CN104782497A

CN104782497A - 一种观赏铁线莲离体培养方法

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Publication number: CN104782497A
Application number: CN201510216185.4A
Authority: CN
Inventors: 冯文杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-05-02
Filing date: 2015-05-02
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明公开了一种观赏铁线莲离体培养方法，铁线莲(Clematis L.)属于毛茛科,为世界著名的观赏植物，分布范围广，素有“攀援植物皇后”之美称。植物组织培养技术是获得整齐一致材料的快捷途径，既可以克服繁殖系数低、周期长等缺点，加快繁殖过程，又可以使生长不受季节限制，节约土地。本发明以铁线莲当年生嫩茎为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、增殖、生根诱导等过程建立了建立一套高诱导率、高增殖系数的铁线莲组培快繁技术体系，能便于大规模生产，为实现工厂化育苗而奠定技术基础，同时也对种质资源的保护和种群的扩大有重要意义。<b/>

Description

一种观赏铁线莲离体培养方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种观赏铁线莲离体培养方法。

背景技术

铁线莲(Clematis L.)属于毛茛科,为世界著名的观赏植物，分布范围广，素有“攀援植物皇后”之美称。其不仅花色品种多，萼片颜色从白色、淡粉色、酒红色、紫红色、淡紫色、蓝紫色到蓝色均有；雄蕊颜色也很丰富，从白色、黄色、粉色、紫红、浅褐到灰棕色；在花型上有单瓣、重瓣和半重瓣，可谓色彩和造型效果极佳。我国是铁线莲资源最为丰富的地区，以西南居多，其中又以云南为最。目前由于重视程度不够，大部分铁线莲属原种仍处于自生自灭的野生状态。

虽然铁线莲原种可以采用播种法获得幼苗，但在自然条件下由于其种子多数较轻，被有毛，成熟后容易被风吹走而又不容易吸水膨胀，存在自然繁殖过程中种子萌发时间长、发芽率低等问题，不能进行周年生产，无法满足市场需求，并且要耗费很长时间，导致发展速度慢、成本增大。植物组织培养技术是获得整齐一致材料的快捷途径，既可以克服繁殖系数低、周期长等缺点，加快繁殖过程，又可以使生长不受季节限制，节约土地。本发明同时也对种质资源的以铁线莲当年生嫩茎为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、增殖、生根诱导等过程建立了建立一套高诱导率、高增殖系数的铁线莲组培快繁技术体系，能便于大规模生产，为实现工厂化育苗而奠定技术基础，保护和种群的扩大有重要意义。

发明内容

本发明以铁线莲当年生嫩茎为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、增殖、生根诱导等过程建立了建立一套高诱导率、高增殖系数的铁线莲组培快繁技术体系，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种观赏铁线莲离体培养方法，包括以下的步骤：

（1）外植体消毒：剪取当年生嫩茎 10cm 左右，用自来水冲去表面尘垢后去除所有叶片，只留取叶柄基部 0.5cm 左右，用洗衣粉水浸泡30min后用自来水冲洗，并经流水漂洗1h 以上，放入无菌瓶内在超净工作台上进行外植体的表面灭菌。用 0.1%的升汞浸泡消毒 5～15min 后用无菌水冲洗 3～5 次，在此过程中轻轻晃动无菌瓶，以使液体与外植体充分接触。经表面灭菌后的材料用滤纸吸干水后切成1cm左右的小段备用。

（2）诱导培养：将经步骤（1）消毒处理后的小嫩茎接种于诱导培养基中进行不定芽诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待分化不定芽后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的不定芽转接至增殖培养基中进行继代培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。

（4）生根培养：将经步骤（3）增殖培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。

（5）炼苗移栽：组培苗在生根培养基上生30d左右，苗高3～4cm，根长在1.5～3cm 之间时，将其移至室温环境进行炼苗，使组培苗逐步适应外界环境条件而提高移栽成活率。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。

上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1.0～4.0mg/L 6-BA+ 0.01～0.1mg/L NAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L6-BA+1.0～2.0mg/L KT+0.1～0.5mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

本发明的优点是：通过外植体消毒、诱导培养、增殖、生根诱导等过程建立了建立一套高诱导率、高增殖系数的铁线莲组培快繁技术体系，能便于大规模生产，为实现工厂化育苗而奠定技术基础，保护和种群的扩大有重要意义。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1

（1）外植体消毒：剪取当年生嫩茎10cm 左右，用自来水冲去表面尘垢后去除所有叶片，只留取叶柄基部 0.5cm左右，用洗衣粉水浸泡30min后用自来水冲洗，并经流水漂洗5h，放入无菌瓶内在超净工作台上进行外植体的表面灭菌。用 0.1%的升汞浸泡消毒 5min 后用无菌水冲洗 3次，在此过程中轻轻晃动无菌瓶，以使液体与外植体充分接触。经表面灭菌后的材料用滤纸吸干水后切成1cm左右的小段备用。

（2）诱导培养：将经步骤（1）消毒处理后的小嫩茎接种于诱导培养基中进行不定芽诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待分化不定芽后再移至置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到89.9%。所述的诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.03mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的不定芽转接至增殖培养基中进行继代培养。接种后置于每天光照1小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天增殖系数达到5.1。所述的增殖培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+1.3mg/L KT+0.2mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。

（4）生根培养：将经步骤（3）增殖培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根为87.5%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.3mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。

（5）炼苗移栽：组培苗在生根培养基上生30d左右，苗高3～4cm，根长在1.5～3cm 之间时，将其移至室温环境进行炼苗，使组培苗逐步适应外界环境条件而提高移栽成活率。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。移栽20天后成活率达到92.1%。

实施例2

（1）外植体消毒：剪取当年生嫩茎10cm 左右，用自来水冲去表面尘垢后去除所有叶片，只留取叶柄基部 0.5cm左右，用洗衣粉水浸泡30min后用自来水冲洗，并经流水漂洗3h，放入无菌瓶内在超净工作台上进行外植体的表面灭菌。用 0.1%的升汞浸泡消毒 7min 后用无菌水冲洗 5次，在此过程中轻轻晃动无菌瓶，以使液体与外植体充分接触。经表面灭菌后的材料用滤纸吸干水后切成1cm左右的小段备用。

（2）诱导培养：将经步骤（1）消毒处理后的小嫩茎接种于诱导培养基中进行不定芽诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待分化不定芽后再移至置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为26℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到87.4%。所述的诱导培养基为：MS+4.0mg/L 6-BA+ 0.05mg/L NAA+26g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的不定芽转接至增殖培养基中进行继代培养。接种后置于每天光照14小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天增殖系数达到4.8。所述的增殖培养基为：MS+3mg/L6-BA+1.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。

（4）生根培养：将经步骤（3）增殖培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根为90%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.5mg/LNAA+27g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.5。

（5）炼苗移栽：组培苗在生根培养基上生30d左右，苗高3～4cm，根长在1.5～3cm 之间时，将其移至室温环境进行炼苗，使组培苗逐步适应外界环境条件而提高移栽成活率。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。移栽20天后成活率达到95%。

Claims

1.一种观赏铁线莲离体培养方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体消毒：剪取当年生嫩茎 10cm 左右，用自来水冲去表面尘垢后去除所有叶片，只留取叶柄基部 0.5cm 左右，用洗衣粉水浸泡30min后用自来水冲洗，并经流水漂洗1h 以上，放入无菌瓶内在超净工作台上进行外植体的表面灭菌，用 0.1%的升汞浸泡消毒 5～15min 后用无菌水冲洗 3～5 次，在此过程中轻轻晃动无菌瓶，以使液体与外植体充分接触，经表面灭菌后的材料用滤纸吸干水后切成1cm左右的小段备用；

（2）诱导培养：将经步骤（1）消毒处理后的小嫩茎接种于诱导培养基中进行不定芽诱导培养，接种后先黑暗条件下培养，待分化不定芽后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率；

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的不定芽转接至增殖培养基中进行继代培养：接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况；

（4）生根培养：将经步骤（3）增殖培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况；

（5）炼苗移栽：组培苗在生根培养基上生30d左右，苗高3～4cm，根长在1.5～3cm 之间时，将其移至室温环境进行炼苗，使组培苗逐步适应外界环境条件而提高移栽成活率，移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理，移栽后经常喷水,保持空气湿度，植株成活后转入正常土壤中定植。

2. 根据权利要求1所述的一种观赏铁线莲离体培养方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1.0～4.0mg/L 6-BA+ 0.01～0.1mg/L NAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

3.根据权利要求1所述的一种观赏铁线莲离体培养方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L6-BA+1.0～2.0mg/L KT+0.1～0.5mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

4.根据权利要求1所述的一种观赏铁线莲离体培养方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。