CN115968789B - 一种金线莲种子消毒与无菌播种培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金线莲种子消毒与无菌播种培养的方法，包含蒴果采收和种子消毒及种子无菌播种培养两部分。所述的蒴果采收和种子消毒是在蒴果饱满刚出现开裂的时候采收蒴果，刮除蒴果表面的微绒毛及杂质，经无菌水、75%酒精擦洗蒴果表面后，将金线莲种子放入2mL无菌的离心管，经0.1%升汞消毒，10000rpm离心收集种子，再无菌水清洗种子，10000rpm离心收集种子；所述的种子无菌播种培养是取种子平铺于本发明的萌发培养基进行萌发培养。按本发明的方法采收蒴果可以确保种子成熟度高，采用的消毒方法能获得高的消毒成功率；将消毒的种子播种于萌发培养基，种子萌发率达90%以上。
Description
技术领域
本发明属于农业科技领域，具体涉及一种金线莲种子消毒与无菌播种培养的方法。
背景技术
金线莲（Anoectochilus roburghii(Wall.) Lindl）是兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus）多年生草本植物，在民间素有“金草”、“神药”、“药中之王”等美称，具有保肝、降血压、降血糖、改善骨质疏松、抗肿瘤、提高免疫力等作用。金线莲种子细小，胚发育不完全，在自然环境中需要与真菌共生才能萌发，萌发率很低，通过无菌播种可以提高种子的萌发率。金线莲种子的成熟度对无菌播种的萌发率和萌发时间存在很大的影响。蒴果采收时间比较难把握，蒴果成熟度不够，种子萌发率低且萌发时间长，蒴果成熟度过高，果皮变薄，极易破裂，消毒成功率低。培养基成分对金线莲种子的萌发率和萌发时间也存在很大的影响。
发明内容
本发明针对所要解决的技术问题是提供一种容易把握的蒴果采收时间和消毒成功率高的种子消毒方法与一种改良的MS基本培养基配方，解决蒴果采收时间比较难把握的问题，提高种子的萌发率和缩短萌发时间。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案，包含蒴果采收和种子消毒及种子无菌播种两部分，其操作包括以下步骤：
（1）蒴果采收和种子消毒
A．蒴果的采收：人工授粉30天后，注意观察蒴果的颜色和形态，发现蒴果饱满刚出现开裂的时候采收；
B．蒴果的处理：轻轻刮除蒴果表面的微绒毛及杂质，用无菌水轻轻擦洗3遍，再用75%酒精擦洗3遍；
C．种子消毒：在超净工作台上，用无菌手术刀切开蒴果的表皮，将金线莲种子放入2mL无菌的离心管，加入质量体积比为0.1%的升汞1.5mL，消毒8分钟，10000rpm离心2分钟，弃升汞；加入无菌水1.5mL清洗种子1分钟，10000rpm离心2分钟，重复5遍，取种子用于组培播种。
（2）种子无菌播种
A．改良MS基本培养基：用(NH4)2SO4代替NH4NO3，浓度为600mg/L，KNO3和MgSO4.7H2O浓度调整为900 mg/L和170 mg/L，其它成分浓度保持不变，具体包括：400 mg/L CaCl2、27.8 mg/L FeSO4.7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA、22.3 mg/L MnSO4.H2O、8.6 mg/LZnSO4.7H2O、6.2 mg/L H3BO3、0.025 mg/L CuSO4.5H2O、0.25 mg/L Na2MoO4.2H2O、0.025 mg/L CoCl2.6H2O、0.83 mg/L KI、100 mg/L肌醇、0.1 mg/L盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆醇、0.5 mg/L烟酸、2 mg/L甘氨酸。
B．萌发培养基：改良MS基本培养基+琼脂5g/L+蔗糖30 g/L；生根培养基：改良MS基本培养基+NAA1mg/L+香蕉泥10%+琼脂5g/L+蔗糖20 g/L；pH值调整为5.6，分装后高压灭菌。
C．种子播种与继代培养：取消毒的种子，在超净工作台上平铺于萌发培养基，在温度26±2℃，光照5000LX，光照时间12小时条件下培养。培养30d后种子开始萌发，萌发率达90%以上。种子萌发后继续培养2个月，将萌发小苗转入萌发培养基继代培养，培养3个月后小苗高2cm以上，转入生根培养基培养。
本发明的显著优点在于：本发明在蒴果刚出现开裂时采收，采收时间容易把握，确保种子的成熟度高，结合使用本发明的种子消毒方法，解决了种子细小，消毒成功率低的问题。本发明采收消毒的种子，利用本发明的萌发培养基进行无菌播种，能显著提高种子的萌发率，萌发率达90%以上，获得的无菌小苗粗壮。
附图说明
图1为本发明方法的金线莲播种、种子萌发、继代培养和生根培养4个阶段的照片。
具体实施方法
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
（1）蒴果采收和种子消毒
A．蒴果的采收：人工授粉30天后，注意观察蒴果的颜色和形态，发现蒴果饱满刚出现开裂的时候采收；
B．蒴果的处理：轻轻刮除蒴果表面的微绒毛及杂质，用无菌水轻轻擦洗3遍，再用75%酒精擦洗3遍；
C．种子消毒：在超净工作台上，用无菌手术刀切开蒴果的表皮，将金线莲种子放入2mL无菌的离心管，加入质量体积比为0.1%的升汞1.5mL，消毒8分钟，10000rpm离心2分钟，弃升汞；加入无菌水1.5mL清洗种子1分钟，10000rpm离心2分钟，重复5遍，取种子用于组培播种。
（2）种子无菌播种
A．改良MS基本培养基：用(NH4)2SO4代替NH4NO3，浓度为600mg/L，KNO3和MgSO4.7H2O浓度调整为900 mg/L和170 mg/L，其它成分浓度保持不变。
B．萌发培养基：改良MS基本培养基+琼脂5g/L+蔗糖30 g/L；生根培养基：改良MS基本培养基+NAA1mg/L+香蕉泥10%+琼脂5g/L+蔗糖20 g/L；pH值调整为5.6，分装后高压灭菌。
C．种子播种与继代培养：取消毒的种子，在超净工作台上平铺于萌发培养基，在温度26±2℃，光照5000LX，光照时间12小时条件下培养。培养30d后种子开始萌发，萌发率达90%以上。种子萌发后继续培养2个月，将萌发小苗转入萌发培养基继代培养，培养3个月后小苗高2cm以上，转入生根培养基培养。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1.一种金线莲种子消毒与无菌播种培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）蒴果采收和种子消毒
A．蒴果的采收和处理；
B．种子消毒：用无菌手术刀切开蒴果的表皮，将金线莲种子放入离心管，加入质量体积比为0.1%的升汞1.5mL，消毒8分钟，10000rpm离心2分钟，弃升汞；加入无菌水1.5mL清洗种子1分钟，10000rpm离心2分钟，重复5遍，取种子用于组培播种；
（2）种子无菌播种
A．改良MS基本培养基：用(NH4)2SO4代替NH4NO3，浓度为600mg/L，KNO3和MgSO4.7H2O浓度调整为900 mg/L和170 mg/L，其它成分浓度保持不变；
B．萌发培养基：改良MS基本培养基+琼脂5g/L+蔗糖30 g/L；生根培养基：改良MS基本培养基+NAA1mg/L+香蕉泥10%+琼脂5g/L+蔗糖20 g/L，pH值调整为5.6，分装后高压灭菌；
C．种子播种与继代培养：取步骤（1）的种子，平铺于萌发培养基进行培养，培养30d后种子开始萌发，种子萌发后继续培养2个月，将萌发小苗转入萌发培养基继代培养，培养3个月后小苗高2cm以上，转入生根培养基培养；
步骤（1）中蒴果的采收和处理具体为：人工授粉30天后，注意观察蒴果的颜色和形态，发现蒴果饱满刚出现开裂的时候采收；然后轻轻刮除蒴果表面的微绒毛及杂质，用无菌水轻轻擦洗3遍，再用75%酒精擦洗3遍；
步骤（2）中在萌发培养基进行培养的条件为：在温度26±2℃，光照5000LX，光照时间12小时条件下培养。
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