CN112575114B

CN112575114B - 与小麦赤霉病抗性相关的snp分子标记905及应用

Info

Publication number: CN112575114B
Application number: CN202011604775.1A
Authority: CN
Inventors: 邓志英; 田纪春; 赵云哲; 王德华; 赵新颖
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112575114A

Abstract

本发明提了与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记及应用，所述SNP分子标记RAC875_c35801_905位于小麦的3D染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，且第51位碱基为A或G，第51位碱基为G的小麦具有赤霉病抗性；本发明涉及的SNP位点对于检测小麦抗赤霉病品种、品系、育种材料的抗性具有重要意义，可根据其开发分子标记，加快小麦育种效率。

Description

与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记905及应用

技术领域

本发明属于小麦育种技术领域，具体涉及与小麦赤霉病抗性相关的SPN分子标记905及应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)作为三大粮食作物之一，是重要的食用和饲用来源。然而，小麦生育期较长，容易受到生物(病害、虫害等)和非生物(干旱、冻害等)胁迫。小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)由真菌镰刀菌引起的一种小麦穗部病害，不仅造成小麦严重减产，而且镰刀菌侵染产生的脱氧腐镰刀菌烯醇(DON)等毒素，污染小麦籽粒。由于至今未发现完全免疫的品种，它已成为世界最具毁灭性的小麦病害，严重威胁粮食生产与食品安全。培育抗病品种，发掘抗病基因，是解决赤霉病问题的最有效途径。

现有技术中，利用遗传连锁分析和全基因组关联分析对小麦赤霉病抗性进行了广泛的研究，发现与赤霉病抗性相关的QTL有200多个，分布在21条染色体上。目前，小麦赤霉病抗性分为5种类型，即抗侵染(TypeⅠ)、抗扩展(TypeⅡ)、抗毒素积累(TypeⅢ)、籽粒抗性(TypeⅣ)和耐病性或耐产量损失(TypeⅤ)。其中，以抗侵染的TypeI型和抗扩展的TypeII型被广泛研究。目前已发现7个抗性基因(Fhb1到Fhb7)，其中Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5分别位于普通小麦的3BS、6BS、4BL和5AS染色体上，其余基因来源于小麦近缘种。除了这7个FHB基因外，还发现了一些重要的抗性位点。例如，QFhb.mgb-2A被鉴定为WAK2基因，其功能已得到证实。在5B染色体上，有明显的抗性QFhb.mbr-5B被发现可以解释高达36％的表型变异。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提了与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记及应用。

本发明以205份小麦材料构成的自然群体为实验材料，在三个不同环境下对小麦赤霉病抗性进行表型鉴定，结合90K小麦基因芯片进行全基因组关联分析，并通过优异等位基因鉴定和关联位点表型分析，发掘出抗性优异等位基因，为小麦赤霉病抗性基因发掘和分子标记辅助选择抗性育种提供了理论指导和基础。

本发明的技术方案如下：

一种与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记RAC875_c35801_905，其位于小麦的3D染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

所述SNP分子标记RAC875_c35801_905的核苷酸序列第51位碱基为A或G。

根据本发明优选的，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即该序列第51位碱基为G的小麦具有赤霉病抗性。

根据本发明优选的，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即该序列第51位碱基为G时，SNP分子标记的基因型为TT型；所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，即该序列第51位碱基为A时，SNP分子标记的基因型为CC，所述SNP分子标记的AA基因型个体的小麦赤霉病发病率显著高于GG基因型个体。

一种利用SNP分子标记在选育具有赤霉病抗性的小麦品种或品系中的用途，所述SNP分子标记至少包括上述的SNP分子标记RAC875_c35801_905。

根据本发明优选的，上述用途中，所述SNP分子标记还包括SNP分子标记Kukri_c4143_1055和RAC875_c5646_774；

所述SNP分子标记Kukri_c4143_1055位于小麦7B染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；

所述SNP分子标记Kukri_c4143_1055的核苷酸序列的第51位碱基为A或C；

所述SNP分子标记RAC875_c5646_774位于小麦7B染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；

所述SNP分子标记RAC875_c5646_774的核苷酸序列第51位碱基为A或G。

根据本发明优选的，所述用途中，SNP分子标记Kukri_c4143_1055的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、SNP分子标记RAC875_c5646_774的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、和SNP分子标记RAC875_c35801_905的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示时的小麦具有赤霉病抗性。

一种筛选具有潜在抗赤霉病性状小麦的方法，其特征在于，利用包括至少所述的SNP分子标记RAC875_c35801_905进行筛选。

根据本发明优选的，上述方法中，分子标记还包括SNP分子标记Kukri_c4143_1055和SNP分子标记RAC875_c5646_774；

根据本发明优选的，所述方法中，SNP分子标记Kukri_c4143_1055的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、SNP分子标记RAC875_c5646_774的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、和SNP分子标记RAC875_c35801_905的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示时的小麦具有赤霉病抗性。

本发明的有益效果

本发明的SNP位点对于检测小麦抗赤霉病品种、品系、育种材料的抗性具有重要意义，可根据其开发分子标记，加快小麦育种效率。

附图说明

图1为全基因组关联分析QQ图(左)、曼哈顿图(右)；

图中：E1,E2和E3同表2。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。

实施例1

与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记的筛选

1、材料与方法

1.1植物材料

关联分析205份小麦材料参见陈广凤,陈建省,田纪春.小麦株高相关性状与SNP标记全基因组关联分析[J].作物学报,2015。

选择苏麦3号为高抗对照，山农102为中抗对照，宁麦22为中感对照。

1.2菌液制备

本发明采用南京农业大学提供的7136、F301、F609、F15四种致病力强的小麦赤霉病病原菌制备混合分生孢子液；将病原菌接种于绿豆培养基中，25℃下1500rpm振荡5-7天，培养后过滤，配制分生孢子悬浮液，在显微镜下观察分生孢子的浓度，至孢子数为5×10⁴个/mL，4℃保存备用。

所述绿豆培养基的配方如下：

(1)称取40g绿豆，去离子水煮沸20～30min后过滤，用去离子水定容到1L；

(2)过滤后的培养基用三角瓶分装，每瓶200mL，灭菌，4℃冰箱保存。

1.3抗性鉴定

将205份小麦试验材料在2015-2016年和2016-2017年分别在山东农业大学试验田和温室(117°16′E,36°17′N)种植，以下分别简称2016、2017。年份-地点组合被认为是一个环境。E1、E2、E3分别代表2017年山东农业大学试验田，2017年山东农业大学温室，2016年山东农业大学试验田。采取随机区组设计，行长1.3m，行距0.2m，采用常规的田间管理措施进行田间管理。

温室中，在小麦扬花期的中下穗部的一个小穗上喷施上述分生孢子悬浮液(孢子数为5×10⁴个/mL)10μL，每个品种(品系)接种10个穗。田间以同样的方式对小麦喷施上述分生孢子悬浮液(孢子数为5×10⁴个/mL)10μL，每个品种(品系)接种10穗。然后用自封袋套住整个麦穗以保持水分，每天向自封袋中喷水1～2次，3天后取下自封袋。接种21d后对发病症状进行调查，计算病小穗率(DSR)、病穗轴率和病情指数(DI)。根据病小穗率(DSR)将病情严重程度分为5级：0％(0)、1-25％(1)、26-50％(2)、51-75％(3)、76-100％(4)(参见陆维忠,程顺和,王裕中.小麦赤霉病研究[M].北京科学出版社,2001)。根据小麦病害调查，计算病情指数(参见标准GB/T 15796-2011)。

其中i为病害严重程度，h_i为各类小麦穗数，H为调查小麦总穗数。

小麦赤霉病抗性划分标准见表1:免疫(DI＝0)，高抗(DI<苏麦3号)，中抗(苏麦3号<DI<山农102)，中感(山农102<DI<宁麦22)，高感(DI>宁麦22)。

表1穗部接菌条件下小麦赤霉病抗性评价标准

Table1 Resistance evaluation criteria of Fusarium head blight underthe condition of inoculated spikelet

1.4全基因组关联分析

SNP标记、基因分型和样本群体结构的分析方法参见陈广凤,陈建省,田纪春.小麦株高相关性状与SNP标记全基因组关联分析[J].作物学报,2015。在此基础上，利用TASSEL3.0的混合线性模型(MLM)确定显著的标记-性状关联(MTAs)。

1.5统计分析

使用SPSS 17.0统计软件进行表型性状间的方差分析(ANOVA)和相关分析。

1.6抗病候选基因预测

将显著的SNP标记序列在国际小麦基因组测序联盟数据库(IWGSC,http://www.wheatgenome.org/)上进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)搜索。当来自IWGSC的SNP标记序列与小麦参考序列100％相同时，根据IWGSC BLAST结果，每个标记的序列延长了2Mb。然后，使用候选小麦基因序列在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/Triticumaestivum/tools/BLAST)进行BLAST搜索，以确认可能的候选基因和功能。

2结果

2.1小麦赤霉病(FHB)抗性表型分析

小麦病小穗率(DSR)变异系数在E2中最高(52.96％)，其次是E3(44.30％)和E1(36.55％)，见表2，遗传变异丰富。小穗和穗轴对FHB抗性的方差分析表明，品种与环境及其相互作用存在显著差异，见表3，表明FHB抗性属于数量性状，不仅受基因型的影响，而且受环境的影响。在三个环境中，小穗与穗轴、小穗与小穗、穗轴与穗轴之间均存在显著的正相关，说明赤霉病发病趋势在小穗与穗轴之间的发展趋势是一致的，见表4。

表2小麦赤霉病病小穗率的表型变异

Table 1 Phenotypic variation of wheat diseased spikelets rate

^aE12017年山东农业大学试验田，E22017年山东农业大学温室，E32016年山东农业大学试验田

^aE1:the experimental field of Shandong Agricultural University in2017；E2:the greenhouse of Shandong Agricultural University in 2017；E3:theexperimental field of Shandong Agricultural University in 2016.

表3不同环境下小麦病穗率和病穗轴率的方差分析

Table 3 ANOVA of wheat diseased spikelet and spike rachis rate indifferent environments

*在0.05水平表示显著

*indicated significant at the 0.05 level(2-tailed)

表4 3个环境下小穗和穗轴的相关系数

Table 4 The correlation coefficients of spikelet and spike rachis inthree environments,respectively

**在0.001水平上显著相关；*在0.05水平上显著相关

**Correlation is significant at the 0.001 level(2-tailed)；*Correlation is significant at the 0.05 level(2-tailed).

2.2抗性FHB标记-性状关联(MTAs)

筛选出66个与FHB抗性相关的MTAs(P<10^-4)分布在1A、1B、2A、2B、2D、3B、3D、4A、5A、5B、6A、6B、7A、7B染色体上，见表5，图1，单个表型变异可解释5.4％～11.2％的贡献率。其中，在小穗和穗轴中均检测到11个MTAs位点。在7B染色体上，在所有三个环境中都检测到一个新的基因区域，遗传定位从92到103cM与FHB抗性显著相关。7B染色体92位有一个主效位点BS00025286_51，占表型变异的11.20％(小穗)，也能在穗轴检测到，可解释7.07％的表型变异。E3环境中发现7B染色体上的4个基因座(Kukri_c4143_1055、RAC875_c18043_369、RAC875_c18043_411、RAC875_c5646_774)与病穗率和病穗轴率均相关。此外，染色体5B、6A、2A、3B上也存在一些与FHB抗性相关的基因组区域。上述11个MTAs位点中的其他六个位点包括D_contig74317_533(5D)、Kukri_c14239_1995(1B)、Kukri_c7087_896(3B)、RAC875_c35801_905(3D)、BS00099729_51(5B)和RAC875_c68525_284(6B)。

表5中，P值用于确定QTL(数量性状位点)是否与标记相关，R²值用于评价MTA(marker-trait association)效应的大小。P值≤0.001的SNP被认为与表型性状显著相关，当标记同时在两个或更多的环境中被检测到时，它被认为是一个稳定的关联位点。

表5三个环境与FHB抗性显著相关的SNP标记

Table 5 SNP markers significantly associated with FHB resistance inthree environments

^aE1,E2和E3同表1 ^b染色体

^aE1,E2 and E3 were same as the Table 1 ^b Chromosome.

2.3MATs基因座的等位变异分析

对10个MATs基因座的等位变异进行分析，见表6。1B染色体上标记Kukri_c14239_1995的等位基因T和C存在最大表型差异(0.2297)，Kukri_c14239_1995-T病小穗率显著高于Kukri_c14239_1995-C，说明kukri_c14239_1995-C对FHB抗性的表现优于Kukri_c14239_1995-T(见表6)。在5D染色体上，由于D_contig74317_533-C病小穗率显着高于D_contig74317_533-T，故D_contig74317_533-T更有利于提高FHB抗性。在7B染色体上，BS00025286_51-C比BS00025286_51-C-T具有更高的病小穗率，因此该位点BS00025286_51-T有利于提高FHB的抗性。而在该染色体上的其他4个位点上，两个等位基因对病小穗率的显著差异仅在5％。在3B染色体上，Kukri_c7087_896-G与Kukri_c7087_896-T对病小穗抗性差异最小，说明该位点对FHB抗性影响较小。在3D染色体上，RAC875_c35801_905-A比RAC875_c35801_905-G具有更高的病小穗率，因此该位点RAC875_c35801_905-G对FHB的抗性优于RAC875_c35801_905-A。其中，Kukri_c4143_1055、RAC875_c5646_774和RAC875_c35801_905分子标记的核苷酸序列见表7。

表6病小穗率相对稳定位点等位基因的表型效应

Table 6 Phenotypic effect of alleles for the relatively stable lociof disease spikelet rate

^aE1,E2和E3同表1 ^b等位基因间差异

^aE1,E2 and E3 were same as Table 1.^b Difference between alleles.

平均值中A和B：不同的大写字母表示在P≤0.01的同一位点等位基因之间存在显著差异；a和b：不同的大写字母表示在P≤0.05的同一位点等位基因之间存在显著差异；

A and B:Different capital letters indicate significant differencebetween alleles at one locus at P≤0.01；a&b:Different lowercase lettersindicate significant difference between alleles at one locus at P≤0.05.

表7 SNP序列信息

Table 7 SNP sequence information

上述表7中，RAC875_c35801_905SNP标记记位于小麦3D染色体，全长101bp，在其第51位碱基为A或G，碱基G为优异等位变异。Kukri_c4143_1055SNP标记位于小麦7B染色体，全长101bp，在其第51位碱基为A或C，碱基C为优异等位变异。RAC875_c5646_774标记位于小麦7B染色体，全长101bp，在其第51位碱基为A或G，碱基A为优异等位变异。

2.4候选基因预测

通过候选基因预测，见表9，发现位于小麦3D染色体上的候选基因TraesCS3D02G326700与小麦肌动蛋白结合有关。Os05g0500500、Os08g0436400(OsSAP12)和ORUFI08G17770的生物过程涉及应激反应，Os01g0888600(OsMLO5)涉及防御反应和生物刺激反应。此外，候选基因在籼稻、粳稻、野生稻中与UDP-糖基转移酶活性相关。

鉴定出位于小麦7B染色体上标记Kukri_c4143_1055的候选基因TraesCS7B01G340200，其同源基因在大麦(6个同源基因)和拟南芥(3个同源基因)中都参与了真菌防御反应的生物学过程。

7B染色体上标记RAC875_c5646_774的候选基因TraesCS7B02G340100与普通小麦的碳水化合物代谢过程有关，而其同源基因ORUFI12G13460和ORUFI01G37780都参与了野生稻的防御反应。

2.5标记单体型与抗性分析

在关联位点的等位变异中，对赤霉病病穗率具有减性效应的等位变异被推测为该位点的抗性等位变异，据此得到具有抗性的优异等位变异，见表8。

表8与病穗率关联位点的抗病优异等位变异及单倍体型

Table 8 Excellent allelic variation and haplotype of the lociassociated with sdisease spikelet rate

由表8可以得出，品种B34、B16、B68、B200含有3个优异等位基因，单倍体型为GCA，对应的病情指数相对较低；品种B179、B113、B166含有2个优异等位基因，对应的病情指数明显提高，说明当RAC875_c35801_905位点第51位碱基位G时，提高了小麦品种对于赤霉病的抗性，表明该位点对于抗赤霉病材料的筛选具有重要作用；同时也说明SNP分子标记RAC875_c5646_774、Kukri_c4143_1055与RAC875_c35801_905同时为优异等位基因的小麦品种利于赤霉病的抗性，对于抗赤霉病材料的筛选具有重要作用。

表9小麦抗赤霉病候选基因的功能预测

Supplementary Table 9 Functional prediction of candidate genes relateto wheat scab resistance

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 与小麦赤霉病抗性相关的SNP分子标记905及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

gttgcaagca gagataattt tgaaagcaga taaagttacg gttcagacag gtggccctat 60

aaatcatgct tcaggattgg aacgttatgt ggaatctcta a 101

<210> 2

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 2

gttgcaagca gagataattt tgaaagcaga taaagttacg gttcagacag atggccctat 60

aaatcatgct tcaggattgg aacgttatgt ggaatctcta a 101

<210> 3

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 3

aacaaggccg accaaattga cactcaacag cttatgagag tgtatggtgc ccttatgtgg 60

tctcttggta aagtattgaa tacccctgag gtgtcgcgcg t 101

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 4

aacaaggccg accaaattga cactcaacag cttatgagag tgtatggtgc acttatgtgg 60

tctcttggta aagtattgaa tacccctgag gtgtcgcgcg t 101

<210> 5

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 5

ggaccaacaa caggtcagct cggccccgaa gcaccaccac gaaacggaag agcgacgtcc 60

acaactgagg caggataaac aaaccatgta atgtacatct c 101

<210> 6

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 6

ggaccaacaa caggtcagct cggccccgaa gcaccaccac gaaacggaag ggcgacgtcc 60

acaactgagg caggataaac aaaccatgta atgtacatct c 101

Claims

1.一种利用SNP分子标记在选育具有赤霉病抗性的小麦品种或品系中的用途，其特征在于，所述SNP分子标记包括分子标记RAC875_c35801_905，其位于小麦的3D染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即该序列第51位碱基为G的小麦具有赤霉病抗性。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，SNP分子标记的基因型为GG型；所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SNP分子标记的基因型为AA，所述SNP分子标记的AA基因型个体的小麦赤霉病发病率显著高于GG基因型个体。

4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述SNP分子标记还包括SNP分子标记Kukri _c4143_1055和RAC875_c5646_774；

所述SNP分子标记Kukri_c4143_1055位于小麦7B染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；

所述SNP分子标记RAC875_c5646_774位于小麦7B染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.5或SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，SNP分子标记Kukri_c4143_1055的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、SNP分子标记RAC875_c5646_774的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、和SNP分子标记RAC875_c35801_905的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示时的小麦具有赤霉病抗性。

6.一种筛选具有潜在抗赤霉病性状小麦的方法，其特征在于，利用SNP分子标记进行筛选，所述分子标记包括SNP分子标记RAC875_c35801_905，其位于小麦的3D染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即该序列第51位碱基为G的小麦具有赤霉病抗性。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，SNP分子标记的基因型为GG型；所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SNP分子标记的基因型为AA，所述SNP分子标记的AA基因型个体的小麦赤霉病发病率显著高于GG基因型个体。

9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，分子标记还包括SNP分子标记Kukri_c4143_1055和SNP分子标记RAC875_c5646_774；

所述SNP分子标记RAC875_c5646_774位于小麦7B染色体上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，SNP分子标记Kukri_c4143_1055的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、SNP分子标记RAC875_c5646_774的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、和SNP分子标记RAC875_c35801_905的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示时的小麦具有赤霉病抗性。