CN110881408A - 一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法 - Google Patents

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高敏霞
陈义挺
冯新
赖瑞联
陈文光
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Abstract

本发明提供一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，属于果树组织培养技术领域。该方法包括：（1）东红猕猴桃外植体处理；（2）东红猕猴桃组培苗无菌苗获得；（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养；（4）东红猕猴桃组培苗生根培养；（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽。该方法组培苗的生根率及成活率高，能快速获得大量优良的东红猕猴桃种苗，为其规模化生产提供技术支持，并为进一步分子育种奠定基础。

Description

一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法
技术领域
本发明属于果树组织培养技术领域，具体涉及一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法。
背景技术
红肉猕猴桃属猕猴桃科猕猴桃属，是我国特有的猕猴桃资源。红肉猕猴桃主要存在于中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃和毛花猕猴桃等，其中以中华猕猴桃和美味猕猴桃的经济利用价值最高。红肉猕猴桃区别于其他猕猴桃的特征是果肉沿中轴呈放射状红色，果实横切面的颜色十分鲜艳，有强烈的刺激食欲感。而且红肉猕猴桃具有较高的经济价值。红色果实色素的主要成分是花青素3 -半乳糖甙（cyanidin3 –galactoside）,次要成分是甲基花青素 3-半乳糖甙（peonidin 3 –galactoside）。这些成分具有防止毛细血管脆裂和抗击炎症的作用，同时花青素能消除人体内的自由基，延缓衰老，防止、减少心血管疾病和癌症的发生。
红肉猕猴桃在自然界中的数量较少，分布零星，仅在河南、湖北、浙江、江西等省份的部分山区发现，是一种极为珍贵的科研和育种材料。它可以通过直接选优的方法培育红肉新品种，也可以与其它基因型的品种杂交获得新品种。植物组织培养技术可以在短期内快速繁殖大量植株，同时将母本的优良性状保持下来。东红猕猴桃是由中国科学院武汉植物园历经15年从红阳猕猴桃实生苗中选育而来，它具有早熟、耐贮等特点，具有较高的生产栽培价值。但目前该品种的供苗量不足，在一定程度上限制了其发展。利用植物组织培养技术，建立东红猕猴桃的组培快繁体系，对东红猕猴桃种质资源的离体保存和推广应用等具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，以解决东红猕猴桃种质资源保存和组培苗种苗紧缺的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，包括以下步骤：
（1）东红猕猴桃外植体处理：取一年生，芽点饱满，无病虫害的枝条，去除叶片和叶柄，用毛刷蘸洗衣粉溶液轻轻刷洗干净，置流水下冲洗10 min，然后移到超净工作台上，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞（加1-2滴Tween-20）消毒10 min，无菌水冲洗4遍，然后用无菌水浸泡5 min，之后再用无菌水冲洗2遍，置于无菌滤纸上，吸干水分；
（2）东红猕猴桃组培苗无菌苗获得：将步骤（1）处理的枝条剪成1.5～2.0 cm长茎段，每段至少带一个茎节；将茎段接种于诱导培养基上，萌发产生无菌苗；
（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养：将步骤（2）诱导的无菌苗，接种于增殖培养基中，进行增殖培养；
（4）东红猕猴桃组培苗生根培养：步骤（3）增殖培养后高3 cm的单个不定芽，接种于生根培养基中培养；
（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽：将步骤（4）中长至5 cm的生根苗从培养室移至炼苗大棚炼苗10～15 d，然后小心取出炼苗后的组培苗，并洗净上面残留的培养基，移栽到混合基质中，移栽后温度25±1℃，湿度75%，培养30 d后统计移栽成活率。
上述（1）～（4）步骤中的培养条件均为：培养温度25±1 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养周期为30 d。
步骤（2）中诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
步骤（3）中增殖培养基为MS+1.0～3.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH为6.0。
步骤（4）所述生根培养基为1/2MS+1.0～1.5 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
步骤（5）中所述混合基质由泥炭土与田园土按体积比为2：1混合制成。
本发明的有益效果是：本发明东红猕猴桃组培快繁体系建立的方法，组培苗的生根率达90%以上，组培苗成活率在93%以上。利用该方法能快速获得大量优良的东红猕猴桃种苗，为其规模化生产提供技术支持，并为进一步分子育种奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例1
一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，包括以下步骤：
（1）东红猕猴桃外植体处理：取一年生，芽点饱满，无病虫害的枝条，去除叶片和叶柄，用毛刷蘸洗衣粉溶液轻轻刷洗干净，置流水下冲洗10 min，然后移到超净工作台上，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞（加1-2滴Tween-20）消毒10 min，无菌水冲洗4遍，然后用无菌水浸泡5 min，之后再用无菌水冲洗2遍，置于无菌滤纸上，吸干水分。
（2）东红猕猴桃组培苗获得：将步骤（1）处理的枝条剪成1.5 cm长茎段，每段至少带一个茎节；将茎段接种于诱导培养基上，萌发产生无菌苗，萌发率为63.33%，诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖。
（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养：将步骤（2）诱导的无菌苗，接种于增殖培养基中，进行增殖培养，增殖系数为5.83，增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH为6.0。
（4）东红猕猴桃组培苗生根培养：将步骤（3）增殖培养后高3cm的单个不定芽，接种于生根培养基中培养，生根率为94%，生根培养基为1/2MS+1.0 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽：将步骤（4）中长至5 cm的生根苗从培养室移至炼苗大棚炼苗15 d，然后小心取出炼苗后的组培苗，并洗净上面残留的培养基，移栽到体积比为泥炭土：田园土=2：1组成的混合基质中，移栽后温度25±1℃，湿度75%，培养30 d后统计移栽成活率，成活率为93%。
上述（1）～（4）步骤中的培养条件均为：培养温度25±1 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养周期为30 d。
实施例2
一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其步骤包括：
（1）东红猕猴桃外植体处理：取一年生，芽点饱满，无病虫害的枝条，去除叶片和叶柄，用毛刷蘸洗衣粉溶液轻轻刷洗干净，置流水下冲洗10 min，然后移到超净工作台上，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞（加1-2滴Tween-20）消毒10 min，无菌水冲洗4遍，然后用无菌水浸泡5 min，之后再用无菌水冲洗2遍，置于无菌滤纸上，吸干水分。
（2）东红猕猴桃组培苗无菌苗获得：将步骤（1）处理的枝条剪成2.0 cm长茎段，每段至少带一个茎节；将茎段接种于诱导培养基上，萌发产生无菌苗，萌发率为63.33%，诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖。
（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养：将步骤（2）诱导的无菌苗，接种于增殖培养基中，进行增殖培养，增殖系数为6.78，增殖培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH为6.0。
（4）东红猕猴桃组培苗生根培养：将步骤（3）增殖培养后高3 cm的单个不定芽，接种于生根培养基中培养，生根率为90%，生根培养基为1/2MS+1.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽：将步骤（4）中长至5 cm的生根苗从培养室移至炼苗大棚炼苗10 d，然后小心取出炼苗后的组培苗，并洗净上面残留的培养基，移栽到体积比为泥炭土：田园土=2：1组成的混合基质中，移栽后温度25±1℃，湿度75%，培养30 d后统计移栽成活率，成活率为96%。
上述（1）～（4）步骤中的培养条件均为：培养温度25±1 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养周期为30 d。
实施例3
一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其步骤包括：
（1）东红猕猴桃外植体处理：取一年生，芽点饱满，无病虫害的枝条，去除叶片和叶柄，用毛刷蘸洗衣粉溶液轻轻刷洗干净，置流水下冲洗10 min，然后移到超净工作台上，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞（加1-2滴Tween-20）消毒10 min，无菌水冲洗4遍，然后用无菌水浸泡5 min，之后再用无菌水冲洗2遍，置于无菌滤纸上，吸干水分。
（2）东红猕猴桃组培苗无菌苗获得：将步骤（1）处理的枝条剪成1.8cm长茎段，每段至少带一个茎节；将茎段接种于诱导培养基上，萌发产生无菌苗，萌发率为63.33%，诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养：将步骤（2）诱导的无菌苗，接种于增殖培养基中，进行增殖培养，增殖系数为5.00，增殖培养基为MS+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH为6.0。
（4）东红猕猴桃组培苗生根培养：将步骤（3）增殖培养后高3 cm的单个不定芽，接种于生根培养基中培养，生根率为93%，生根培养基为1/2MS+1.5 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽：将步骤（4）中长至5 cm的生根苗从培养室移至炼苗大棚炼苗13 d，然后小心取出炼苗后的组培苗，并洗净上面残留的培养基，移栽到体积比为泥炭土：田园土=2：1组成的混合基质中，移栽后温度25±1℃，湿度75%，培养30 d后统计移栽成活率，成活率为95%。
上述（1）～（4）步骤中的培养条件均为：培养温度25±1 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养周期为30 d。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）东红猕猴桃外植体处理：取一年生，芽点饱满，无病虫害的枝条，去除叶片和叶柄，用毛刷蘸洗衣粉溶液轻轻刷洗干净，置流水下冲洗10 min，然后移到超净工作台上，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞（加1-2滴Tween-20）消毒10 min，无菌水冲洗4遍，然后用无菌水浸泡5 min，之后再用无菌水冲洗2遍，置于无菌滤纸上，吸干水分；
（2）东红猕猴桃组培苗无菌苗获得：将步骤（1）处理的枝条剪成1.5～2.0 cm长茎段，每段至少带一个茎节；将茎段接种于诱导培养基上，萌发产生无菌苗；
（3）东红猕猴桃组培苗增殖培养：将步骤（2）诱导的无菌苗，接种于增殖培养基中，进行增殖培养；
（4）东红猕猴桃组培苗生根培养：步骤（3）增殖培养后高3 cm的单个不定芽，接种于生根培养基中培养；
（5）东红猕猴桃生根组培苗炼苗移栽：将步骤（4）中长至5 cm的生根苗从培养室移至炼苗大棚炼苗10～15 d，然后小心取出炼苗后的组培苗，并洗净上面残留的培养基，移栽到混合基质中，移栽后温度25±1℃，湿度75%，培养30 d后统计移栽成活率。
2.根据权利要求1所述的一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于：所述（1）～（4）步骤中的培养条件均为：培养温度25±1 ℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养周期为30 d。
3.根据权利要求1所述的一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于：步骤（2）中所述诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
4.根据权利要求1所述的一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于：步骤（3）中所述增殖培养基为MS+1.0～3.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH为6.0。
5.根据权利要求1所述的一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于：步骤（4）所述生根培养基为1/2MS+1.0～1.5 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，pH为6.0。
6.根据权利要求1所述的一种东红猕猴桃组培快繁体系的建立方法，其特征在于：步骤（5）中所述混合基质由泥炭土与田园土按体积比为2：1混合制成。
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