CN108441545A - 一种筛选黑果枸杞棘刺相关msap位点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析；本发明筛选出的黑果枸杞棘刺相关MSAP位点稳定，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础；可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论。
Description
技术领域
本发明属于植物表观遗传学领域，具体涉及一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法。
背景技术
黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木。野生黑果枸杞常以灌丛状生于盐碱荒地、盐化沙地、盐湖岸边、路旁等各种盐渍化土壤或荒漠环境，具有防风固沙和改善土质的作用。并且黑果枸杞果实保健价值和价格远超普通红果枸杞。黑果枸杞是用于治理和开发利用沙化土地及盐碱地的优良生态经济型树种。因此，荒漠和沙化土地营造黑果枸杞经济防护林具有重要的社会、经济和生态意义。但是黑果枸杞坚硬且牢固的棘刺不但增加造林和日常管理（尤其是采果）难度，而且降低了人工林的经济效益。棘刺表型是采果类经济树种的重要性状之一。参照无刺沙棘的生产表现，我们发现同等条件下的无刺类型无疑更宜作经济型林木栽培。综上，培育优良无刺黑果枸杞是一个很值得研究的课题。
有研究通过盆栽控水处理联合浇灌营养液的方法成功抑制了黑果枸杞组培无性系产生棘刺。相同遗传背景的组培无性系，在不同的水分营养条件下，可以产生或者完全不产生棘刺，这属于环境影响发育的典型实例。在前期研究的基础之上，本发明筛选出稳定的黑果枸杞棘刺相关MSAP（甲基化敏感的扩增片段长度多态性）位点。对位点相关基因的进一步研究可为阐明黑果枸杞棘刺发育机理奠定基础，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础，为培育其它木本植物的无刺类型提供借鉴。此外，本发明可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论、填补国内外茎刺相关研究的空缺。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效且低成本的筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法。
一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：
1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；
2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；
3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；
4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；
5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；
6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；
7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；
8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；
9）特异性条带的回收、测序和分析；
步骤4）中所述的双酶切，反应体系为：
反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切体系）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为20 μL；
反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切体系）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为20 μL；
将混匀的体系，在37 ℃进行DNA酶切5-6 h之后，每个反应体系添加T4 ligase 0.1 μL，混匀后
在8 ℃下进行接头连接4 h；
步骤4）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，冷却后得到；
步骤5）中PCR预扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（酶切连接产物稀释20倍后） 2 μl
Total volume 25 μl；
反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用0.1×TE buffer稀释预扩增产物5-20倍；
步骤6）中选择性PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl；
混匀体系，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；
步骤6）所述的选择性 PCR扩增，引物对如下：
EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。
本发明提供了一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析；本发明筛选出的黑果枸杞棘刺相关MSAP位点稳定，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础；可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论。
附图说明
图1筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点流程图。
具体实施方式
下面将结合实际操作对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不局限于以下的实施例。
实施例1 一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法
1.获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2 min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8，121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触。将接种的材料置于25℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种茎外植体获得再生植株
待上步接种的种子萌发并长出20片以上真叶时，于超净工作台将茎剪为1-2节的小段，接种到添加6-BA 0.2 mg·L-1的MS固体培养基（蔗糖3.5%；琼脂0.45%；pH5.6；121℃高压灭菌16 min）。将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，培养温度为25 ℃；此条件下茎段外植体插入培养基一端产生结节样愈伤后形成不定芽，茎段外植体叶腋处产生丛生芽。待芽长至2-4 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min）诱导生根。
3.壮苗、移栽驯化、盆栽控水/营养获得无刺和有刺黑果枸杞
参照专利201710307900.4进行。注意所有移栽植株均为来自同一种苗的茎外植体产生。80%田间持水量条件下获得黑果枸杞无刺植株简称“80无刺”，40%和60%田间持水量条件下获得黑果枸杞有刺植株分别简称“40有刺”和“60有刺”。
4.提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA
选取“80无刺”的发育完全的健康叶片、“40有刺”和“60有刺”的有刺节的发育完全的健康提取DNA。注意“40有刺”和“60有刺”所有节都带棘刺的枝（完全棘刺枝）和部分节带有棘刺的枝（部分棘刺枝）的叶片均要取材；实验需要设置重复。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取上述叶片材料的基因组总DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的 1%的TE缓冲液。采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析提取叶片的基因组总DNA
MSAP大概步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ：5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链接头的方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
将混匀体系，在37 ℃进行DNA酶切6 h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8 ℃进行接头连接4 h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增；
①预扩增引物为：
EcoRI+A：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’；
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用引物组合J4（表1）用于选择性扩增（第二次PCR扩增），EcoRⅠ 引物5’端用FAM进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除。将删除精简后的01矩阵经肉眼矫正后用R软件进行分析，确定“80无刺”叶片特异的MSAP位点（所有“80无刺”叶片表现为同一甲基化状态，而所有“60有刺”和“40有刺”均表现为另一种统一的状态）。本实施例中我们通过重复实验，最终筛选出1个稳定可重复的无棘刺特异性叶片MSAP位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出无棘刺相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。具体步骤如下：采用无荧光标记的引物组合J4对稀释后的预扩增产物再次进行选择性PCR扩增，反应体系和程序和步骤（4）相同；采用变性聚丙烯酰胺凝胶对选择性PCR产物进行电泳分离，将棘刺相关MSAP位点对应的条带回收；将回收条带置于0.1×TE溶液中煮沸5 min后，取冷却的溶液做模板，采用非荧光标记的J4引物组合再次进行PCR扩增；将回收纯化的PCR产物链接载体，载体转化大肠杆菌后进行测序分析。
实施例2 一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法
1.获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2 min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触。将接种的材料置于25 ℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种茎外植体获得再生植株
待上步接种的种子萌发并长出20片以上真叶时，于超净工作台将茎剪为1-2节的小段，接种到不添加任何植物生长调节剂的MS固体培养基（蔗糖4.0%；琼脂0.45%；pH5.8；121℃高压灭菌15 min）。将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，培养温度为25 ℃；此条件下茎段外植体叶腋处产生丛芽。待芽长至2-4 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min）诱导生根。
3.壮苗、移栽驯化、盆栽控水/营养获得无刺和有刺黑果枸杞
参照专利201710307900.4进行。注意所有移栽植株均为来自同一种苗的茎外植体产生。80%田间持水量条件下获得黑果枸杞无刺植株简称“80无刺”，40%和60%田间持水量条件下获得黑果枸杞有刺植株分别简称“40有刺”和“60有刺”。
4.提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA
选取“80无刺”的发育完全的健康叶片、“40有刺”和“60有刺”的有刺节的发育完全的健康叶片提取DNA，注意所有“40有刺”和“60有刺”节都带棘刺的枝（完全棘刺枝）和部分节带有棘刺的枝（部分棘刺枝）的叶片均要取材；实验需要设置重复。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取上述叶片材料的基因组总DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的 1%的TE缓冲液。采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析提取叶片的基因组总DNA，
MSAP步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ：5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链接头的方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
将体系混匀，在37 ℃进行DNA酶切6 h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8 ℃进行接头连接4 h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增；
①预扩增引物为：
EcoRI+A： 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’；
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用引物组合G8和J4（表1）用于选择性扩增（第二次PCR扩增），EcoRⅠ 引物5’端用FAM进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除。将删除精简后的01矩阵经肉眼矫正后用R软件进行分析，确定“80无刺”叶片特异的MSAP位点（所有“80无刺”叶片表现为同一甲基化状态，而所有“60有刺”和“40有刺”均表现为另一种统一的状态）。本实施例中我们通过重复实验，最终筛选出2个稳定可重复的无棘刺特异性叶片MSAP位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出无棘刺相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。具体步骤如下：分别采用无荧光标记的引物组合J4和G8对稀释后的预扩增产物再次进行选择性PCR扩增，反应体系和程序和步骤（4）相同；采用变性聚丙烯酰胺凝胶对选择性PCR产物进行电泳分离，将棘刺相关MSAP位点对应的条带回收；将回收条带置于0.1×TE溶液中煮沸5 min后，取冷却的溶液做模板，分别采用非荧光标记的J4和G8引物组合再次进行PCR扩增；将回收纯化的PCR产物链接载体，载体转化大肠杆菌后进行测序分析。
实施例3 一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法
1.获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2 min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触。将接种的材料置于25 ℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种茎外植体获得再生植株
待上步接种的种子萌发并长出20片以上真叶时，于超净工作台将茎剪为1-2节的小段，接种到不添加任何植物生长调节剂的MS固体培养基（蔗糖4.0%；琼脂0.45%；pH5.8；121℃高压灭菌15 min）。将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，培养温度为25 ℃；此条件下茎段外植体叶腋处产生丛芽。待芽长至2-4 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min）诱导生根。
3.壮苗、移栽驯化、盆栽控水/营养获得无刺和有刺黑果枸杞
参照专利201710307900.4进行。注意所有移栽植株均为来自同一种苗的茎外植体产生。80%田间持水量条件下获得黑果枸杞无刺植株简称“80无刺”，40%和60%田间持水量条件下获得黑果枸杞有刺植株分别简称“40有刺”和“60有刺”。
4.提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA
选取“80无刺”的发育完全的健康叶片、“40有刺”和“60有刺”的有刺节的发育完全的健康叶片提取DNA，注意所有“40有刺”和“60有刺”节都带棘刺的枝（完全棘刺枝）和部分节带有棘刺的枝（部分棘刺枝）的叶片均要取材；实验需要设置重复。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取上述叶片材料的基因组总DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的 1%的TE缓冲液。采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析提取叶片的基因组总DNA
MSAP步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ：5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链接头的方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为20 μL；
将体系混匀，在37 ℃进行DNA酶切6 h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8 ℃进行接头连接4 h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增；
①预扩增引物为：
EcoRI+A： 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’；
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用引物组合G8（表1）用于选择性扩增（第二次PCR扩增），EcoRⅠ 引物5’端用FAM进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除。将删除精简后的01矩阵经肉眼矫正后用R软件进行分析，确定“80无刺”叶片特异的MSAP位点（所有“80无刺”叶片表现为同一甲基化状态，而所有“60有刺”和“40有刺”均表现为另一种统一的状态）。本实施例中我们通过重复实验，最终筛选出1个稳定可重复的无棘刺特异性叶片MSAP位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出无棘刺相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。具体步骤如下：采用无荧光标记的引物组合G8对稀释后的预扩增产物再次进行选择性PCR扩增，反应体系和程序和步骤（4）相同；采用变性聚丙烯酰胺凝胶对选择性PCR产物进行电泳分离，将棘刺相关MSAP位点对应的条带回收；将回收条带置于0.1×TE溶液中煮沸5 min后，取冷却的溶液做模板，采用非荧光标记的G8引物组合再次进行PCR扩增；将回收纯化的PCR产物链接载体，载体转化大肠杆菌后进行测序分析。
Claims (7)
1.一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：
1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；
2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；
3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；
4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；
5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；
6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；
7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；
8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；
9）特异性条带的回收、测序和分析。
2.根据权利要求1所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤4）中所述的双酶切，反应体系为：
反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切体系）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为20 μL；
反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切体系）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为20 μL；
将混匀的体系，在37 ℃进行DNA酶切5-6 h之后，每个反应体系添加T4 ligase 0.1 μL，混匀后在8 ℃下进行接头连接4 h。
3. 根据权利要求2所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤4）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，冷却后得到。
4. 根据权利要求3所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中PCR预扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（酶切连接产物稀释20倍后） 2 μl
Total volume 25 μl；
反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用0.1×TE buffer稀释预扩增产物5-20倍。
5. 根据权利要求4所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤6）中选择性PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl；
混匀体系，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮；
接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10min。
6.根据权利要求5所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤6）所述的选择性 PCR扩增，引物对如下：
EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。
7.一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤8）中所述的筛选无刺节叶片特异性MSAP位点，它采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除，将删除精简后的01矩阵经肉眼矫正后用R软件进行分析，确定“80无刺”叶片特异的MSAP位点（所有“80无刺”叶片表现为同一甲基化状态，而所有“60有刺”和“40有刺”均表现为另一种统一的状态）；最终筛选出1个稳定可重复的无棘刺特异性叶片MSAP位点。
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