CN114717334A - 一种利用kit基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法。依据对斑点毛色性状瘤牛及其他纯色毛色性状牛品种进行全基因组CNV分析所发现的牛6号染色体上一个包含KIT基因的约490Kb的发生重复突变的CNV区段，对斑点瘤牛实现品种鉴定。根据该CNV区段可以在DNA水平上对瘤牛毛色性状进行分子标记辅助选择，从而快速建立遗传资源优良的种群。
Description
技术领域
本发明涉及瘤牛(Bos indicus)引种和育种中的分子标记，具体涉及在DNA水平上检测与瘤牛斑点毛色性状密切相关的拷贝数变异遗传标记(CNV标记)，以及利用CNV标记区分斑点瘤牛(即斑点毛色性状瘤牛)与其他牛品种(例如纯色毛色性状瘤牛)。
背景技术
拷贝数变异(CNV，copy number variation)是一种涉及1Kb或更大DNA片段的拷贝数变化。与参考基因组相比，片段的拷贝数可能在不同品种之间存在差异，并且这种差异是可以遗传的。拷贝数变异在真核生物的染色体中影响相当数量碱基对的重复或者缺失事件，表现为某片段在染色体上连续的重复排列或者丢失，拷贝数变异发生的位点并不局限于功能基因，也存在于无意义的基因间区和ncRNA等区域。
在哺乳动物群体中，拷贝数变异与部分性状有着很强的关联。CNV对性状产生影响的可能机制有剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。就剂量效应来说，大多数常染色体基因存在来自于父母亲本的各一个拷贝，这种正常的基因拷贝剂量的改变会显著影响到定量或定性的表型特征。
KIT基因是受体酪氨酸激酶蛋白家族中的一员，其产物刺激的信号通路控制重要的细胞过程，如细胞生长和增殖、存活和迁移。KIT蛋白信号对生殖细胞、造血干细胞、白细胞、称为Cajal间质细胞的胃肠道细胞(ICC)和产生黑色素的黑素细胞的发育和功能的影响已得到一定的研究，KIT基因的不同基因型可以通过调控黑色素的数量、分布而影响哺乳动物整体的毛色性状，以及维持眼睛和皮肤的颜色。
斑点瘤牛因其斑点毛色性状而具有较高的选育和经济价值，且有很高的遗传潜力，可作为优质的种质资源。开发准确将斑点瘤牛区别于其他瘤牛品种的方法，有利于提高后续遗传育种的效率。
目前还未见到有瘤牛斑点毛色相关CNV的研究，特别是影响瘤牛斑点毛色性状的主效基因至今仍然没有得到确定，主要的技术难点在于：瘤牛的毛色根据底色和斑点颜色的不同，存在多种不同的组合，具体毛色性状可能受到来自不止一个基因和各类不同基因变异的影响，情况复杂、分析难度较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种利用包含KIT基因区域的拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法，该鉴定斑点瘤牛品种的方法包括以下步骤：
对瘤牛候选基因组区域的拷贝数变异进行检测，若检测到重复突变，则判断所述瘤牛属于斑点毛色性状瘤牛，所述候选基因组区域位于牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内，候选基因组区域包含整个KIT基因(KIT基因区域为70166681bp–70254049bp)。
优选的，若未检测到重复突变，则判断所述瘤牛属于纯色毛色性状瘤牛(即纯色瘤牛)。
优选的，所述鉴定斑点瘤牛品种的方法具体包括以下步骤：对待测瘤牛个体进行基因组测序，然后计算上述候选基因组区域的测序覆盖深度，若候选基因组区域的覆盖深度表征了所述瘤牛个体的候选基因组区域具有覆盖深度高于正常拷贝数类型的重复拷贝数类型所对应的等位基因，则将所述瘤牛个体的品种确定为斑点瘤牛；所述候选基因组区域为牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp，牛参考基因组为ARS-UCD1.2(NCBI版本号为GCF_000003205.7)。
优选的，所述正常拷贝数类型具有单拷贝的候选基因组区域，重复拷贝数类型具有1.5到2个拷贝(即任意一个等位基因上拷贝数为2)的候选基因组区域。
优选的，所述斑点毛色性状瘤牛具有明显特异性的斑点性状，斑点颜色为棕色或黑色，底色为白色，基因型为突变纯合(即两个等位基因均为2个拷贝)或杂合(一个等位基因正常，另一个等位基因为2个拷贝)；所述纯色毛色性状瘤牛的毛色为纯的白色，基因型为野生纯合(即两个等位基因均为单拷贝)。
牛参考基因组ARS-UCD1.2(NCBI版本号为GCF_000003205.7)第6号染色体69975000bp–70467000bp候选基因组区域(包含整个KIT基因)的拷贝数变异，在瘤牛毛色性状分子标记辅助选择育种或瘤牛品种鉴定中的应用(鉴定为上述斑点毛色性状瘤牛、纯色毛色性状瘤牛两种品种之一)。
优选的，以上包含整个KIT基因的区域(即上述候选基因组区域)的拷贝数变异遗传标记的检测方法在瘤牛毛色性状分子标记辅助选择育种或瘤牛品种鉴定中的应用(鉴定为上述斑点毛色性状瘤牛、纯色毛色性状瘤牛两种品种之一)。
优选的，以上包含整个KIT基因的区域(即上述候选基因组区域)的拷贝数变异遗传标记在瘤牛毛色性状分子标记辅助选择育种或瘤牛品种鉴定中的应用(鉴定为上述斑点毛色性状瘤牛、纯色毛色性状瘤牛两种品种之一)。
优选的，所述遗传标记为上述候选基因组区域的重复突变，突变等位基因拷贝数为1.5-2。
一种利用包含KIT基因区域的拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的试剂盒，该试剂盒包括用于检测位于牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内的候选基因组区域的拷贝数的试剂，所述候选基因组区域包含整个KIT基因(KIT基因区域为70166681bp–70254049bp)。
一种利用包含KIT基因区域的拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的系统，该系统包括测序模块、数据分割模块、数据计算模块及分型模块；
所述测序模块用于读取或检测瘤牛的基因组数据；
所述数据分割模块用于提取所述基因组数据中位于牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内的候选基因组区域的对应部分，所述候选基因组区域包含整个KIT基因(KIT基因区域为70166681bp–70254049bp)；
所述数据计算模块用于利用提取的对应基因组数据计算候选基因组区域的覆盖深度；
所述分型模块用于通过比对正常拷贝数类型的覆盖深度，确定所述瘤牛候选基因组区域的拷贝数变异情况，若检测到重复突变，则判断所述瘤牛属于斑点毛色性状瘤牛。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过分析瘤牛候选基因组区域(包含整个KIT基因)的拷贝数变异情况，并以重复突变作为遗传标记，可以有效的筛选瘤牛种公牛和母牛以及进行种用瘤牛的分子标记辅助选择，且不受个体毛色随生长发育变化的影响(斑点瘤牛是在个体发育过程中逐渐显现出斑点毛色性状的)，可以通过早期选择快速建立遗传资源优良的瘤牛种群。
进一步的，本发明通过基因组重测序、全基因组关联分析以及全基因组选择性清除信号计算方法，不仅寻找到一种瘤牛毛色性状的主效基因(即KIT基因)，而且精准定位了包含该基因的主要变异区段(牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp)，为提高斑点瘤牛分子标记辅助选择及品种鉴定的效率提供了重要依据。
附图说明
图1为本发明实施例中瘤牛品种的鉴定技术流程图。
图2为瘤牛基因组包含KIT基因(70166681bp-70254049bp)的区域(即69975000bp–70467000bp区段)的覆盖深度(coverage)可视化图；其中：A.多拷贝数的覆盖深度，B.正常拷贝数的覆盖深度，下方线段为KIT基因及其外显子分布。
图3为不同毛色性状(coat color)的瘤牛在目标区域(69975000bp–70467000bp区段)的平均拷贝数(copy number)统计。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)利用全基因组重测序、全基因组关联分析以及全基因组选择性清除探寻斑点瘤牛毛色基因候选遗传标记
(1.1)从巴基斯坦采集19头瘤牛的耳组织样本(Cholistani 9头，Dhanni 10头，耳组织样采集时间为2020年11月，由本团队成员Quratulain Hanif采集)，从缅甸采集22头纯白色缅甸牛耳组织样本(采集时间为2019年12月)，以30头纯色瘤牛(同样于巴基斯坦采集耳组织样本)和22头纯色的缅甸牛基因组DNA数据为对照。
采集的19头瘤牛的毛色性状：Cholistani的斑点颜色为棕色，底色为白色；Dhanni的斑点为黑色，底色为白色。
30头纯色瘤牛的毛色性状：Bhagnari为纯的白色(white)，Dajal为纯的白色(white)，Sahiwal为纯的黄色(yellow)，三品种各10头。
缅甸牛的毛色性状：雄性为纯的白色(white)，雌性为纯的黄色(yellow)，雌雄各11头。
(1.2)基因组比对：利用BWA软件将71头牛的重测序结果比对到牛参考基因组ARS-UCD1.2(NCBI版本号GCF_000003205.7)，并利用GATK软件进行全基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测，构建71头牛的全基因组SNP集合。
(1.3)利用全基因组SNPs与纯色和斑点毛色性状进行全基因组关联分析，关联分析结果将瘤牛斑点毛色性状相关的候选区域定位在6号染色体，信号最强的区域位于70014006-70460593bp之间，信号值大小为1.742555×10-80)，该区间内包含KIT基因。
(1.4)通过利用全基因组选择性清除信号计算(Vst)方法，比较纯色牛和斑点牛基因组中分化明显的区域，从中筛选斑点瘤牛与纯色瘤牛基因组中分化的区域，发现全基因组关联分析定位的6号染色体70.1Mb至70.5Mb区间在纯色和斑点瘤牛中分化明显，Vst信号值高达0.9018(Vst值大小介于0-1之间，代表了群体的分化程度，值越大，群体分化程度越高，受选择程度越高)。
(1.5)检查CNVcaller软件检测出的所有瘤牛6号染色体的CNV，发现了斑点瘤牛在此区域的一个CNV区段，该区段为牛参考基因组69975000bp–70467000bp区域，长度约490Kb)，该区段包含整个KIT基因(且区段内不含其他基因)，斑点瘤牛的该区段由野生型(纯色瘤牛)的单拷贝改变为1.5-2个拷贝，且两个等位基因均存在这一重复突变，导致瘤牛的毛色性状在纯色基础上增加斑点。
参见图3，采样的斑点瘤牛个体全部为重复拷贝数类型，重复的倍数在1.5-2之间，而采样的纯色瘤牛为野生纯合型，单个等位基因的拷贝数为1。
(二)鉴定瘤牛品种实例
(2.1)参照图1对待测瘤牛个体进行全基因组测序、包含KIT基因区域的CNV区段(牛参考基因组ARS-UCD1.2，6号染色体69975000bp–70467000bp)测序数据分割。
(2.2)使用sambamba计算待测瘤牛个体的CNV区段(牛参考基因组ARS-UCD1.26号染色体69975000bp–70467000bp)的覆盖深度，并绘制覆盖深度图。
(2.3)在步骤2.2基础上判定个体的品种，具体说明如下。
依据覆盖深度分析结果(图2)，明显可见斑点瘤牛CNV区段(牛参考基因组ARS-UCD1.2，6号染色体69975000bp–70467000bp)拷贝数高于纯色瘤牛。因此，当瘤牛个体CNV区段(牛参考基因组ARS-UCD1.2，6号染色体69975000bp–70467000bp)的覆盖深度(见图2A)高于正常拷贝数的覆盖深度时，则判定个体属于斑点瘤牛；当瘤牛个体CNV区段(牛参考基因组ARS-UCD1.2，6号染色体69975000bp–70467000bp)的覆盖深度与正常拷贝数的覆盖深度(见图2B)相符，则判定个体属于纯色瘤牛。
实验结果表明，品种鉴定的准确性或一致性达到100％。
总之，本发明揭示了牛参考基因组第6号染色体的69975000bp–70467000bp是一个包含KIT基因区域并在瘤牛群体中存在重复类型的结构变异的特征区段，该区段发生的基因变异可以更有效的解释瘤牛品种形成明显斑点毛色性状的原因，利用这一基因变异可以建立在DNA水平上鉴定斑点瘤牛品种的方法，并能有效用于瘤牛的引种及分子标记辅助选择育种，为快速建立遗传资源优良的瘤牛种群奠定基础。
Claims (10)
1.一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法，其特征在于：该鉴定斑点瘤牛品种的方法包括以下步骤：
对瘤牛候选基因组区域的拷贝数变异进行检测，若检测到重复突变，则判断所述瘤牛属于斑点毛色性状瘤牛，所述候选基因组区域位于牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内。
2.根据权利要求1所述一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法，其特征在于：所述鉴定斑点瘤牛品种的方法具体包括以下步骤：对待测瘤牛个体进行基因组测序，然后计算候选基因组区域的覆盖深度，若候选基因组区域的覆盖深度表征了所述瘤牛个体的候选基因组区域具有高于正常拷贝数类型的覆盖深度，则将所述瘤牛个体的品种确定为斑点瘤牛；所述候选基因组区域为牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp，牛参考基因组为ARS-UCD1.2。
3.根据权利要求2所述一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法，其特征在于：所述正常拷贝数类型具有单拷贝的候选基因组区域，重复拷贝数类型具有1.5到2个拷贝的候选基因组区域。
4.根据权利要求1所述一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的方法，其特征在于：所述斑点毛色性状瘤牛的斑点颜色为棕色或黑色。
5.一种KIT基因拷贝数变异遗传标记或KIT基因拷贝数变异遗传标记检测方法在瘤牛毛色性状分子标记辅助选择育种、瘤牛品种鉴定中的应用，其特征在于：所述遗传标记为牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内候选基因组区域的重复突变。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述候选基因组区域为牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp，牛参考基因组为ARS-UCD1.2。
7.一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于检测牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内的候选基因组区域的拷贝数的试剂。
8.根据权利要求7所述一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的试剂盒，其特征在于：所述候选基因组区域为牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp，牛参考基因组为ARS-UCD1.2。
9.一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的系统，其特征在于：该系统包括测序模块、数据分割模块、数据计算模块及分型模块；
所述测序模块用于读取或检测瘤牛的基因组数据；
所述数据分割模块用于提取所述基因组数据中位于牛参考基因组第6号染色体69.9Mb至70.5Mb以内的候选基因组区域的对应部分；
所述数据计算模块用于利用提取的对应基因组数据计算候选基因组区域的覆盖深度；
所述分型模块用于通过比对正常拷贝数类型的覆盖深度，确定所述瘤牛候选基因组区域的拷贝数变异情况，若检测到重复突变，则判断所述瘤牛属于斑点毛色性状瘤牛。
10.根据权利要求9所述一种利用KIT基因拷贝数变异遗传标记鉴定斑点瘤牛品种的系统，其特征在于：所述候选基因组区域为牛参考基因组第6号染色体69975000bp–70467000bp，牛参考基因组为ARS-UCD1.2。
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