ggcgcacgct ctagcctggc acacttatga 2160
ccgcgacttc aggcatggac agggaggaca ggtgtctctg gctctgcaca tggactgggt 2220
ggaaccagcg ttttcattca gccgcgaaga cgtggaacca gctaaaaggg tgttggactt 2280
ccgcgttggc tggtttgcag agccgatctt tggcagtggg gactatcctc tgggaatgag 2340
gagctggctg cgtcagctca actcacttga cctgccagtg ttcaacgagg aggacagaca 2400
acttgttaaa gggacatatg acttctttgc cattagtcac ttcagtacca agttggtgac 2460
acatgccaag gaagactcgt acacctacac agcaatgcta gaggtccaac acatgataga 2520
caccacgtgg atcatgtctc cgaggcctgt tgtgccctgg ggcctgagga aagccctcaa 2580
ctgggtgagg gagcactact gtgatgtacc tgtctatgtg atggccaacg gggtccagga 2640
agacgcagcc cacttcaaag acagcctgag agtctactac ctgtataact acatcaatga 2700
ggcgctgaaa gcgtacactc tggacggcgt aaacctgaag ggttactttg cttacgccct 2760
gagcgaccaa agggacccag ggtttggttt gtacggccac gttcatgagg aggtcatcgt 2820
caaggcctct ctctccaatt atcgcaacat catccagcac agtggcttcc ccattcaggg 2880
agctgcgctc cggcagtgtc ccagcatgcc tcagccctgc ctaggctgcc acatactggt 2940
caagagccct gtggtgggct tcctgaccct ggtaggttca ggggtgctga tcaccctcgg 3000
cctcattatc tactacacag ccaagagaca caaggagagt tactgatgat tgtaactttt 3060
gataaatgac tcagtgaaag aaaactgagc ttaatgttca gcaaagtaga gttcagtctg 3120
tattttattg tacaacccta aattatggga cttcttttga cctttatatt aaatgaagtc 3180
tggataatga aagtggtcca atcctcttca cattgtagct gttacagctg ttattagatg 3240
tttataaagt tggtgtaatt ttgttacaaa acctgttttt aaagtcgata gagtgatggt 3300
caatgagata ataaaaccca cgcttggtca tatccatgca acaccagact tttacatatc 3360
aacaaagcaa tttattgtac tgttctgatg tagattttaa agggacaaaa tgttgtccct 3420
tt 3422
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcagcaaag tagagttcag tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggtgttgc atggatatga c 21

Claims (10)

1.一种适合食人工配合饲料大口黑鲈klotho基因的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为三个紧密连锁的SNP位点，所述三个SNP位点分别为位于大口黑鲈klotho基因2089bp处的C-T型SNP、位于大口黑鲈klotho基因2128bp处的G-A型SNP和位于大口黑鲈klotho基因3212bp处的A-G型SNP，所述大口黑鲈klotho基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈的klotho基因SNP位点，其特征在于，所述三个SNP位点的等位基因型分别为C-T、G-A和A-G。
3.如权利要求1或2所述的SNP位点在筛选适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本中应用。
4.一种适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测大口黑鲈中提取样品DNA；
(2)对步骤(1)所得DNA进行PCR扩增，获取含有SNP位点的目标片段；
(3)对步骤(2)PCR产物进行纯化后测序，对测得的序列进行比对，分析样品的基因型，筛选出待测样本的klotho基因为(A/A)基因型的纯合个体，作为亲本。
5.如权利要求4所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用以下方法提取样品DNA：
(a)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时；
(b)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
(c)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
(d)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μlTE溶解DNA，4℃贮存备用。
6.如权利要求5所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述步骤(a)中加入的裂解液中含有10mmol/LTris-HCl、0.1mol/LEDTA、0.5％SDS、30mg/LRNase、100mg/L蛋白酶K，且所述裂解液的pH为8.0；
所述步骤(b)中酚/氯仿/异戊醇混合物中酚、氯仿、异戊醇的体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1；
所述步骤(d)中所述TE中含有10mmol/LTris－HCl、1mmol/LEDTA，且其pH为8.0。
7.如权利要求4所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增引物对为：
引物1：5’-TTCAGCAAAGTAGAGTTCAGTC-3’(SEQ ID NO.2)
引物2：5’-CTGGTGTTGCATGGATATGAC-3’(SEQ ID NO.3)。
8.如权利要求7所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：
9.如权利要求8所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，50℃退火15秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。
10.如权利要求4所述的适合食人工配合饲料大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中用ABI 3730XL测序仪对纯化后的PCR产物进行测序，然后再用Vector 11.0软件对测得的序列进行比对。
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