CN105875414A - 一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法 - Google Patents

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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明公开了一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，步骤包括：A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种；B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；D、花梗腋芽的诱导，在诱导腋芽形成的培养基中进行诱导；E、类原球体的诱导；F、类原球体的增殖；G、芽体的分化、壮苗及生根；本发明通过在蝴蝶兰类原球茎体的诱导和增殖中关键阶段运用适当的操作工艺，从而达到快速诱导、增殖和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了的蝴蝶兰品种的类原球茎体，通过类原球茎体的快速增殖从而达到蝴蝶兰试管苗工厂化生产的开展。

Description

一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法
技术领域
本发明涉及植物栽培及育苗技术领域，尤其涉及一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法。
背景技术
蝴蝶兰（Phalaenopsis）属兰科多年生植物，是世界上栽培最广泛、最普及的洋兰品种之一，由于其花大、色艳，开花期长达2~3个月，而素有“洋兰皇后”的美称。随着近年来蝴蝶兰价格的降低，蝴蝶兰更是成为普通市民年宵花优选的盆花之一，销量逐年增加。随着蝴蝶兰品种的普及，市场对花色、品质的要求越来越高，后代分离严重的播种苗已开始退出市场，代之的是高品质的、花色统一的无性苗。近几年来流行和畅销的品种有“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“火鸟”、“红龙”、“超群9号”等，而这些品种无一不是通过花梗诱导而成的组培苗栽培形成的。
通过花梗诱导侧芽萌发，再通过侧芽繁殖组培苗的方法有两种途径。一是通过侧芽诱导丛生芽生产，再通过芽生芽的方式进行增殖，从而达到快繁的目的；二是通过花梗侧芽或叶片诱导类原球茎体（Protocorm-like bodies，简称PLB）发生，再经类原球茎体的增殖、分化成苗，从而达到快繁的目的。通过芽生芽的方式繁殖速度较慢，且基部产生的褐化物质较多，制约着蝴蝶兰无性繁殖速度；以无菌苗叶片作为外植体材料诱导类原球茎体的途径，在生产实际中也存在着一些技术难题，一是不同品种诱导类原球茎体的难易程度不同，某些品种的叶片较易诱导类原球茎体，而某些品种很难诱导；二是类原球茎体在生长过程中极易形成单个芽体从而影响增殖速度；三是产生褐化组织较多，抑制培养体的生产速度甚至使之死亡。由于这些问题的存在，极大地制约了蝴蝶兰组培苗无性繁殖速度，从而影响种苗工厂化生产的进程。
发明内容
本发明旨在提供一种操作简单，产生经济价值高的紫香兰组培快繁方法。
本发明目的通过以下技术方案来予以实现：
一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，步骤包括：
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括：“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“富乐夕阳”、“沙拉黄金”、“小白兔”等品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导，在诱导腋芽形成的培养基中进行诱导；
E．类原球体的诱导；
F．类原球体的增殖；
G、芽体的分化、壮苗及生根；
所述步骤D具体包括；
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟；在洁净工作台上，用刀片小心去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位；将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动；然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟；后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上；每瓶1个茎段；
（3）培养条件：前7~14 d黑暗培养，温度24 ~26℃；10 d后，光强提到12.5~18.75μmol•m-2•s-1，继续培养20~30 d；
所述步骤G具体为：当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10% +马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%；pH值为5.4~5.6；每30~40 d继代培养一次；所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养；当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中；不达标的植株在分化培养基中继续培养；培养条件为：光照强度31.25~37.5μmol•m-2•s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃；生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
所述步骤E具体为：当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点以下0~0.2cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生；去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：前7~14天黑暗培养；待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到5~12.5μmol•m-2•s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~26℃；培养周期20~25天；所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15天左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5~10 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害；如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
所述步骤F具体为：当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中，所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎体；培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
所述一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L+椰子水50~150ml/L+白糖25g/L。
所述二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT 0.5~3 mg/L+NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。
本发明的有益效果：在花梗芽诱导形成后或在类原球体形成后，切割位置位于生长点部位，目的是破坏具有顶端优势的生长点组织，促使生长点周围幼嫩组织细胞增殖，从而诱导新的或更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。蝴蝶兰丛生芽或类原球茎体在诱导阶段和增殖阶段均易于产生褐化组织，通过前期暗培养和快速变换芽体或类原球茎体位置的方法，有利于减少褐化物质的产生，避免芽体或类原球茎体受到褐化物质的浸害。
本发明通过在蝴蝶兰类原球茎体的诱导和增殖中关键阶段运用适当的操作工艺，从而达到快速诱导、增殖和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了的蝴蝶兰品种的类原球茎体，通过类原球茎体的快速增殖从而达到蝴蝶兰试管苗工厂化生产的开展。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例一
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括：“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“富乐夕阳”、“沙拉黄金”、“小白兔”等品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导：
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小心去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3）培养条件：前7 d黑暗培养，温度24 ~26℃；10 d后，光强提到12.5~18.75μmol·m-2·s-1，继续培养20~30 d；
E．类原球体的诱导：
当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点或以下0cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：前7 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到5μmol•m-2•s-1 ，光照时间12 h·d-1，温度为24~26℃。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
F：原球体的增殖：
当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中，一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎体；培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
G、芽体的分化、壮苗及生根：
当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10%+马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%。pH值为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培养。培养条件为：光照强度31.25~37.5 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
实施例二
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括：“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“富乐夕阳”、“沙拉黄金”、“小白兔”等品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导：
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小心去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3）培养条件：前10 d黑暗培养，温度24 ~26℃；10 d后，光强提到12.5~18.75μmol·m-2·s-1，继续培养20~30 d；
E．类原球体的诱导：
当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点以下0.1cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：前10 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到10 μmol•m-2•s-1 ，光照时间12 h·d-1，温度为24~26℃。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每7 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
F、类原球体的增殖：
当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中，一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L+KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎体；培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
G、芽体的分化、壮苗及生根：
当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10%+马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%。pH值为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培养。培养条件为：光照强度31.25~37.5 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
实施案例三
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括：“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“富乐夕阳”、“沙拉黄金”、“小白兔”等品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导：
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小心去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。
（3）培养条件：前14 d黑暗培养，温度24 ~26℃；10 d后，光强提到12.5~18.75μmol·m-2·s-1，继续培养20~30 d；
E．类原球体的诱导：
当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点以下0.2cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：前14 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到12.5μmol•m-2•s-1 ，光照时间12 h·d-1，温度为24~26℃。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每10 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
F、类原球体的增殖：
当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中，一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎体；培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
G、芽体的分化、壮苗及生根：
当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10%+马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%。pH值为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培养。培养条件为：光照强度31.25~37.5 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
对比例1
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括：“大辣椒”、“红太阳”、“内山姑娘”、“富乐夕阳”、“沙拉黄金”、“小白兔”等品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导：
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小心去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3）培养条件，自然光照，温度24 ~26℃；10 d后，光强改为12.5~18.75μmol·m-2·s-1，继续培养20~30 d；
E．类原球体的诱导：
当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点以下3cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：自然光照培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到25μmol•m-2•s-1 ，光照时间12 h·d-1，温度为24~26℃。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
F：原球体的增殖：
当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位以下0cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。当所述增殖培养基表面变色时，将所述类原球茎体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5~7 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害。培养周期30~35 d，如此反复，直到获得足够的类原球茎体。培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
G、芽体的分化、壮苗及生根：
当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10%+马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%。pH值为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培养。培养条件为：光照强度31.25~37.5 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
将以上实施例培养的甁苗1周后移至花盆栽培，通过以下表格对实施例中的结果进行统计和对比如下：
由实施例数据看以看出，经过本发明培养的蝴蝶兰新苗较为健壮，炼苗后成活率高，与对比例相比，实施例1-3与对比例相比有更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生，并且苗成活率较高，所以本发明具有极高的推广价值。
以上所述并非对本新型的技术范围作任何限制，凡依据本发明技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于，步骤包括：
A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种；
B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；
C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；
D、花梗腋芽的诱导，在诱导腋芽形成的培养基中进行诱导；
E．类原球体的诱导；
F．类原球体的增殖；
G、芽体的分化、壮苗及生根；
所述步骤D具体包括；
（1）采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟；用刀片去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成1-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位；将所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动；然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟；后浸入无菌水中备用；
（2）将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上；每瓶1个茎段；
（3）培养条件：前7~14 d黑暗培养，温度24 ~26℃；10 d后，光强提到12.5~18.75μmol•m-2•s-1，继续培养20~30 d；
所述步骤G具体为：当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS + 香蕉泥5~10% +马铃薯泥3~5%+白糖2.5~3%；pH值为5.4~5.6；每30~40 d继代培养一次；所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养；当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中；培养条件为：光照强度31.25~37.5μmol•m-2•s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃；生根苗培养周期50~60d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。
2.根据权利要求1所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于：所述步骤E具体为：当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中心生长点以下0~0.2cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生；去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为：前7~14天黑暗培养；待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到1~12.5μmol•m-2•s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~26℃；培养周期20~25天；所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15天左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5~10 d变换一个区域，以减少所述褐化物质对培养材料的浸害；如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
3.根据权利要求1所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于：所述步骤F具体为：当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中，所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~10 d，之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体；
当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d；
如此反复，直到获得足够的类原球茎体；培养条件为：光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h•d-1，温度为24~28℃。
4.根据权利要求3所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于：所述一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L。
5.根据权利要求3所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于：所述二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。
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