CN110338062A

CN110338062A - 一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法

Info

Publication number: CN110338062A
Application number: CN201910760831.1A
Authority: CN
Inventors: 杨迪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明提供了一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：花蕾取材、花蕾预处理、花药消毒与接种和愈伤组织诱导培养。本发明还提供了一种固液双层的诱导培养基，其固体成分包括KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄等大量元素，铁盐及络合物，H₃BO₃、KI等微量元素，肌醇、维生素、烟酰胺、色氨酸、脯氨酸、水解酪蛋白、D‑生物素、TDZ、6‑BA、NAA、麦草畏、植物血凝素、3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸、番茄伤流液、蔗糖和琼脂，液体成分不含琼脂，其它与固体相同。利用本发明的方法对甘草花药进行诱导培养，可以大大提高愈伤组织的诱导频率，为建立高效的甘草花药培养体系以及开展甘草单倍体育种研究奠定基础。

Description

一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法

技术领域

本发明属于药用植物育种技术领域，具体涉及一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法。

背景技术

甘草为豆科甘草属多年生草本植物，药用部位是根及根茎，是一味重要的大宗中药材，常作佐使药入多种中药复方，中医常有“十方九草”之说。作为一味古老的植物药，甘草在中国的古代医药典籍中多有记载，至今已有几千年的使用历史。中医认为甘草味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。甘草在全世界约有29种6变种，我国约有18种3变种，主要包括乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草、无腺毛甘草、洋甘草、粗毛甘草、圆果甘草、刺果甘草、云南甘草等，其中前三种为《中华人民共和国药典》2000年版规定的药材正品。现代研究表明，甘草中含有三萜类、黄酮类以及甘草多糖等多种活性成分。三萜类是甘草中含量较高的活性成分，目前已鉴定得到60余种三萜类化合物，主要包括甘草酸、甘草甜素、甘草次酸、甘草次酸甲酯、甘草酸新苷、3-乙酰化甘草次酸、乌热酸、24-羟基甘草次酸、甘草内酯、24-羟基甘草内酯等。黄酮类成分是近年来研究最活跃的天然活性成分之一，目前，从甘草属植物中已发现黄酮及其衍生物 150余，主要包括二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、异黄烷、异黄酮、黄酮、黄酮醇、二氢异黄酮等。目前，多项研究表明甘草及其提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化、保肝、神经保护、美白、降糖、增强记忆力等多种活性，预示了甘草在肝病治疗、糖尿病治疗、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默症、帕金森氏症、癫痫、抑郁、癌症治疗及化妆品方面有更好的开发和应用前景。此外，甘草多生长在干旱、半干旱的沙土、沙漠边缘和黄土丘陵地带，具有喜光、耐旱、耐热、耐盐碱和耐寒的特性，因此甘草也是我国西部荒漠半荒漠地区重要的固沙作物。

近年来随着国内外甘草需求量逐年增加，甘草野生资源日趋枯竭，生态环境日益恶化。早在2002年甘草已经被国家列为重点专控中药材，并列为二级保护物种。通过人工栽培甘草取代野生甘草，是实现甘草资源可持续利用根本有效措施。但目前与野生甘草相比，人工栽培甘草普遍存在药材质量偏低的问题。更重要的是，由于栽培甘草所用的种子基本来自野生，种子来源不清，种子调拨混乱，所产药材良莠不齐，药材质量无法保障。中药材质量的稳定、可控是保证中药制剂质量和疗效的首要环节，其中优良的种子是生产优质药材的基础。因此，对甘草进行优良品种选育，最终建立良种繁育体系成为获得质量稳定、可控优质甘草的必经之路。

早在20世纪60年代我国就开始了甘草野生变家栽尝试，80年代开始了生产性试验，90年代中期开始规模化生产，人工栽培技术逐步成熟，并在育种方面进行了一定的研究，例如周成明等从种源的角度对选自不同产地的野生甘草种子进行栽培试验，以内蒙古中西部的甘草作为对照，在甘肃民勤筛选了一个高产、优质栽培新品系，此品系还有待进一步深入研究；张新玲等以居群为单位对新疆甘草属7个种进行种间人工杂交；马春英在甘草自然变异类群中，在不同花色与茎色的类型间进行杂交，并获得一定数量的荚果；李晓瑾等应用低能离子束注入不同年份的甘草种子并观察其发芽率、出土率以及测定呼吸速率。目前甘草主要采取的育种途径有选择育种、杂交育种、人工诱变育种等，但甘草为多年生草本植物，从种子萌发到开花结实需要3年以上时间，生育期较长。甘草自交、异交亲和但自然状态下以异交为主，这些都增加了甘草品种选育的难度和复杂性，因此甘草育种进程十分缓慢。

现代生物技术的快速发展，为植物品种的改良提供了新的途径。单倍体育种是现代生物技术育种手段之一，在生产实践中日益受到广大育种工作者的重视。单倍体育种即利用植物组织培养技术诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而使植物恢复正常染色体数。单倍体是具有体细胞染色体数为本物种配子染色体数的生物个体，单倍体植株经染色体加倍后，在一个世代中即可出现纯合的二倍体（一般情况下为纯合，但在亲本为多倍体情况下，得到的单倍体植株加倍后，子代可能为杂合），从中选出的优良纯合系后代不分离，表现整齐一致，可缩短育种年限。单倍体植株中由隐性基因控制的性状，虽经染色体加倍，但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。这对诱变育种和突变遗传研究很有好处。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。中国首先应用单倍体育种法改良作物品种，已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种。单倍体育种如能进一步提高诱导频率并与杂交育种、诱变育种、远缘杂交等相结合应用，则在作物品种改良上的作用将更显著。

1964年印度的Guha和Maheshwari首次成功地从毛叶曼陀罗离体花药培养中获得单倍体植株，从此开创了利用花药培养诱导单倍体的新途径，之后，花药培养诱导单倍体在许多重要作物上获得成功。花药培养的目的是选择性的改变花粉核的分裂方式，从而产生愈伤组织或胚状体。在这个过程中，各种培养条件、遗传因素都单独或者联合作用影响花粉植株的诱导频率。目前关于甘草花药培养的研究很少，并且现有技术存在着甘草花药愈伤组织诱导率和分化率都很低的问题，导致甘草花药培养效率不高，不能满足育种工作的需要。针对这些问题，我们在总结前人经验的基础上，对影响甘草花药培养的关键因素如供体材料、培养条件、预处理、培养基等进行优化，以期进一步提高甘草花药培养的效率。

发明内容

本发明的目的是确定甘草花药愈伤组织诱导的最佳培养基、最佳预处理条件和最佳培养条件，从而提供一种优化的甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，进一步提高甘草花药愈伤组织的诱导频率。

本发明提供的技术方案是：

一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）花蕾取材：于甘草正常现蕾开花期采集花蕾，采后放入冰盒中带回实验室镜检；花蕾用醋酸洋红染色，显微镜观察，选取多数花药小孢子处于单核靠边期的花蕾用于试验；

2）花蕾预处理：将甘草花蕾用湿纱布包裹后放入塑料袋中，置于4℃冰箱低温预处理2~3d；

3）花药消毒与接种：在无菌条件下，先用无菌水将甘草花蕾冲洗3遍，再用75%酒精浸泡30s，取出用无菌水清洗1~2次，接着放入0.1%HgCl₂中消毒8min或放入2%次氯酸钠中消毒15min，然后取出再用无菌水冲洗 4~5次；从消毒后的花蕾中剥离出花药，接种于固液双层的诱导培养基中，诱导培养基分装于50mL三角瓶中，透气膜封口；

4）愈伤组织诱导培养：将接种的花药先置于黑暗条件下进行暗培养7d左右，然后转入光照条件下继续培养35~45d，可获得甘草花药愈伤组织。

所述甘草品种为乌拉尔甘草和胀果甘草。

所述步骤1）中花蕾染色的具体方法为：将花蕾放于烧杯中，加入适量的卡诺氏固定液，在室温下固定24h，用镊子从固定处理的花蕾中剥离出花药放在载玻片上，用刀片将花药切割开来，滴一滴醋酸洋红染色液，加盖盖玻片适当的用力挤压出花粉，在显微镜下观察花粉小孢子所处的发育时期。

所述步骤2）中固体诱导培养基的成分为：KNO₃1500~1700mg/L，NH₄NO₃1080~1200mg/L，KH₂PO₄ 470~530mg/L，MgSO₄·7H₂O 100~140mg/L，CaCl₂·2H₂O 130~170mg/L，Na₂-EDTA 37~38mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.4~28.2mg/L，H₃BO₃ 3.0~3.4mg/L，KI 0.8~1.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 7.8~8.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.7~3.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.04~0.06mg/L，肌醇90~110mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，盐酸硫胺素0.9~1.1mg/L，烟酰胺1.0~1.5mg/L，色氨酸2.0~3.0mg/L，脯氨酸25~35mg/L，水解酪蛋白200~250mg/L，D-生物素1.7~2.3mg/L，TDZ 0.01~0.03mg/L，6-BA0.9~1.1mg/L，NAA1.8~2.2mg/L，麦草畏1.7~2.3mg/L，植物血凝素2.5~3.5mg/L，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸5.0~7.0mg/L，番茄伤流液130~170ml/L，蔗糖56~64g/L，琼脂6~8g/L，pH值为5.6~6.0。

所述步骤2）中液体诱导培养基不含琼脂，其它成分与固体诱导培养基相同。

所述步骤2）中花药的接种密度为每50mL三角瓶接种40~50个花药。

所述步骤4）中暗培养的温度为24~26℃；光照培养的温度为24~26℃，光照强度为500~1000lx，光照时间为8~12h/d。

所述固体和液体诱导培养基的成分中，番茄伤流液的采集方法为：将脱脂棉塞入自封袋中，在距番茄根基2cm处用手术刀片切断茎杆，3min 后用洁净滤纸吸走断茎处的组织液，以防韧皮部汁液的交叉污染，然后迅速将袋子套住茎杆并使茎断面与脱脂棉接触，3~4h后取下袋子，挤压脱脂棉可获得番茄伤流液。

本发明具有如下有益效果：

1）本发明对甘草花蕾进行低温预处理，在诱导培养时采用先暗培养再光照培养的方法，均能提高甘草花药愈伤组织的诱导频率。

2）本发明的诱导培养基调整了基本元素的浓度，使其更适合于甘草花药培养，植物激素选择了TDZ、6-BA、NAA进行复配，还添加了烟酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白、D-生物素、麦草畏、植物血凝素、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、番茄伤流液，可有效地提高甘草花药愈伤组织的诱导频率。此外本发明的诱导培养基为固液双层，透气膜封口，与单纯的液体培养基或固体培养基相比能够更好地解决营养与通气的矛盾，更利于花药愈伤组织的诱导。本发明最终获得了24.84%的甘草花药愈伤组织诱导率，为建立高效的甘草花药培养体系以及开展甘草单倍体育种研究奠定了基础。

具体实施方式

为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

1 材料与方法

1.1供试材料

以人工栽培的乌拉尔甘草和胀果甘草作为供试材料，来源于内蒙古北方生态甘草种植基地。

1.2试验方法

1）花蕾取材：于甘草正常现蕾开花期采集花蕾，采后放入冰盒中带回实验室镜检；将花蕾放于烧杯中，加入适量的卡诺氏固定液，在室温下固定24h，用镊子从固定处理的花蕾中剥离出花药放在载玻片上，用刀片将花药切割开来，滴一滴醋酸洋红染色液，加盖盖玻片适当的用力挤压出花粉，在显微镜下观察花粉小孢子所处的发育时期，选取多数花药小孢子处于单核靠边期的花蕾用于试验。

2）花蕾预处理：将甘草花蕾用湿纱布包裹后放入塑料袋中，置于4℃冰箱低温预处理2d。

3）花药消毒与接种：在无菌条件下，先用无菌水将甘草花蕾冲洗3遍，再用75%酒精浸泡30s，取出用无菌水清洗1~2次，接着放入0.1%HgCl₂中消毒8min或放入2%次氯酸钠中消毒15min，然后取出再用无菌水冲洗 4~5次；从消毒后的花蕾中剥离出花药，接种于固液双层的诱导培养基中，诱导培养基分装于50mL三角瓶中，透气膜封口；花药接种密度为每50mL三角瓶接种40~50个；

固体诱导培养基的成分为：KNO₃1600mg/L，NH₄NO₃1140mg/L，KH₂PO₄ 500mg/L，MgSO₄·7H₂O 120mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，H₃BO₃3.2mg/L，KI 1.0mg/L，MnSO₄·4H₂O 8.1mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.05mg/L，肌醇100mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，烟酰胺1.25mg/L，色氨酸2.5mg/L，脯氨酸30mg/L，水解酪蛋白225mg/L，D-生物素2.0mg/L，TDZ0.02mg/L，6-BA1.0mg/L，NAA2.0mg/L，麦草畏2.0mg/L，植物血凝素3.0mg/L，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸6.0mg/L，番茄伤流液150ml/L，蔗糖60g/L，琼脂6~8g/L，pH值为5.8；液体诱导培养基不含琼脂，其它成分与固体诱导培养基相同。

番茄伤流液的采集方法为：将脱脂棉塞入自封袋中，在距番茄根基2cm处用手术刀片切断茎杆，3min 后用洁净滤纸吸走断茎处的组织液，以防韧皮部汁液的交叉污染，然后迅速将袋子套住茎杆并使茎断面与脱脂棉接触，3~4h后取下袋子，挤压脱脂棉可获得番茄伤流液。

4）愈伤组织诱导培养：将接种的花药先置于黑暗条件下进行25℃暗培养7d，然后转入光照条件下（温度为25℃，光照强度为750lx，光照时间为10h/d）继续培养45d，统计甘草花药愈伤组织诱导频率。

愈伤组织诱导频率（%）＝（产生愈伤组织的花药个数/接种花药个数）×100%

实施例2、麦草畏对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响

麦草畏是一种对环境相对友好的除草剂，其结构和作用类似于2，4-D，在一些植物组织培养研究中发现其对愈伤组织或胚状体的诱导具有一定作用。为了研究麦草畏对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响，我们分别在诱导培养基（除麦草畏外其它成分与实施例1中的相同）中添加0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L的麦草畏，以不添加麦草畏的诱导培养基作为对照，按照实施例1的试验方法将甘草花药分别接种到上述诱导培养基上培养，统计每种培养基上产生愈伤组织的花药数，计算愈伤组织诱导频率。

从表1可以看出，与对照组相比，在添加不同浓度麦草畏的诱导培养基上，两种甘草花药愈伤组织诱导频率均有不同程度的提高，其中添加1.5~2.0mg/L麦草畏的诱导培养基对甘草花药愈伤组织诱导效果更好，在添加2.0mg/L麦草畏的诱导培养基中两种供试材料的愈伤组织诱导频率均达到最高，分别为乌拉尔甘草27.18%，胀果甘草22.46%，平均诱导频率为24.82%，较对照组14.86%的平均诱导频率有显著提高。

实施例3、植物血凝素对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响

植物血凝素是一种在医学方面应用于细胞培养的物质，具有促进细胞分裂和增殖的作用。为了研究植物血凝素对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响，我们分别在诱导培养基（除植物血凝素外其它成分与实施例1中的相同）中添加1.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L、7.0mg/L、9.0mg/L的植物血凝素，以不添加植物血凝素的诱导培养基作为对照，按照实施例1的试验方法将甘草花药分别接种到上述诱导培养基上培养，统计每种培养基上产生愈伤组织的花药数，计算愈伤组织诱导频率。

从表 2可以看出，与对照组相比，在添加1.0~5.0mg/L植物血凝素的诱导培养基上，两种甘草花药愈伤组织诱导频率增加较为显著，其中在添加3.0mg/L麦草畏的诱导培养基中两种供试材料的愈伤组织诱导频率均达到最高，分别为乌拉尔甘草27.30%，胀果甘草22.39%，平均诱导频率为24.85%，较对照组13.60%的平均诱导频率有显著提高。在添加7.0mg/L植物血凝素的诱导培养基上，两种甘草花药愈伤组织诱导频率与对照组接近，而在添加9.0mg/L植物血凝素的诱导培养基上，两种甘草花药愈伤组织诱导频率已经低于对照组，说明植物血凝素的浓度过高不利于甘草花药完成脱分化过程形成愈伤组织。

实施例4、番茄伤流液对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响

植物伤流液是从植物茎的基部把茎切断，由于根压作用从切口溢出的液体。植物伤流液的成分复杂，有植物土壤中吸收的大量水分、矿质元素，植物根系合成的蛋白质、氨基酸、可溶性糖等，还存在一些植物激素。番茄伤流液是一种比较容易采集的植物伤流液，为了研究番茄伤流液对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响，我们分别在诱导培养基（（除番茄伤流液外其它成分与实施例1中的相同））中添加50ml/L、100ml/L、150ml/L、200ml/L、250ml/L的麦草畏，以不添加麦草畏的诱导培养基作为对照，参照实施例1的方法将甘草花药分别接种到上述诱导培养基上培养，统计每种培养基上产生愈伤组织的花药数，计算愈伤组织诱导频率。

从表3可以看出，与对照组相比，在添加不同浓度番茄伤流液的诱导培养基上，两种甘草花药愈伤组织诱导频率均有不同程度的提高，其中添加150ml/L番茄伤流液的诱导培养基对甘草花药愈伤组织诱导效果更好，两种供试材料的愈伤组织诱导频率均达到最高，分别为乌拉尔甘草27.23%，胀果甘草22.50%，平均诱导频率为24.87%，较对照组16.92%的平均诱导频率有显著提高。

实施例5、不同诱导培养基对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响

为了比较不同诱导培养基对甘草花药愈伤组织诱导频率的影响，我们根据苟克俭、任茜《甘草花药培养中愈伤组织诱导和芽再生植株》的研究结果制备了一种诱导培养基：MS +BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+NAA5.0mg/L+蔗糖15%，此培养基为液体培养基，参照实施例1的方法将甘草花药接种到该诱导培养基上培养，统计产生愈伤组织的花药数，计算愈伤组织诱导频率，与实施例1的结果进行比较。

从表4可以看出，在试验材料和试验方法相同的条件下，不同诱导培养基对甘草花药愈伤组织的诱导频率差异显著，采用本发明的诱导培养基，两种供试材料愈伤组织的平均诱导频率为24.84%，采用前人研究的诱导培养基，平均诱导频率仅为7.96%。之所以产生这样的效果，是因为本发明的诱导培养基成分经过了大量试验优化。本发明的诱导培养基调整了基本元素的浓度，使其更适合于甘草花药培养，植物激素选择了TDZ、6-BA、NAA进行复配，还添加了烟酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白、D-生物素、麦草畏、植物血凝素、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、番茄伤流液，可有效地提高甘草花药愈伤组织的诱导频率。此外本发明的诱导培养基为固液双层，与单纯的液体培养基相比能够更好地解决营养与通气的矛盾，更利于花药愈伤组织的诱导。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述甘草品种为乌拉尔甘草和胀果甘草。

3.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤1）中花蕾染色的具体方法为：将花蕾放于烧杯中，加入适量的卡诺氏固定液，在室温下固定24h，用镊子从固定处理的花蕾中剥离出花药放在载玻片上，用刀片将花药切割开来，滴一滴醋酸洋红染色液，加盖盖玻片适当的用力挤压出花粉，在显微镜下观察花粉小孢子所处的发育时期。

4.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤2）中固体诱导培养基的成分为：KNO₃1500~1700mg/L，NH₄NO₃1080~1200mg/L，KH₂PO₄ 470~530mg/L，MgSO₄·7H₂O 100~140mg/L，CaCl₂·2H₂O 130~170mg/L，Na₂-EDTA 37~38mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.4~28.2mg/L，H₃BO₃ 3.0~3.4mg/L，KI 0.8~1.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 7.8~8.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.7~3.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.04~0.06mg/L，肌醇90~110mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，盐酸硫胺素0.9~1.1mg/L，烟酰胺1.0~1.5mg/L，色氨酸2.0~3.0mg/L，脯氨酸25~35mg/L，水解酪蛋白200~250mg/L，D-生物素1.7~2.3mg/L，TDZ 0.01~0.03mg/L，6-BA 0.9~1.1mg/L，NAA1.8~2.2mg/L，麦草畏1.7~2.3mg/L，植物血凝素2.5~3.5mg/L，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸5.0~7.0mg/L，番茄伤流液130~170ml/L，蔗糖56~64g/L，琼脂6~8g/L，pH值为5.6~6.0。

5.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤2）中液体诱导培养基不含琼脂，其它成分与固体诱导培养基相同。

6.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤2）中花药的接种密度为每50mL三角瓶接种40~50个花药。

7.根据权利要求1所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤4）中暗培养的温度为24~26℃；光照培养的温度为24~26℃，光照强度为500~1000lx，光照时间为8~12h/d。

8.根据权利要求4所述的一种甘草花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述固体和液体诱导培养基的成分中，番茄伤流液的采集方法为：将脱脂棉塞入自封袋中，在距番茄根基2cm处用手术刀片切断茎杆，3min 后用洁净滤纸吸走断茎处的组织液，以防韧皮部汁液的交叉污染，然后迅速将袋子套住茎杆并使茎断面与脱脂棉接触，3~4h后取下袋子，挤压脱脂棉可获得番茄伤流液。