CN114885840A

CN114885840A - 一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基和培养方法

Info

Publication number: CN114885840A
Application number: CN202210544044.5A
Authority: CN
Inventors: 赵术珍; 王兴军; 卢金东; 厉广辉; 赵传志; 田锐铮; 侯蕾; 潘教文
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN114885840B

Abstract

本发明公开了一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基和培养方法，涉及农业生物工程技术领域。该培养基的配方为：1/2MS+2wt％蔗糖+NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+嘧啶醇1.0mg/L+IBA1.0mg/L+琼脂0.65wt％，pH5.6‑5.8。本发明还提供一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，包括：将芦笋腋芽消毒后，接种于上述的培养基上，一步培养成再生植株。本发明提供的由芦笋腋芽一步诱导再生植株的培养基和培养方法，能够简便、快速、高效的对芦笋进行无性繁殖，为工厂化育苗提供技术支撑。

Description

一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基和培养方法

技术领域

本发明涉及农业生物工程技术领域，特别是涉及一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基和培养方法。

背景技术

芦笋(Asparagus officinalisL.)，也称为石刁柏，是一种宿根性的多年生草本植物，属于典型的雌雄异株植物。芦笋富含蛋白质、维生素、多糖、黄酮类、皂苷等多种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等功效，是一种食药兼用型蔬菜，被誉为“蔬菜之王”。目前，加快优异品种培育是提高芦笋国际市场竞争力的关键所在。然而，芦笋为雌雄异株植物，无法通过自交保持和繁育优良品种。芦笋生产用种为F1杂种，其雌雄亲本的繁殖只能通过营养繁殖，因此，亲本材料的组织培养快速繁殖就成为芦笋杂交育种的关键环节。建立高效的离体繁育技术，既可有效的保持优良品种的种性，防止品种在繁育过程中混杂退化，又可实现优异杂交亲本的工厂化育苗，加快芦笋良种繁育，对推动芦笋产业的发展具有重要意义。

关于芦笋再生体系的研究已有不少报道。从芦笋茎尖、腋芽离体培养到获得再生植株可以通过两种途径，第一种是由茎尖、腋芽首先形成愈伤组织，诱导不定胚或直接分化获得再生植株。第二种途径是茎尖、腋芽不经过愈伤组织诱导过程，使顶芽或腋芽增殖形成丛生芽，然后生根获得再生植株。经过愈伤组织再生的途径，由于存在体细胞变异，不是优良材料或亲本繁殖的最佳途径。不经过愈伤组织途径芦笋的再生体系研究较多，但是，这些研究一般需要先对外植体进行芽诱导、芽增殖和生根等多步培养，操作复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基和培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的由芦笋腋芽一步诱导再生植株的离体培养体系，能够简便、快速、高效的对芦笋进行无性繁殖，为工厂化育苗提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基，所述培养基的配方为：1/2MS+2wt％蔗糖+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+嘧啶醇1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+0.65wt％琼脂，pH5.6-5.8。

本发明还提供上述的培养基在芦笋腋芽一步成苗组织培养中的应用。

本发明还提供一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，包括：将芦笋腋芽消毒后，接种于上述的培养基上，一步培养成再生植株。

进一步地，所述消毒处理所用的消毒剂为0.1％升汞。

进一步地，所述消毒处理的时间为20min。

进一步地，所述一步培养的培养温度为27℃。

进一步地，所述一步培养的光照时间为14h/d。

进一步地，所述一步培养的光照强度为3000lx。

本发明公开了以下技术效果：

本发明开发了芦笋腋芽一步成苗的培养体系，该体系步骤简单，再生苗获得所用时间短，生根质量高，大大提高了芦笋组培快繁的效率，对优异亲本材料的繁殖和新品种培育都具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为用于消毒的不同植物材料，其中A为腋芽，B为笋尖；线框内部为用于消毒的植物材料；

图2为芦笋组织培养中的三种类型的根；

图3为组培苗移栽大田前的生长情况，其中A为再生苗向大田移栽前植株生长状态，B为移栽前根的生长状态。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1外植体取材及灭菌

从田间取回幼茎，先用自来水流水冲洗5min，然后用中性洗涤液逐条清洗，注意不要损伤顶芽和侧芽，再用自来水流水冲洗15min。消毒的材料分为3-5cm笋尖和5-10mm腋芽两种。消毒处理分为6种，即用75％酒精浸泡30s后，分别用0.1％升汞消毒5min，0.1％升汞消毒10min，0.1％升汞消毒20min，2％次氯酸钠消毒5min，2％次氯酸钠消毒10min，2％次氯酸钠消毒20min，。消毒过程为在摇床上以160rpm速度不断摇动。用无菌水冲洗5遍，每遍3分钟。冲洗完后，将外植体放在无菌滤纸上吸干多余水分，取腋芽接种于不同的生根培养基中进行培养。每种消毒方法接种8瓶，每瓶接种5个外植体。培养室温度27℃，光照时间每天14h，光照强度3000lx。培养10天后，统计不同处理的污染率，确定适宜的灭菌方法。外植体污染率(％)＝污染外植体个数/外植体总数×100。

结果分析可知，本实验在进行灭菌处理时分为两种方式，一种直接以5-10mm腋芽为材料(图1A)，另一种以3-5cm笋尖为材料(图1B)，两种外植体经过75％酒精浸30s，无菌水冲洗2遍，然后分别用2％次氯酸钠和0.1％升汞消毒不同时间。结果显示，用0.1％升汞溶液分别消毒5min、10min和20min后，芦笋腋芽污染率分别为15％，7.5％，5.0％，而用2％次氯酸钠溶液分别消毒5min、10min和20min后，芦笋腋芽污染率分别为20％，12.5％和7.5％(表1)。可见，处理相同的时间，0.1％升汞消毒的污染率低于2％次氯酸钠，升汞效果更好。以笋尖为材料，用0.1％升汞溶液消毒5min，10min和20min后，芦笋笋尖污染率分别为25.0％，17.5％和10.0％，相同的消毒时间其效果不及用腋芽为材料的效果。此外，在试验中还观察到，笋尖鳞片(变态叶)包裹的紧实程度也是影响污染率的重要因素，鳞片包裹越紧实，污染率越低。

本实验确定的灭菌体系为：选取鳞片包裹紧实的笋尖，经自来水流水冲洗5min，然后用中性洗涤液逐条清洗，再用自来水流水冲洗15min，剥去鳞片，取腋芽用75％酒精浸30s，无菌水冲洗2遍，然后以0.1％升汞浸泡20min，期间置于160rpm摇床上摇动，然后用无菌水冲洗5遍，每遍3min。

表1不同灭菌处理的效果

实施例2腋芽增殖，伸长及生根培养

基础培养基为1/2MS+2wt％蔗糖+0.65wt％琼脂，pH5.6-5.8，分别添加NAA、KT、IBA、PP333(多效唑)和嘧啶醇，设计4种组合的试验处理，分别为NAA 0.2 mg/L+KT0.3mg/L(RM1)，NAA 0.2 mg/L+KT 0.3m/L+嘧啶醇1.0mg/L(RM2)，NAA 0.2 mg/L+KT 0.1mg/L+嘧啶醇1.0mg/L+IBA 1.0mg/L(RM3)，NAA 0.2mg/L+KT 0.1m/L+IBA 1.0mg/L+PP333 3.0mg/L(RM4)。将消毒(即实施例1确定的灭菌体系，0.1％升汞浸泡20min)后的腋芽分别接种于RM1、RM2、RM3和RM4培养基上，培养温度为27℃，光照14h/d，光照强度3000lx。70d统计根生长情况。

将腋芽分别转接到RM1，RM2，RM3和RM4培养基上，诱导培养30天，就开始生根，培养至70天时，对生根率及生根类型进行统计(表2)。结果发现，再生根明显分为三种类型，即从腋芽基部直接生出的粗壮肉质根(I型)、从腋芽基部的愈伤组织上产生的不定根(II型)以及从腋芽基部直接生出的细长的根(III型)(图2)。在不同的培养基上，产生的不同类型根的比例不同，RM3是最适宜生根培养基，外植体生根率最高，可达86％，在此培养基产生的根主要是I型根。具有I型根的植株，在培养45天后，芽开始迅速伸长生长，培养至60天左右芽长可达3-5cm。RM1培养基生根率较低，而且形成的根主要是III型根，即从茎上直接发生的细弱的根，产生这类根的植株，其芽生长缓慢。RM2培养基生根率为80％，产生的根主要是III型和II型根，少量I型根。RM4培养基中外植体的生根率为80％，培养基中再生植株产生的根主要是I型和III型，也有少量II型根，图2中线框内为愈伤组织。

表2不同培养基对芦笋生根的影响

生根培养至70d左右时，将培养瓶盖打开并半覆盖在瓶口，置于培养室弱光条件下放置2天，然后将生根苗从瓶中取出，用自来水小心冲洗芦笋根上的培养基后，移至盛有潮湿营养土的塑料盆中，并用保鲜膜覆盖以保持湿度。试管苗移栽第一周内，是再生植株能否成活的关键期，要确保较高的土壤湿度(80％以上)和空气湿度(80％以上)。进入第二周，可将保鲜膜部分掀起，进行适度透气。随着培养时间的延长，根据小苗的生长状态，透气程度逐步提高，直到完全去掉保护膜。植株长至3-4个分枝时即可移植到大田，这时的苗已经长出很好的根系(图3)，移栽成活率98％以上。在大田中植株生长旺盛，1个月左右即可长成健康植株。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：1/2MS+2wt％蔗糖+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+嘧啶醇1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+0.65wt％琼脂，pH5.6-5.8。

2.一种如权利要求1所述的培养基在芦笋腋芽一步成苗组织培养中的应用。

3.一种芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，包括：将芦笋腋芽消毒后，接种于权利要求1所述的培养基上，一步培养成再生植株。

4.根据权利要求3所述的芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，所述消毒处理所用的消毒剂为0.1％升汞。

5.根据权利要求4所述的芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，所述消毒处理的时间为20min。

6.根据权利要求3所述的芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，所述一步培养的培养温度为27℃。

7.根据权利要求3所述的芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，所述一步培养的光照时间为14h/d。

8.根据权利要求3所述的芦笋腋芽一步成苗组织培养的方法，其特征在于，所述一步培养的光照强度为3000lx。