CN106498058B - 水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用。本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505 SNP位点的基因型为CC基因型还是TT基因型；如果待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505 SNP位点的基因型为CC基因型、待测水稻为感盐水稻；如果待测水稻的基因组DNA中基于rs12_14215505SNP位点的基因型为TT基因型、待测水稻为耐盐水稻。本发明提供了一个水稻耐盐基因位点，并提供该基因位点的分子标记，该标记可以预测水稻耐盐性，从而为水稻耐盐分子标记辅助选择育种提供基础。

Description

水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用
技术领域
本发明涉及水稻抗逆育种领域，具体涉及一种水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，目前我国65％以上的人口以此作为主食。但随着人口与经济的快速增长，粮食生产面临着巨大的挑战，其中水稻安全生产对于中国的可持续发展至关重要。水稻对盐碱表现为中度敏感，其生长和结实会受到盐碱的抑制。当前，土地盐碱化已成为威胁水稻生产的重要因素之一，盐碱可以使粮食作物严重减产，甚至高达40％以上。目前，全球大约20％的耕地存在盐碱化现象，其中中国约为2000万公顷，加之灌溉技术不当，造成的耕地次生盐碱化面积也在日益扩大。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505SNP位点的基因型，如果所述rs12_14215505SNP位点的基因型为CC基因型、待测水稻为感盐水稻，如果所述rs12_14215505SNP位点的基因型为TT基因型、待测水稻为耐盐水稻。
所述“检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505SNP位点的基因型”的实现方法如下：提取待测水稻的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
本发明还保护一种检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505SNP位点的基因型的方法，包括如下步骤：提取待测水稻的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
本发明还保护一种特异DNA分子(分子标记)，如序列表的序列1所示。
本发明还保护所述特异DNA分子在检测水稻耐盐性中的应用。
本发明还保护以上任一所述方法或所述特异DNA分子，在水稻育种中的应用。
所述育种的目的是选育耐盐性水稻。
本发明还保护一种特异引物对，由所述引物F和所述引物R组成。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定水稻耐盐性中的应用。
本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为鉴定水稻耐盐性。
以上任一所述rs12_14215505SNP位点为水稻基因组中序列表的序列1自5’末端第12位核苷酸。所述rs12_14215505SNP位点为C/T多态。
以上任一所述引物F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子。
以上任一所述耐盐水稻具体可为VI_R≥0.3的水稻。
以上任一所述感盐水稻具体可为VI_R＜0.3的水稻。
VI_R的计算方法如下：将待测水稻的种子分为两组，一组进行盐溶液处理，一组进行水处理，在平行试验的情况下，计算VI，进一步计算VI_R；VI_R＝盐溶液处理组的VI/水处理组的VI。
VI为种子活力指数。
VI＝GL×SL，GL表示发芽指数；SL表示第10天的平均芽长。
GL＝∑(Ni/n)/i，Ni为第i天种子总发芽数，n为种子总数，i为实验进行到第i天。
所述盐处理具体可为采用60mM NaCl水溶液处理。
所述水处理具体可为采用蒸馏水处理。
所述盐处理和所述水处理的条件具体可为：放置在30℃，相对湿度为80％的恒温箱中处理10天(12h光照/12h黑暗)。
计算发芽指数时，具体可从第3天开始，每天记录种子发芽数目并统计芽长，当芽长为种子长度一半，同时根长大于种子本身长度时作为种子发芽的标准。
以上任一所述待测水稻具体可为栽培稻。
以上任一所述待测水稻具体可为如下水稻材料中的任意一种：ARC 12867：：IRGC22401-1、AUS 171：：IRGC 29004-1、AUS 233：：IRGC 29036-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、MADISA：：IRGC 27568-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANI BHOG：：IRGC 35109-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、SADUMONI：：IRGC 25919-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、ARC11822：：IRGC 21677-1、JHUL DIGA：：IRGC 26478-1、AUS 282：：IRGC 29072-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、AUS 449：：IRGC 29230-1、PINIDWA QAN QIPUGO PINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、ADUKKAN：：IRGC 81783-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、LIU TIAO XIAN：：IRGC72758-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、BHU BHUSI：：IRGC70803-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、GITANO：：IRGC 82424-1、ARNG’-KAR PHARONG：：IRGC 87196-1、ARC 11901：：IRGC 21727-1、EDAKKADAN 0-69-27：：IRGC 19560-1、ARC18533：：IRGC 51756-1、FAN WU：：IRGC 70245-1。
以上任一所述待测水稻为以如下水稻材料中的任意一种或两种为亲本得到的后代：ARC 12867：：IRGC 22401-1、AUS 171：：IRGC 29004-1、AUS 233：：IRGC 29036-1、BIRBAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、MADISA：：IRGC27568-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANIBHOG：：IRGC 35109-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、SADUMONI：：IRGC 25919-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、ARC 11822：：IRGC 21677-1、JHUL DIGA：：IRGC 26478-1、AUS 282：：IRGC29072-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、AUS 449：：IRGC 29230-1、PINIDWA QAN QIPUGOPINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、ADUKKAN：：IRGC 81783-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、LIUTIAO XIAN：：IRGC 72758-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、BHUBHUSI：：IRGC 70803-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、GITANO：：IRGC 82424-1、ARNG’-KAR PHAR ONG：：IRGC 87196-1、ARC 11901：：IRGC 21727-1、EDAKKADAN 0-69-27：：IRGC 19560-1、ARC 18533：：IRGC 51756-1、FAN WU：：IRGC 70245-1。
为了克服盐碱对水稻生产的不利影响，除了采用传统的农业栽培保护措施外，种植耐盐品种成为降低盐害损失最经济、最环保、最有效的重要方式之一。因此，鉴定耐盐新基因，开发与耐盐性紧密相关的分子标记成为水稻育种工作者最亟待解决的问题。通过分子标记辅助选择的方法，挖掘新的耐盐基因或聚合已知优良的耐盐基因，可以提高水稻的抗逆性，适应不同的生长环境，加快耐盐水稻品种培育，有利于水稻的稳产和高产。
本发明提供了一个水稻耐盐基因位点，并提供该基因位点的分子标记，该标记可以预测水稻耐盐性，从而为水稻耐盐分子标记辅助选择育种提供基础。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中的水稻材料均已经在参考文献：3K RGP.The 3,000rice genomesproject[J].Gigascience，2014，3：7.中公开记载。
实施例1、水稻耐盐基因及其紧密连锁的分子标记
1、从己测序(平均深度14×)的全球水稻核心种质资源(3K RGP.The 3,000ricegenomes project[J].Gigascience，2014，3：7.)中选取来自49个国家的478份水稻品种作为实验材料；针对478份水稻品种进行全基因组关联分析，在第12染色体定位到水稻耐盐性相关的新基因qST14.2，进一步发掘了与qST14.2基因紧密连锁的SNP标记，将其命名为rs12_14215505SNP。
rs12_14215505SNP位于水稻日本晴参考基因组第12染色体的14215505bp，rs12_14215505SNP及其附近的核苷酸如序列表的序列1所示，其中第12位核苷酸为rs12_14215505SNP，为C/T多态。
2、针对步骤1的SNP位点设计引物，如表1所示。
表1引物信息
3、检测水稻rs12_14215505SNP位点基因型的方法：提取水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用步骤2中的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序，检测rs12_14215505SNP位点的基因型为CC还是TT。
实施例2、水稻耐盐性鉴定实验
1、采用36份水稻材料作为实验材料，每份材料选出120粒饱满的种子，在温度为50℃的烘箱中烘3天。将每份种子分成4份(盐处理组和对照组，每组设置两个重复，每个重复30粒种子)。
2、将步骤1的种子用体积百分比为15％的次氯酸钠水溶液浸泡20min，用蒸馏水清洗3次。
3、在直径9cm的培养皿中放置双层滤纸，将30粒种子均匀分布于滤纸上，然后加入处理液(每天更换新配制的处理液，每次的加入量为10ml；盐处理组的处理液为60mM盐水，对照组的处理液为蒸馏水)，将培养皿放置在30℃，相对湿度为80％的恒温箱中处理10天(12h光照/12h黑暗)。从第3天起，每天记录种子发芽数目并统计芽长，当芽长为种子长度一半，同时根长大于种子本身长度时作为种子发芽的标准。根据统计的数据计算种子活力指数(VI)：VI＝GL×SL，其中GL表示发芽指数(GL＝∑(Ni/30)/i，Ni为第i天种子总发芽数，30为实验种子总数，i为实验进行到第i天)，SL表示第10天的平均芽长。VI_R＝盐处理组的VI/对照组的VI。VI_R≥0.3为耐盐品种，VI_R＜0.3为感盐品种。
结果见表2。36份水稻材料中，30份为耐盐材料，6份为感盐材料。
表2水稻耐盐性统计
实施例3、水稻耐盐基因及其紧密连锁的分子标记在鉴定水稻耐盐性中的应用
待测样本为：实施例2表2中水稻。
提取待测水稻的基因组DNA，按照实施例1步骤3的方法检测待测水稻基因组DNA中rs12_14215505SNP位点基因型。表2中编号1-36的水稻材料基因组DNA的PCR扩增产物经测序均为1035bp-1055bp(上游末端19个核苷酸如序列表的序列2所示，下游末端18个核苷酸与序列表的序列3反向互补)，其中均含有序列1所示的41bp碱基(第12位碱基为rs12_14215505SNP位点)。
测序结果表明，30个耐盐品种的水稻rs12_14215505SNP位点的基因型为TT，6个感盐的水稻rs12_14215505SNP位点的基因型为CC。通过用该功能标记对36份具不同耐盐性的水稻品种进行检测，发现该标记能够明确的鉴定出耐盐品种和感盐品种，实验证明开发的分子标记是有效和准确的，可用于水稻耐盐种质资源的筛选和分子标记辅助选择育种。
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<210> 1
<211> 41
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> y is c or t
<400> 1
cattccaccc cyagacggac ggccaaacgg aggcggctaa t 41
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gatgattccg caacaccac 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tatctccagg gcgacagc 18

Claims (7)

1.一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505 SNP位点的基因型，如果所述rs12_14215505 SNP位点的基因型为CC基因型、待测水稻为感盐水稻，如果所述rs12_14215505 SNP位点的基因型为TT基因型、待测水稻为耐盐水稻；
所述rs12_14215505 SNP位点位于水稻日本晴参考基因组第12染色体的14215505bp。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505 SNP位点的基因型”的实现方法如下：提取待测水稻的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；
所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
3.一种检测待测水稻的基因组DNA中rs12_14215505 SNP位点的基因型的方法，包括如下步骤：提取待测水稻的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；
所述rs12_14215505 SNP位点位于水稻日本晴参考基因组第12染色体的14215505bp；
所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
4.权利要求1-3任一所述的方法在水稻育种中的应用，所述育种的目的是选育耐盐性高的水稻。
5.引物对，由引物F和引物R组成；
所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
6.权利要求5所述引物对在鉴定水稻耐盐性中的应用。
7.含有权利要求5所述引物对的试剂盒，所述试剂盒的应用为鉴定水稻耐盐性。
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CN106498058A (zh) 2017-03-15

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