CN104719136B - 楸树组培苗生根培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种楸树组培苗生根培养方法，它按照以下步骤顺序进行：(1)楸树无菌苗的获取；(2)无菌苗的继代；(3)楸树组培苗生根培养；和(4)炼苗与移栽，采用本发明所提供的楸树组培苗生根培养方法，控制扩繁比例为1：3－3.5，控制苗的株高为2.5－4cm后在进行生根培养，生根的比例达90％以上；降低了生产成本，在楸树组培苗生根培养的过程中无菌苗的获取和继代培养使用的是同一种培养基，节省了操作步骤和生产成本，更适于工业化生产。为实验林木组培产业化，简化产业化流程，缩减步骤，控制人工，有利于成本控制，进而促进木本植物组织培养的产业化。本发明适用于楸树组培苗的生根培养。
Description
技术领域
本发明属于植物培植领域，涉及一种植物组织培养的方法，具体涉及一种楸树组培苗生根培养方法。
背景技术
楸树(Catalpa bungei C.A.Meyer)，属紫葳科，梓树属，为落叶乔木，在立地较好的条件下，树高可达30m，胸径达1m以上。但是在繁殖方面，由于楸树雌雄花期不遇，往往自花不育，需人工授粉才能结实，结实出种率很低，种子发芽率不高，实生繁殖较为困难，造成楸树资源相对较少。目前多采用根蘖或嫁接方法生产楸树种苗。随着对楸树采伐利用增多，常规的繁殖不能满足生产对良种苗木的需要，致使出现成材比例严重失调和楸木供不应求的局面，与当前快速发展林业的形势不相适应。探索快繁繁殖楸树的方法来促进和改善楸树繁育和苗木培育状况成为亟待解决的问题。
组织培养是迅速繁殖林木的方法之一，如孟永红等，在《河北林果研究》、报道的“楸树植株再生体系的建立”中，筛选出了楸树不定芽生长及分化的培养基为MS+6－BA0.8mg/L+IBA 0.1mg/L，其最高增殖系数为5。
韩创举等，在《西北林学院学报》报道的“楸树组培技术研究”中，对楸树组培研究表明N6+6－BA 1.5mg/L+NAA 0.0016mg/L是楸树的最佳增殖培养基，最高增殖系数为7.2，该配方基本培养基为N6。
傅玉兰等在《技术开发》报道的“楸树试管丛生芽继代增殖影响因素的研究”中，公开了楸树丛生芽继代增殖最适宜培养基配方是MS+BA 4.0mg/L+IBA 0.5mg/L+PVP 100mg/L+食糖30g/L，最高增殖系数为4.8，且培养周期为35天。
以上关于楸树增殖培养基的研究中，激素配比以细胞分裂素与生长素的组合为主，且研究多停留在理论层面，且组培生根苗需要经过炼苗后才能进行大棚移栽，在工厂化生产过程中，该步骤耗费人工成本大，降低炼苗成本是楸树组培产业化生产又一待解决的难题。
中国发明专利申请CN104054580 A公开了“一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”，包括以下步骤(1)无菌培养物的建立；(2)腋芽的诱导；(3)腋芽的增殖；(4)芽苗的生根培养；(5)炼苗与移栽，五个步骤，该专利申请最佳腋芽诱导配方为MS+BA 0.8mg/L+IBA0.1mg/L；最佳腋芽增殖配方为MS+BA1.5mg/L+ZT O.1mg/L+IAA 0.2mg/L；最高增殖系数为15，该方法虽然获得较高的增殖系数，但其增殖主要通过腋芽诱导和腋芽增殖两步实现，若进行工厂化生产，该方法步骤繁琐，人工成本大，不利于大规模的工厂化生产。
在楸树工厂化生产过程中，不仅要保证扩繁比例，还需确保可用于生根种苗比例，而现有文件报道大都仅限于理论水平，生根材料需要从扩繁苗中筛选，可用于生根种苗比例极低，难以满足产业化生产要求。
因此，建立一种操作过程简单，周期短，增殖系数稳定，成本低，扩繁比例和可用于生根种苗比例均符合楸树组培产业化生产即能在短期内为生产提供大量正常健康的楸树无菌组培苗方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种楸树组培苗生根培养的方法，该培养方法所得增殖系数稳定，周期短，操作过程简单，能有效降低人工成本，利于大规模的工厂化生产。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种楸树组培苗生根培养方法，它按照以下步骤顺序进行：
(1)楸树无菌苗的获取
选取带芽点的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发出来后切割成2～3cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面， 用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05％的升汞处理6～9min，用无菌水冲洗5次，接种至培养基A中，每瓶接种2株，获得楸树无菌苗；
(2)无菌苗的继代
选取生长周期为26～30天，生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，利用顶芽、茎段及基部丛生芽进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1cm，至少含一个腋芽，基部愈伤组织含2～4个小芽，继续转接至培养基A中，培养26～30天后，即可得用于生根的楸树组培苗进行生根培养或者用于继续继代的楸树组培苗；
(3)楸树组培苗生根培养
选取步骤(2)增殖培养中高度为2.5～4cm的楸树组培苗，保留3片以上展开的大叶，基部叶柄贴茎杆切除，同时将展开的腋芽切除，切口以下留出1mm的茎杆，接种至生根培养基中，切口部位没入培养基B中，培养25～28天，即得楸树生根苗；所得的楸树生根苗的生根率为90～98％。
(4)炼苗与移栽
将楸树生根苗根系上的培养基洗净，种植于含有营养基C的营养杯或穴盘中，湿度为80％～90％，待新根及新叶发出后接膜通风，培养45～60天，即得楸树大棚生根苗。所得的楸树大棚生根苗的成活率为90～95％。
作为本发明的一种限定，所述步骤(2)中的楸树组培苗的培养条件为：光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度3000勒克斯，温度为25℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为20℃。
作为本发明的另一种限定，所述步骤(2)中的培养基A包括：以MS为基础培养基，添加浓度为30g/L的蔗糖，浓度为5.8g/L的琼脂，浓度为0.05～0.2mg/L的6－BA、浓度为0.01～0.05mg/L的TDZ，调节pH为5.8～6.0。
作为本发明的第三种限定，所述步骤(3)中的培养基B包括：以MS1/2为基础培养基，添加浓度为0.3～1.5mg/L的IBA，15～30g/L蔗糖和浓度为5.8g/L的琼脂，pH调节至5.5～5.8。
本发明还有一种限定，所述步骤(4)中的营养基C包括两层，其中下层2/3容量为体积比为菜园土：珍珠岩：蛭石：草炭＝2：2：1：1混合的营养基，上层1/3为体积比为蛭石：珍珠岩＝1：1的营养基。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
采用本发明所提供的楸树组培苗生根培养方法，控制扩繁比例为1：3－3.5，控制苗的株高为2.5－4cm后在进行生根培养，生根的比例达90％以上；降低了生产成本，工厂化生产的可生根苗数量与可扩繁苗数量比值应大于0.75。
在楸树组培苗生根培养的过程中无菌苗的获取和继代培养使用的是同一种培养基，节省了操作步骤和生产成本，更适于工业化生产。为实验林木组培产业化，简化产业化流程，缩减步骤，控制人工，有利于成本控制，进而促进木本植物组织培养的产业化。
本发明适用于楸树组培苗的生根培养。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1楸树组培苗生根培养方法的流程框图。
具体实施方式
实施例1一种楸树组培苗生根培养方法
一种楸树组培苗生根培养方法，如图1所示，它按照以下步骤顺序进行：
(1)楸树无菌苗的获取
选取带芽点的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发出来后切割成2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5h；在超净工作台上，用0.05％的升汞处理6min，用无菌水冲洗5次，接种至培养基A中，每瓶接种2株，获得楸树无菌苗；
(2)无菌苗的继代
选取生长周期为26天，生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，利用顶芽、茎 段及基部丛生芽进行繁殖，其中顶芽高1.0cm、茎段高0.5cm，至少含一个腋芽，基部愈伤组织含2个小芽，继续转接至培养基A(培养基A包括：以MS为基础培养基，添加浓度为30g/L的蔗糖，浓度为5.8g/L的琼脂，浓度为0.1mg/L的6－BA、浓度为0.02mg/L的TDZ，调节pH为6.0)中培养(培养条件为：光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度3000勒克斯，温度为25℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为20℃)培养26天后，即可得用于生根的楸树组培苗进行生根培养或者用于继续继代的楸树组培苗；
(3)楸树组培苗生根培养
选取步骤(2)增殖培养中高度为2.5cm的楸树组培苗，保留3片以上展开的大叶，基部叶柄贴茎杆切除，同时将展开的腋芽切除，切口以下留出1mm的茎杆，接种至生根培养基中，切口部位没入培养基B(培养基B包括：以MS1/2为基础培养基，添加浓度为1.5mg/L的IBA，20g/L蔗糖和浓度为5.8g/L的琼脂，pH调节至5.5。)中，培养26天，即得楸树生根苗，生根率为94％；
(4)炼苗与移栽
将楸树生根苗根系上的培养基洗净，种植于含有营养基C(营养基C包括两层，其中下层2/3容量为体积比为菜园土：珍珠岩：蛭石：草炭＝2：2：1：1混合的营养基，上层1/3为体积比为蛭石：珍珠岩＝1：1的营养基。)的营养杯或穴盘中，湿度为80％，待新根及新叶发出后接膜通风，培养45天，即得楸树大棚生根苗，成活率为93％。
实施例2－6楸树组培苗生根培养方法
实施例2－6分别为一种楸树组培苗生根培养的方法，其培养方法中所涉及的步骤与实施例1相似，不同之处仅在于其中所涉及的技术参数的差别，具体如下表所示：
实施例2－6中培养基A以MS为基础培养基，还添加的组成如下所示：
实施例2－6中培养基B以1/2MS为基础培养基，还添加的组成如下所示：
实施例7培养基A和B的筛选
(1)培养基A的筛选
由于无菌苗的筛选和继代培养中使用的是同一种培养基，所以对培养基A的筛选尤为重要，以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L，琼脂5.8g/L，选择了不 同的营养成分，但是并非所有的生长促进剂都能够促进楸树的生长，具体如下表所示：
由上表可知，使用不同的生长促进剂进行培养，最终所培养出的苗株的苗株高、增值比例和表现出的现象均不相同，说明并不是使用所有的生长促进剂进行培养均能够具有好的效果，其中，使用6－BA(6－苄基腺嘌呤)和TDZ(噻苯隆)组合，苗株高和增值比例均较其它生长促进剂高，并且植株分化率高，植株平均株高高，高矮一致，用于生根培养的植株数量较多，利于后期生根培养。后又对其使用浓度进行了筛选，具体过程如下所示：
注：上表所示增值比例1为茎段的增值比例；增值比例2为顶芽的增值比例。
由上表可知，采用6－BA(6－苄基腺嘌呤)和TDZ(噻苯隆)为生长促进剂，在不同浓度下进行培养，每种浓度的培养基接种20瓶，每瓶接种5株，实验重复三次，培养28天后统计增殖比例及生长情况，结果显示，使用浓度为0.05～0.2mg/L的6－BA和浓度为0.01～0.05mg/L的TDZ所培养的楸树组培苗，分化率高，增值比例高，生长健壮，一瓶苗中可用于生根培养的植株数量较多，节约成本，利于组培苗工厂化的生产。
(2)培养基B的筛选
对培养基B的筛选，首先对基础培养基进行了筛选，具体如下表所示：
注：1/2MS为MS基础培养基中大量元素减半，其余元素不变所得；MS1/2为MS基础培养基中所有物质的量均减半所得。
由上表可知，以MS1/2为基本培养基进行生根培养时，植株生根率高，根系健壮，利于后期大棚移栽。后又对其选用的生长促进剂IBA的浓度进行了筛选，具体过程如下所示：
由上表可知，选择了不同的浓度的IBA进行培养，但是并非所有浓度的IBA都能够促进楸树的生根，以MS1/2为基础培养基，添加浓度为5.8g/L的琼脂和15～30g/L蔗糖的琼脂，每个处理接种100株，3次重复，结果显示IBA的浓度为0.3～1.5mg/L时，生根率为90～98％，现象为植株生长健壮，根系数量多，根系长度长，大棚移栽成活率高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种楸树组培苗生根培养方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
(1)楸树无菌苗的获取
选取带芽点的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发出来后切割成2～3cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05％的升汞处理6～9min，用无菌水冲洗5次，接种至培养基A中，每瓶接种2株，获得楸树无菌苗；
(2)无菌苗的继代
选取生长周期为26～30天，生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，利用顶芽、茎段及基部愈伤组织含有的小芽进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1cm，至少含一个腋芽，基部愈伤组织含2～4个小芽，继续转接至培养基A中，培养26～30天后，即可得用于生根的楸树组培苗进行生根培养或者用于继续继代的楸树组培苗；培养基A包括：以MS为基础培养基，添加浓度为30g/L的蔗糖，浓度为5.8g/L的琼脂，浓度为0.05～0.2mg/L的6-BA、浓度为0.01～0.05mg/L的TDZ，调节pH为5.8～6.0；
(3)楸树组培苗生根培养
选取步骤(2)继代培养中高度为2.5～4cm的楸树组培苗，保留3片以上展开的大叶，基部叶柄贴茎杆切除，同时将展开的腋芽切除，切口以下留出1mm的茎杆，接种至生根培养基中，切口部位没入培养基B中，培养25～28天，即得楸树生根苗；所述培养基B包括：以MS1/2为基础培养基，添加浓度为0.3～1.5mg/L的IBA，15～30g/L蔗糖和浓度为5.8g/L的琼脂，pH调节至5.5～5.8；
(4)炼苗与移栽
将楸树生根苗根系上的培养基洗净，种植于含有营养基C的营养杯或穴盘中，湿度为80～90％，待新根及新叶发出后接膜通风，培养45～60天，即得楸树大棚生根苗；所述营养基C包括两层，其中下层2/3容量为体积比为菜园土：珍珠岩：蛭石：草炭＝2:2:1:1混合的营养基,上层1/3为体积比为蛭石：珍珠岩＝1:1的营养基。
2.根据权利要求1所述的楸树组培苗生根培养方法，其特征在于所述步骤(2)中的楸树组培苗的培养条件为：光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度3000勒克斯，温度为25℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为20℃。
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