CN114891653B - 一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，属于生物工程领域。该高产神经神经酸的重组解脂耶氏酵母菌，保藏编号为CCTCC NO：M 20211245。该重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，将Δ12去饱和酶、过氧化物酶体生物发生因子10和三酰甘油脂肪酶4敲除盒，所述乙酰辅酶A羧化酶、NAD+3‑磷酸甘油脱氢酶、脂肪酸延长酶1、蒜头果二酰甘油酰基转移酶、拟南芥β‑酮脂酰辅酶A合酶、β‑酮脂酰辅酶A合酶、高山被孢霉的omega‑9去饱和酶、高山被孢霉的脂肪酸延长酶2等的表达盒导入解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产神经酸。

Description

一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术
神经酸(Nervonic acid,C24:1)，学名：顺-15-二十四碳烯酸，是一种ω-9型超长链单不饱和脂肪酸，其最早发现于哺乳动物的神经组织，故名神经酸。神经酸是大脑神经细胞和组织的核心天然成分，是迄今为止世界上发现的唯一能促进受损神经组织修复和再生的特效物质。随着年龄的增长，人体中的神经酸缺乏将会引起脑中风后遗症、老年痴呆、脑瘫、脑萎缩、记忆力减退及失眠健忘等脑疾病。目前，神经酸已被发现对阿尔茨海默病、齐薇格综合征、肾上腺脑白质营养不良等脑疾病有明显治疗和预防效果。此外，神经酸还可作为配方奶粉添加剂，加快婴幼儿大脑的发育。
人体自身不能合成神经酸，只能靠体外摄取来补充。神经酸最初主要依靠从鲨鱼大脑中获取，由于国际社会禁止捕杀鲨鱼，动物源神经酸逐渐受到了限制。为寻找神经酸的替代来源，化学家们先后开发了数种方法合成神经酸，但都由于路线长、得率低且难以提纯而放弃，合成神经酸至今没有成功的报道。随后，人们发现一些稀有植物，如蒜头果、盾叶木、银扇草以及元宝枫等含有神经酸，并开发了相应的提取工艺。然而这些多年生草本植物资源生长周期较长且来源有限，易受产地、气候等因素影响，另一方面这些原料中神经酸含量较低导致提取难度较大，成本较高。相比植物提取法而言，微生物发酵法生长周期短且可全天候生产，是一种经济高效的方式。但是，现有技术中，缺乏能够高效生产神经酸的微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌。
本发明再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产神经酸中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一株高产神经神经酸的重组解脂耶氏酵母菌，是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)XJ-10株，保藏编号为CCTCC NO：M 20211245。
在本发明中，所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-10株是在解脂耶氏酵母基因组中敲除Δ12去饱和酶基因、过氧化物酶体生物发生因子10基因和三酰甘油脂肪酶4基因，插入乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、异源β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、2个拷贝的异源omega-9去饱和酶表达盒、脂肪酸延长酶表达盒、异源二酰甘油酰基转移酶。
在本发明中，所述异源β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒包括来源于银扇草的β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒和来源于拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒；所述脂肪酸延长酶表达盒包括脂肪酸延长酶1表达盒和来源于高山被孢霉的脂肪酸延长酶2表达盒；所述的二酰甘油酰基转移酶表达盒来源于蒜头果。
在本发明中，所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子PTEF、Php4d、PTEFin、PYAT1、PFBA、PFBAin、PPOX2、PPOT1或PGPD中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子Txpr2t、Tmig1t、Tlip2t、Tcyc1t、Tpex3t、Tpex10t或Tpex20t中的任意一种。
在本发明中，所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的A08位点、26s rDNA位点、IntA位点、IntB位点、IntC位点、GUT2位点、IntD位点、IntE2位点、IntF位点、lip1位点、SCP2位点、DGAT位点、GPAT位点或LPAAT位点中的任意一种。
在本发明中，所述乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒Y1ELO1来源于解脂耶氏酵母，来源于蒜头果的二酰甘油酰基转移酶的序列如SEQ ID NO:4所示；来源于拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶的序列如SEQ ID NO:10所示，银扇草的β-酮脂酰辅酶A合酶的序列如SEQ ID NO:7所示、高山被孢霉的omega-9去饱和酶的序列如SEQ ID NO:12所示，高山被孢霉的脂肪酸延长酶2的序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，所述乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、蒜头果二酰甘油酰基转移酶表达盒、拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、银扇草的β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、高山被孢霉的omega-9去饱和酶表达盒、高山被孢霉的脂肪酸延长酶2表达盒分别整合至基因组IntC位点、Gut2位点、IntE2位点、DGAT位点、A08位点、A08位点、IntF位点、IntE2位点。
本发明还提供所述高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括如下步骤：将Δ12去饱和酶敲除盒、过氧化物酶体生物发生因子10敲除盒和三酰甘油脂肪酶4敲除盒整、所述乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、蒜头果二酰甘油酰基转移酶表达盒、拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、银扇草的β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、高山被孢霉的omega-9去饱和酶表达盒、高山被孢霉的脂肪酸延长酶2表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。
在本发明中，所述乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、蒜头果二酰甘油酰基转移酶表达盒、拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、银扇草的β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒、高山被孢霉的omega-9去饱和酶表达盒、高山被孢霉的脂肪酸延长酶2表达盒分别整合至基因组IntC位点、Gut2位点、IntE2位点、DGAT位点、A08位点、A08位点、IntF位点、IntE2位点的。
本发明还提供所述重组菌在高产神经酸中的应用，其特征在于包括如下步骤：(1)采用发酵培养基培养权利要求1-7中任一所述重组菌，得到发酵产物；(2)含氢氧化钠的有机溶剂甲酯化并萃取并冻干细胞，收集有机相，得到神经酸甲酯。
有益效果：本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-10株，是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-10株敲除了Δ12去饱和酶(对应FAD2位点)、过氧化物酶体生物发生因子10(对应PEX10位点)、三酰甘油脂肪酶4(对应TGL4位点)、二酰甘油酰基转移酶(对应DGAT位点)和FAD+3-磷酸甘油脱氢酶(对应GUT2位点)；插入乙酰辅酶A羧化酶表达盒、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶表达盒、异源二酰甘油酰基转移酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、异源脂肪酸延长酶2表达盒、异源β-酮脂酰辅酶A合酶表达盒和异源omega-9去饱和酶表达盒，实验证明该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产神经酸，实现了植物来源天然产物神经酸在解脂耶氏酵母中的高效合成。
附图说明
图1为本发明实施例提供的神经酸合成策略图。ACC1：乙酰辅酶A羧化酶；C16:0：棕榈酸；C16:1：棕榈油酸；C18:0：硬脂酸；C18:1：油酸；C18:2：亚油酸；C20:0：花生酸；C22:0：二十二烷酸；C24:0：二十四烷酸；C24:1：神经酸；DGAT：二酰甘油酰基转移酶；ELO1：脂肪酸延长酶1；FAD2：Δ12去饱和酶；FAS：脂肪酸延长酶；GPAT：3-磷酸甘油酰基转移酶；GPD1：NAD+3-磷酸甘油脱氢酶；GUT2：FAD+3-磷酸甘油脱氢酶；KCS：β-酮脂酰辅酶A合酶；LPAAT：溶血磷脂酸酰基转移酶；MaELO2：脂肪酸延长酶2；PEX10：过氧化物酶体生物发生因子10；TGL4：三酰甘油脂肪酶4；ω-9：omega-9去饱和酶；
图2是重组整合质粒pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3的结构图，其中A08-up表示A08位点上游同源臂，A08-dm表示A08位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，leu表示3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)，AtKCS18为甘蓝型油菜β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因，LaKCS3为银扇草β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因。
图3是重组整合质粒pUC-HUH-IntC-ACC1的结构图，其中IntC-up表示IntC位点上游同源臂，IntC-dm表示IntC位点下游同源臂，hp4d表示启动子Php4d，mig1t表示终止子Tmig1t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子Php4d、终止子Tmig1t)，ACC1为解脂耶氏酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶编码基因。
图4是重组敲除质粒pUC-HUH-Fad2的结构图，其中Fad2-up表示Fad2位点上游同源臂，Fad2-dm表示Fad2位点下游同源臂，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)。
图5为本发明实施例提供的脂肪酸组分分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f，购于美国菌种保藏中心，编号为ATCCMYA-2613。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytizca)Po1fΔku70(MatA,Δku70::hisG,leu2-270,ura3-302,xpr2-322,axp1-2)，缩写为Yarrowia lipolytica Po1fΔku70。Yarrowialipolytica Po1fΔku70由解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f敲除了负责非同源重组的编码基因ku70后构建得到(公开于Kretzschmar A,et al.,Current Genetics,2013,59(1-2):63-72)。
A08位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体上的A08位点起始密码子上游大小为2521bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为2031bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-leu载体中所得。其中，pUC57-leu载体是把leu表达盒插入pUC57载体后所得，leu表达盒由启动子PTEFin、leu编码基因(GenBank:AF260230.1)和终止子Txpr2t组成。
本发明实施例提供的神经酸合成策略图见图1。
在本发明中，启动子PTEF、Php4d、PTEFin、PYAT1、PFBA、PFBAin、PPOX2、PPOT1或PGPD来源于解脂耶氏酵母；终止子Txpr2t、Tmig1t、Tlip2t、Tcyc1t、Tpex3t、Tpex10t或Tpex20t来源于解脂耶氏酵母。
pUC57购自金唯智公司。
实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
根据NCBI上公开的来自高山被孢霉的脂肪酸延长酶2编码基因(MaELO2)、碎米芥β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因CgKCS4、银扇草β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因LaKCS3、两节荠β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因CaKCS2、甘蓝型油菜β-酮脂酰辅酶A合酶编码基因BnKCS1、拟南芥的omega-9去饱和酶编码基因AtADS2、高山被孢霉的omega-9去饱和酶编码基因MaW9，进行密码子优化，以适宜在酵母菌内表达。各基因优化后的序列编号见表1。表1中优化后的序列，以及Php4d启动子委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并插入质粒pUC57中，作为之后目的基因扩增的模板。Php4d启动子插入质粒pUC57中所得载体记为pUC57-Php4d。
表1基因来源及优化后序列的编号
基因名称 来源 优化后序列编号 对应的重组载体
脂肪酸延长酶2 高山被孢霉 SEQ ID No：1 pUC57-MaELO2
β-酮脂酰辅酶A合酶CgKCS4 碎米芥 SEQ ID No：6 pUC57-CgKCS4
β-酮脂酰辅酶A合酶LaKCS3 银扇草 SEQ ID No：7 pUC57-LaKCS3
β-酮脂酰辅酶A合酶CaKCS2 两节荠 SEQ ID No：8 pUC57-CaKCS2
β-酮脂酰辅酶A合酶BnKCS1 甘蓝型油菜 SEQ ID No：9 pUC57-BnKCS1
omega-9去饱和酶AtADS2 拟南芥 SEQ ID No：11 pUC57-AtADS2
omega-9去饱和酶MaW9 高山被孢霉 SEQ ID No：12 pUC57-MaW9
根据NCBI上提供的解脂耶氏酵母内源3-磷酸甘油酰基转移酶GPAT、溶血磷脂酸酰基转移酶LPAAT、二酰甘油酰基转移酶DGAT和脂肪酸延长酶1ELO1比对蒜头果转录组数据得到的蒜头果来源的3-磷酸甘油酰基转移酶MoGPAT、溶血磷脂酸酰基转移酶MoLPAAT、二酰甘油酰基转移酶MoDGAT和β-酮脂酰辅酶A合酶MoKCS8编码基因的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成密码子优化后的蒜头果来源的3-磷酸甘油酰基转移酶MoGPAT编码基因(SEQ ID No：2)、溶血磷脂酸酰基转移酶MoLPAAT编码基因(SEQID No：3)、二酰甘油酰基转移酶MoDGAT编码基因(SEQ ID No：4)和β-酮脂酰辅酶A合酶MoKCS8编码基因(SEQ ID No：5)，并插入pUC57中，分别记为pUC57-MoGPAT、pUC57-MoLPAAT、pUC57-MoDGAT、pUC57-MoKCS8，作为之后目的基因扩增的模板。
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成密码子优化后的拟南芥β-酮脂酰辅酶A合酶AtKCS18(序列如SEQ ID No.10所示)，并插入pUC57中，得到重组载体pUC57-AtKCS18。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因ura的核苷酸序列(GenBank登录号：AJ306421.1)和hisG标签(GenBank登录号：AF324729.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，将两个hisG标签编码基因序列插入质粒pUC57中，在两个hisG标签编码基因序列之间插入乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(由Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、GenBank登录号为AJ306421.1的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因ura和终止子Txpr2t组成)，以便实现ura标记回收，得到质粒pUC57-hisG-ura-hisG。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC::ACC1-F和IntC::ACC1-R、GUT2::GPD1-F和GUT2::GPD1-R、IntE2::YlELO1-F和IntE2::YlELO1-R为引物分别扩增乙酰辅酶A羧化酶编码基因ACC1(GenBank登录号：YALI0C11407g)、NAD+3-磷酸甘油脱氢酶编码基因GPD1(GenBank登录号：YALI0B02948g)、脂肪酸延长酶1编码基因YlELO1(GenBank登录号：YALI0F06754g)。
(二)重组质粒的构建
以Leu为筛选标记的整合质粒以图2为例，以Ura为筛选标记的整合质粒以图3为例，以Ura为筛选标记的位点整合质粒以图4为例；构建重组质粒所用引物见表2。
1.以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架的重组整合质粒的结构和构建方法
重组整合质粒pUC-HUH-IntC-ACC1、pUC-HUH-GPAT-MoGPAT、pUC-HUH-LPAAT-MoLPAAT、pUC-HUH-DGAT-MoDGAT、pUC-HUH-IntE2-MaELO2、pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1、pUC-HUH-IntF-TEFp-AtADS2、pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9、pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9、pUC-HUH-GUT2-GPD1均以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了整合位点上下游同源臂，并在上下游同源臂之间插入了目的基因表达盒，URA表达盒处于整合位点上下游同源臂之间。整合位点上下游同源臂是指Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中整合位点起始密码子上游同源臂和终止密码子下游同源臂，例如IntC位点上下游同源臂是指Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70中IntC位点起始密码子上游同源臂和终止密码子下游同源臂。目的基因表达盒表示为：启动子-目的基因-终止子，例如ACC1表达盒表示为Php4d-ACC1-Tmig1t，其中Php4d是启动子，ACC1是目的基因，Tmig1t是终止子。URA表达盒结构为PTEFin-URA-Txpr2t，其中PTEFin是启动子，Txpr2t是终止子。
具体来说，重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1中插入了IntC位点上游同源臂IntC-up、下游同源臂IntC-dm和ACC1表达盒(Php4d-ACC1-Tmig1t)；重组质粒pUC-HUH-GPAT-MoGPAT中插入了GPAT位点上游同源臂GPAT-up、下游同源臂GPAT-dm和MoGPAT表达盒(PTEFin-MoGPAT-Txpr2t)；重组质粒pUC-HUH-LPAAT-MoLPAAT中插入了LPAAT位点上游同源臂LPAAT-up、下游同源臂LPAAT-dm和MoLPAAT表达盒(PTEFin-MoLPAAT-Txpr2t)；重组质粒pUC-HUH-DGAT-MoDGAT中插入了DGAT位点上游同源臂DGAT-up、下游同源臂DGAT-dm和MoDGAT表达盒(PTEFin-MoDGAT-Txpr2t)；重组质粒pUC-HUH-IntE2-MaELO2中插入了IntE2位点上游同源臂IntE2-up、下游同源臂IntE2-dm、MaELO2表达盒(PFBA-MaELO2-Tpex10t)；重组质粒pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1插入了IntE2位点上游同源臂IntE2-up、下游同源臂IntE2-dm、MaELO2表达盒(PFBA-MaELO2-Tpex10t)和YlELO1表达盒(PGPD-YlELO1-Tpex20t)，其中MaELO2表达盒和YlELO1表达盒直接相连；重组质粒pUC-HUH-IntF-TEFp-AtADS2中插入了IntF位点上游同源臂IntF-up、下游同源臂IntF-dm和AtADS2表达盒(PTEF-AtADS2-Tcyc1t)；重组质粒pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9中插入了IntF位点上游同源臂IntF-up、下游同源臂IntF-dm和MaW9表达盒(PTEF-MaW9-Tcyc1t)；重组质粒pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9中插入了SCP2位点上游同源臂SCP2-up、下游同源臂SCP2-dm和MaW9表达盒(PTEF-MaW9-Tcyc1t)；重组质粒pUC-HUH-GUT2-GPD1中插入了GUT2位点上游同源臂GUT2-up、下游同源臂GUT2-dm和GPD1表达盒(PTEFin-GPD1-Txpr2t)。
重组整合质粒pUC-HUH-GPAT-MoGPAT、pUC-HUH-LPAAT-MoLPAAT、pUC-HUH-DGAT-MoDGAT、pUC-HUH-IntE2-MaELO2、pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1、pUC-HUH-IntF-TEFp-AtADS2、pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9、pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9、pUC-HUH-GUT2-GPD1的结构和构建方法与重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1相同，不同之处仅在于将重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1中的整合位点上下游同源臂(来自于对应的位点整合质粒，位点整合质粒的结构见本实施例(二)中标题6)和目的基因表达盒替换成对应序列。
2.以pUC57-leu为骨架的重组整合质粒的结构和构建方法
重组整合质粒pUC-A08-leu-BnKCS1、pUC-A08-leu-CaKCS2、pUC-A08-leu-LaKCS3、pUC-A08-leu-CgKCS4、pUC-A08-leu-MoKCS8、pUC-A08-leu-AtKCS18、pUC-A08-leu-Atkcs18-LaKCS3、pUC-A08-leu-AtKCS18-CgKCS4是以pUC57-leu为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1fΔku70中的A08位点起始密码子上游同源臂A08-up和终止密码子下游同源臂A08-dm，并在上下游同源臂之间插入了目的基因表达盒。各重组整合质粒中插入的目的基因表达盒如下：pUC-A08-leu-BnKCS1中插入了BnKCS1表达盒(PTEFin-BnKCS1-Txpr2t)；pUC-A08-leu-CaKCS2中插入了CaKCS2表达盒(PTEFin-CaKCS2-Txpr2t)；pUC-A08-leu-LaKCS3中插入了LaKCS3表达盒(PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)；pUC-A08-leu-CgKCS4中插入了CgKCS4表达盒(PTEFin-CgKCS4-Txpr2t)；pUC-A08-leu-MoKCS8中插入了MoKCS8表达盒(PTEFin-MoKCS8-Txpr2t)；pUC-A08-leu-AtKCS18中插入了AtKCS18表达盒(PTEFin-AtKCS18-Txpr2t)；pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3中插入了AtKCS18表达盒(PTEFin-AtKCS18-Txpr2t)、LaKCS3表达盒(PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)，其中表达盒AtKCS18和LaKCS3相连；pUC-A08-leu-AtKCS18-CgKCS4中插入了AtKCS18表达盒(PTEFin-AtKCS18-Txpr2t)、CgKCS4表达盒(PTEFin-CgKCS4-Txpr2t)，其中，表达盒AtKCS18和CgKCS4相连。其中目的基因表达盒表示为：启动子-目的基因-终止子。
其中pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3的结构见图2。重组整合质粒pUC-A08-leu-BnKCS1、pUC-A08-leu-CaKCS2、pUC-A08-leu-LaKCS3、pUC-A08-leu-CgKCS4、pUC-A08-leu-MoKCS8、pUC-A08-leu-AtKCS18、pUC-A08-leu-AtKCS18-CgKCS4的结构和构建方法同pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3，不同之处仅在于以对应的目的基因表达盒替代AtKCS18表达盒和LaKCS3表达盒。
3.各目的基因表达盒中启动子、目的基因和终止子的扩增方法
各目的基因表达盒中启动子、目的基因和终止子的扩增方法如下：
ACC1表达盒(Php4d-ACC1-Tmig1t)：以pUC57-Php4d为模板，IntC::Php4d-F、IntC::Php4d-R为引物，扩增Php4d；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntC::Tmig1t-F、IntC::Tmig1t-R为引物，扩增Tmig1t；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntC::ACC1-F、IntC::ACC1-R为引物，扩增ACC1。
BnKCS1表达盒(PTEFin-BnKCS1-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin；以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t；以pUC57-BnKCS1为模板，A08::BnKCS1-F、A08::BnKCS1-R为引物，扩增BnKCS1。
CaKCS2表达盒(PTEFin-CaKCS2-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物扩增Txpr2t。以pUC57-CaKCS2为模板，A08::CaKCS2-F、A08::CaKCS2-R为引物，扩增CaKCS2。
LaKCS3表达盒(PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t。以pUC57-LaKCS3为模板，A08::LaKCS3-F、A08::LaKCS3-R为引物，扩增LaKCS3。
CgKCS4表达盒(PTEFin-CgKCS4-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t。以pUC57-CgKCS4为模板，A08::CgKCS4-F、A08::CgKCS4-R为引物，扩增CgKCS4。
MoKCS8表达盒(PTEFin-MoKCS8-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t。以pUC57-MoKCS8为模板，A08::MoKCS8-F、A08::MoKCS8-R为引物，扩增MoKCS8。
AtKCS18表达盒(PTEFin-AtKCS18-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，A08::PTEFin-F、A08::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，A08::Txpr2t-F、A08::Txpr2t-R为引物扩增Txpr2t。以pUC57-AtKCS18为模板，A08::AtKCS18-F、A08::AtKCS18-R为引物，扩增AtKCS18。
AtKCS18-LaKCS3表达盒(PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)：以pUC57-LaKCS3为模板，A08::AtKCS18-LaKCS3-F、A08::AtKCS18-LaKCS3-R为引物扩增。
AtKCS18-CgKCS4表达盒(PTEFin-CgKCS4-Txpr2t)：以pUC57-CgKCS4为模板，A08::AtKCS18-CgKCS4-F、A08::AtKCS18-CgKCS4-R为引物扩增。
MoGPAT表达盒(PTEFin-MoGPAT-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，GPAT::PTEFin-F、GPAT::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，GPAT::Txpr2t-F、GPAT::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t。以pUC57-MoGPAT为模板，GPAT::MoGPAT-F、GPAT::MoGPAT-R为引物，扩增MoGPAT。
MoLPAAT表达盒(PTEFin-MoLPAAT-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，LPAAT::PTEFin-F、LPAAT::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin；以Yarrowialipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，LPAAT::Txpr2t-F、LPAAT::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t；以pUC57-MoLPAAT为模板，LPAAT::MoLPAAT-F、LPAAT::MoLPAAT-R为引物，扩增MoLPAAT。
MoDGAT表达盒(PTEFin-MoDGAT-Txpr2t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，DGAT::PTEFin-F、DGAT::PTEFin-R为引物，扩增PTEFin；以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70基因组DNA为模板，DGAT::Txpr2t-F、DGAT::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t；以pUC57-MoDGAT为模板，DGAT::MoDGAT-F、DGAT::MoDGAT-R为引物，扩增MoDGAT。
MaELO2表达盒(PFBA-MaELO2-Tpex10t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntE2::PFBA-F、IntE2::PFBA-R为引物，扩增PFBA；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntE2::Tpex10t-F、IntE2::Tpex10t-R为引物，扩增Tpex10t；以pUC57-MaELO2为模板，IntE2::MaELO2-F、IntE2::MaELO2-R为引物，扩增MaELO2。
YlELO1表达盒(PGPD-YlELO1-Tpex20t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntE2::PGPD-F、IntE2::PGPD-R为引物，扩增PGPD；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntE2::Tpex20t-F、IntE2::Tpex20t-R为引物，扩增Tpex20t；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntE2::YlELO1-F、IntE2::YlELO1-R为引物，扩增YlELO1。
AtADS2表达盒(PTEF-AtADS2-Tcyc1t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntF::PTEF-F、IntF::PTEF-R为引物，扩增PTEF；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntF::Tcyc1t-F、IntF::Tcyc1t-R为引物，扩增Tcyc1t；以pUC57-AtADS2为模板，IntF::AtADS2-F、IntF::AtADS2-R为引物，扩增AtADS2。
MaW9表达盒(PTEF-MaW9-Tcyc1t)：以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntF::PTEF-F、IntF::PTEF-R为引物扩增PTEF；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，IntF::Tcyc1t-F、IntF::Tcyc1t-R为引物扩增Tcyc1t；以pUC57-MaW9为模板，IntF::MaW9-F、IntF::MaW9-R为引物，扩增MaW9。
GPD1表达盒(PTEFin-GPD1-Txpr2t)：以pUC57-Php4d为模板，GUT2::PTEFin-F、GUT2::PTEFin-R为引物扩增PTEFin；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，GUT2::Txpr2t-F、GUT2::Txpr2t-R为引物，扩增Txpr2t；以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，GUT2::GPD1-F、GUT2::GPD1-R为引物，扩增GPD1。
上述引物序列如表2所示。
4.以重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1(图3)为例，说明以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架的重组整合质粒的构建方法。
重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1fΔku70中IntC位点起始密码子上游同源臂IntC-up和终止密码子下游同源臂IntC-dm，在该上下游同源臂之间还插入了ACC1基因表达盒(Php4d-ACC1-Tmig1t)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间。
以IntC::Php4d-F和IntC::Php4d-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ACC1表达盒启动子Php4d。以IntC::Tmig1t-F和IntC::Tmig1t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ACC1表达盒终止子Tmig1t。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC::ACC1-F和IntC::ACC1-R为引物，扩增两端分别带有启动子Php4d和终止子Tmig1t同源臂的ACC1基因。
上述PCR扩增体系如下：
其中，PrimerSTAR Max Premix购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
上述PCR的程序如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复30个循环。
用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(购自上海百赛生物技术股份有限公司)纯化回收各片段。
将IntC位点整合质粒用NEB公司的限制性内切酶PacⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化的IntC位点整合质粒。
将线性化IntC位点整合质粒和本实施例标题1构建的ACC1基因表达盒中的各元件(启动子Php4d、基因ACC1和终止子Tmig1t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，将ACC1基因表达盒插入到IntC位点整合质粒的上下游同源臂之间，且两个hisG标签编码基因处于ACC1基因表达盒的同一侧。反应体系见下表。将反应体系在37℃孵育30min后，得到环状的重组载体。
一步克隆的体系如下表：
组分 体积
5×CE MultiS Buffer 4ul
Exnas eMultiS 2ul
线性化载体 x ng
插入片段 y ng
蒸馏水 补足体积至10ul
其中，线性化载体(x)、插入片段(y)的使用量可由下面公式计算获得：每片段或线性化载体的最适使用量＝[0.02×片段或线性化载体的碱基对数]ng。5×CE MultiSBuffer、Exnase MultiS购自南京诺维赞公司。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1。
用NEB公司的限制性内切酶KpnⅠ对质粒pUC-HUH-IntC-ACC1进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-IntC-ACC1质粒。
用NEB公司的限制性内切酶KpnⅠ分别对重组整合质粒pUC-HUH-GPAT-MoGPAT、pUC-HUH-LPAAT-MoLPAAT、pUC-HUH-DGAT-MoDGAT、pUC-HUH-IntE2-MaELO2、pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1、pUC-HUH-IntF-TEFp-AtADS2、pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9、pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9、pUC-HUH-GUT2-GPD1进行酶切，得到对应的重组质粒。
5.以重组质粒pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3(图2)为例，说明以pUC57-leu为骨架的重组整合质粒的构建方法。
pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3是以pUC57-leu为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1fΔku70中A08位点起始密码子上游大小为2521bp的同源臂(A08-up)和终止密码子下游大小为2031bp的同源臂(A08-dm)，在该上下游同源臂之间还插入了AtKCS18基因表达盒(PTEFin-AtKCS18-Txpr2t)与LaKCS3基因表达盒(PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)。
以A08-up-F和A08-up-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增A08位点起始密码子上游同源臂A08-up。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pUC57-leu进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-leu质粒。
将线性化pUC57-leu质粒和A08位点起始密码子上游同源臂A08-up(两端带有pUC57-leu同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的II One StepCloning Kit实现一步克隆，得到环状的重组载体。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-A08-leu-up。
以A08-dm-F和A08-dm-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增A08位点终止密码子下游同源臂A08-dm。
用NEB公司的限制性内切酶HindⅢ对质粒pUC-A08-leu-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-A08-leu-up质粒。
将线性化pUC-A08-leu-up质粒和A08位点终止密码子下游同源臂A08-dm(两端带有pUC-A08-leu-up同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的II OneStep Cloning Kit实现一步克隆，得到位点整合质粒pUC-A08-leu。
以A08::PTEFin-F和A08::PTEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增启动子PTEFin。以A08::Txpr2t-F和A08::Txpr2t-R为引物，以Yarrowialipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增终止子Txpr2t。
用NEB公司的限制性内切酶PacⅠ对质粒pUC-A08-leu进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-A08-leu质粒。
以A08::AtKCS18-F和A08::AtKCS18-R为引物，以pUC57-AtKCS18为模板，扩增AtKCS18。以A08::LaKCS3-F和A08::LaKCS3-R为引物，以pUC57-LaKCS3为模板，扩增LaKCS3。
将线性化的pUC-A08-leu和启动子PTEFin、终止子Txpr2t和AtKCS18利用南京诺唯赞生物科技有限公司的II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到pUC-A08-leu-AtKCS18。将线性化的pUC-A08-leu和启动子PTEFin、终止子Txpr2t和LaKCS3利用南京诺唯赞生物科技有限公司的/>II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到pUC-A08-leu-LaKCS3。
以A08::AtKCS18-LaKCS3-F和A08::AtKCS18-LaKCS3-R为引物，以pUC-A08-leu-LaKCS3为模板，扩增两端携带pUC-A08-leu-LaKCS3同源臂的LaKCS3表达盒(即AtKCS18-LaKCS3表达盒，PTEFin-LaKCS3-Txpr2t)。
用NEB公司的限制性内切酶SnaBⅠ对质粒pUC-A08-leu-AtKCS18进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-A08-leu-AtKCS18质粒。
将线性化的pUC-A08-leu-AtKCS18和AtKCS18-LaKCS3表达盒利用南京诺唯赞生物科技有限公司的II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3。
将重组质粒pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3在NotⅠ核苷酸内切酶的作用下37度孵育4个小时，得到线性化质粒，用于后续导入酵母。
重组整合质粒pUC-A08-leu-BnKCS1、pUC-A08-leu-CaKCS2、pUC-A08-leu-LaKCS3、pUC-A08-leu-CgKCS4、pUC-A08-leu-MoKCS8、pUC-A08-leu-AtKCS18、pUC-A08-leu-Atkcs18-LaKCS3、pUC-A08-leu-AtKCS18-CgKCS4分别在NotⅠ核苷酸内切酶的作用下37度孵育4个小时，得到对应的线性化质粒，用于后续导入酵母。
6.位点整合质粒的结构和构建方法
IntC、Fad2、PEX10、TGL4、IntF、SCP2、GUT2、IntE2、DGAT、GPAT、LPAAT位点整合质粒分别是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体上对应位点起始密码子上游序列(上游同源臂)和终止密码子下游序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在各位点上下游同源臂之间，记为pUC-HUH-整合位点。例如，IntC位点整合质粒记为pUC-HUH-IntC，是将Yarrowialipolytica Po1fΔku70基因组中染色体上IntC位点起始密码子上游序列(上游同源臂)和终止密码子下游序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体中所得，两个hisG标签编码基因在上、下游同源臂之间。Fad2、PEX10、TGL4、IntF、SCP2、GUT2、IntE2、DGAT、GPAT、LPAAT位点整合质粒的结构同IntC位点整合质粒，不同之处在于将IntC位点上游同源臂和下游同源臂替换为各位点整合质粒中对应位点上下游同源臂。IntC、Fad2、PEX10、TGL4、IntF、SCP2、GUT2、IntE2、DGAT、GPAT、LPAAT位点上游同源臂大小分别为1402、1539、2250、1500、1610、1523、1500、1533、1946、1500、1500bp；IntC、Fad2、PEX10、TGL4、IntF、SCP2、GUT2、IntE2、DGAT、GPAT、LPAAT位点下游同源臂大小分别为1396、1503、1500、1500、1852、1524、1536、1521、1468、1500、1500bp。
例如，位点整合质粒pUC-HUH-PEX10、pUC-HUH-TGL4均是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，分别插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中PEX10位点起始密码子上游同源臂(PEX10-up，大小为2250bp)和终止密码子下游同源臂(PEX10-dm大小为1500bp)、Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中TGL4位点起始密码子上游同源臂(TGL4-up，大小为1500bp)和终止密码子下游同源臂(TGL4-dm，大小为1500bp)。以Yarrowia lipolyticaPo1fΔku70的DNA为模板，以PEX10-up-F、PEX10-up-R为引物，扩增PEX10-up；以PEX10-dm-F、PEX10-dm-R为引物，扩增PEX10-dm；以TGL4-up-F、TGL4-up-R为引物，扩增TGL4-up；以TGL4-dm-F、TGL4-dm-R为引物，扩增TGL4-dm。各引物见表2。
以位点整合质粒pUC-HUH-Fad2为例来描述位点整合质粒的构建方法。pUC-HUH-Fad2是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中Fad2位点起始密码子上游大小为1539bp的同源臂(Fad2-up)和终止密码子下游大小为1503bp的同源臂(Fad2-dm)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒URA(包含Yarrowialipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间。
以Fad2-up-F和Fad2-up-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增Fad2位点起始密码子上游同源臂Fad2-up。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和Fad2位点起始密码子上游同源臂Fad2-up(两端带有pUC57-hisG-ura-hisG同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到环状的重组载体。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-HUH-Fad2-up。
以Fad2-dm-F和Fad2-dm-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增Fad2位点终止密码子下游同源臂Fad2-dm。
用NEB公司的限制性内切酶HindⅢ对质粒pUC-HUH-Fad2-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-Fad2-up质粒。
将线性化pUC-HUH-Fad2-up质粒和Fad2位点终止密码子下游同源臂Fad2-dm(两端带有pUC-HUH-Fad2-up同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的IIOne Step Cloning Kit实现一步克隆，得到位点整合质粒pUC-HUH-Fad2。将pUC-HUH-Fad2质粒在BglⅡ核苷酸内切酶的作用下37度孵育4个小时，即可得到线性化的pUC-HUH-Fad2，用于导入酵母。
Fad2、PEX10、TGL4、IntF、SCP2、GUT2、IntE2、DGAT、GPAT、LPAAT位点整合质粒分别在BglⅡ核苷酸内切酶的作用下37度孵育4个小时，即可得到对应的线性化质粒。
表2引物序列
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实施例2、重组解脂耶氏酵母菌的构建
在本实施例中导入菌体内的质粒都是线性化的，制备方法见实施例1。
(一)将含有ACC1基因表达盒的质粒pUC-HUH-IntC-ACC1导入Yarrowialipolytica Po1fΔku70中，然后依次导入含有GPD1基因表达盒的质粒pUC-HUH-GUT2-GPD1以及位点整合质粒pUC-HUH-Fad2、pUC-HUH-PEX10，上述四个质粒分别导入后，均在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，再导入下一个重组质粒；最后导入pUC-HUH-TGL4，得到重组菌1。最终，ACC1基因表达盒和一个hisG标签整合到基因组IntC位点、GPD1表达盒和一个hisG标签整合到基因组GUT2位点、一个hisG标签通过同源重组整合至基因组Fad2、PEX10位点处，hisG-ura-hisG片段通过同源重组整合至基因组TGL4位点处，从而敲除Gut2、Fad2、PEX10和TGL4基因，过表达ACC1和GPD1。
具体方法如下：
①Yarrowia lipolytica Po1fΔku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZYeastTransformation Kit II将线性化pUC-HUH-IntC-ACC1转化至Yarrowia lipolytica Po1fΔku70感受态细胞，进行同源重组。
③重组质粒导入后阳性克隆的筛选方法：采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定正确的即得成功导入pUC-HUH-IntC-ACC1的重组菌。其中筛选培养基SD-Ura含有：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酵母氮源，购自BBI Life Sciences)6.7g/L，CSM-Ura(完全补充混合物除去尿嘧啶，购自MPBiomedicals)0.67g/L，琼脂粉23g/L。
④丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的方法：将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板(含有：5-氟乳清酸1g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂粉23g/L)，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板(配方同上)和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落，即得成功导入pUC-HUH-IntC-ACC1并丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的重组菌。
⑤在成功导入pUC-HUH-IntC-ACC1并丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的重组菌中依次进行如下操作：导入含有GPD1基因表达盒的质粒pUC-HUH-GUT2-GPD1，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入位点整合质粒pUC-HUH-Fad2，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-PEX10，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-TGL4，筛选阳性克隆，得到重组菌命名为重组菌1。各重组质粒的导入、阳性克隆的筛选、丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的方法同pUC-HUH-IntC-ACC1(步骤①-④)，不同之处仅在于将pUC-HUH-IntC-ACC1替换成对应的质粒。相对于原始菌，重组菌1敲除了Gut2、Fad2、PEX10和TGL4位点，插入了ACC1表达盒和GPD1表达盒。
(二)将重组质粒pUC-A08-leu-LaKCS3、pUC-A08-leu-AtKCS18分别导入重组菌1，LaKCS3和AtKCS18表达盒分别整合至基因组A08位点，得到重组菌4和7。相对于重组菌1，重组菌4过表达LaKCS3，重组菌7过表达AtKCS18。
具体方法如下：
①将重组菌1于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZYeastTransformation Kit II将pUC-A08-leu-LaKCS3或pUC-A08-leu-AtKCS18分别转化至Yarrowia lipolytica Po1fΔku70感受态细胞，进行同源重组。
③重组质粒导入后阳性克隆的筛选方法：采用筛选培养基SD-Leu筛选阳性克隆，PCR鉴定正确的即得成功导入pUC-A08-leu-LaKCS3或pUC-A08-leu-AtKCS18的重组菌。其中筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酵母氮源，购自BBI Life Sciences)6.7g/L，CSM-Leu(完全补充混合物除去亮氨酸，购自MPBiomedicals)0.67g/L，琼脂粉23g/L。
(三)将重组质粒pUC-A08-leu-AtKCS18-LaKCS3导入重组菌1，通过同源重组整合至基因组A08位点，得到重组菌8。重组质粒的导入和筛选方法同本实施例标题(二)。重组菌8过表达AtKCS18和LaKCS3。
将重组质粒pUC-A08-leu-AtKCS18-CgKCS4导入重组菌1，通过同源重组整合至基因组A08位点，得到重组菌9。重组质粒的导入和筛选方法同本实施例标题(二)。重组菌9过表达AtKCS18和CgKCS4。
(四)按照本实施例标题(一)步骤④中方法丢失重组菌8中的一个hisG标签和Ura筛选标记，然后导入重组质粒pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9，MaW9表达盒整合至基因组IntF位点，筛选阳性克隆，即得到重组菌11。重组质粒的导入和阳性克隆的筛选方法同本实施例标题(一)。重组菌11过表达MaW9。
(五)按照本实施例标题(一)步骤④中方法丢失重组菌11中的一个hisG标签和Ura筛选标记，然后依次进行如下操作：导入重组质粒pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1，筛选阳性克隆，得到得到重组菌12。重组菌12中，MaW9表达盒整合至SCP2位点，MaELO2和YlELO1表达盒整合至基因组IntE2位点。重组质粒的导入、阳性克隆的筛选方法、以及丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的方法同本实施例标题(一)。
(六)丢失重组菌12中的一个hisG标签和Ura筛选标记，导入重组质粒pUC-HUH-DGAT-MoDGAT，将MoDGAT整合至基因组DGAT位点，筛选阳性克隆，得到重组菌15。重组质粒的导入、阳性克隆的筛选以及一个hisG标签和Ura筛选标记的丢失方法同本实施例标题(一)。
(七)丢失重组菌9中的一个hisG标签和Ura筛选标记，依次进行如下操作：导入重组质粒pUC-HUH-IntF-TEFp-MaW9，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-SCP2-TEF-MaW9，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-IntE2-MaELO2-YlELO1，筛选阳性克隆，丢失一个hisG标签和Ura筛选标记；导入pUC-HUH-DGAT-MoDGAT筛选阳性克隆，得到重组菌16。重组菌16中MaW9表达盒分别整合至基因组IntF和SCP2位点，MaELO2和YlELO1表达盒整合至基因组IntE2位点，MoDGAT表达盒整合至DGAT位点。重组质粒的导入、阳性克隆的筛选方法以及丢失一个hisG标签和Ura筛选标记的方法同本实施例标题(一)。
将重组菌15命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-10株，于2021年10月09日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
地址：中国.武汉.武汉大学，
分类命名为：解脂耶氏酵母XJ-10，
Yarrowia lipolytica XJ-10，
保藏编号：CCTCC NO:M 20211245。
实施例3重组解脂耶氏酵母在生产神经酸中的应用
(一)工程菌的培养及产物提取
分别采用初始菌解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1fΔku70、实施例2中重组菌4、7、8、9、11、12、15、16生产神经酸。具体方法如下：将菌株活化，于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，溶剂为水)中30℃、220rpm条件下培养16h，得到种子液。将种子液以1％的接种量接种于50ml发酵培养基中，在30℃、220rpm震荡培养5天。发酵结束后，将发酵液转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，去上清，将菌体沉淀置于烘箱(75℃)中烘干至恒重。
其中发酵培养基配方为：葡萄糖60g/L，无氨基酵母氮源(YNB)1.7g/L，硫酸铵1.3g/L，溶剂为水。
(二)神经酸的定性定量分析
1、脂肪酸甲酯化
称量1.5g左右烘干菌体，并在其中添加10ml浓度为4M盐酸，反应20min；移至沸水浴中加热10min；-80℃冷冻放置15min；加入10mL氯仿和5mL甲醇，在200rpm震荡30min；取下层脂溶层于10ml离心管中，在通风橱中用氮气吹干；真空干燥2h得到油脂。于2ml离心管中称取0.1g油脂，加入1ml正己烷和10ml浓度为1M氢氧化钾/甲醇溶液(将0.4g氢氧化钠溶于10ml甲醇溶液中所得)，快速震摇1min，使其混合完全。将该反应液置于室温下静置15min进行甲酯化反应。静置完毕，5000rpm离心5min，取上清液200μl置于2ml离心管中，待气相分析。
2、神经酸检测
检测条件：FID检测器，进样口温度250℃，进样体积1μl，分流比：50:1，色谱柱：DB-23(60m*0.25μm*0.15μm，购自Agilent Technologies)。色谱条件：初始温度为100℃，按照25℃/min的速度上升到196℃，然后2℃/min上升到220℃，保持2min左右。用Sigma-Aldrich公司的脂肪酸混合标准品进行定性定量。
在上述条件下，GC检测的神经酸甲酯出峰时间为14.8min左右(图5)。
发酵5天后，各重组解脂耶氏酵母神经酸产量如表3所示。其中重组菌15神经酸产量最高，为每升发酵液产5.14g的神经酸。
表3重组菌的神经酸产量
重组菌株编号 神经酸(g/L)
4 0.18
7 0.05
8 0.47
9 0.41
11 1.37
12 2.87
15 5.14
16 1.99
将菌株12、15、16接入50ml种子培养液(YPD液体培养基)中培养24h，然后以接种量为5％接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度为28℃，发酵时间为6天。发酵0-48h，控制溶氧为20％；发酵时间＞48h，控制溶氧为0-5％。发酵过程中pH值恒定地控制在5.5，直到发酵结束。在发酵时间为40h和96h，分别补进体积浓度为800g/L的葡萄糖水溶液使发酵液葡萄糖浓度达到80g/L。其中，发酵培养基的成分：葡萄糖150g/L、硫酸铵11g/L、酵母提取物(美国Sigma-Aldrich公司)3g/L、玉米蛋白胨0.1g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁2g/L、硫酸钙0.8g/L、氯化钠0.4g/L、盐酸硫铵12mg/L、生物素1mg/L、钼酸钠160mg/L、硫酸铜0.2mg/L、硼酸40mg/L、硫酸锰180mg/L、氯化亚铁75mg/L。发酵5天后，重组菌12、15、16的神经酸产量分别为：13.21、31.26、11.93g/L。其中重组菌15神经酸产量最高，即每升发酵液产31.26g的神经酸，显著高于其它菌株。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
<130> 20220517
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 828
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> MaELO2
<400> 1
atggagtctg gccccatgcc cgccggaatt cccttccccg agtactacga cttcttcatg 60
gactggaaga cccctttagc cattgccgcc acttacaccg ctgccgtcgg tttattcaac 120
cctaaggtgg gcaaggtctc ccgagtggtg gccaagtctg ccaacgccaa gcccgccgag 180
agaactcagt ctggcgctgc catgaccgcc ttcgtgtttg tgcacaattt aatcctctgc 240
gtctactccg gcatcacctt ctactacatg ttccccgcca tggtgaagaa cttccgaacc 300
cacactttac acgaggccta ctgcgacacc gaccagtctt tatggaacaa cgctttaggc 360
tactggggtt atttattcta tttatccaag ttctacgagg tcatcgatac catcatcatt 420
attctgaagg gacgacgatc ctctttactg cagacctacc accacgctgg cgccatgatc 480
accatgtggt ctggcatcaa ctaccaagct acccccatct ggattttcgt ggtctttaac 540
tccttcattc acaccattat gtactgctac tatgccttca cctccatcgg cttccatccc 600
cccggtaaga agtatttaac ctctatgcag attacccagt ttttagtcgg catcaccatt 660
gccgtgtctt atttattcgt ccccggatgc atcagaaccc ccggcgctca gatggccgtg 720
tggatcaacg tgggctatct gttccctctg acctacttat tcgtggactt cgccaagcga 780
acctattcca agcgatccgc catcgccgcc cagaagaagg cccagtaa 828
<210> 2
<211> 1269
<212> DNA
<213> artificial
<220>
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gcccccaagc agcgatctcc cgagtcttac gaggacgatg acggctgggc cgccgtgatc 180
atctcttgtg tgcgaatcgt gacctgtttc gtgaccatga tggtgaccac cttcctgtgg 240
gccctgatca tggtggtgct gatcccctgg ccctatcagc gaatccgaca aggcaacgtg 300
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<223> MoDGAT
<400> 4
atggctgaga ccgaagtgcg agaatctcct ctgaccgccg cccccgcccc tgaagtgacc 60
gtgatcgagt ctccccgagt gcccctgctg cattctgtgc tcgccaccgc cctgtggatc 120
ggctgtatcc acctgttctt cgccgtgatg ttcaccgcca ccttcctgct gcccctgtct 180
aagtctatcg ccgtgttcgc cctgctcctg gtgctgatcg tggtgcccgt ggaggccgac 240
tctaagttcg gcatgaaggt gcgacgatac atcttcaaga acgtgtgtgg ctactacccc 300
atcaccgtgc acgtggagga catcaaggcc ttcgtgccca accgagccta catcttcgcc 360
ctggagcccc actctgtgct gcccgtcggc gtgatctctc tgatgcacct gtctaacgcc 420
gtgcccctgc ccaagacccg agtgctggcc tcttctgccg tgttccgaac ccccttcctg 480
cgacacatct ggacctggat gggcctggcc gccgtgaccc gaaagaactt catctctctg 540
ctggccgccg gctactcttg tgccatcatc cccggcggca cccgagagac cctgctgatg 600
gtgcaagacc acgagatcgc cttcctgaag acccgaaagg gcttcgtgcg aaccgccatc 660
gagaccggcg tgcccctgat ccccgtgttc tctttcggac agtctaaggt gtacaactgg 720
tggcgaccca ccggcaagct gttcctgcag atctgtcgaa agatcaagtt cacccccatg 780
ttcttctggg gcgtgctggg cacccccatg cctcgacgac tgcccctgca cgtggtcgtg 840
ggccgaccca tcgaggtgaa gcagaactct cagcccaccg ccgaagaggt gaacgaggtg 900
cactctcagt tcgtgggcgc cctgcaagac ctgttcgagc gacacaaggc ccgagtgggc 960
cacgccgacc gagagctgaa gatcatctaa 990
<210> 5
<211> 1536
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> MoKCS8
<400> 5
gctcaaccaa agcttgtcaa acccttgatc gctccatctg cttccccaag acttcctgat 60
ttcaaacagg gtgtgaaact gaaatatgtg aaactgggct accattacct cgttactcat 120
gcaatgtacc tcttcctacc acctcttgca gtcatcgctg cagtccagct ctccacattc 180
tcactccaag atgttcatga ccttttgggg cagctccggt acaatctcat ttcagtgatc 240
ctttgctcca gcacccttgt ctttctatcc actctttatt tcctcactcg cccccgccct 300
gtttatcttg ttgatttctc gtgctttaag cctgatgatg atgataaaaa atgctcgtgg 360
caacgtttca tgaagtgttc tgaatcaaga ggtacattca ctgaggaaaa tattgagttc 420
caaaggaaaa ttatggcaag atctggtatt ggtgaatcaa cttacctgcc accagctgtt 480
atgaaaattc ctccaaattc gtcaatggcg gaagcgagag aagaagccaa gatgataatc 540
tttggtgttc ttgatcgcct ctttgagaaa acctcagtga aaccaaaaga tatcagtatc 600
ctaattgtca attgtagctt attcaatccc gtaccttctc tatctgcaat ggttgttaac 660
cattacaagc taagagggaa cacacgtact tataatttgg gtgggatggg ttgtagtgct 720
ggtttgatct caattgatct tgcaaaagac ctacttcgag ttcatcccaa ttcttatgca 780
ttggttgtaa gcatggaaag catcactatg aattggtatt ttgggaatga gagatcaatg 840
atcgtcccga attgcttgtt ccgaatggga ggggcagcag ttttgctttc caacaagatg 900
tccgaccgat ggcattctaa gtacaaattg gtccacactg tccggactca caaaggttct 960
gatgataagt gctatacttg tgttacccag cgagaggatt ccattgggaa gattgggatt 1020
tctttgtcaa aggatctgat ggcagttgct ggcgatgccc tgaaggcaaa catcactaca 1080
ttgggccccc ttgtgctacc aatgtctgaa cagctactct tctttgcaac attggtcggg 1140
aggaaatttt ttaaggtgaa ggtgaagcct tacatcccag atttcaagct agcttttgag 1200
catttctgta ttcatgctgg gggaagagct gtgctagatg aattgcaaaa gaacttgcag 1260
cttactgatt ggcatatcga accttcaagg atgacactat accgttttgg caacacatca 1320
agtagctctc tctggtatga attggcttat accgaagcca agggaagggt gaagaaagga 1380
gatagaacat ggcaaatagc atttggttct gggttcaagt gtaacagtgc agtttgggag 1440
gctctaagaa ctatcaaccc cgcaaaggag aagaatccat ggatgacgga gatccaccag 1500
ttccctataa atgttccgca agtctcggcc atctaa 1536
<210> 6
<211> 1518
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CgKCS4
<400> 6
acctccatta acgtcaagct gctgtaccac tacgtcctca ctaacttctt caacctctgc 60
ctcttccctc tcaccgcctt ccctgccggt aaggcctctc agctgaccac caacgacctg 120
caccacctct actcttacct gcaccataac ctcatcaccg tcactctgct gtttgccttc 180
accgtcttcg gttccatctt atatattgtg actcgaccta agcccgtgta cctcgtcgat 240
tactcctgct acctgccccc cagacacctc tcttgtggca tctcccgagt gatggagatt 300
ttctacgaga tccgaaagtc tgacccctcc cgagaggtgc ctttcgacga cccctcttcc 360
ctggagttcc tccgaaagat ccaggaacga tctggtctgg gtgatgagac ctatggcccc 420
caaggcctcg tgcatgacat gcccctgcga atgaacttcg ctgccgcccg agaagagacc 480
gagcaagtga tcaacggcgc cctcgagaag ctgttcgaga acaccaaagt gaacccccga 540
gagatcggca tcctggtggt gaactcctcc atgttcaacc ccaccccctc cctgtctgct 600
atggtggtca acaccttcaa gctgcgatcc aacatcaaat ccttctctct cggcggtatg 660
ggctgttccg ctggcatcat cgctatcgat ctcgccaaag acctgctgca tgtgcacaag 720
aacacctacg ccctggttgt ttctactgaa aacatcaccc attccaccta taccggtgac 780
aaccgatcca tgatggtctc caactgcctg ttccgaatgg gcggcgctgc cattctcctg 840
tccaataagg ccggtgaccg acgacgatct aagtacaagc tggcccacac cgtcagaacc 900
cacaccggcg ccgatgacca gtcttttcga tgcgtgcgac aggaggacga cgacagaggc 960
aagattggcg tctgtctctc caaggatatc accgctgtgg ccggtaagac tgtgaccaag 1020
aacattgcca ccctgggtcc tctcgtcctg cccctgtccg aaaagttcct gtacgtggtc 1080
tccctcatgg ccaagaagct cttcaagaac aagatcaagc acacctacgt ccctgacttt 1140
aagctcgcca tcgaccactt ctgtattcac gccggcggca gagctgtgat cgacgtcctg 1200
gagaagaatc tggccctgtc ccctgtcgac gtcgaagcct ctcgatccac cctgcaccga 1260
tttggcaaca cctcctcttc ctccatctgg tacgagctgg cctacattga ggccaagggt 1320
cgaatgaaga aaggtaacaa ggtctggcag atcgccatcg gctctggctt taagtgtaac 1380
tccgccgtgt gggtcgctct ctgtaatgtc aaaccctccg tgaactcccc ttgggaacac 1440
tgtatcgacc gataccccgt ggagatcaac tacggctctt ccaagtccga aacccgagcc 1500
cagaacggcc gatcctaa 1518
<210> 7
<211> 1515
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LaKCS3
<400> 7
acctccatta acgtgaagct gctgtaccac tacgtcatca ccaacttttt taacctgtgc 60
tttttccccc tgactgccat cctggccggc aaggcctctc gactcactac caacgacctc 120
catcacttct actcctacct gcagcacaac ctgatcaccc tcaccctgct cttcgccttc 180
actgtcttcg gttccgtcct gtactttgtc acccgaccta agcccgtgta cctggtggac 240
tattcttgct acctcccccc tcagcacctg tctgccggca tttccaagac tatggagatt 300
ttctaccaaa ttcgaaagtc cgaccccctc cgaaacgtcg ctctggacga ctcttcctcc 360
ctggacttcc tgcgaaagat ccaggagcga tctggtctgg gcgatgaaac ttacggccct 420
gagggcctct tcgaaatccc tcctcgaaag aacctcgcct ctgcccgaga ggaaaccgaa 480
caggtcatca acggcgccct gaagaacctg tttgagaaca ccaaagtcaa ccctaaggag 540
atcggcattc tggtcgtgaa ctcctctatg ttcaacccca ccccctccct gtccgctatg 600
gtggtgaaca ctttcaagct gcgatccaac atcaagtcct tcaacctcgg cggcatgggc 660
tgttctgctg gtgtcattgc catcgacctg gccaaggacc tgctgcacgt ccacaagaat 720
acctacgccc tcgtggtgtc caccgagaat atcacccaga acatttacac cggcgataac 780
cgatccatga tggtctccaa ctgtctcttc agagtcggcg gcgctgccat cctcctgtcc 840
aacaaacccg gtgaccgacg acgatccaag taccgactgg cccacactgt gcgaacccat 900
actggcgccg acgataagtc ctttggttgc gtcagacagg aggaggacga ctccggtaag 960
accggcgtgt ccctgtccaa ggacattact ggtgtggccg gcatcaccgt gcagaagaac 1020
atcactactc tgggtcctct ggtcctgccc ctctccgaga agattctgtt cgtcgtgacc 1080
ttcgtggcca agaagctcct caaggacaag atcaagcatt actacgtccc tgactttaaa 1140
ctcgccgtcg accatttctg tattcacgcc ggtggtcgag ccgtcatcga cgtcctcgag 1200
aagaacctgg gtctctcccc catcgatgtc gaggcctccc gatccactct gcatcgattc 1260
ggcaacacct cctcctcttc catctggtac gagctcgctt acatcgaggc taagggccga 1320
atgaaaaagg gcaataaagc ctggcagatc gccgtgggct ctggctttaa gtgcaactct 1380
gctgtctggg tggctctgcg aaacgtgaag gcctctgcca attctccctg ggaacactgc 1440
attcacaaat accccgtcca aatgtactct ggctcctcca agtccgaaac cagagcccag 1500
aacggtcgat cttaa 1515
<210> 8
<211> 1518
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CaKCS2
<400> 8
acctctatta atgtcaagct cctctaccac tacgtcatta ctaacctctt caacctctgc 60
ttcttccccc tcaccgctat cgtggccggt aaggcctcta gactgactat tgacgacctg 120
caccacctgt actactccta cctgcagcac aatgtgatta ccatcgcccc tctcttcgcc 180
ttcaccgtct tcggctccat tctgtacatc gtgacccgac ccaagcccgt gtacctggtc 240
gagtactcct gctacctgcc ccccacccaa tgccgatcct ccatctccaa ggtcatggat 300
atcttttacc aggtgcgaaa agccgacccc ttccgaaacg gtacctgtga cgactcttct 360
tggctcgact tcctccgaaa gatccaggaa cgatccggtc tgggcgatga gacccacggc 420
cctgagggtc tgctgcaagt cccccccaga aagaccttcg ccgccgctcg agaggagact 480
gagcaggtca ttgtcggcgc cctcaagaac ctcttcgaga acaccaaggt gaaccccaaa 540
gacattggta tcctcgtcgt caattcctcc atgttcaacc ccaccccttc cctctctgcc 600
atggtggtga acaccttcaa gctgcgatcc aatgtgcgat ccttcaatct cggtggcatg 660
ggttgttccg ccggtgtgat cgctattgat ctggctaagg acctgctgca cgtccacaaa 720
aacacttacg ccctggtcgt gtccaccgag aacatcacct acaacatcta cgccggcgac 780
aaccgatcca tgatggtctc caactgcctc ttccgagtgg gtggtgctgc catcctcctc 840
tctaataagc cccgagacag acgacgatcc aagtacgagc tggtccacac cgtgagaacc 900
cacactggtg ccgacgataa gtcctttcga tgtgtgcagc agggcgatga tgagaacggc 960
aagaccggcg tgtccctgtc caaggacatc actgaggtcg ctggccgaac cgtcaagaag 1020
aatatcgcca ccctcggtcc cctgatcctg cccctgtccg agaagctcct cttcttcgtg 1080
accttcatgg ccaagaagct cttcaaggac aaggtcaagc actattacgt ccccgacttc 1140
aagctggcca ttgatcattt ctgcatccac gccggtggta gagccgtcat cgatgtgctg 1200
gagaaaaacc tgggtctcgc tcccattgat gtggaggcct cccgatccac tctgcatcga 1260
ttcggcaaca cctcctcctc ttccatctgg tacgaactcg cctacattga ggccaagggc 1320
cgaatgaaga agggcaacaa ggtctggcag atcgctctgg gttctggctt caagtgcaat 1380
tctgccgtct gggtggccct ctccaacgtc aaggcctcta ccaactcccc ttgggaacac 1440
tgcattgaca gataccccgt gaagatcgac tctgactccg ccaagtccga gacccgagcc 1500
cagaatggcc gatcttaa 1518
<210> 9
<211> 1515
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> BnKCS1
<400> 9
acctccatca acgtgaaact cctgtaccac tatgtcatca ccaacctctt caacctgtgt 60
ttcttccccc tcactgccat cgtcgccggt aaggcctacc tcaccatcga tgacctgcat 120
catctgtact actcctacct gcagcacaac ctcatcacca ttgctcccct gctggccttc 180
actgtgttcg gctccgtcct ctacatcgcc acccgaccca agcccgtcta cctcgtggag 240
tactcttgtt acctgccccc cacccactgc cgatcctcca tttccaaggt catggacatc 300
ttttttcaag tccgaaaggc cgacccctcc cgaaacggca cttgcgatga ctcctcctgg 360
ctggacttcc tgcgaaagat ccaggaaaga tccggtctcg gcgacgagac tcacggccct 420
gaaggtctgc tgcaggtccc tcctagaaag accttcgctc gagcccgaga ggagaccgag 480
caagtcatca tcggtgctct cgagaatctg tttaagaaca ctaacgtgaa ccccaaggac 540
attggcatcc tggtcgtgaa ctcctccatg tttaacccca ccccctctct gtccgccatg 600
gtggtgaaca ccttcaagct gcgatccaac gtccgatcct tcaacctggg cggcatgggt 660
tgctctgctg gcgtgatcgc tattgacctc gccaaggatc tcctgcacgt ccacaagaac 720
acctacgccc tggtcgtgtc tactgagaac atcacctaca atatctacgc cggcgataac 780
cgatccatga tggtgtccaa ttgcctcttc cgagtgggcg gcgccgctat cctcctgtcc 840
aacaagcccc gagaccgacg acgatccaag tacgagctcg tccacactgt ccgaacccac 900
accggtgctg acgacaagtc cttcagatgc gtccagcagg gcgacgatga gaacggccag 960
accggcgtgt ccctgtctaa ggacattact gatgtggccg gccgaaccgt caagaagaac 1020
attgccactc tgggccccct gattctgccc ctctccgaga agctgctctt tttcgtcacc 1080
ttcatgggca agaaactgtt caaggacgag atcaagcact attacgtccc cgactttaaa 1140
ctcgccatcg accatttttg catccacgct ggcggtaagg ctgtcatcga cgtcctggag 1200
aaaaacctgg gtctggctcc tatcgacgtc gaggcttctc gatctaccct ccatcgattc 1260
ggcaacacct cctcctcctc catctggtac gagctggcct acatcgagcc caagggtcga 1320
atgaagaagg gcaacaaggt ctggcagatc gctctgggct ccggcttcaa atgtaactct 1380
gctgtctggg tggctctgaa caacgtcaag gcttccacta actccccctg ggagcactgc 1440
atcgaccgat accctgtcaa gatcgactct gactctggca agtccgagac ccgagtcccc 1500
aacggccgat cttaa 1515
<210> 10
<211> 1518
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AtKCS18
<400> 10
acctccgtca acgtcaagct gctctaccga tacgtgctca ccaatttctt caacctctgt 60
ctgttccccc tcaccgcttt tctggctggc aaggcttccc gactgaccat caacgacctc 120
cacaacttcc tctcctatct gcagcataat ctcatcaccg tcactctgct gttcgctttt 180
accgtgttcg gtctcgtgct gtacatcgtc acccgaccca accccgtcta cctcgtggac 240
tactcttgtt acctccctcc cccccatctg aaagtctccg tctccaaggt gatggacatc 300
ttctaccaaa tccgaaaagc tgacacctcc tcccgaaacg tggcttgcga tgacccctcc 360
tctctggact ttctgagaaa gatccaagag cgatctggtc tgggcgacga gacttactcc 420
cccgagggtc tgattcatgt gccccctcga aagaccttcg ccgcctccag agaggagacc 480
gagaaggtca ttattggcgc tctggagaat ctgttcgaga ataccaaggt gaatccccga 540
gaaatcggca tcctcgtcgt gaactcctcc atgtttaacc ccactccctc tctctccgcc 600
atggtggtga acaccttcaa gctgcgatcc aacatcaagt ccttcaatct cggcggcatg 660
ggctgttctg ctggcgtcat tgctatcgat ctggctaaag atctgctcca cgtccacaag 720
aacacctacg ctctggtggt ctccactgag aacatcaccc aaggcatcta tgctggcgaa 780
aatagatcca tgatggtctc caactgcctc ttcagagtcg gcggcgccgc tattctgctg 840
tctaacaaat ctggcgaccg aagacgatcc aagtacaagc tcgtccacac tgtgagaacc 900
catactggcg ctgatgacaa gtccttccga tgtgtccaac aagaggatga cgagtctggc 960
aagatcggcg tgtgtctgtc taaggacatc accaacgtgg ccggcactac tctgactaaa 1020
aacatcgcca ccctcggccc tctgattctc cctctgtccg agaagtttct gtttttcgcc 1080
accttcgtgg ccaaaaagct gctgaaggat aaaattaagc actactacgt gcccgacttt 1140
aagctcgctg tcgaccattt ttgcatccac gccggcggta gagccgtcat cgacgagctc 1200
gagaagaatc tgggcctctc ccctattgac gtcgaagctt ctcgatccac cctccaccga 1260
ttcggtaaca cctcctcctc ctccatttgg tacgaactgg cttatattga ggctaagggc 1320
cgaatgaaga agggcaacaa ggcttggcag atcgctctgg gctccggttt taagtgtaac 1380
tccgccgtct gggtggctct gcgaaacgtc aaggcctctg ccaactcccc ttggcagcat 1440
tgcatcgatc gataccccgt caagatcgac tccgatctgt ccaaatccaa gacccacgtc 1500
cagaacggcc gatcctaa 1518
<210> 11
<211> 924
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AtADS2
<400> 11
atgtctgtga cctccaccgt ggaggagaac caccagaaga acccttctac ccccgccgct 60
gtggaagaga aaaagaagcg acgatgggtg ttttgggacc gacgatggcg acgactggac 120
tacgtcaagt tctccgcctc cttcaccgtg cactccctcg ctctgctggc tcccttctac 180
tttacttggt ccgctttatg ggtgaccttt ctgttctaca ctatcggtgg tttaggcatc 240
actgtctctt accaccgaaa tttagcccac cgatccttca aggtgcccaa gtggctcgag 300
tatttactcg cctactgtgc tttactcgcc atccaaggtg accccattga ctgggtgtcc 360
actcaccgat accaccacca gtttaccgac tctgagcgag accctcactc tcccaaggag 420
ggcttttggt tctcccacct cctctggatc tacgactccg cttatttagt gtccaagtgc 480
ggtcgacgag ccaatgtgga ggatttaaag cgacaatggt tctaccgatt tttacagaag 540
accgtgctct tccacatttt aggtttaggt tttttcctct tctatttagg cggcatgtcc 600
ttcgtgactt ggggcatggg cgtcggtgct gctctcgagg tccacgtcac ttgtctcatc 660
aactctttat gccacatctg gggcactcga acttggaaga ccaacgacac ctctcgaaat 720
gtgtggtggc tctccgtctt ctccttcggc gagtcttggc acaacaacca ccacgccttc 780
gagtcttccg ctcgacaagg tttagagtgg tggcagatcg acatctcttg gtacatcgtg 840
cgattcttcg agatcattgg tttagccacc gacgtgaagg tccctaccga ggcccagcga 900
cgacgaatgg ccatcgtgcg ataa 924
<210> 12
<211> 1539
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> MaW9
<400> 12
atgggctccc tcacctctcc tactaagaga accactcgat cctcctccgg taagtccacc 60
tccatgaaga atccctcttc cgccatctcc tcttcctcct cttccaactc cgactgctct 120
gattctgagg ccattggccg actctccatt tcttccgccg cctccgtcac ttctctggag 180
gattcctctt cccccgtgat cgccaagcat atcaaggaaa tccctaagat cactaccaag 240
aacgacttct ctgtcctcta tgagccttgg accattacca acttctacaa aaagctggac 300
tgggtccaca tgctgggtct ggtcttcatg cccatctacg gcttctacat ggccttcacc 360
tctgtgcctc tgcagcaaaa gactgccgtc tttgccgtgg cctactactt cttcaccggt 420
ctcggcatta ccgccggcta ccatcgactg tggtctcacc gagcctacaa cgctggcccc 480
accctccagt tcatcctcat gattgcctcc accggtgcta tgcaaggctc tatccgatgg 540
tggtgtcgaa accatcgagc tcatcaccga tacaccgata ccgagaagga cccctacggc 600
gcccagaagg gtctgatctg gtcccatatt ctgtggatgc tggtgcgaca agaccccacc 660
actgtcggtt gggctgatgt ggctgatctg aaagccaaca agctcgtgcg attccagcac 720
gaccacttcc tctggctggc tcctctcatc tctctgggcc tccctaccat ggtggccggc 780
tttggctggg gtgattattg gggcggtttc atctacggtg gcatcatccg acaagtcgtg 840
gtccaccacg ccaccttctg cgtcaactct ctggctcatt ggctcggtga tatgcccttc 900
gacgaccgac acactcctag agaccacatt ctgactgctc tggtgactct cggcgagggc 960
taccacaact ttcaccacga gttcccccaa gactaccgaa atgctattcg attctaccag 1020
tatgacccca ctaagtggct catcgctttc tgtgccttcc tcggcctcgc ttctgacctc 1080
aagcgatttc ccaccaacga gatcaagaag ggcgaggtca gaatgcagca acagaagctg 1140
gaccgagtga aggccggcct catttggggt acccccatcg ctcaactgcc cgtcttcacc 1200
tacgaggagt tcgaggaact ggccaccgag aagggccaag ccgtcaccct catcgagggt 1260
attatctacg acatcggtgc cttcgtcgac gagcatcccg gtggccgatc tctgatcaag 1320
ggcgccatcg gtaaggacgc cactacctcc ttcaacggcg gtgtgtacga ccactccaac 1380
gctgcccgac atctgctcga gagaatgcga gtgggcgtcg tcgctggcgg tggttttgtc 1440
gagcaccgaa agtcctccac cgcccccaaa caactgtcca ccatccctct gggttcctat 1500
ccccccgcct ccattcccgt ggtctctcga accgcctaa 1539

Claims (1)

1.一株高产神经神经酸的重组解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica），是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ-10株，保藏编号为CCTCC NO：M 20211245。
CN202210535236.XA 2022-05-17 2022-05-17 一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 Active CN114891653B (zh)

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