CN111269897A

CN111269897A - 一种编码凤丹δ15脂肪酸去饱和酶的dna序列及其应用

Info

Publication number: CN111269897A
Application number: CN202010113544.4A
Authority: CN
Inventors: 于水燕; 胡永红; 张晓�; 吕玉平; 袁军辉; 姚祖杰; 张颖; 张晓骁
Original assignee: Shanghai Jiangnan Peony Research Institute; SHANGHAI CHENSHAN BOTANICAL GARDEN
Current assignee: Shanghai Jiangnan Peony Research Institute; SHANGHAI CHENSHAN BOTANICAL GARDEN
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明涉及一种编码凤丹Δ15脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。本发明基于牡丹基因组数据和凤丹种子发育过程转录组数据，在凤丹中注释到omega 3 FAD的编码基因。根据基因编码序列，设计引物，扩增得到微体型FAD3基因Pofad3_4的DNA全长和CDS全长序列，在外源模式生物中表达基因的ORF，认证Δ15脂肪酸去饱和酶基因的功能从而弄清楚该基因对ALA合成代谢的作用。本发明为初步探讨凤丹在种子发育时期快速高效积累ALA的代谢途径及分子机理，以及开发高产ALA的生物合成体系提供了坚实的基础和理论依据。

Description

一种编码凤丹Δ15脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种编码凤丹Δ15脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。

背景技术

α-亚麻酸(C18:3^Δ9,12,15，α-linolenic acid，ALA)，属ω-3系列多不饱和脂肪酸，为人类必需脂肪酸，是DHA和EPA的合成前体，具有促进大脑发育、预防神经和心脑血管疾病、降低血脂和抑制衰老等重要作用，对人体正常发育和生长代谢尤其是对孕妇和婴幼儿发育起着至关重要的作用。FAO/WHO推荐饮食中ω-6与ω-3脂肪酸的比例应低于5，然而，现代日常饮食中高ω-6与ω-3的比值(15:1～20:1)被认为是心脑血管疾病的主要原因，因为传统油料作物(大豆、花生、玉米、向日葵和油菜)中具有相对较低的ALA含量。人体由于缺乏ω-3脂肪酸脱氢酶，不能使亚油酸转化为ALA，所以必须依靠食物来获取。目前，ALA的来源主要是深海鱼油，但中国深海鱼油资源较为贫乏，而日常的食用油中油酸和亚油酸的含量较为丰富，但ALA的含量却很低。在正常饮食情况下，人体往往不能足量摄入所需的ALA，致使中国人群膳食中普遍缺乏ALA，因此，挖掘和开发富含ALA的植物资源具有重要的应用价值。

牡丹(Paeonia section Moutan DC)属于芍药科芍药属牡丹组木本植物。油用牡丹是一种新兴的木本油料作物，具备高产量、高含油率、高品质和低成本的特点。2011年我国国家食品药品监督管理局批准凤丹(P.ostii)和紫斑牡丹(P.rockii)的籽油为新资源食品，ALA含量高达45％。我国牡丹共有9个野生种和很多不同的品种，种子的脂肪酸含量存在较大的差异。通过对不同野生种的牡丹种子脂肪酸检测分析表明，共检测到14种不同的脂肪酸，不饱和脂肪酸含量高达90％，其中ALA含量达到50％，ω6/ω3的比值均小于1，因此，牡丹籽油可以作为高品质的食用油。

植物种子脂肪酸合成主要包括质体中的从头合成和内质网的酰基编辑。质体中乙酰-CoA在乙酰辅酶A羧化酶以及脂肪酸合成酶复合体作用下，逐步合成为棕榈酰-ACP和硬脂酰-ACP，稍后硬脂酰-ACP在硬脂酰-ACP去饱和酶作用下，合成油脂酰-ACP。这些脂肪酸再经过2个途径的去饱和进一步形成多不饱和脂肪酸。一条是存在于质体中依赖于糖脂经过脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase，FAD)FAD6、FAD7和FAD8的去饱和途径；另一条是输出到内质网依赖于磷脂经过FAD2和FAD3的去饱和途径。FAD3、FAD7和FAD8同属于omega3FAD，催化亚油酸(C18:2^Δ9,12，linoleic acid，LA)形成ALA，是ALA形成的关键酶。

寻找omega 3FAD的编码基因，对于研究ALA合成代谢的机制、开发高产ALA的生物合成体系具有重要的意义。

专利文献CN106244604A，公开日2016.12.21，公开了凤丹α-亚麻酸合成的三个关键酶编码基因及其应用，其中，凤丹硬脂酰-ACP脱氢酶(PoSAD)编码基因调控硬脂酸转化成油酸，凤丹脂肪酸脱氢酶2(PoFAD2)编码基因调控油酸转化成亚油酸，凤丹脂肪酸脱氢酶3(PoFAD3)编码基因调控亚油酸转化为α-亚麻酸。

然而，仍有必要探索更多的omega 3FAD编码基因。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新的凤丹Δ15脂肪酸去饱和酶、编码基因和它们的应用。

第一方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

第二方面，本发明提供了一种分离的核苷酸，所述核苷酸编码如上所述多肽。

优选地，所述核苷酸其序列含有下列中的任一种：

a)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

b)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

c)与以上a)或b)所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体是由如上所述核苷酸与质粒或病毒所构建的重组表达载体。

第四方面，本发明提供了一种基因工程化的宿主细胞，所述宿主细胞选自下列中的一种：

a)用如上所述核苷酸转化或转导的宿主细胞；

b)用如上所述重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、不具备细胞全能性的植物细胞或不具备细胞全能性的动物细胞。

第五方面，本发明提供了如上所述多肽、如上所述核苷酸、如上所述重组表达载体、如上所述宿主细胞在促进Δ15脂肪酸去饱和酶表达中的用途。

第六方面，本发明提供了如上所述多肽、如上所述核苷酸、如上所述重组表达载体、如上所述宿主细胞在增加α-亚麻酸产量中的用途。

第七方面，本发明提供了一种将亚油酸转化为α-亚麻酸的方法，所述方法是基于表达如上所述多肽的质粒的转化酵母菌实现的。

优选地，所述转化酵母菌的培养温度为15-20℃。

本发明优点在于：

我们基于牡丹基因组数据和凤丹种子发育过程转录组数据，在凤丹中共注释到5个omega 3FAD的编码基因，与拟南芥的FAD3、FAD7和FAD8基因聚类分析发现凤丹中有4个微体型FAD3基因(Pofad3_1、Pofad3_2、Pofad3_3和Pofad3_4)和1个质体型FAD7/8基因(Pofad7/8)。根据基因编码序列，设计引物，扩增得到Pofad3_4的DNA全长和CDS全长序列，在外源模式生物中表达基因的ORF，认证Δ15脂肪酸去饱和酶基因的功能从而弄清楚该基因对ALA合成代谢的作用。(1)本发明为初步探讨凤丹在种子发育时期快速高效积累ALA的代谢途径及分子机理以及开发高产ALA的生物合成体系提供了坚实的基础和理论依据；(2)本发明证实所述Pofad3_4蛋白具有较高的产物转化率，能更快、更多的将底物转化为ALA，显著优于获得的其他脂肪酸脱氢酶；(3)本发明发现在酵母体系中，培养温度为15-20℃可显著提高α-亚麻酸转化效率。

附图说明

图1：PoFAD3_4基因的CDS和DNA序列扩增电泳图谱。M：分子量标准Marker 5000；1：目的基因的DNA序列长度为2106bp；2：目的基因的CDS序列长度为1395bp。

图2：PoFAD3_4基因DNA全长结构示意图。

图3：GC-MS检测分析酵母脂肪酸甲酯。a：添加底物LA培养野生型酵母；b：添加底物LA培养转GFP酵母；c：添加底物LA培养转PoFAD3_4基因酵母和产物ALA的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

主要研究内容如下：

1.根据牡丹基因组和转录组数据获得Δ15脂肪酸去饱和酶基因(Pofad3_4)的编码序列，设计引物cdsF(SEQ ID NO:1)和cdsR(SEQ ID NO:2)以提取种子mRNA反转录得到cDNA为模板进行PCR扩增，得到去饱和酶基因的CDS全长序列(SEQ ID NO:7)。设计引物dnaF(SEQ ID NO:3)和dnaR(SEQ ID NO:4)以提取种子DNA为模板进行PCR扩增，得到该基因的DNA全长序列(SEQ ID NO:8)。

2.根据以上获得的Pofad3_4基因的CDS和DNA序列，分析后获得该基因DNA全长结构，共具有8个内含子和9个外显子，如图2。

3.根据Gateway表达系统和Pofad3_4基因ORF序列特征设计引物orfF(SEQ ID NO:5)和orfR(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增得到接入attB位点的目的基因的ORF序列，与入门载体pDonr207进行BP重组反应后得到含有Pofad3_4基因ORF的重组载体pD-fad3_4。

4.将重组载体pD-fad3_4与最终载体pYES-DEST52进行LR重组反应后筛选获得含有目的基因的重组表达载体pY-fad3_4。

5.应用Frozen-EZ Yeast Transformation II TM试剂盒制备酵母菌株INVSc1(His–、Leu–、Trp–、Ura–缺陷型)感受态细胞，将重组载体pY-fad3_4转化感受态细胞，应用尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U)进行筛选，得到转化株pY34。

6.酵母转化株pY34在不同温度28℃、25℃、20℃、15℃、10℃和5℃培养下，添加底物LA，半乳糖诱导表达1h、5h、12h、24h、48h和72h后，收集酵母，冷冻干燥。甲醇-硫酸的方法进行脂肪酸甲酯化。

7.气质联谱(GC-MS)检测脂肪酸甲酯，证明在FAD3_4作用下添加的底物C18:2^Δ9,12被脱氢去饱和为C18:2^Δ9,12,15。并且FAD3_4的产物转化率受温度影响，最适温度是20℃；在该温度下，产物随着时间延长而积累。

具体实验如下：

1.材料

1)引种的凤丹植株栽培于上海辰山植物园(31°4′52″N,121°10′14″E)牡丹养护基地，在同一条件下生长超过10年。在种子开始迅速积累油脂的时期采收，于液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。

2)酵母INVSc1菌株(His–,Leu–,Trp–,Ura–缺陷型)由上海海洋大学周志刚教授馈赠。Gateway系统的克隆载体pDonr207和表达载体pYES-DEST52由中国科学院上海辰山植物科学研究中心赵清副教授馈赠。酵母菌株于YPD培养基中30℃ 180rpm振荡培养。

2.方法

1)利用E.Z.N.A.

HP Plant RNA试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取凤丹种子RNA，利用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根生化公司)进行cDNA第一链合成；利用植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物公司)提取凤丹种子DNA。

2)根据引物cdsF和cdsR以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25μL：PCR buffer2.5μL,dNTP 2μL,Mg²⁺2μL,cDNA模板2μL，引物cdsF 1μL,引物cdsR 1μL,exTaq酶0.25μL,无菌水14.25μL。扩增条件为94℃预变性5min；35个循环包含94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min得到去饱和酶基因的CDS。根据引物dnaF和dnaR以DNA为模板应用longTag酶进行PCR扩增，反应体系25μL：10×long Taq buffer 2.5μL,dNTP 2μL,cDNA模板0.5μL，引物dnaF 1μL,引物dnaR 1μL,long Taq酶0.5μL,无菌水17.5μL。扩增条件为94℃预变性30s；30个循环包含94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸4min；最后72℃延伸5min得到去饱和酶基因的DNA序列，与CDS比较确定内含子序列。

3)根据Gateway反应入门载体pDonr207和PoFAD3_4基因的ORF序列设计引物orfF和orfR，进行PCR扩增，以此将attB位点整合到目的基因上。反应体系为50μL：Q5热启动超保真2×预混液25μL，模板cDNA 500ng，10μM引物orfF和orfF各2.5μL，ddH2O补至50μL。扩增条件为98℃预变性30s，35个循环包括98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延长2min；最后72℃延伸2min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，试剂盒回收目的条带，并用Nanodrop 2000c(Thermo)检测浓度。

4)将回收的PCR产物与入门载体pDonr207进行BP重组反应，于冰上配置5μL反应体系：目的基因PCR产物450ng，入门载体pDonr207 150ng，Gateway BP Clonase II EnzymeMix 0.5μL，1×TE(pH8.0)溶液补充至5μL。25℃温育5h后再加入0.5μL proteinase K溶液终止反应，37℃温育10min。然后将全部反应物用热激法转化TOP 10感受态细胞，涂布于含20mg/L庆大霉素的LB筛选培养基上，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆于2.5mL含20mg/L庆大霉素的LB液体培养基中生长12h后进行菌液PCR鉴定，菌液送到上海生工生物科技有限公司测序保证目的基因的序列准确性。将测序正确的菌液进行质粒提取并测取浓度，获得含有目的基因的重组入门载体pD-fad3_4。

5)将含有目的基因的重组入门载体pD-fad3_4与最终载体pYES-DEST52进行LR重组反应，于冰上配置5μL反应体系：重组入门载体pD-fad3_4 450ng，最终载体pYES-DEST52150ng，Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 0.5μL，1×TE(pH8.0)溶液补充至5μL。25℃温育5h，再加入0.5μL proteinase K溶液终止反应，37℃温育10min。然后将全部反应物热激法转化TOP 10感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄的LB筛选培养基上，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆于2.5mL含100mg/L氨苄的LB液体培养基中生长12h后进行菌液PCR鉴定，菌液送到上海生工生物科技有限公司测序保证目的基因的序列准确性。将测序正确的菌液进行质粒提取并测取浓度，获得含有目的基因的重组表达载体pY-fad3_4。按照上述方法构建gfp基因的重组表达载体pY-gfp作为阳性对照组。

6)利用Frozen-EZ Yeast Transformation II TM试剂盒进行酵母感受细胞的制备以及重组表达载体pY-fad3_4的酵母转化实验。将酿酒酵母INVSc1细胞于10mL YPD培养基中28℃、220rpm振荡培养至OD 600＝0.8～1.0，室温下500rcf离心4min弃上清液。加入10mL EZ 1solution重悬菌体，再次500rcf离心4min弃上清液。加入1mL EZ 2solution溶液重悬菌体，此时制得酵母感受态细胞。保存菌种时要用2-6层纸巾包裹EP管，放在泡沫盒中再存入-80℃冰箱中，使其缓慢冷冻，不可液氮速冻。

7)取上述6)制得的酵母感受态细胞50μL加入0.2μg(＜5μL)重组表达质粒pY-fad3_4和pY-gfp，再加入500μL EZ 3solution溶液，彻底混匀。30℃水浴45min，期间用手指波弹混匀2-3次。5000rpm短暂离心30s，弃上清，留100μL涂布于尿嘧啶缺陷合成筛选培养基(SC-U)上，28℃倒置培养48-72h，直至形成单菌落。挑取单菌落于SC-U液体培养基中培养，菌液PCR验证后获得转入pY-fad3_4质粒的转化株pY34，用含25％甘油的SC-U培养基保存菌种。

8)将带有pY-fad3_4和pY-gfp的酵母菌液和酵母菌INVSc1分别接种于YPD培养基中，28℃以220rpm转速振荡培养。然后离心收集菌液，重悬于2％半乳糖YPD培养基中，加入底物亚油酸至终浓度为0.005％，并加入表面活性剂1％Tergitol type NP-40。分别在28℃、25℃、20℃、15℃、10℃和5℃以180rpm转速振荡培养，在1h、5h、12h、24h、48h、72h共6个时间点分别离心收集酵母菌体，经去离子水洗涤3次后液氮冻存。每个样品工作3个生物学重复。

9)液氮速冻后的酵母在真空冷冻干燥机(Labconco)内冻干，进行酵母的脂肪酸甲酯化。C19作为内标，配置贮液浓度为1mg/mL，每个样品中加入50μL。冻干后的酵母粉分别称取25mg，溶于2mL含2％浓硫酸的甲醇溶液，涡旋振荡1min，充氮气以排除空气避免氧化。将酯化瓶盖旋紧于85℃水浴中进行酯化反应1h(确保盖子拧紧避免高温下有机液体挥发)，反应结束后涡旋振荡2min。向酯化瓶中加入1mL超纯水结束酯化反应，再加入1mL正己烷，充分混匀。4000rpm离心10min，收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩至正己烷完全挥发。样品重新溶于500μL正己烷用于上机检测。

10)应用GC-MS检测脂肪酸甲酯及分析。色谱柱为HP-88型毛细管柱(30m×0.25mm×0.2μm)；升温程序为70℃保留1min，10℃/min升温至210℃用于0min，3℃/min升温至230℃用于5min；分流比为20:1；进样量为1μL。脂肪酸的定性分析采用标准品(37种脂肪酸标准品，Sigma)和执行谱库检索两种方法进行，质谱数据库参考NIST MS Search 2.0。脂肪酸定量分析采用内标法。

3.结果

1)获得Pofad3_4基因的CDS(SEQ ID NO:7)和DNA全长序列(SEQ ID NO:8)。Pofad3_4蛋白序列为SEQ ID NO:9。

2)选用Gateway表达系统成功构建了Pofad3_4基因的重组表达载体pD-fad3_4。

3)将重组载体pY-fad3_4成功转入制备的酵母菌株INVSc1(His–、Leu–、Trp–、Ura–缺陷型)感受态细胞，应用尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U)进行筛选转基因菌株，验证后获得转入pY-fad3_4质粒的转化株pY34。载体上有编码尿嘧啶的URA3基因，酵母INVSc1是Ura–缺陷型菌株，因此转入pY-fad3_4质粒的酵母能够在尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U)上生长。

4)酵母转化株pY34在不同温度28℃、25℃、20℃、15℃、10℃和5℃培养下，培养基中添加外源底物亚油酸，经半乳糖诱导后，分别在1h、5h、12h、24h、48h和72h后，收集酵母检测脂肪酸甲酯化。结果显示FAD3_4基因在酵母中能将亚油酸(C18:2^Δ9,12)脱氢产生ALA(C18:2^Δ9,12,15)，并且FAD3_4的产物转化率受温度影响，最适温度是15℃～20℃；在该温度下，产物随着时间延长而积累(表1和表2)。

表1转基因酵母在不同温度下添加外源LA培养72h后脂肪酸组分(占总脂肪酸的％)的比较

表2转基因酵母在20℃温度下添加外源LA及培养不同时间后脂肪酸组分(占总脂肪酸的％)的比较

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海辰山植物园

上海江南牡丹研究所

<120> 一种编码凤丹△15脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用

<130> /

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggagatg acttcagatt t 51

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttaatctgcc ttgccacgga 50

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acaccttcca tgtcttcaag ga 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggagatg acttcagatt t 51

<210> 6

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<212> DNA

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttaatctgcc ttgccacgga 50

<210> 7

<211> 1395

<212> DNA

<213> Paeonia ostii

<400> 7

taaattcata acgatatggt catacgtgca agttaagaag tagaaccaat ttgaatgaga 60

tggagatgac ttcagatttc agtgacaatg gcaagttcga cccaagtgca ccccctccat 120

tccgtattgc tgatgttcga gccgccattc ccaagcactg ttgggtgaag gatccatgga 180

ggtcactgag ttacgttttg agggatgtca ttgttgtttt tgggctggca gccattgcta 240

tttacttcaa cagctggctt gtttggcctt tctactgggc tgctcagggg actatgttct 300

gggctctgtt tgttcttggg catgattgtg gtcatggaag cttttctgac ctgccctggt 360

tgaatagcct tgtgggtcat ctcttacaca gttcaattct tgtaccctac catggctgga 420

gaataagtca cagaactcac catcagaacc atggaaatgt agagaaagat gaatcatggg 480

tcccgattcc tgagaaggtg tacaaagaac tggacattac tactcgtttt atgagattca 540

cagtgccatt tcctctgtta gcctatcctt tctatttgtg gtggagaagt ccaggaaaaa 600

ctgggtctca ctatgaccct aacagtgatt tgttcactcc tgctgagaag atggatgtta 660

tcatctctac atcatgttgg actgtaatgg ttgctctgct agcctattta aacatcgttg 720

ttgggcctgt ccccatgctt aaaatctatg gagttccata tatgattttt gtaatgtggc 780

tggattttgt gacttatttg catcaccatg gttatgacag tgaagttcct tggtatcgtg 840

gagaggaatg gaattattta agaggagggc ttacaacaat tgatcgtgat tatggattgt 900

ttaatgacat ccaccatgac attggcaccc atgttgtaca tcatctcttc cctcaaatcc 960

cacattacca cttgatagaa gcgacgaagg cagctaagcc agtgcttggc aagtattacc 1020

gagagcctaa gaaatctggg ccttttcctt ttcatttgat tggatattta gtcagaagca 1080

tgaaacagga ccactacgtt agtgacactg gaaatgttgt gttctaccag actgaccctc 1140

agctctatcg atttttccgt ggcaaggcag attaagagta ctttggacgg atatgatatg 1200

aatgtaaaac tagaaggctt ttgtcaagta cctacatgtt tatgttgaat tgtgttgaca 1260

tatcatcaat aaaagaagtg gaatgcagga ttgtgtgtca tctctctcat gttgtaatgt 1320

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tgaaattaaa gtaca 1395

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<211> 2106

<212> DNA

<213> Paeonia ostii

<400> 8

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tggagatgac ttcaggtata cttcttccga gtttgttctt tgtacaaggc tttaggtaat 120

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aagcactgtt gggtgaagga tccatggagg tcactgagtt acgttttgag ggatgtcatt 300

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atggaaatgt agagaaagat gaatcatggg tcccggtagt ttatcttgct atttttaact 780

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tataatttca ccttttcttt cagattcctg agaaggtgta caaagaactg gacattacta 900

ctcgttttat gagattcaca gtgccatttc ctctgttagc ctatcctttc tatttggtag 960

gaatgcctct ttggcttatc accttttttt ttagttgaat taatattgac gtttgtttta 1020

tcagtggtgg agaagtccag gaaaaactgg gtctcactat gaccctaaca gtgatttgtt 1080

cactcctgct gagaagatgg atgttatcat ctctacatca tgttggactg taatggttgc 1140

tctgctagcc tatttaaaca tcgttgttgg gcctgtcccc atgcttaaaa tctatggagt 1200

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gtggttcact ttcatttatt ttaaccctgc agatttttgt aatgtggctg gattttgtga 1320

cttatttgca tcaccatggt tatgacagtg aagttccttg gtatcgtgga gaggtgaatc 1380

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tacaacaatt gatcgtgatt atggattgtt taatgacatc caccatgaca ttggcaccca 1560

tgttgtacat catctcttcc ctcaaatccc acattaccac ttgatagaag cggtatgtag 1620

aattgcaaat atccttattt ttttattaaa ttgattttat taactgatta ttatttgttt 1680

tggattctat gtagacgaag gcagctaagc cagtgcttgg caagtattac cgagagccta 1740

agaaatctgg gccttttcct tttcatttga ttggatattt agtcagaagc atgaaacagg 1800

accactacgt tagtgacact ggaaatgttg tgttctacca gactgaccct cagctctatc 1860

gatttttccg tggcaaggca gattaagagt actttggacg gatatgatat gaatgtaaaa 1920

ctagaaggct tttgtcaagt acctacatgt ttatgttgaa ttgtgttgac atatcatcaa 1980

taaaagaagt ggaatgcagg attgtgtgtc atctctctca tgttgtaatg tttcaaatca 2040

gctagaattt acttgcacca ttagtttgat tgttaaagct tatttaacac atgaaattaa 2100

agtaca 2106

<210> 9

<211> 371

<212> PRT

<213> Paeonia ostii

<400> 9

Met Glu Met Thr Ser Asp Phe Ser Asp Asn Gly Lys Phe Asp Pro Ser

1 5 10 15

Ala Pro Pro Pro Phe Arg Ile Ala Asp Val Arg Ala Ala Ile Pro Lys

20 25 30

His Cys Trp Val Lys Asp Pro Trp Arg Ser Leu Ser Tyr Val Leu Arg

35 40 45

Asp Val Ile Val Val Phe Gly Leu Ala Ala Ile Ala Ile Tyr Phe Asn

50 55 60

Ser Trp Leu Val Trp Pro Phe Tyr Trp Ala Ala Gln Gly Thr Met Phe

65 70 75 80

Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys Gly His Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Asp Leu Pro Trp Leu Asn Ser Leu Val Gly His Leu Leu His Ser Ser

100 105 110

Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile Ser His Arg Thr His His

115 120 125

Gln Asn His Gly Asn Val Glu Lys Asp Glu Ser Trp Val Pro Ile Pro

130 135 140

Glu Lys Val Tyr Lys Glu Leu Asp Ile Thr Thr Arg Phe Met Arg Phe

145 150 155 160

Thr Val Pro Phe Pro Leu Leu Ala Tyr Pro Phe Tyr Leu Trp Trp Arg

165 170 175

Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser His Tyr Asp Pro Asn Ser Asp Leu Phe

180 185 190

Thr Pro Ala Glu Lys Met Asp Val Ile Ile Ser Thr Ser Cys Trp Thr

195 200 205

Val Met Val Ala Leu Leu Ala Tyr Leu Asn Ile Val Val Gly Pro Val

210 215 220

Pro Met Leu Lys Ile Tyr Gly Val Pro Tyr Met Ile Phe Val Met Trp

225 230 235 240

Leu Asp Phe Val Thr Tyr Leu His His His Gly Tyr Asp Ser Glu Val

245 250 255

Pro Trp Tyr Arg Gly Glu Glu Trp Asn Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr

260 265 270

Thr Ile Asp Arg Asp Tyr Gly Leu Phe Asn Asp Ile His His Asp Ile

275 280 285

Gly Thr His Val Val His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr His

290 295 300

Leu Ile Glu Ala Thr Lys Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Lys Tyr Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Pro Lys Lys Ser Gly Pro Phe Pro Phe His Leu Ile Gly Tyr

325 330 335

Leu Val Arg Ser Met Lys Gln Asp His Tyr Val Ser Asp Thr Gly Asn

340 345 350

Val Val Phe Tyr Gln Thr Asp Pro Gln Leu Tyr Arg Phe Phe Arg Gly

355 360 365

Lys Ala Asp

370

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码权利要求1所述多肽。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸其序列含有下列中的任一种：

a)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

b)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

c)与以上a)或b)所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是由权利要求2所述核苷酸与质粒或病毒所构建的重组表达载体。

5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下列中的一种：

a)用权利要求2或3所述核苷酸转化或转导的宿主细胞；

b)用权利要求4所述重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、不具备细胞全能性的植物细胞或不具备细胞全能性的动物细胞。

7.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述核苷酸、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5或6所述宿主细胞在促进Δ15脂肪酸去饱和酶表达中的用途。

8.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述核苷酸、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5或6所述宿主细胞在增加α-亚麻酸产量中的用途。

9.一种将亚油酸转化为α-亚麻酸的方法，其特征在于，所述方法是基于表达权利要求1所述多肽的质粒的转化酵母菌实现的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转化酵母菌的培养温度为15-20℃。