CN106244604A - 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用 - Google Patents

凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106244604A
CN106244604A CN201610682329.XA CN201610682329A CN106244604A CN 106244604 A CN106244604 A CN 106244604A CN 201610682329 A CN201610682329 A CN 201610682329A CN 106244604 A CN106244604 A CN 106244604A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
gene
sequence
paeonia ostii
pofad2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610682329.XA
Other languages
English (en)
Inventor
王华芳
修宇
银雪
熊健楠
吴国栋
任建武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN201610682329.XA priority Critical patent/CN106244604A/zh
Publication of CN106244604A publication Critical patent/CN106244604A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，公开了凤丹α‑亚麻酸合成的三个关键酶编码基因及其应用。其中，凤丹硬脂酰‑ACP脱氢酶(PoSAD)编码基因调控硬脂酸转化成油酸，凤丹脂肪酸脱氢酶2(PoFAD2)编码基因调控油酸转化成亚油酸，凤丹脂肪酸脱氢酶3(PoFAD3)编码基因调控亚油酸转化为α‑亚麻酸。本发明还涉及上述三个基因编码蛋白的应用。利用该基因在植物种籽中的表达选育合成α‑亚麻酸野生凤丹及其同类油用植物材料，评价其优质高产品种；利用该类基因及其亲本进行生物育种、杂交或其他方式育种，定向改良和提升油用风丹及其同类植物合成油酸、亚油酸或α‑亚麻酸的比例和/或含量，培育富含特定不饱和脂肪酸，尤其是富含α‑亚麻酸的油料品种。

Description

凤丹α-亚麻酸合成酶编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，更具体地涉及凤丹α-亚麻酸合成酶基因PoSAD(SEQ ID No.1)、PoFAD2(SEQ ID No.3)以及PoFAD3(SEQ ID No.5)及其编码的蛋白质PoSAD(SEQ ID No.2)、PoFAD2(SEQ ID No.4)以及PoFAD3(SEQ ID No.6)。本发明还涉及PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因的克隆及应用方法。本发明的脂肪酸脱氢酶及其编码基因对筛选和改良含有上述基因及其调控的特征不饱和脂肪酸含量组成的油用凤丹及其同类植物品种具有重要意义。
背景技术
牡丹(Paeonia spp.)被广泛应用作为观赏花卉和中药材丹皮栽培已有1,600余年(李嘉珏.张西方,赵孝庆,等.中国牡丹[M].中国大百科全书出版社,2011；刘庭风,李长华，万婷婷.上古园林年表.中国园林,2005,21(5):76-78.)。凤丹(Paeonia ostiivar.lishizhenii)历来作为砧木以繁殖观赏牡丹和作为药材丹皮种植，为芍药科属牡丹组革质花盘亚组植物，种子繁殖。凤丹抗逆性强，适应性广，对干旱、寒冷、轻度盐碱等多种非生物胁迫抗性极强，适应多种环境和气候(Wang Y,Dong C,Xue Z,et al.De novo,transcriptome sequencing and discovery of genes related to copper tolerancein Paeonia ostii[J].Gene,2016,576(1Pt 1):126-135.)，在我国28个省市自治区(港澳台尚未统计)广泛引种，是牡丹组植物可在干旱困难地区种植的重要抗逆绿化先锋树种。
近年来发现，凤丹种籽富含油脂，其种籽含油量高于20％，去壳含油率高达30％(修宇.FpDREB2A基因调控刺槐直根生长抗旱机制及选育改良抗旱优质材料基础研究[D].北京林业大学,2016.)。凤丹为单瓣花，雌蕊和雄蕊发育正常，结实量大，是目前唯一有种籽产量估测的油用牡丹品种，其产量达2,250-6,000kg/ha(姜培军.菏泽1500亩油用牡丹进入“收获期”亩产量200kg左右[Z].201382.)，与大豆和油菜产量相似(Wang X,Jiang G L,Green M,et al.Identification and validation of quantitative trait loci forseed yield,oil and protein contents in two recombinant inbred linepopulations of soybean[J].Molecular Genetics&Genomics,2014,289(5):935-949；Kelly AA,Shaw E,Powers S J,et al.Suppression of the SUGAR-DEPENDENT1,triacylglycerol lipase family during seed development enhances oil yield inoilseed rape(Brassica napus L.)[J].Plant Biotechnology Journal,2013,11(3):355-361；Shi T,Li R,Zhao Z,et al.QTL for yield traits and their associationwith functional genes in response to phosphorus deficiency in Brassica napus[J].Plos One,2012,8(1):1970.)。据含油量20％估算，凤丹籽油产量可达450-1,200kg/ha，凤丹籽仁中不饱和脂肪酸含量为89-92％，其中，α-亚麻酸(C18:3Δ9c,12c,15c，一种omega-3不饱和脂肪酸)含量高于40％(修宇.FpDREB2A基因调控刺槐直根生长抗旱机制及选育改良抗旱优质材料基础研究[D].北京林业大学,2016.)。凤丹已从传统的观赏和药用植物拓展为一种重要的木本油料资源和新资源食品(中华人民共和国卫生部公告2011年第9号[EB/OL].www.moh.gov.cn 2011-03-29)。
凤丹籽油主要存在于胚乳中且组成主要为不饱和脂肪酸，黄曲霉素B1、铅、砷、汞、铬以及过氧化值等均符合国家食品卫生标准(修宇.FpDREB2A基因调控刺槐直根生长抗旱机制及选育改良抗旱优质材料基础研究[D].北京林业大学,2016.)，其α-亚麻酸含量远高于其他四种主要木本植物油(橄榄油，0-1.5％；棕榈油，0.3％；椰子油，0-0.2％；茶油:0.5-0.9％)(Bezard J,Bugaut M,Clement G.Triglyceride composition of coconut oil[J].Journal of Oil&Fat Industries,1971,48(3):134-139；Sabelli P A,Dante R A,Nguyen H N,et al.Expression,regulation and activity of a B2-type cyclin inmitotic and endoreduplicating maize endosperm[J].Frontiers in Plant Science,2013,5(5):561；López-Villalobos A,Rol,Hornung.Changes in fatty acidcomposition during development of tissues of coconut(Cocos nucifera L.)embryos in the intact nut and in vitro[J].Journal of Experimental Botany,2001,52(358):933-942；Nevin K G,Rajamohan T.Virgin coconut oil supplementeddiet increases the antioxidant status in rats[J].Food Chemistry,2006,99(2):260-266；Terés S,Barcelócoblijn G,Benet M,et al.Oleic acid content isresponsible for the reduction in blood pressure induced by olive oil[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2008,105(37):13811-13816；Torstensen B E,Lie,L.Lipidmetabolism and tissue composition in Atlantic salmon(Salmo salar L.)-Effectsof capelin oil,palm oil,and oleic acid-enriched sunflower oil as dietarylipid sources[J].Lipids,2012,35(6):653-664；Wang Y,Tan X F,Xie P,et al.Thephysical and chemical properties of the seed oil and its fatty acidcompositions of Camellia oleifera superior clones species[J].Journal ofCentral South University of Forestry&Technology,2011,31(6):70-74.)，有助于降低人们罹患糖尿病、哮喘、前列腺癌和乳腺癌等疾病的风险(Leitzmann M F,Stampfer M J,Michaud D S,et al.Dietary intake of n-3and n-6fatty acids and the risk ofprostate cancer[J].American Journal of Clinical Nutrition,2004,80(1):204-216；Myles I A,Pincus N B,Fontecilla N M,et al.Effects of parental omega-3fattyacid intake on offspring microbiome and immunity[J].Plos One,2014,9(1):e87181；Thorsdottir I,Hill J,Ramel A.Omega-3 fatty acid supply from milkassociates with lower type 2diabetes in men and coronary heart disease inwomen[J].Preventive Medicine,2004,39(3):630-634；Wu M,Harvey K A,Ruzmetov N,etal.Omega-3polyunsaturated fatty acids attenuate breast cancer growth throughactivation of a neutral sphingomyelinase-mediated pathway[J].InternationalJournal of Cancer Journal International Du Cancer,2005,117(3):340-348.)。而油酸(C18:1Δ9c)、亚油酸(C18:2Δ9c,12c)、α-亚麻酸含量比例分别为23％：25％：44％，约为1：1：2，也是人类脑健康的重要保健食品(Deng R X,Liu Z,Qin L L,et al.Optimization ofsupercritical CO2 extraction and analysis of chemical composition of peonyseed oil[J].Food Science,2010,10:142-145；Li S S,Yuan R Y,Chen L G,etal.Systematic qualitative and quantitative assessment of fatty acids in theseeds of 60tree peony(Paeonia section Moutan DC.)cultivars by GC-MS[J].FoodChemistry,2015,173:133-140.McNamara R K,Carlson S E.Role of omega-3fattyacids in brain development and function:potential implications for thepathogenesis and prevention of psychopathology[J].Prostaglandins,Leukotrienes&Essential Fatty Acids,2006,75(4-5):329-349.)。
综上所述，凤丹抗逆性强，适应性广；种籽产量高，含油量丰富；其种籽油中含有大量不饱和脂肪酸，特别是富含有对人类身体健康有益的omega-3不饱和脂肪酸。2011年中华人民共和国国家发展计划委员会已经批准凤丹成为新资源食品(Su J,Ma C,Liu C,etal.Hypolipidemic activity of peony seed oil rich inα-linolenic,is mediatedthrough inhibition of lipogenesis and upregulation of fatty acidβ-oxidation[J].Journal of Food Science,2016,81(4):H1001-H1009.)，使之成为能够在我国干旱半干旱广袤地区推广应用的重要木本健康油料品种。
脂肪酸合成相关基因的时空表达与植物种籽中脂肪酸组成高度相关(Gu K,Yi C,Tian D,et al.Expression of fatty acid and lipid biosynthetic genes indeveloping endosperm of Jatropha curcas[J].Biotechnology for Biofuels,2012,5(1):47.)。在胚乳组织中，丙二酰-CoA经7轮反应生成C16:0-ACP并延长生成C18:0-ACP；C18:0-ACP经硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)调控脱氢产生C18:1-ACP并水解生成油酸；油酸经脂肪酸脱氢酶2(FAD2)和脂肪酸脱氢酶3(FAD3)调控顺序脱氢生成亚油酸和α-亚麻酸(BatesP D,Stymne S,Ohlrogge J,et al.Biochemical pathways in seed oil synthesis[J].Current Opinion in Plant Biology,2013,16(3):358-364；Huang J,Tong Z,Zhang Q,et al.The mechanism of high contents of oil and oleic acid revealed bytranscriptomic and lipidomic analysis during embryogenesis in Caryacathayensis,Sarg[J].Bmc Genomics,2016,17(1):1-18.)。目前已相继从拟南芥、油茶、麻疯树等植物中克隆获得SAD基因(张党权,谭晓风,陈鸿鹏,等.油茶SAD基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析[J].林业科学,2008,44(02):155-159；罗通.麻疯树的抗冷性和SAD基因的克隆及表达研究[D].四川大学,2006.)；油菜、花生、玉米等植物中克隆获得FAD2基因(谭晓风,陈鸿鹏,张党权,等.油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析[J].林业科学,2008,44(03):70-75；黄冰艳,张新友,苗利娟,等.花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析[J].中国油料作物学报,2008,30(03):290-293；陶芳,朱苏文,范军,等.玉米FAD2基因的克隆及序列分析[J].植物生理与分子生物学学报,2006,32(6):649-656.)，紫苏、亚麻、麻疯树等植物中获得FAD3基因(付瑜华,陈新,王文泉.麻疯树FAD3基因的克隆及亚细胞定位研究[J].热带作物学报,2012,33(11):2030-2034；白瑞英,陆俊杏,黄兴琳,等.紫苏FAD3基因的克隆与表达分析[J].分子植物育种,2015(12)；陈芳.亚麻FAD3基因的克隆及载体构建与遗传转化[D].甘肃农业大学,2014.)。
凤丹转录组分析表明，硬脂酰-ACP脱氢酶基因(PoSAD)、脂肪酸脱氢酶2基因(PoFAD2)和脂肪酸脱氢酶3基因(PoFAD3)在胚乳发育过程中大量表达(修宇.FpDREB2A基因调控刺槐直根生长抗旱机制及选育改良抗旱优质材料基础研究[D].北京林业大学,2016；宋淑香,郭先锋,马燕,等.凤丹(Paeonia ostii)脂肪酸去饱和酶基因PoFAD_2的克隆及表达分析[J].园艺学报,2016,43(02):347-355.)，证实凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因协同调控凤丹种籽中α-亚麻酸的合成和积累，其分工明确，过程连续，是α-亚麻酸合成不可分割的关键基因。本发明所述PoSAD、PoFAD2和PoFAD3基因与同属的草本植物芍药脂肪酸去饱和酶相似性较高，分别为94％、97％和97％，表明同属并非相同；本发明所述PoFAD2基因较文献(宋淑香,郭先锋,马燕,等.凤丹(Paeonia ostii)脂肪酸去饱和酶基因PoFAD_2的克隆及表达分析[J].园艺学报,2016,43(02):347-355.)报道的凤丹FAD2基因相似度最高但是具有两个明显特征：第一，3’非编码区多37个核苷酸；第二，编码蛋白有2个氨基酸残基不同。本发明PoFAD2与文献(宋淑香等，2016)凤丹FAD2可能为同源基因但并非同一基因，其差异可能与基因转录后调控和编码蛋白活性等密切相关(Xiu Y,Iqbal A,Zhu C,etal.Improvement and transcriptome analysis of root architecture byoverexpression of Fraxinus pennsylvanica DREB2A transcription factor inRobinia pseudoacacia L.'Idaho'.[J].Plant Biotechnology Journal,2016.)。上述凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因对提高和改良牡丹籽油的食用价值和品质具有重要的理论意义；对筛选特征不饱和脂肪酸高产的野生品种、定向改良含有特征不饱和脂肪酸的油用品种、以及评价特征不饱和脂肪酸含量和比例符合人们需求的优质高产品种具有重要的应用价值。
发明内容
发明要点一，本发明提供了凤丹α-亚麻酸合成关键酶基因PoSAD(SEQ ID No.1)、PoFAD2(SEQ ID No.3)、PoFAD3(SEQ ID No.5)及凤丹α-亚麻酸合成关键酶基因对应编码的蛋白质(SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6)。
发明要点二，本发明提供了一种脂肪酸脱氢酶基因PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3的制备方法。从发育中的凤丹胚乳组织中提取RNA。然后，构建转录组文库进行高通量转录组测序。经过序列拼接比对和数据生物信息学分析，预测凤丹胚乳发育过程中α-亚麻酸合成关键酶基因序列。然后，利用上述关键基因序列在GenBank上通过BLAST在线程序与其他物种进行比对获得凤丹脂肪酸脱氢酶基因保守序列。设计引物通过RT-PCR扩增基因保守序列。利用保守序列设计引物通过RACE法获得基因3’端和5’端序列。以DNAMAN软件对获得的基因片段进行拼接，分别获得凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因cDNA全长序列。最后设计引物利用RT-PCR扩增得到基因ORF全长序列。
发明要点三，本发明提供了PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因在筛选和定向改良含有特定不饱和脂肪酸组成的植物品种中的应用。依据本发明提供的分子辅助选育方法，利用PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因保守序列设计引物，提取牡丹胚乳RNA，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牡丹胚乳中基因表达量，评价筛选高α-亚麻酸油用牡丹品种。本发明分别构建了PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因重组表达载体，利用转化了所述重组表达载体的农杆菌侵染植物材料获得转基因植物种子，改变了转基因植物种子油中特征不饱和脂肪酸的含量。
附图说明
从下面结合附图的详细叙述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1.本发明中CTAB-LiCl法提取3个发育时期凤丹胚乳RNA电泳图。A：CTAB-LiCl法；B：SDS法；C：Trizol法；D：异硫氰酸胍法。
图2.本发明中的PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因的全长电泳图。M：DNA Marker；1：PoSAD；2：PoFAD2；3：PoFAD3。
图3.PoSAD基因的ORF序列和蛋白质预测序列。
图4.PoFAD2基因的ORF序列和蛋白质预测序列。
图5.PoFAD3基因的ORF序列和蛋白质预测序列。
图6.凤丹胚乳中PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因的表达特征。
图7.图示PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因表达载体构建策略。
图8.转基因植物(拟南芥)种籽中特征脂肪酸含量变化。
具体实施方式
以下通过实施例进一步阐明本发明。但是所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例一
提取凤丹胚乳组织RNA
选择凤丹种籽胚乳组织，按照CTAB-LiCl法提取RNA。具体提取方法如下：65℃预热用于RNA提取的CTAB缓冲液(2％CTAB；2％PVP；0.1mol/L Tris-HCl；25mmol/L EDTA；2.0mol/L NaCl；0.5g/L亚精胺；pH＝8.0)。称取约100mg凤丹胚乳组织在液氮中研磨至粉末状，快速转移到含有800μL CTAB提取缓冲液的离心管中，加入16μLβ-巯基乙醇，颠倒混均。65℃温育5min后转移至冰上冷却。加入等体积的氯仿/异戊醇(v：v＝24：1)，颠倒混匀，10,000rpm，4℃离心10min。小心吸取上清至新的离心管中。重复该步骤一次。小心吸取上清，加入1/4体积的10mol/L LiCl(-20℃保存)，混匀后冰浴中沉淀过夜。10,000rpm，4℃离心20min。弃上清，沉淀溶解于600μL SDS溶液(0.5％，w/v)。加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀。10,000rpm，4℃离心10min。小心吸取上清至新的离心管中。重复该步骤一次。吸取上清约400μL，加入2.5体积无水乙醇(-20℃)和1/10体积的3mol/L NaAc溶液，-20℃沉淀2h。12,000rpm，4℃离心15min，弃上清。加入1mL 70％乙醇清洗沉淀，12,000rpm，4℃离心5min，弃上清。加入30μL DEPC水溶解沉淀。
所得RNA经1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到图1所示结果，CTAB-LiCl法提取RNA的18S和28S条带完整清晰。
实施例二
克隆PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因
转录组测序及分析，利用实施例一所述方法提取凤丹胚乳组织总RNA，以Oligo(dT)富集mRNA并构建cDNA文库，Illumina HiSeqTM 2000进行转录组测序。测序后除去接头序列和低质量序列，以Velvet软件进行从头组装并获得转录本(Zerbino D R,BirneyE.Velvet:algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs[J].Genome Research,2008,18(5):821-829.)。将上述转录本分别比对到GO(http://www.geneontology.org/)、COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)以及KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)数据库中，获得转录本的生物学功能注释。根据转录组基因功能注释和基因表达量分别得到凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因拼接序列。
采集凤丹种籽，以实施例一的方法提取RNA后以RNase Free-DNase(Promega)去除基因组DNA污染，然后利用反转录试剂盒(Promega)获得cDNA序列。
PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因保守序列克隆，根据凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因转录组拼接序列，设计引物序列见下表1。RT-PCR反应体系包括：0.5μl LA Taq(5U/μl,TaKaRa)，5μl Taq Buffer II(10×,TaKaRa)，8μl dNTP Mixture(2.5mM,TaKaRa)，2μlcDNA模板(100ng/μl)，上、下游引物各1μl(10μM)，Nuclease-free Water 32.5μl。反应程序：94℃，10min(1个循环)；95℃，30s，52℃，30s，72℃，1min(30个循环)；72℃，10min(1个循环)。利用T4DNA连接酶(Promega)将RT-PCR所得产物连接到pGEM-T easy载体(Promega)上，热激法转化DH5α(天根)，经测序得到PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因保守序列。
表1.用于保守序列扩增的引物
3’RACE、5’RACE获得PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因全长序列。根据凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因保守序列，设计引物序列见下表2。以3’RACE法(TaKaRa)分别克隆得到PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因3’端序列。
表2.用于3’端序列扩增的引物
根据凤丹PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因保守序列，设计引物序列见下表3。以5’RACE法(TaKaRa)分别克隆得到PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因5’端序列。
表3.用于5’端序列扩增的引物
以DNAMAN软件拼接获得PoSAD(SEQ ID No.1)、PoFAD2(SEQ ID No.3)以及PoFAD3(SEQ ID No.5)基因全长序列。
PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因ORF序列克隆，设计引物序列见下表4进行RT-PCR。RT-PCR反应体系包括：25μl PrimeSTAR Max Premix(2×,TaKaRa)，2μl cDNA模板(100ng/μl)，上、下游引物各1.5μl(10μM)，Nuclease-free Water 20μl。反应程序：94℃，3min(1个循环)；94℃，15s，52℃，15s，72℃，30s(35个循环)；72℃，10min(1个循环)。
表4.用于基因ORF序列扩增的引物
通过对实施例1提取的RNA进行RT-PCR，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测得到如图2所示的结果。图中，第2、3和第4泳道RT-PCR分别得到一条大小约为1479bp、1333bp、1523bp的条带。
回收上述3个条带(UPTECH)后加A尾(TaKaRa)，连接pGEM-T easy载体(Promega)后热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根)，PCR检测后进行基因测序(华大基因)。测序结果证实：在实验中，所谓1479bp的序列为PoSAD基因，序列包含于SEQ ID No.1；所谓1333bp的序列为PoFAD2基因，序列包含于SEQ ID No.3；所谓1523bp的序列为PoFAD3基因，序列包含于SEQ ID No.5。
PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因编码蛋白质序列分析，利用DNAMAN软件以通用密码子预测基因ORF。SEQ ID No.1序列翻译396个氨基酸残基(SEQ ID No.2)(图3)，预测蛋白质大小为45.13KDa，等电点为5.86，利用BLAST比对工具在线比对可以看出，该预测氨基酸序列与其他植物(芍药、柑橘、葡萄、可可)SAD基因具有80％以上相似性，验证该序列为调控油酸合成的SAD基因序列。SEQ ID No.3序列翻译383个氨基酸残基(SEQ ID No.4)(图4)，预测蛋白质大小为44.43KDa，等电点为7.10，该预测氨基酸序列与其他植物(芍药、珙桐、芝麻、咖啡)FAD2基因具有80％以上相似性，验证该序列为调控亚油酸合成的FAD2基因序列。SEQID No.5序列翻译435个氨基酸残基(SEQ ID No.6)(图5)，预测蛋白质大小为49.93KDa，等电点为7.42，该预测氨基酸序列与其他植物(芍药、葡萄、荷花、桉树)FAD3基因具有70％以上相似性，验证该序列为调控α-亚麻酸合成的FAD3基因序列。
实施例三
PoSAD、PoFAD2和PoFAD3基因的表达特征
PoSAD、PoFAD2和PoFAD3基因表达量检测，采集6个不同发育时期的凤丹种籽(S1-S6)，利用实施例一的方法提取RNA后以DNase去除基因组DNA污染，然后反转录获得cDNA序列。根据实施例二所获得基因序列设计如下RT-qPCR引物。利用荧光定量PCR方法对PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因在凤丹种籽不同发育时期表达量进行检测。反应体系包括：10μlRT-qPCR Mix(Promega)，10ng cDNA模板，上、下游引物各0.3μl(10μM)，8.4μl ddH2O。PCR程序：95℃，10min(1个循环)；95℃，15s，52℃，20s，72℃，30s(40个循环)；72℃，10min(1个循环)。以Ubiquitin基因为内参，目的基因表达量最低的时期为标准，利用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。得到如图6的结果，PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因在凤丹种籽发育过程中均有表达，其中PoSAD基因从S2期开始高表达，PoFAD2和PoFAD3基因从S4期开始高表达。
表6.用于RT-qPCR检测的引物
实施例四
PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因功能鉴定
植物表达载体的构建。构建PoSAD、PoFAD2以及PoFAD3基因表达载体，构建策略如图7所示。按照如下序列设计引物，增加SpeI和SalI双酶切位点，通过PCR方法在基因两段分别引入上述两个限制性酶切位点(上游为SpeI下游为SalI)并连接在T载体上转化大肠杆菌DH5α，提取的质粒进行双酶切后得到带有黏性末端的基因片段；pBin438载体(参见专利号：ZL00103561.4；李太元,田颖川,秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学,1994,24(3):276-282.)双酶切后回收大片段，利用T4DNA连接酶将目的基因插入pBin438植物表达载体中，分别获得三种表达载体pBin438-P35S-35S-PoSAD、pBin438-P35S-35S-PoFAD2和pBin438-P35S-35S-PoFAD3，测序验证后转化农杆菌菌株GV3101。
表5.用于植物表达载体构建的引物
转基因拟南芥测定其种子中特征不饱和脂肪酸含量。以pBin438载体作为阴性对照，pBin438-P35S-35S-PoSAD、pBin438-P35S-35S-PoFAD2和pBin438-P35S-35S-PoFAD3表达载体分别转化拟南芥(农杆菌介导的花粉管通道法)，收获种子(T1代)后在含有卡那霉素100mg/L的MS培养基上筛选转基因拟南芥，获得转基因拟南芥种子(T2代)。
提取转基因拟南芥种子脂肪酸，甲酯化后利用高效气相色谱分析其脂肪酸组成(Liu Y F,Li Q T,Lu X,et al.Soybean GmMYB73,promotes lipid accumulation intransgenic plants[J].Bmc Plant Biology,2013,14(1):1-16.)。如图8所示，转基因拟南芥种子中主要脂肪酸含量变化明显，相应不饱和脂肪酸含量提高。其中，超表达PoSAD基因的转基因拟南芥种子中C18:1和C20:1含量显著增高，超表达PoFAD2基因拟南芥种子中C18:2含量显著增高，超表达PoFAD3基因拟南芥种子中C18:3含量显著提高。

Claims (7)

1.凤丹α-亚麻酸合成关键酶编码基因及其编码蛋白，其特征在于：
(a)硬脂酰-ACP脱氢酶基因PoSAD及其编码蛋白，调控硬脂酸转化为油酸；
(b)脂肪酸脱氢酶基因PoFAD2及其编码蛋白，调控油酸转化为亚油酸；
(c)脂肪酸脱氢酶基因PoFAD3及其编码蛋白，调控亚油酸转化为α-亚麻酸。
2.根据权利要求1所述的PoSAD基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；其编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；在凤丹胚乳发育过程中调控硬脂酸转化为油酸。
3.根据权利要求1和所述的PoFAD2基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；其编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；在凤丹胚乳发育过程中调控油酸转化为亚油酸。
4.根据权利要求1所述的PoFAD3基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；其编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列，在凤丹胚乳发育过程中调控亚油酸转化为α-亚麻酸。
5.根据权利要求1-4所述的凤丹α-亚麻酸合成关键酶及其编码基因，其特征在于PoSAD、PoFAD2、PoFAD3及其编码蛋白为α-亚麻酸合成过程中功能明确，过程连续，不可分割的关键基因及其编码蛋白。
6.根据权利要求1和5所述的特征，其特征在于PoSAD、PoFAD2、PoFAD3可以通过基因序列、核酸或蛋白表达量、特征脂肪酸测试分析评价其调控功能。
7.根据权利要求1-6所述特征，其特征在于PoSAD、PoFAD2、PoFAD3用于凤丹及其同类油用植物育种，筛选特征不饱和脂肪酸的野生品种；定向改良特定品种的特征不饱和脂肪酸产量和品质；评价特征不饱和脂肪酸含量优质高产品种；尤其是油酸、亚油酸和α-亚麻酸比例符合人们需要的优质高产品种。
CN201610682329.XA 2016-08-18 2016-08-18 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用 Pending CN106244604A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610682329.XA CN106244604A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610682329.XA CN106244604A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106244604A true CN106244604A (zh) 2016-12-21

Family

ID=57591718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610682329.XA Pending CN106244604A (zh) 2016-08-18 2016-08-18 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106244604A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591326A (zh) * 2017-03-10 2017-04-26 青岛农业大学 辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的专用引物
CN108070603A (zh) * 2017-12-28 2018-05-25 河南健特生物科技集团有限公司 一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法
CN108165556A (zh) * 2018-02-27 2018-06-15 浙江大学 低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用
CN109430051A (zh) * 2018-10-22 2019-03-08 北京林业大学 一种油用牡丹矮化抗逆品种选育技术
CN111269897A (zh) * 2020-02-24 2020-06-12 上海辰山植物园 一种编码凤丹δ15脂肪酸去饱和酶的dna序列及其应用
CN111304237A (zh) * 2020-01-19 2020-06-19 北京林业大学 一种高油抗逆牡丹选育方法
CN118441094A (zh) * 2024-06-03 2024-08-06 中国科学院植物研究所 与牡丹不饱和脂肪酸含量相关的Indel分子标记及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105494105A (zh) * 2016-01-18 2016-04-20 北京林业大学 一种牡丹组织培养容器苗技术

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105494105A (zh) * 2016-01-18 2016-04-20 北京林业大学 一种牡丹组织培养容器苗技术

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "KJ441080.1", 《GENBANK》 *
姜瑶: "芍药种子中α-亚麻酸生物合成相关基因的克隆与表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
宋淑香等: "凤丹（Paeonia ostii）脂肪酸去饱和酶基因PoFAD2", 《园艺学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591326A (zh) * 2017-03-10 2017-04-26 青岛农业大学 辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的专用引物
CN108070603A (zh) * 2017-12-28 2018-05-25 河南健特生物科技集团有限公司 一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法
CN108070603B (zh) * 2017-12-28 2021-06-08 洛阳健特药业有限公司 一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法
CN108165556A (zh) * 2018-02-27 2018-06-15 浙江大学 低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用
CN109430051A (zh) * 2018-10-22 2019-03-08 北京林业大学 一种油用牡丹矮化抗逆品种选育技术
CN111304237A (zh) * 2020-01-19 2020-06-19 北京林业大学 一种高油抗逆牡丹选育方法
CN111304237B (zh) * 2020-01-19 2022-04-01 北京林业大学 一种高油抗逆牡丹选育方法
CN111269897A (zh) * 2020-02-24 2020-06-12 上海辰山植物园 一种编码凤丹δ15脂肪酸去饱和酶的dna序列及其应用
CN118441094A (zh) * 2024-06-03 2024-08-06 中国科学院植物研究所 与牡丹不饱和脂肪酸含量相关的Indel分子标记及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106244604A (zh) 凤丹α‑亚麻酸合成酶编码基因及其应用
CN105475117B (zh) 大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法
Li et al. Fatty acid composition of developing tree peony (Paeonia section Moutan DC.) seeds and transcriptome analysis during seed development
CN102202498B (zh) 改良的棉籽油及应用
Salehi Jouzani et al. Fueling the future; plant genetic engineering for sustainable biodiesel production
ES2645787T3 (es) Ciertas plantas con niveles reducidos de ácidos grasos saturados o sin ácidos grasos saturados en las semillas, y aceite que se obtiene a partir de las semillas
Razeghi-Jahromi et al. Sequence characterization and temporal expression analysis of different SADs and FAD2-2 genes in two Iranian olive cultivars
US20150320002A1 (en) Isolation and Use of FAD2 and FAE1 From Camelina
Tan et al. The molecular mechanism of WRINKLED1 transcription factor regulating oil accumulation in developing seeds of castor bean
JP2011505163A5 (zh)
Cook et al. Modification of fatty acid composition in tomato (Lycopersicon esculentum) by expression of a borage Δ 6-desaturase
CN108795898A (zh) 一种促进植物种子亚麻酸积累的基因的应用
CN109943587B (zh) PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用
CN109415737A (zh) 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
CN114990153B (zh) 水稻脂质转移蛋白在提高稻米脂肪酸含量和降低稻米垩白度中的应用
CN107312077A (zh) 蜡梅CpSOC1基因及其编码的蛋白和应用
CN110117598A (zh) 芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用
CN109837290B (zh) ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因植物中的应用
CN106929518A (zh) 一种橡胶树HbAG基因及其应用
KR101382402B1 (ko) 왜성 및 측지 발달 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물
CN102021188A (zh) 白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途
JP2023512376A (ja) ブラシカ・ジュンセア系統ｎｕｂｊ１２０７
Heddleson et al. High-oleic oils: Future developments and technologies
Habibi et al. Studying the expression pattern of PMP3 and dehydrin genes in AS5305 and 9CSA3 oily sunflower lines under salt stress
Lee et al. Analysis of expressed sequence tags from a normalized cDNA library of perilla (Perilla frutescens)

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination