CN110558227A - 培育芦草的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培育芦草的方法,包括:摘取芦草的腋芽,对腋芽进行外植体消毒处理;将消毒后的腋芽段置于第一培养基中,进行黑暗避光培养,得到愈伤组织;将愈伤组织转移到第二培养基中,进行强光培养,得到芦草胚状体;将芦草胚状体转移到第三培养基中,进行强光培养,得到芦草;将芦草腋芽继续在第三培养基中,进行强光培养,得到壮芽的芦草;将壮芽的芦草转移到第四培养基中,进行强光培养,得到生根的芦草;对生根的芦草进行驯化,将驯化后的芦草移栽到温室或者大田。本发明可以加快芦草的繁殖速度,实现芦草的高效繁殖。

Description

培育芦草的方法
技术领域
本发明植物组织培育技术领域,特别是涉及一种培育芦草的方法。
背景技术
芦草是一种分布范围广、适应力强的多年生高秆草本植物。芦草的分布北起辽宁,南至广西、台湾,多见于江浙地带;它对盐碱、干旱、贫瘠都有一定的忍耐力。但是,现有的芦草繁殖速度较慢,不能满足需求。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提出一种培育芦草的方法,以加快芦草的繁殖速度,实现芦草的高效繁殖。
基于上述目的,本发明提供的培育芦草的方法包括以下步骤:
摘取芦草的腋芽,对腋芽进行外植体消毒处理;
将消毒后的腋芽段置于第一培养基中,进行黑暗避光培养,得到愈伤组织;
将愈伤组织转移到第二培养基中,进行强光培养,得到芦草胚状体;
将芦草胚状体转移到第三培养基中,进行强光培养,得到芦草;
将芦草腋芽继续在第三培养基中,进行强光培养,得到壮芽的芦草;
将壮芽的芦草转移到第四培养基中,进行强光培养,得到生根的芦草;
对生根的芦草进行驯化,将驯化后的芦草移栽到温室或者大田。
在本发明的一些实施例中,摘取芦草的腋芽,对腋芽进行外植体消毒处理,包括:
从芦草上摘取5-8mm的腋芽,将腋芽裁剪成2-3cm2的腋芽段;
采用质量浓度为70-80%的乙醇溶液浸没腋芽段10-20秒,然后用无菌水清洗2-3次;
采用质量浓度为0.05-0.2%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段4-8分钟,然后用无菌水清洗3-5次;
去除腋芽段上残留的水分。
在本发明的一些实施例中,第一培养基为包含1-3mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和0.5-1.5mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基;
黑暗避光培养包括:黑暗避光处理18-22小时,微弱光间隔处理1-3小时,光照光强为1000-1200Lx,培养温度为25-26℃。
在本发明的一些实施例中,第二培养基为1/2MS培养基。
在本发明的一些实施例中,第三培养基为包含4-6mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、0.1-1mg/mL吲哚-3-乙酸和0.1-1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基;第三培养基的pH为5-6.5。
在本发明的一些实施例中,第四培养基为包含4-6mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、1.5-2.5mg/mL吲哚-3-乙酸和0.1-1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基。
在本发明的一些实施例中,强光培养包括:光照周期为16-20小时、光照4-8小时黑暗,光照强度为2500-2600Lx,培养温度为25-26℃左右。
在本发明的一些实施例中,从3-4月份采集的野生芦草上摘取腋芽。
在本发明的一些实施例中,对生根的芦草进行驯化,包括:
取出生根的芦草,将其转移到打孔泡沫板中,打孔泡沫板漂浮在水面上,进行为期一周的驯化。
在本发明的一些实施例中,将驯化后的芦草移栽到温室或者大田,包括:
取底部有孔的盆中,在盆中装填草炭土;
在盆中种植芦草后,向盆中放入水位高为2-4厘米的自来水,使草炭土充分吸水后置于常温环境中;
植株在盆中生长2个月后移栽于温室或大田。
从上面可以看出,本发明实施例从3-4月份采集的野生芦草上摘取腋芽,3-4月份采集的芦草腋芽在外植体脱分化形成愈伤组织的几率最大,可以达到百分之百,愈伤组织呈现淡黄色的不规则组织。本发明实施例对腋芽段进行黑暗避光处理,使得愈伤组织在培养基中生长迅速,同时愈伤组织状态饱满。通过该方法处理愈伤组织节约了实验时间以及实验成本。本发明实施例分别配制不同的培养基,使得腋芽分化的幼芽结实粗壮、生长较快、腋芽诱导率较多,每个腋芽段平均会产生10到15个以上芽,在生根培养的过程中,芦草愈伤组织的生根率可达到90%以上。而且,由于3-4月份采集的芦草腋芽形成愈伤组织的几率以及愈伤组织的快速繁殖的速度是其他月份采集的2倍还多。本发明实施例提供的浮床驯化体系能加强植株适应外界的有菌环境的适应性得到了很好的驯化,保证了移栽成活率可以达到100%。而传统的方法是直接在原有培养瓶或土壤中驯化,与传统驯化方法相比,本发明的驯化方法可以显著提高移栽成活率。本发明将愈伤组织转移到不加任何生长激素及细胞分裂素的1/2MS培养基中,经过-12周的去激素培养后玻璃体形成的情况会好转,接着再转移到含有生长激素的培养基中就会形成大批量的腋芽,腋芽的状态比正常情况下生长的还要粗壮结实,因此出芽率更高。
附图说明
图1为本发明实施例的野生芦草的照片;
图2为本发明实施例的愈伤组织的照片;
图3为本发明实施例的愈伤组织的腋芽的照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
实施例1
步骤1):在3-4月份时采集野生芦草,如图1所示,从野生芦草上摘取腋芽,腋芽高度为5-8mm左右;用无菌水冲洗后,将腋芽剪成2-3cm2左右的腋芽段,将腋芽段转移到超净工作台中,并将剪好的腋芽段转移到含有无菌水的培养皿中。
接着,将腋芽段在质量浓度为75%的乙醇溶液中完全浸没15秒后立即用无菌水清洗2-3次(每1-2min清洗一次),并将其转移到质量浓度为0.1%的升汞溶液中浸没6分钟,然后用无菌水清洗体3-5次(每1-2min清洗一次)。
最后,将清洗后的腋芽段转移到灭过菌的布式漏斗中抽去多余的水分,并用事先在121℃高温高压灭菌的无菌滤纸上吸干净腋芽段上残留的水分。
步骤2):将步骤1)得到的腋芽段置于含有2mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS(Murashige and Skoog)培养基中培养1-2个月后即可生长出淡黄色不规则的愈伤组织,如图2所示。其中,培养条件为黑暗避光处理20小时,微弱光间隔处理2小时,可以7-9点和13-15点进行微弱光处理,光照强度为1000-1200Lx;培养温度为25-26℃左右。
步骤3):将愈伤组织转移到不加任何生长激素及细胞分裂素的1/2MS培养基中培养1-2周,即可形成含有胚状体的芦草。
步骤4):将芦草胚状体转移到含有5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L吲哚-3-乙酸和0.5mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为5.8。培养基中还可以进一步添加蔗糖40g/L、琼脂8g/L,并在在121℃高温高压灭菌锅中灭菌。培养条温度为25-26℃左右,光照强度为2500-2600Lx,光照周期为:18小时光照6小时黑暗。培养1周后即可形成大量的腋芽,如图3所示,芦草腋芽粗壮结实,生长迅速。
步骤5):将芦草腋芽继续在含有5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L吲哚-3-乙酸和0.5mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,进行强光培养,得到壮芽的芦草。培养2-3周即可形成大批量的芦草腋芽,完成芦草的大批量生产。可选地,光照条件可以与步骤4)相同。
步骤6):将壮芽的芦草转移到包含5mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、2mg/mL吲哚-3-乙酸和0.5mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基中,进行强光培养,培养3-4周便可以形成大量的根。可选地,光照条件可以与步骤4)相同。
步骤7):取出生根的芦草,将其转移到打孔泡沫板中,打孔泡沫板漂浮在水面上,进行为期一周的驯化。
步骤8):取底部有孔的盆中,在盆中装填草炭土;在盆中种植芦草后,向盆中放入水位高为3厘米的自来水,使草炭土充分吸水后置于常温环境中;植株在盆中生长2个月后移栽于温室或大田。
实施例2
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,将腋芽段在质量浓度为78%的乙醇溶液中完全浸没18秒后立即用无菌水清洗2-3次。
实施例3
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,将腋芽段在质量浓度为80%的乙醇溶液中完全浸没12秒后立即用无菌水清洗2-3次。
实施例4
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,将腋芽段在质量浓度为70%的乙醇溶液中完全浸没20秒后立即用无菌水清洗2-3次。
实施例5
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,采用质量浓度为0.05-0.2%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段4-8分钟,然后用无菌水清洗3-5次。
实施例6
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,采用质量浓度为0.08%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段8分钟,然后用无菌水清洗3-5次。
实施例7
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,采用质量浓度为0.2%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段5分钟,然后用无菌水清洗3-5次。
实施例8
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤1)中,采用质量浓度为0.15%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段4分钟,然后用无菌水清洗3-5次。
实施例9
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,将步骤1)得到的腋芽段置于含有1.2mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和1.2mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中。
实施例10
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,将步骤1)得到的腋芽段置于含有3mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和0.8mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中。
实施例11
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,将步骤1)得到的腋芽段置于含有1mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和0.5mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中。
实施例12
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,培养条件为黑暗避光处理18小时,微弱光间隔处理2小时,可以早8-10点、12-14点和16-18点进行微弱光处理,光照强度为1100-1200Lx;培养温度为25-26℃左右。
实施例13
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,培养条件为黑暗避光处理22小时,微弱光间隔处理2小时,可以12-14点进行微弱光处理,光照强度为1000-1150Lx;培养温度为25-26℃左右。
实施例14
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤2)中,培养条件为黑暗避光处理20小时,微弱光间隔处理2小时,可以12-14点和18-20点进行微弱光处理,光照强度为1150-1200Lx;培养温度为25-26℃左右。
实施例15
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,将芦草胚状体转移到含有4.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚-3-乙酸和0.6mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为5.2。
实施例16
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,将芦草胚状体转移到含有5.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.7mg/L吲哚-3-乙酸和0.35mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为5.5。
实施例17
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,将芦草胚状体转移到含有6mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚-3-乙酸和0.66mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为6.0。
实施例18
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,将芦草胚状体转移到含有5.8mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.75mg/L吲哚-3-乙酸和1mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为6.5。
实施例19
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,将芦草胚状体转移到含有4.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、1mg/L吲哚-3-乙酸和0.5mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,所述培养基的pH为5.8。
实施例20
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,培养条温度为25-26℃左右,光照强度为2500-2600Lx,光照周期为:17小时光照7小时黑暗。
实施例21
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,培养条温度为25-26℃左右,光照强度为2500-2600Lx,光照周期为:19小时光照5小时黑暗。
实施例22
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤4)中,培养条温度为25-26℃左右,光照强度为2500-2600Lx,光照周期为:20小时光照4小时黑暗。
实施例23
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤5)中,将芦草腋芽继续在含有5.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.6mg/L吲哚-3-乙酸和0.5mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,进行强光培养。
实施例24
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤5)中,将芦草腋芽继续在含有4.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L吲哚-3-乙酸和0.9mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,进行强光培养。
实施例25
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤5)中,将芦草腋芽继续在含有6.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.7mg/L吲哚-3-乙酸和0.1mg/L6-糠基氨基嘌呤的MS培养基中,进行强光培养。
实施例26
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤6)中,将壮芽的芦草转移到包含5mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、2.2mg/mL吲哚-3-乙酸和0.5mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基中,进行强光培养。
实施例27
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤6)中,将壮芽的芦草转移到包含6mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、2.5mg/mL吲哚-3-乙酸和0.1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基中,进行强光培养。
实施例28
本实施例提供了一种培育芦草的方法,其与实施例1的培育方法的不同之处在于:在步骤6)中,将壮芽的芦草转移到包含5mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、1.8mg/mL吲哚-3-乙酸和1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基中,进行强光培养。
因为芦草表面凹凸不平并含有较多毛,因此给芦草外植体消毒带来了很多困难,很难达到理想的消毒效果。为了解决这一问题,本发明实施例将腋芽裁剪成2-3cm2的腋芽段,同时选取较嫩部分作为外植体,通过乙醇消毒和升汞消毒进行消毒,可以减少消毒时间。采用本发明实施例提供的消毒方法,外植体的污染率在3%以下。
而且,本发明实施例从3-4月份采集的野生芦草上摘取腋芽,3-4月份采集的芦草腋芽在外植体脱分化形成愈伤组织的几率最大,可以达到百分之百,愈伤组织呈现淡黄色的不规则组织。在5月份采集的芦草腋芽外植体诱导率在百分之九十以上。本发明实施例对腋芽段进行黑暗避光处理,使得愈伤组织在培养基中生长迅速,同时愈伤组织状态饱满。通过该方法处理愈伤组织节约了实验时间以及实验成本。本发明实施例分别配制不同的培养基,使得腋芽分化的幼芽结实粗壮、生长较快、腋芽诱导率较多,每个腋芽段平均会产生10到15个以上芽,在生根培养的过程中,芦草愈伤组织的生根率可达到90%以上。而且,由于3-4月份采集的芦草腋芽形成愈伤组织的几率以及愈伤组织的快速繁殖的速度是其他月份采集的2倍还多。
本发明实施例提供的浮床驯化体系能加强植株适应外界的有菌环境的适应性得到了很好的驯化,保证了移栽成活率可以达到100%。而传统的方法是直接在原有培养瓶或土壤中驯化,与传统驯化方法相比,本发明的驯化方法可以显著提高移栽成活率。
芦草愈伤组织再生时会形成玻璃体,本发明将愈伤组织转移到不加任何生长激素及细胞分裂素的1/2MS培养基中,经过-12周的去激素培养后玻璃体形成的情况会好转,接着再转移到含有生长激素的培养基中就会形成大批量的腋芽,腋芽的状态比正常情况下生长的还要粗壮结实,因此出芽率更高。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本发明的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。因此,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种培育芦草的方法,其特征在于,包括以下步骤:
摘取芦草的腋芽,对腋芽进行外植体消毒处理;
将消毒后的腋芽段置于第一培养基中,进行黑暗避光培养,得到愈伤组织;
将愈伤组织转移到第二培养基中,进行强光培养,得到芦草胚状体;
将芦草胚状体转移到第三培养基中,进行强光培养,得到芦草;
将芦草腋芽继续在第三培养基中,进行强光培养,得到壮芽的芦草;
将壮芽的芦草转移到第四培养基中,进行强光培养,得到生根的芦草;
对生根的芦草进行驯化,将驯化后的芦草移栽到温室或者大田。
2.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,摘取芦草的腋芽,对腋芽进行外植体消毒处理,包括:
从芦草上摘取5-8mm的腋芽,将腋芽裁剪成2-3cm2的腋芽段;
采用质量浓度为70-80%的乙醇溶液浸没腋芽段10-20秒,然后用无菌水清洗2-3次;
采用质量浓度为0.05-0.2%的升汞溶液浸没清洗后的腋芽段4-8分钟,然后用无菌水清洗3-5次;
去除腋芽段上残留的水分。
3.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,第一培养基为包含1-3mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸和0.5-1.5mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基;
黑暗避光培养包括:黑暗避光处理18-22小时,微弱光间隔处理1-3小时,光照光强为1000-1200Lx,培养温度为25-26℃。
4.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,第二培养基为1/2MS培养基。
5.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,第三培养基为包含4-6mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、0.1-1mg/mL吲哚-3-乙酸和0.1-1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的MS培养基;第三培养基的pH为5-6.5。
6.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,第四培养基为包含4-6mg/mL6-苄氨基腺嘌呤、1.5-2.5mg/mL吲哚-3-乙酸和0.1-1mg/mL6-糠基氨基嘌呤的1/2MS培养基。
7.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,强光培养包括:光照周期为16-20小时、光照4-8小时黑暗,光照强度为2500-2600Lx,培养温度为25-26℃左右。
8.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,从3-4月份采集的野生芦草上摘取腋芽。
9.根据权利要求1的培育芦草的方法,其特征在于,对生根的芦草进行驯化,包括:
取出生根的芦草,将其转移到打孔泡沫板中,打孔泡沫板漂浮在水面上,进行为期一周的驯化。
10.根据权利要求9的培育芦草的方法,其特征在于,将驯化后的芦草移栽到温室或者大田,包括:
取底部有孔的盆中,在盆中装填草炭土;
在盆中种植芦草后,向盆中放入水位高为2-4厘米的自来水,使草炭土充分吸水后置于常温环境中;
植株在盆中生长2个月后移栽于温室或大田。
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