CN105900842B

CN105900842B - 一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法

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Publication number: CN105900842B
Application number: CN201610299886.3A
Authority: CN
Inventors: 刘�英; 曾炳山
Original assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2017-12-08
Anticipated expiration: 2036-05-09
Also published as: CN105900842A

Abstract

一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，包括如下步骤：种子消毒、丛芽诱导、继代培养、生根培养、练苗培养、生根苗移植，其中，丛芽诱导培养基、继代基本培养基、生根基本培养基均经过改良，本发明通过调整五个大量元素配比、微量元素浓度、添加抗氧化剂等技术方法，解决了部分胚系苗木在0.7MS上，由于营养元素不平衡，苗木生长不良，甚至玻璃化、褐化死亡的问题，生产出1.5‑4.0cm高度的健壮苗木，实现高质量继代苗木生产，适应于多数种胚使用，减少壮苗培养环节，节约成本、同时实现了高效产业化生产，降低培养成本，减少管理难度及培养时间过长，苗木出现褐化死亡。移植成活率达90%以上。

Description

一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法

技术领域

本发明涉及热带林木的良种选育及苗木繁殖技术领域，尤其是涉及火力楠组织培养快速繁殖育苗方法。

背景技术

火力楠（Micheliamacclurei Dandy）为木兰科（Dagnoliaceae）含笑属常绿阔叶乔木，分布于我国广东、海南和广西北部以及越南北部，生长速度快，适应性强，是世界珍稀优良树种，也是我国南方主要用材造林树种和优良的改土树种。其树干通直，木材切面装饰光滑美观，硬度较高且耐腐，易干燥，有香气，少开裂，不反翘，是优良的家具和建筑用材。其花朵艳丽、树型美观、林分燃烧性差，是优良的木本花卉、园林风景树和行道树，同时也是防火林带的莺要树种，火力楠为乡土珍稀多用途造林树种。

近年来，随着桉树造林面积的不断扩大，保护生态平衡、生物多样性、发展乡土珍稀造林树种的呼声越来越高，加上市场对高档珍贵用材的需求日益增长和对天然林的禁伐。火力楠作为速生珍贵乡土阔叶用材树种受到广泛的关注。很多省份及研究部门开展了火力楠种源区域化筛选、优良种源筛选、优树筛选等研究，因此，开展火力楠组培快繁技术研究，对加快火力楠生产的良种化进程，提高火力楠林的单位面积产量具有重要的意义。由于火力楠的选优研究才开始，没有确定的优良母株，而林木间的个体差异性大，外采不经确定的母株，组培成功后，苗木不能有效的发挥无性系苗的作用，潜在存在着病害、生长不良等风险，同时潜在存在着方法、配方落点不落面的风险。

申请号为201410297285X，专利名称为“一种火力楠的组织培养快繁方法”的申请文件公开了的方法为：该方法选取火力楠的嫩茎或顶芽作为外植体, 经消毒后接种到诱导培养基上，诱导培养基以1/2MS 为基本培养基，配加2.0% ～ 3.5% 蔗糖、0.35% ～ 0.5%琼脂、0.05% ～0.1% 活性炭、0.03% ～ 0.1% 蛋白胨、50 ～ 100ml/L 椰子汁以及0.8 ～1.2mg/L 6-BA 和0.3 ～0.5mg/L NAA，pH 值为5.4 ～ 5.8；将不定芽转入继代培养基上进行增殖培养，继代培养基以MS 为基本培养基，配加1.5% ～ 2.5% 蔗糖、0.35% ～ 0.5% 琼脂、0.05% ～ 0.1% 活性炭以及0.4 ～ 0.8mg/L 6-BA、0.1 ～ 0.3mg/L IBA 和0.1 ～0.4mg/L NAA，pH 值为5.4 ～ 5.8 ；将高度约为3 ～ 5cm 的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，生根培养基以SH为基本培养基，配加1.0% ～ 1.5% 蔗糖、0.35% ～0.45% 琼脂、0.05% ～ 0.1% 活性炭、30 ～50ml/L 椰子汁以及0.3 ～ 0.6mg/L IBA 和0.1 ～ 0.3mg/L NAA，pH 值为5.4 ～ 5.8 ；然后进行炼苗移栽试。该培养方法均能取得较高的成活率，但是也有不足的地方，其不定芽诱导、丛芽诱导、生根培养、均需要经过暗培养，且用到蛋白胨、椰子汁、其生根培养时间为30-45天内生根，练苗时间30天，存在着以下几方面的不足：1、操作环节多而复杂且蛋白胨、椰子汁培养成本高。2、生根培养及练苗时间过长，长达60-75天的生根练苗培养，不仅大大提高培养成本，而且会增加污染率，降低生产效益；长时间的生根练苗培养，增加管理难道，对容易褐化的火力楠芽苗，不仅容易出现褐化死亡，同时也容易出现营养耗尽而死。

另有中国文献（李雪，王淑芬，蒋雄辉.醉香含笑的组织培养与植株再生[J]. 植物生理学通讯.2005(06)）公开了醉香含笑，即火力楠的组培，诱导培养基为1/3MS+6BA0.2mg.L（单位下同）+NAA0.02；增殖培养基：1/3MS+活性炭0.3%；生根培养基：1/4MS+IBA2.0+NAA3.0，以上培养基均加2.0g.L~Gelrite，除生根培养基加1.5%蔗糖外，其余加2.5%蔗糖，pH5.8，培养温度为26±1℃，光照12h/d，诱导培养时光强为6μmol.m^-2.s^-1左右，其他为50μmol.m^-2.s^-1左右。该培养方法:最佳增殖培养基40 d继代转接一次，长新芽的方式是“芽生芽”，芽的高度在0.5~2.0cm，新芽未抽出，基部呈现出黑色，偶尔也有白色呈晶体状的愈伤组织产生。继代单芽太小时，易褐化死亡。存在着以下不足：增殖培养基存在缺陷，造成芽苗转接周期长，高度生长不高，繁殖倍数低，有效苗低，需通过壮苗才能生根培养的问题，不利于效益化产业生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，生产成本低、繁殖高、成苗高，繁殖育苗时间短、移植成活率高的火力楠组织培养快速繁殖育苗方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，包括如下步骤：

S1、种子消毒

人工去除种壳，并尽可能保持胚的完整，在超净工作台上对种子进行消毒得到去壳种胚；

S2、丛芽诱导

将消毒好的种胚，接入丛芽诱导培养基中进行诱导丛芽，丛芽诱导培养基的pH值为5.8-6.2，包括0.7倍MS的大量元素、MS的微量元素、MS的有机质、6BA 0.35-0.75mg/L、NAA0.2-0.4mg/L、30-40mg/L蔗糖；

S3、继代培养

丛芽诱导出来后，转入火力楠基本培养基，培养条件同S2，培养周期为30-35天，得到继代芽苗，火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃ 150-500mg/l、KH₂PO₄ 340-680mg/l、MgSO₄ 555-800mg/l、KNO₃1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂ 85mg/L，微量元素2 倍MS、有机质MS、激素6BA 0.15-0.3mg/L、NAA 0.1-0.2mg/L、30-40mg/L蔗糖、PVP 4-7g/L；

S4、生根培养

继代芽苗长到3.0cm以上，选取高度在3.0cm以上最少带3片充分展开叶，节间长度短的上代芽苗接入生根培养基，培养45天，芽苗开始生根；

S5、练苗培养

芽苗生根培养30天后，在光照强度为5000-10000LX的练苗棚中练苗，练苗时间为7-15天，及时移植，练苗时间不适过长，过长容易造成生根苗褐化，影响苗木质量；

S6、生根苗移植

移植前用0.5%高锰酸钾消毒介基，移植后一个星期内全盖薄膜，并适当遮阴，一个星期后打开薄膜一日6次清水喷雾，每次10秒，两个星期后一日5次喷雾，每次10秒，3个星期后一日5次喷雾，每次10秒，移植后第7天、第14天，第21天轮流喷托不津或多菌灵，一个月后，一日4次喷雾，每次10秒，移植成活率在90%以上。

进一步地，S1中，对种子进行消毒的方法为用0.01%升汞消毒5-9分钟后，无菌水清洗后浸泡5分钟，在用无菌水清洗，重复清洗浸泡4-5次后，可以接入丛芽诱导培养基中，消毒成功率62%以上。

进一步地，生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS，3.5-11.5mg/L NAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号。

作为另一种技术方案，生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS， 0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、5.0-11.5mg/L ABT生根二号。

进一步地，S2中丛芽诱导的条件为：光照强度为2000-3000LX、温度22-28^OC、8h.d^-1的条件下诱导丛芽；去壳种胚7天后开始出芽。

进一步地，S3中的继代培养条件为光照强度为2000-3000LX、温度22-28^OC、8h.d^-1。

进一步地，S4中的生根培养条件为光照强度为2000-3000LX、温度22-28^OC、8h.d^-1。

本发明有如下的优点：

1、本发明采用多胚系外植体为切入点，通过调整五个大量元素配比、微量元素浓度、添加抗氧化剂等技术方法，发明了适应80%胚系以上的继代生产配方，解决了部分胚系苗木在0.7MS上，由于营养元素不平衡，苗木生长不良，甚至玻璃化、褐化死亡的问题，生产出1.5-4.0cm高度的健壮苗木，实现高质量继代苗木生产。

2、本发明适应于多数种胚使用，种子消毒成率达60%以上、丛芽诱导率100%、继代培养实现50%的胚系增殖倍数3倍以上，30%的胚系增殖倍数2.5-3倍，20%的胚系增殖倍数1.8-2.5倍，继代生产周期（30-35天），高质量的继代苗木与适量的增殖倍数，不仅减少壮苗培养环节，节约成本、同时实现了高效产业化生产。

3、本发明生根培养适应60%胚系培养，芽苗生根率50-90%、生根培养时间短，始根期22-26天，45天达到生根高峰，练苗时间7-15天，节省培养时间，降低培养成本，减少管理难度及培养时间过长，苗木出现褐化死亡。移植成活率达90%以上。

4、本发明由于采用多胚系外植体为切入点，因培养材料多样性，迫使培养基大调整，调整后的培养基及方法适应了复杂的胚系生长，能更广更有效的克服个体差异，对今后林地选出的优树具有很高的应用价值。

5、本发明操作简单、成本低，生产周期短。

附图说明

图1为实施例1中丛芽诱导后的火力楠的形态图；

图2为实施例1中继代培养后的火力楠的形态图；

图3为实施例1中生根培养的火力楠的形态图；

图4为实施例2中丛芽诱导后的火力楠的形态图；

图5为实施例2中继代培养后的火力楠的形态图；

图6为实施例2中生根培养的火力楠的形态图；

图7为实施例3中丛芽诱导后的火力楠的形态图；

图8为实施例3中继代培养后的火力楠的形态图；

图9为实施例3中生根培养的火力楠的形态图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，包括如下步骤：

S1、种子消毒

人工去除种壳，尽可能保持胚的完整，在超净工作台上，对种子进行消毒，方法为用0.1%升汞消毒5-9分钟后，无菌水清洗后浸泡5分钟，在用无菌水清洗，重复清洗浸泡4-5次后，可以接入丛芽诱导培养基中，消毒成功率62%以上。

具体操作为：采用保种近２个月的HLN127、HLIY100、PX04３个优良家系种子作为试验材料。取0.01%升汞分1min、3min、5min、7min、9min五个处理水平，对３个优良家系种胚进行消毒试验，培养90天后，1min、3min、5min、7min、9min的消毒成功率分别为47.5%、45.0%、65.0%、62.5%、62.5%。5-9 min的处理比1-3min的处理高近20%。结果分析：1min的消毒，时间过短，培养10d时，污染率高达47.5%，5-9min消毒，能杀死种胚表面及种胚内部分内生污染，消毒成功率达60%以上，以5min的消毒效果最佳，在充分杀菌的同时，减少对种胚的杀伤，利于种胚更快的健壮萌发.

S2、丛芽诱导

将消毒5min的种胚，接入丛芽诱导培养基中进行诱导丛芽，丛芽诱导培养基的pH值为5.8-6.2，包括0.7倍MS的大量元素、MS的微量元素、MS的有机质、6BA 0.56mg/L、NAA0.3mg/L、35mg/L蔗糖；丛芽诱导的条件为：光照强度为2500LX、温度25^OC、8h.d^-1的条件下诱导丛芽；去壳种胚7天后开始出芽，具体参照图1，部分直接诱出丛芽，部分经过多次转接后诱出丛芽，这种差异主要来自种胚的遗传因子差异。

S3、继代培养

丛芽诱导出来后，继续在丛芽诱导培养基上培养，会出现苗木玻璃化、褐化严重、生长不良死亡等现象，应及时转入研制的火力楠基本培养基，在常规组培条件下培养，培养周期为30-35天，实现50%的无性系增殖3倍以上，30%的无性系增殖2.5倍以上, 20%的无性系低于2.5倍。继代芽苗生长正常，为有效苗木，可进一步生根培养。火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃ 330mg/l、KH₂PO₄ 510mg/l、MgSO₄ 555mg/l、KNO₃ 1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂85mg/L。微量元素2 倍MS、有基质MS、激素6BA 0.24mg/L、NAA 0.15mg/L、35mg/L蔗糖、PVP 5.5g/L。继代培养条件为光照强度为2500LX、温度25^OC、8h.d^-1，参照图2，火力楠苗为出现苗木玻璃化、生长不良死亡等现象。

S4、生根培养

继代芽苗长到3.0cm以上，选取高度在3.0cm以上最少带3片充分展开叶，节间长度短的上代芽苗接入生根培养基，培养45天，芽苗开始生根，生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L, 微量MS、有机质MS，7.2mg/L NAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号及0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、8mg/L ABT；生根培养条件为光照强度为2500LX、温度25^OC、8h.d^-1，具体形态可参照附图3，火力楠苗发根良好。

S5、练苗培养

S6、生根苗移植

实施例2

一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，除以下不同外，其他步骤与实施例1一致：

丛芽诱导培养基包括0.7倍MS的大量元素、MS的微量元素、MS的有机质、6BA0.35mg/L、NAA 0.2mg/L、30mg/L蔗糖。

火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃ 150mg/l、KH₂PO₄ 680mg/l、MgSO₄ 555mg/l、KNO₃1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂ 85mg/L，微量元素2 倍MS、有机质MS、激素6BA0.15mg/L、NAA0.2mg/L、30mg/L蔗糖、PVP 7g/L。

生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L, 微量MS、有机质MS，3.5mg/L NAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号及0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、11.5mg/LABT。

丛芽诱导条件、继代培养条件、生根培养条件均为光照强度为2000LX、温度28^OC、8h.d^-1。

S5中练苗光照强度为5000LX，练苗时间为15天。

丛芽诱导、继代培养以及生根培养的火力楠的形态图见图4~6。

实施例3

丛芽诱导培养基包括0.7倍MS的大量元素、MS的微量元素、MS的有机质、6BA0.75mg/L、NAA 0.4mg/L、40mg/L蔗糖。

火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃500mg/l、KH₂PO₄ 340mg/l、MgSO₄ 800mg/l、KNO₃1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂ 85mg/L，微量元素2 倍MS、有机质MS、激素6BA0.3mg/L、NAA 0.1mg/L、40mg/L蔗糖、PVP 4g/L。

生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L, 微量MS、有机质MS，11.5mg/L NAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号及0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、5.0mg/LABT。

丛芽诱导条件、继代培养条件、生根培养条件均为光照强度3000LX、温度22^OC、8h.d^-1。

丛芽诱导、继代培养以及生根培养的火力楠的形态图见图7~9。

S5中练苗光照强度为10000LX，练苗时间为7天。

实施例4

丛芽诱导培养基包括0.7倍MS的大量元素、MS的微量元素、MS的有机质、6BA0.5mg/L、NAA 0.32mg/L、36mg/L蔗糖。

火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃ 200mg/l、KH₂PO₄ 400mg/l、MgSO₄ 700mg/l、KNO₃1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂ 85mg/L，微量元素2 倍MS、有机质MS、激素6BA0.2mg/L、NAA 0.13mg/L、36mg/L蔗糖、PVP 6g/L。

生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L, 微量MS、有机质MS，9mg/L NAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号及0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、7mg/L ABT。

丛芽诱导条件、继代培养条件、生根培养条件均为光照强度2700LX、温度23^OC、8h.d^-1的条件下诱导丛芽；去壳种胚7天后开始出芽。

S5中练苗光照强度为8000LX，练苗时间为11天。

实施例5

不同的地方为生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS， 0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、5.0mg/L ABT生根二号。

实施例6

不同的地方为生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS， 0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、11.5mg/L ABT生根二号。

实施例7

不同的地方为生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS， 0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、8mg/L ABT生根二号。

实施例4~7培养的芽苗转接周期短，高度生长高，繁殖倍数高，有效苗多。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。

Claims

1.一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、种子消毒

S2、丛芽诱导

S3、继代培养

丛芽诱导出来后，转入火力楠基本培养基，培养条件同S2，培养周期为30-35天，得到继代芽苗，火力楠继代基本培养基：大量元素NH₄NO₃ 150-500mg/l、KH₂PO₄ 340-680mg/l、MgSO₄555-800mg/l、KNO₃1900mg/l、CaCl₂332mg/l、Ca (NO₃)₂ 85mg/L，微量元素2 倍MS、有机质MS、激素6BA 0.15-0.3mg/L、NAA 0.1-0.2mg/L、30-40mg/L蔗糖、PVP 4-7g/L；

S4、生根培养

继代芽苗长到3.0cm以上，选取高度在3.0cm以上最少带3片充分展开叶，节间长度短的上代芽苗接入生根培养基，培养20-25天，芽苗开始生根；

S5、炼苗培养

芽苗生根培养30天后，在光照强度为5000-10000LX的炼苗棚中炼苗，炼苗时间为7-15天，及时移植，炼苗时间不适过长，过长容易造成生根苗褐化，影响苗木质量；

S6、生根苗移植

移植前用0.5%高锰酸钾消毒介基，移植后一个星期内全盖薄膜，并适当遮阴，一个星期后打开薄膜一日6次清水喷雾，每次10秒，两个星期后一日5次喷雾，每次10秒，3个星期后一日5次喷雾，每次10秒，移植后第7天、第14天，第21天轮流喷托不津或多菌灵，一个月后，一日4次喷雾，每次10秒，移植成活率在90%以上，

S1中，对种子进行消毒的方法为用0.01%升汞消毒5-9分钟后，无菌水清洗后浸泡5分钟，在用无菌水清洗，重复清洗浸泡4-5次后，可以接入丛芽诱导培养基中，消毒成功率62%以上。

2.根据权利要求1所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS，3.5-11.5mg/LNAA、0.2mg/L IBA、0.2mg/L ABT生根二号。

3.根据权利要求1所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，生根基本培养基为：五个大量元素0.4MS、Ca(NO₃)₂ 380mg/L，微量MS、有机质MS， 0.2mg/L IBA、0.2mg/L NAA、5.0-11.5mg/L ABT生根二号。

4.根据权利要求2或3所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，S2中的丛芽诱导培养基为基础，丛芽诱导条件为：光照强度为2000-3000LX、温度22-28℃ 、8h· d^-1的条件下诱导丛芽；去壳种胚7天后开始出芽。

5.根据权利要求4所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，S3中的火力楠继代培养基为基础，继代培养条件为光照强度为2000-3000LX、温度22-28℃ 、8h·d^-1。

6.根据权利要求5所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，S4中的生根培养基为基础，生根培养条件为光照强度为2000-3000LX、温度22-28℃ 、8h· d^-1。

7.根据权利要求6所述的一种火力楠组织培养快速繁殖育苗方法，其特征在于，S5中炼苗光照强度为5000-10000LX，炼苗时间为7-15天。