CN109182586B - 用于小麦赤霉病抗性检测的kasp引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一组用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用，该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的前引物AlleleFAM、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的前引物AlleleHEX、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的后引物Common；本发明提供的KASP引物组可配制PCR检测体系，并进一步应用于小麦赤霉病抗性检测。

Description

用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用
技术领域
本申请涉及小麦育种领域，特别是一种用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用。
背景技术
小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由镰孢属(Fusarium spp.)引起的一种世界性小麦穗部病害，不仅造成产量损失，且其引起的真菌毒素还严重危害人畜健康。随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区、西南麦区和西北麦区扩展，且大流行频率不断增加，2000至2012年，我国有9个年份赤霉病的发生面积超过3.3×106hm2。改变耕作制度和栽培技术难以解决赤霉病的侵染和蔓延，依赖化学防治尽管对控制赤霉病的大发生和大流行取得了一定成效，但不可避免地造成成本增加和环境污染，有悖于绿色发展理念，因此培育抗病品种成为减轻赤霉病危害的主要途径。
国内外对赤霉病的抗性遗传进行了大量研究，发现多个赤霉病抗性QTL，并命名7个抗赤霉病基因。由于抗性效应及稳定性等方面原因，目前广泛应用的仅有位于3BS染色体上的Fhb1位点，为了应对生产需求，新的赤霉病抗性基因亟待挖掘。长江中下游麦区是我国最早开展赤霉病抗性育种的区域，其代表性系列品种宁麦、扬麦、镇麦等均具有较高的赤霉病抗性，部分品种含有FHB1，系谱研究表明其FHB1多源于宁麦9号。
单核苷酸多态性(SNP)标记，是继限制性片段长度多态性(RFLP)和简单重复序列(SSR)之后的第3代分子标记，具有密度高、代表性强、遗传稳定性好和自动化程度高等优点，因此在遗传研究中具有广阔的应用潜力。在大量测序数据积累的基础上,芯片技术得到快速发展，相继开发出小麦Illumina iSelect 9k、Illumina iSelect 90k、AffymetrixAxiom 660k等芯片，并广泛应用于小麦遗传连锁图谱的构建、群体结构和连锁不平衡分析等研究。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)标记是针对基因组DNA样品，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行精准的双等位基因分型的PCR技术，目前广泛应用在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中。
扬麦158是90年代长江中下游麦区的主推品种，同时也是重要的亲本材料，其赤霉病抗性达到中抗水平，但经鉴定其中不含FHB1，目前，针对扬麦158系的赤霉病抗性检测引物尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本身提供一组针对扬麦158的小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用，
小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的前引物AlleleFAM、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的前引物AlleleHEX、核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的后引物Common。
上述KASP引物组在检测小麦赤霉病抗性中的应用，其具体步骤如下：利用上述KASP引物组配制成PCR检测体系并进行PCR扩增，再利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并以KlusterCaller software软件对5A染色体48.2cM处的标记Excalibur_c6567_743进行基因分型，该位点等位变异为T/G，含有等位基因G的小麦赤霉病抗性显著高于含有等位基因T的小麦。扬麦158含有的优势等位变异为G，与前引物AlleleHEX结合，T为非优势等位变异，可与前引物AlleleFAM结合，从而利用KASP引物组将二者区分。
所述PCR检测体系(5μL)：包括2.5μL DNA(30ngμL-1),KASP Mix 2.5μL(LGCGenomics,Hoddeston,UK)和0.07μL KASP Assay Mix；
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的前引物AlleleFAM(SEQ ID NO.1)12μL、浓度为100μM的前引物AlleleHEX(SEQ ID NO.2)12μL、浓度为100μM的后引物Common(SEQ ID NO.3)30μL、加入ddH2O补足至100μL。
PCR扩增程序：94℃热激活15min；94℃变性20s,61～55℃退火和延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和延伸60s,26个循环。
本发明同时还提供了一种用于检测小麦赤霉病抗性的基因盒，包括：2.5μL DNA(30ngμL-1),KASP Mix 2.5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK)和0.07μL KASP Assay Mix；
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的AlleleFAM 12μL、浓度为100μM的AlleleHEX 12μL、浓度为100μM的后引物30μL、加入ddH2O补足至100μL。
本发明利用Illumina iSelect 90k芯片对宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系进行基因组扫描，构建遗传图谱，结合3个环境的表型鉴定数据进行QTL定位，最终在5A染色体上检测到一个来源于扬麦158的稳定抗性位点，进一步转化为KASP标记，并验证其对赤霉病抗性影响显著，可应用于育种选择。
附图说明
图1为遗传图谱示意图。
图2为实施例1KASP标记扩增检测结果示意图。
图3为实施例2基因分型检测结果示意图。
具体实施方式
遗传定位使用的宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系群体由江苏省农业科学院粮食作物研究所保存。
标记验证使用的46份品种材料由江苏省农业科学院粮食作物研究所收集并保存。
赤霉菌由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。
实施例1扬麦158的稳定抗性位点筛选
1、筛选方法
本实施例以源自于宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系(RILs)为材料，2015-2016生长季将所有RILs及其亲本种植于江苏省农科院院内试验基地，单行区,行长2.0m,行距0.3m,每行50粒,2次重复。单花滴注的赤霉菌孢子液10μL,孢子浓度为5×105mL-1。在始花期,每个株系接种10穗,套袋保湿72h后,在弥雾保湿条件下继续生长,接种后21d调查病小穗数,作为赤霉病抗性评价指标。2016-2017生长季在江苏省农科院院内试验基地(玄武)及六合试验基地(六合)两个地点采用同样方法进行重复鉴定。利用EXCEL 2016对表型数据进行初步统计处理，用IBM SPSS 19.0进行相关分析及方差分析。
采用CTAB法从试验材料植株幼嫩叶片中分离DNA(具体方法参见文献：Doyle,J.J.(1987).A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaftissue.Phytochem Bull 19,11-15.)，利用Illumina 90k基因芯片(参见文献：Wang,S.,Wong,D.,Forrest,K.,Allen,A.,Chao,S.,Huang,B.E.,Maccaferri,M.,Salvi,S.,Milner,S.G.,and Cattivelli,L.(2014).Characterization of polyploid wheat genomicdiversity using a high-density 90 000 single nucleotide polymorphismarray.Plant Biotechnology Journal 12,787-796.)对试验材料进行基因组扫描，构建遗传连锁图，综合基因型与表型数据，使用IciMapping 4.1的完备区间作图方法(ICIM)进行QTL定位，统计在多环境中稳定检测到的位点，并进行标记转化，在品种材料中进行验证。
2、筛选结果
通过上述筛选方法检测到一个来源于扬麦158的稳定抗性位点，位于5A染色体48.2cM处(图1箭头标记处)，Excalibur_c6567_743为其紧密连锁标记(如图1所示)，其等位变异为T/G，扬麦158含有的优势等位变异为G。
为了能够进一步验证并利用此标记，申请人其转化为KASP标记，包括两条前引物(AlleleFAM、AlleleHEX)与一条后引物(Common)，序列分别如下，
AlleleFAM(SEQ ID NO.1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACTAATTTAAACTTGGAGCTGTGAT；
AlleleHEX(SEQ ID NO.2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACTAATTTAAACTTGGAGCTGTGAG；
Common(SEQ ID NO.3)：GTTCATACCTACACCCGTACTGACAA。
并进行PCR扩增反应，反应体系及扩增程序如下：
PCR体系(5μL)：包括2.5μL样品DNA(30ngμL-1),KASP Mix 2.5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK)和0.07μL KASP Assay Mix；
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的AlleleFAM 12μL、浓度为100μM的AlleleHEX 12μL、浓度为100μM的后引物30μL、加入ddH2O补足至100μL。
PCR程序：94℃热激活15min；94℃变性20s,61～55℃退火和延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和延伸60s,26个循环。
利用多功能酶标仪(PHERAstar，MG LABTECH,Germany)检测PCR扩增产物，并使用KlusterCaller software(LGC Genomics,Beverly,USA)进行基因分型(参见文献：Wu J,Liu S,Wang Q,Zeng Q,Mu J,Huang S,Yu S,Han D,Kang Z(2018)Rapid identificationof an adult plant stripe rust resistance gene in hexaploid wheat by high-throughput SNP array genotyping of pooled extremes.Theoretical and AppliedGenetics 131:43-58)。
从282份RILs中随机选取46份材料按如上方法进行KASP标记扩增检测，检测结果如图2所示。图2中，红色为携带优势等位变异G(+)，蓝色为携带非优势等位变异T(-)，且分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测。
实施例2 KASP引物组基因组分型鉴定
利用实施例1获得的KASP引物组对46份品种材料(表1)进行基因分型(检测结果见图3及表1所示)，并结合表型鉴定数据进行统计分析(t检验)，统计软件采用SPSS 19.0，结果如表2所示。
表1小麦材料分型检测结果1
Figure BDA0001840923190000051
Figure BDA0001840923190000061
表1中，“+”表示携带优势等位变异G，“-”表示携带非优势等位变异T。
表2小麦材料分型鉴定结果
Figure BDA0001840923190000062
表2中，t、p代表统计参数。
t检验显示携带优势等位变异G的材料赤霉病小穗数显著低于含非优势等位变异T的材料，表明含有等位基因G的小麦赤霉病抗性显著高于含有等位基因T的小麦，证明该KASP引物组可有效的帮助进行赤霉病筛选。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcgactaatt taaacttgga gctgtgat 48
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tgactaattt aaacttggag ctgtgag 47
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcatacct acacccgtac tgacaa 26

Claims (4)

1.用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组，其特征在于，该引物组由核苷酸序列如SEQID NO.1所示的前引物AlleleFAM、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的前引物AlleleHEX、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的后引物Common组成。
2.如权利要求1所述用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组在小麦赤霉病抗性检测中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
利用所述KASP引物组配制PCR检测体系并进行PCR扩增，然后利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并进行基因分型，含有等位基因G的小麦样品赤霉病抗性显著高于含有等位基因T的小麦样品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR检测体系包括：30 ng· μL-1 的DNA 2.5μL 、 KASP Mix 2.5μL 、0.07μL KASP Assay Mix;
其中，每100μL 的KASP Assay Mix配制方法如下：100μM 的AlleleFAM 12μL、100μM 的AlleleHEX 12μL 、100μM 的Common 30μL、ddH2O补足至100μL；
所述PCR扩增是指：94℃热激活15 min; 94℃变性20 s, 61~55℃退火和延伸60 s, 10个循环且每循环降低0.6℃; 94℃变性20s, 55℃退火和延伸60 s, 26个循环。
4.一种用于小麦赤霉病抗性检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：30 ng· μL-1 的DNA 2.5μL 、 KASP Mix 2.5μL 、0.07μL KASP Assay Mix;
其中，每100μL 的KASP Assay Mix配制方法如下：100μM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的AlleleFAM 12μL、100μM核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的AlleleHEX 12μL 、100μM核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Common 30μL、ddH2O补足至100μL。
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