CN114885841B - 利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法 - Google Patents

利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物细胞工程领域，涉及利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法。以水角(Hydrocera triflora(L.)Wight.et Arn)幼嫩叶片为外植体，通过诱导胚性愈伤组织途径建立水角植株再生和快繁体系。包括：外植体的选取与消毒、胚性愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖和再生植株生根。通过综合比较不同激素种类及组合等对胚性愈伤组织诱导率、不定芽诱导率及增殖系数和生长状态的影响，优选到水角诱导胚性愈伤组织、植株再生和快繁的系列培养基。本发明为遗传转化改良水角性状提供了基础，提高了水角不定芽的增殖效率，可用于水角组培苗的工厂化生产。

Description

利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快 繁的方法
技术领域
本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体涉及利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法。
背景技术
水角(Hydrocera triflora(L.)Wight.et Arn)属于凤仙花科水角属的单种属多年生水生草本植物，主要生长在沼泽地、湖边、水稻田中。水角花期长，在海南条件下，一年中有10个月在开花，其花色鲜丽，具有较高的观赏价值。水角属于濒危的国家二级保存水生植物，在国内仅分布于海南省的极少数区域中。由于水角耐旱性极差，其原生态环境常受到人为或气候影响，导致其种群数量极其稀少。申请人所在的研究团队期望利用植物细胞工程和转基因工程技术来培育出耐旱的水角新品种。
现有技术中，水角的离体培养技术是以水角的种子和茎段诱导出不定芽，对不定芽进行增殖培养，再进行生根培养。王景飞等(2019)以水角的茎段和种子为外植体，经常规消毒后，接种于芽诱导培养基中获得不定芽，在优化的增殖培养基培养30天后，获得不定芽的最大增殖系数为6.8(王景飞等，濒危水生植物水角的离体培养技术；江苏农业科学，2019，47(3):110-113)。上述技术尚未能通过愈伤组织的途径来建立水角再生体系，因而很难通过遗传转化技术来达到改良水角耐旱性状的目的。
发明内容
本发明的目的提供利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法，为利用遗传转化技术来改良水角耐旱性状提供基础。同时，该方法的不定芽增殖系数比现有报道的增加近1倍，且不定芽增殖的培养时间比现有报道缩短一半，对促进水角组培苗工厂化生产提供了技术支撑。
本发明的技术方案如下所述：
一种利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选取与消毒
于连续2个晴朗的天气取野外水角的幼嫩叶片，自来水冲洗30分钟，滤纸吸干，再用70％酒精消毒20秒，市售5％的蓝月亮牌漂白水(有效氯≥40g/L)消毒5分钟，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干。
(2)胚性愈伤组织的诱导
将消毒好的叶片切成0.5厘米×0.5厘米方块，接种至胚性愈伤组织诱导培养中，黑暗条件下培养30天后，培养温度为25℃±2℃，从水角叶片中诱导出胚性愈伤组织。
(3)不定芽的诱导
将步骤(2)获得的胚性愈伤组织接到至不定芽诱导培养基中，光照条件下培养30天后，胚性愈伤组织分化出不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h/8h黑暗。
(4)不定芽的增殖培养
将步骤(3)不定芽连同愈伤组织块一起转移至新的不定芽诱导培养基中，光照条件下培养15天，形成丛生芽；将水角丛生芽切割成含3-5个不定芽的小块，接种至不定芽增殖培养基中光照条件下培养15天后，得到增殖的不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx，光周期为16h光照/8h黑暗。
(5)不定芽的生根培养
将步骤(4)健壮不定芽切下，接种至生根培养基培养中光照培养条件下25-30天；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h光照/8h黑暗。
上述植株再生和快繁的体系中的培养基如下所述：
培养基成分及其配比如下：
1)叶片胚性愈伤组织诱导培养基：MS，附加NAA 2mg/L，6-BA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
2)不定芽诱导培养基：MS，附加6-BA 5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
3)不定芽增殖培养基：MS，附加6-BA3mg/L，NAA0.1mg/L，蔗糖30g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
4)生根培养基：MS，附加NAA 0.5mg/L,蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
申请人提供了利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法的专用培养基，该专用培养基的配比及其制备方法包括：
1)叶片胚性愈伤组织诱导培养基：MS，附加NAA 2mg/L，6-BA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
2)不定芽诱导培养基：MS，附加6-BA5 mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
3)不定芽增殖培养基：MS，附加6-BA 3mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
4)生根培养基：MS，附加NAA 0.5mg/L,蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
本发明培养基采用常规高温蒸汽(121℃)灭菌，灭菌20min后使用。
本发明的积极效果是：
(1)本发明是通过诱导水角胚性愈伤组织的途径来建立水角植株再生和快繁体系，为通过转基因技术来改良水角性状提供了基础。
(2)与现有技术相比，本发明的方法在不定芽的增殖培养效率得到显著改良，不定芽增殖系数达到12.2，且培养时间为15天，对水角组培苗工厂化生产和恢复水角这一濒危水生植物种群数量提供技术支撑。
附图说明
图1：本发明的一个实施例从水角叶片诱导出的胚性愈伤组织。附图标记说明：图1中的A图是水角胚性愈伤组织，外观为红色，结构紧密，表面有颗粒状突起；图1中的B图是水角非胚性愈伤组织，外观为白色，结构疏松。
图2：本发明的一个实施例从水角的胚性愈伤组织中分化出不定芽。
图3：本发明的一个实施例从水角的不定芽形成丛生芽。
图4：本发明的一个实施例水角不定芽增殖培养。
图5：本发明的一个实施例水角再生植株的生根培养
图6：本发明的一个实施例移栽25天的水角再生植株。
具体实施方式
实施例1：
本实施例提供了利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法。具体步骤如下所述：
(1)外植体的选取与消毒
于连续2个晴朗天气的条件下在海南省海口市龙华区遵谭镇将军山周边的沼泽地中采集水角幼嫩叶片，用自来水冲洗30分钟，滤纸吸干，再用70％酒精消毒20秒，市售5％的蓝月亮牌漂白水(有效氯≥40g/L)消毒5分钟，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干。
(2)胚性愈伤组织的诱导
将上述消毒后的水角叶片于超净工作台中切成0.5厘米×0.5厘米的方块，分别接种于不同激素组合的诱导愈伤组织培养基中(表1)，每皿接种30-33个外植体，每处理重复3次。胚性愈伤组织诱导培养基除了激素存在差异外，其他组分均相同，即以MS培养基(Murashige和Skoog，1962)为基础培养基，附加蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。25℃黑暗条件下培养30天后，统计不同培养基的愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率。计算公式：愈伤组织诱导率％＝分化愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100；胚性愈伤组织诱导率％＝分化胚性愈伤组织的外植体数量/接种的外植体数量×100。结果见表1。
由表1和图1可知，在诱导愈伤组织培养基中，水角叶片会分化出两种类型的愈伤组织：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。其中胚性愈伤组织的外观表现为红色、结构紧密、表面有颗粒状突起(图1中的A图)；非胚性愈伤组织的外观表现为白色、结构疏松(图1中的B图)。只有胚性愈伤组织才具有分化不定芽能力。
由表1可知，不同激素种类及组合对水角叶片胚性愈伤组织诱导率存在显著的差异。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-苄基氨基嘌呤)组合、NAA(萘乙酸)和KT(激动素)组合均能诱导出水角叶片愈伤组织，但均为非胚性愈伤组织，未能获得胚性愈伤组织。只有NAA和6-BA组合才能诱导出胚性愈伤组织，其中当NAA浓度为2mg/L与6-BA浓度为0.1mg/L的组合时胚性愈伤组织诱导率达到68.3％，显著高于其他处理。这些结果表明NAA2mg/L和6-BA0.1mg/L的组合为诱导水角叶片胚性愈伤组织的最佳组合。
优选地，本发明的水角叶片胚性愈伤组织诱导最佳培养基为：MS，附加NAA 2mg/L，6-BA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
表1培养基中不同植物激素种类及组合对诱导水角胚性愈伤组织的影响
Figure BDA0003694364560000041
Figure BDA0003694364560000051
注：同列不同小写字母表示在5％水平上差异显著。
3、不定芽的诱导
将上述水角非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织分别接种于水角不定芽诱导培养基中(表2)，每处理接种30块愈伤组织，每处理重复3次。培养温度为25℃，光照强度为2000lx。培养30天后，统计不同培养基的不定芽率诱导率。计算公式：不定芽率诱导率％＝发生不定芽的愈伤组织块数量/接种的愈伤组织块数量×100。结果见表2。
由表2可知，水角非胚性愈伤组织在诱导不定芽培养基中不能分化出不定芽，而只有胚性愈伤组织才具有分化不定芽能力。不同植物激素浓度组合对胚性愈伤组织的不定芽诱导率存在显著差异。在6-BA浓度在3-6mg/L范围内，不定芽诱导率随着6-BA浓度增加而升高。虽然6-BA 6mg/L和NAA 0.1mg/L的组合不定芽诱导率最高，即达到76.7％，但所分化出的不定芽较弱。6-BA 5mg/L和NAA 0.1mg/L的组合不定芽诱导率高达72.2％，与6-BA 6mg/L和NAA 0.1mg/L的组合相当，但显著高于其他处理，且不定芽较健壮(见图2)。当培养基中只含5mg/L 6-BA，而不含有0.1mg/L NAA时，不定芽诱导率显著下降，不定芽较弱小。上述结果表明6-BA 5mg/L和NAA 0.1mg/L的组合为诱导不定芽的最佳组合,在该组合作用下不定芽诱导率较高，且分化出的不定芽较健壮。
优选地，本发明中水角不定芽诱导最佳培养基：MS，附加6-BA 5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
表2不同植物激素浓度组合对水角诱导不定芽的影响
Figure BDA0003694364560000052
Figure BDA0003694364560000061
注：同列不同小写字母表示在5％水平上差异显著。
4、丛生芽的形成
将上述水角不定芽连同愈伤组织块一起转移至新的不定芽诱导培养基中，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养15天后，愈伤组织上形成密集的丛生芽(见图3)。
5、不定芽增殖培养
1)不同6-BA浓度对增殖芽的影响
将上述水角丛生芽切割成含3-5个不定芽的小块，接种至不定芽增殖培养基(见表3)，每处理重复3次。增殖培养基除了6-BA浓度不同外，其他组分均相同，即以MS培养基为基础培养基，附加NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。培养温度25℃，光照强度2000lx。培养30天后，统计各处理的不定芽增殖系数。计算公式：不定芽增殖系数＝(培养后的总芽数-接种的芽数)/接种的芽数。结果见表3。
由表3可知，在6-BA浓度1-4mg/L范围内，随着6-BA浓度的升高，水角不定芽增殖系数显著增加。当6-BA浓度为4mg/L时，不定芽增殖系数达8.8，显著高于其他处理，但不定芽生长较弱小，表明过高的6-BA浓度会影响不定芽生长。当6-BA浓度为3mg/L时，不定芽增殖系数达7.2，虽然低于6-BA4mg/L的处理，但显著高于其他处理，且不定芽生长健壮。上述结果表明6-BA3mg/L为不定芽增殖最佳浓度。
表3 6-BA浓度对水角增殖芽的影响
Figure BDA0003694364560000062
Figure BDA0003694364560000071
注：同列不同小写字母表示在5％水平上差异显著。
2)固体、液体不定芽增殖培养基对增殖芽的影响
根据上面试验结果确定出较优不定芽增殖培养基为：MS，附加6-BA 3mg/L，NAA0.1mg/L，蔗糖30g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。以在此培养基中添加琼脂粉8g/L作为固体不定芽增殖培养基，以在此培养基中不添加琼脂粉作为液体不定芽增殖培养基。将丛生芽切割成含3-5个不定芽的小块，分别接种至固体、液体不定芽增殖培养基中(表4)，每个处理重复3次。培养温度为25℃，光照强度2000lx。培养15天后，统计各处理不定芽增殖系数，计算公式：不定芽增殖系数＝不定芽增殖系数＝(培养后的总芽数-接种的芽数)/接种的芽数。结果见表4。
由表4可知，固体、液体培养基对水角增殖芽存在显著影响。当培养15天后，液体培养基的不定芽增殖系数达12.2，极显著高于固体培养基的不定芽增殖系数，且不定芽较健壮(图4)。这些结果表明液体培养基对不定芽的增殖效果显著优于固体培养基。
本发明最佳不定芽增殖培养基为：以MS培养基为基础培养基，附加6-BA 3mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
表4固体、液体培养基对水角增殖芽的影响
培养基类型 不定芽增殖系数 不定芽生长状态
固体不定芽增殖培养基 4.1±0.5 较健壮
液体不定芽增殖培养基 12.2±1.2** 较健壮
备注：“**”表示在1％水平上差异显著。说明：液体培养基采用本领域通用的滤纸桥为载体，培养物在滤纸桥上，滤纸桥下是液体培养基，省略了传统的琼脂培养基。
6、再生植株的生根及移栽
将上述增殖培养的健壮不定芽切下，接种于水角生根培养基中，25℃光照条件下培养20天后，不定芽形成健壮的带有发达根系和多片完整叶片的植株(图5)。生根培养基是以MS培养基为基础培养基，附加NAA0.5mg/L,蔗糖30g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
将生根的试管苗置于室温和自然光照条件下炼苗2天，清洗干净组培苗根部培养基，再移入装有珍珠岩：草炭土：蛭石＝1：4：1的营养钵中，置于温棚内，在温度25-34℃、相对湿度90％、自然光照条件下培养25天后，植株生长良好(见图6)，试管苗移栽成活率达98％以上。

Claims (2)

1.一种利用不定芽增殖培养提高离体水角组培效率的方法，其特征在于以下步骤：
(1)外植体的选取与消毒
于连续2个晴朗的天气取野外水角的幼嫩叶片，用自来水冲洗30分钟，滤纸吸干，再用70％酒精消毒20秒，再用有效氯≥40g/L的漂白水消毒5分钟，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干；
(2)胚性愈伤组织的诱导
将消毒好的水角叶片切成0.5厘米×0.5厘米方块，接种至胚性愈伤组织诱导培养基中，在黑暗条件下培养30天后，培养温度为25℃±2℃；从水角叶片中诱导出胚性愈伤组织；
(3)不定芽的诱导
将步骤(2)获得的胚性愈伤组织接到于不定芽诱导培养基中，在光照条件下培养30天后，使胚性愈伤组织分化出不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h光照/8h黑暗；
(4)不定芽的增殖培养
将步骤(3)的不定芽连同愈伤组织块一起转移至新的不定芽诱导培养基中，在光照条件下培养15天后，使之形成丛生芽；将水角丛生芽切割成含3-5个不定芽的小块，接种至不定芽增殖培养基中，在光照条件下培养15天后，得到增殖的不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h光照/8h黑暗；
(5)不定芽的生根培养
将步骤(4)所得的健壮不定芽切下，接种至生根培养基中培养培养25-30天，培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h光照/8h黑暗；
其中：
上述培养基成分及其配比如下：
叶片胚性愈伤组织诱导培养基：MS+NAA2mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
不定芽诱导培养基：MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
不定芽增殖培养基：MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
生根培养基：MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
2.专用于不定芽增殖培养提高离体水角组培效率方法的培养基，其征在于，所述培养基的成分及配比为：
叶片胚性愈伤组织诱导培养基：MS+NAA 2mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
不定芽诱导培养基：MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
不定芽增殖培养基：MS+6-BA3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；
生根培养基：MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。
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